中南大学学报（医学版）

ＪＣｅｎｔＳｏｕｔｈＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ）　２００８，３３（３）

收稿日期（Ｄａｔｅｏｆｒｅｃｅｐｔｉｏｎ）　２００７０９１４

作者简介（Ｂｉｏｇｒａｐｈｙ）　陈进伟（１９５４），女，湖南长沙人，教授，主要从事血液病和风湿免疫性疾病的研究。

通讯作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ）　陈进伟，Ｅｍａｉｌ：ｊｉｎｗｅｉ７３１０４＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ

基金项目（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｉｔｅｍ）　湖南省科学技术厅科技计划资助项目（０５ＳＳＹ３０６９）　　ＴｈｉｓｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＳｃｉｅｎｃｅ

ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＰ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ（０５ＳＳＹ３０６９）．

Ｐｕｅｒａｒｉｎ逆转 Ｋ５６２／ＡＯ２耐药的分子机制

陈进伟，陶师，骆蓉，张广森，徐运孝

（中南大学湘雅二医院血液科，长沙 ４１０００７）

［摘要］　目的：研究黄酮类化合物 ｐｕｅｒａｒｉｎ对 Ｋ５６２／ＡＯ２（人红白血病多药耐药细胞系）细胞耐药

逆转作用的分子机制。方法：免疫荧光染色方法检测阿霉素（ＡＤＲ）和 ｐｕｅｒａｒｉｎ对 Ｋ５６２（人红白血病细

胞系）和 Ｋ５６２／ＡＯ２两种细胞 ＮＦκＢ活性的影响；免疫细胞化学染色方法检测 ＡＤＲ和 ｐｕｅｒａｒｉｎ对 Ｋ５６２

和 Ｋ５６２／ＡＯ２的 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响；流式细胞仪检测 ＡＤＲ和 ｐｕｅｒａｒｉｎ对 Ｋ５６２和 Ｋ５６２／ＡＯ２的 ｐｇｐ表

达的影响。结果：经 ＡＤＲ处理后的 Ｋ５６２细胞和 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞 ＮＦκＢ的活性明显高于 Ｋ５６２细胞空

白对照组；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ预处理后再加 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞中的 ＮＦκＢ的活性明显低于只用 ＡＤＲ处理

的 Ｋ５６２细胞。经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞的 ＮＦκＢ的活性明显低于未经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预的

Ｋ５６２／ＡＯ２细胞；经 ＡＤＲ处理后的 Ｋ５６２细胞和 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞的 ｐｇｐ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达明显高于 Ｋ５６２细

胞空白对照组；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ预处理后再加 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞中的 ｐｇｐ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达明显低于未经 ｐｕ

ｅｒａｒｉｎ预处理的 Ｋ５６２细胞；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞的 ｐｇｐ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达明显低于未经 ｐｕｅｒ

ａｒｉｎ干预的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞。ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达呈正相关。结论：ＮＦκＢ的活化使 ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表

达增多可能是 Ｋ５６２细胞多药耐药形成的机制之一。Ｐｕｅｒａｒｉｎ能预防和阻止 Ｋ５６２细胞耐药形成，并能

逆转 Ｋ５６２／ＡＯ２对 ＡＤＲ的耐药，其机制与抑制 ＮＦκＢ活性及 ｓｕｒｖｉｖｉｎ和 ｐｇｐ的表达有关。

［关键词］　 ｐｕｅｒａｒｉｎ；　Ｋ５６２／ＡＯ２；　多药耐药；　逆转；　分子机制

［中图分类号］　Ｒ７３３．７　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１６７２７３４７（２００８）０３０２１６０６

ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｖｅｒｓｉｎｇｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ

ＣＨＥＮＪｉｎｗｅｉ，ＴＡＯＳｈｉ，ＬＵＯＲｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｕａｎｇｓｅｎ，ＸＵＹｕｎｘｉａｏ

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎｄＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００７，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｒｅｖｅｒｓｉｎｇｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＡＤＲａｎｄｐｕｅｒａｒｉｎｏｎＮＦκＢａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫ５６２，Ｋ５６２／ＡＯ２ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｏｆＫ５６２，Ｋ５６２／ＡＯ２ｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｐｇｐｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅＮＦκＢａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫ５６２ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＫ５６２／ＡＯ２．ＴｈｅＮＦκＢａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫ５６２ｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｕｎｔｒｅａｔｅｄ．ＴｈｅＮＦκＢａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫ５６２ｗｈｉｃｈｗａｓｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎａｎｄｔｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲｗａｓｍｕｃｈｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲａｌｏｎｅ．ＴｈｅＮＦκＢａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｕｎｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ．ＴｈｅｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＫ５６２．ＴｈｅｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ５６２ｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｕｎｔｒｅａｔｅｄｂｙ

６１２

Ｐｕｅｒａｒｉｎ逆转Ｋ５６２／ＡＯ２耐药的分子机制　陈进伟，等

ＡＤＲ．ＢｕｔｔｈｅｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ５６２ｗｈｉｃｈｗａｓｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎａｎｄｔｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲｗａｓｍｕｃｈｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｎｏｔｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ．ＴｈｅｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｕｎｉｎｔｅｒｖｅｎｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｉｍｅｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦκＢｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎ，ｗｈｉｃｈｍａｙｂｅｐａｒｔｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＫ５６２．ＰｕｅｒａｒｉｎｃａｎｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｓｔｏｐｔｈｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＫ５６２ａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｔｈｅｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＫ５６２／ＡＯ２ｔｏＡＤＲｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮＦκＢａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｇｐａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：　 ｐｕｅｒａｒｉｎ；　 Ｋ５６２／ＡＯ２；　 ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；　 ｒｅｖｅｒｓａｌ；　 ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍ

［ＪＣｅｎｔＳｏｕｔｈＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ），２００８，３３（３）：０２１６０６］

　　白血病细胞多药耐药（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，

ＭＤＲ）的发生严重制约着白血病的治疗。近年来

有研究发现黄酮类化合物除具有很好的心血管

疾病的治疗作用外，还具有抗肿瘤 ［１２］和逆转白

血病细胞株的多药耐药的作用［３］。但其作用机制

尚不十分清楚，本研究探讨了黄酮类化合物 ｐｕｅｒ

ａｒｉｎ（普乐 林）对 人 红 白 血 病 多 药 耐 药 细 胞 系

Ｋ５６２／ＡＯ２耐药逆转的分子机制。

１　材料与方法

１．１　材料、试剂及主要仪器　　Ｐｕｅｒａｒｉｎ购于美

国 ＡｌｅｘｉｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ公司。人红白血病细胞株

Ｋ５６２由湘雅二医院血液病研究室提供。Ｋ５６２／

ＡＯ２耐药细胞株为阿霉素（ＡＤＲ）诱导 Ｋ５６２／Ｓ

建立的 ＭＤＲ细胞株，由中国协和医科大学血液病

研究所提供。小牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培养液为 Ｈｙ

ｃｌｏｎ公司产品。ＡＤＲ购自意大利法玛西亚普强公

司。鼠抗人 ｐｇｐ单抗（ＪＳＢ１）为 ＡｌｅｘｉｓＢｉｏｃｈｅｍｉ

ｃａｌｓ公司产品。ＦＩＴＣ羊抗鼠 ＩｇＧ为 ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａ

ｔｏｒｉｅｓ公司产品。ＮＦκＢ单抗（鼠抗人）和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ

单抗（鼠抗人）为美国 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品。其他

试剂为国产分析纯，流式细胞仪为美国 ＢＤ公司

产品（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）。

１．２　方法

１．２．１　细胞培养　　白血病亲本细胞株 Ｋ５６２

用含 １０％小牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养液在３７℃，

５％ ＣＯ２ 条件下培养。耐药细胞株 Ｋ５６２／ＡＤＲ

（对阿霉素耐药的人红白血病细胞株）在含 ＡＤＲ

１ｍｇ／Ｌ，１０％小牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养液中稳

定生长，试验前两周换用无 ＡＤＲ的 ＲＰＭＩ１６４０培

养液 培 养。取 Ｋ５６２和 Ｋ５６２／ＡＤＲ 细 胞 用 含

１０％灭活的新生牛血清的 ＲＰＭＩ１６４０培养基制成

单细胞悬液接种入 ６孔培养板中，每孔 ２ｍＬ，含

细胞８×１０４个，隔天小心吸去上清进行换液。每

天收取 １孔细胞，适当稀释，制备细胞悬液，９份

细胞悬液加 １份 ０．４％台盼蓝染液，混匀，镜下计

数拒染的细胞数（活细胞数），从而算出相应的每

孔活细胞数量，以上记数操作重复 ４次，取平均

值。绘制细胞生长曲线。

１．２．２　试验分组　　Ａ组：Ｋ５６２细胞常规培

养，不用任何干预；Ｂ组：Ｋ５６２细胞用 １ｍｇ／Ｌ的

ＡＤＲ处 理 ２４ｈ；Ｃ组：Ｋ５６２细 胞 用 ｐｕｅｒａｒｉｎ

２５μｍｏｌ／Ｌ干预 ２４ｈ后，１ｍｇ／Ｌ的 ＡＤＲ处理７２ｈ；

Ｄ组：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞常规培养，不用任何干预；

Ｅ组：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞用 ２５μｍｏｌ／Ｌ的 ｐｕｅｒａｒｉｎ处

理 ２４ｈ。

１．２．３　免疫荧光检测细胞株 ＮＦκＢ的活化　　

按实验分组分别加入相应浓度药物，置 ３７℃，

５％ ＣＯ２及饱和湿度培养箱中培养，于 ２４ｈ后收

集细胞。取密度为 １×１０６／ｍＬ细胞悬液 １０μＬ

制作细胞涂片，８０％丙酮固定 ３０ｍｉｎ，０．２％Ｔｒｉ

ｔｏｎＸ１００特化处理 １５ｍｉｎ，山羊血清工作液孵育

３０ｍｉｎ后弃孵育液，加１∶１００稀释的一抗（ＮＦκＢ

单抗），４℃过夜，再加 ＦＩＴＣ羊抗鼠 ＩｇＧ（１∶１００）

孵育 ３０ｍｉｎ，甘油封片。荧光显微镜下观察细胞

的免疫组织化学染色情况。

１．２．４　免疫组织细胞化学染色检测细胞株中

ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达　　按实验分组分别加入相应浓

度药物，置 ３７℃，５％ ＣＯ２及饱和湿度培养箱中

培养，取 １０μＬ细胞悬液作细胞涂片，干燥后浸

入 ４％多聚甲醛溶液中固定 ３０ｍｉｎ，加入 ３％

７１２

中南大学学报（医学版），２００８，３３（３）　

Ｈ２Ｏ２于玻片上，反应 ２ｍｉｎ，再加山羊血清孵育２０ｍｉｎ后弃孵育液，加一抗（ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体）４℃过夜。再加相应的二抗，２５ｍｉｎ后加入的辣根酶标记链霉卵白素工作液 ３７℃孵育 ２５ｍｉｎ，ＤＡＢ显色，苏木素复染，中性树胶封片，光学显微镜下观

察。细胞染成棕黄色为 ｓｕｒｖｉｖｉｎ阳性。用彩色病理图文分析系统测定细胞株 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的灰度值，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表 达 越 强，细 胞 染 色 越 深，灰 度 值越小。

１．２．５　流式细胞仪检测细胞株 ｐｇｐ表达　　按实验分组分别加入相应浓度药物，置３７℃，５％ＣＯ２及饱和湿度培养箱中培养，收集２×１０

６个细

胞，用 １ｍＬ７０％乙醇 ４℃固定细胞６０ｍｉｎ，用１ｍＬ含 ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００和 ５％血清的 ＰＢＳ重悬细胞，样 本 组 加 入 饱 和 剂 量 ｐｇｐ抗 体 ＪＳＢ１（１∶２０），阴 性 对 照 组 加 入 鼠 ＩｇＧ１，４℃冰 箱

过 夜（１４～１６ｈ），加入荧光（ＦＩＴＣ）标记的二抗（１∶５０），再加入 ＰＢＳ１ｍＬ重悬细胞，用尼龙膜过滤，流式细胞仪检测荧光值，每个样品分析

１００００个细胞。１．３　统计学处理　　数据采用 ＳＰＳＳ１３．０ｆｏｒｗｉｎｄｏｗｓ软件包进行处理，Ｐ＜０．０１认为差异有统计学意义。Ｋ５６２组，Ｋ５６２／ＡＯ２组及其各药物

干预组间的 ｐｇｐ表达，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达 Ａ值比较采用两样本 ｔ检验（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓａｍｐｌｅｓｔｔｅｓｔ）和完全随机设计资料的方差分 析 （ｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ）。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达 Ａ值，ｓｕｒｖｉｖｉｎ与 ｐｇｐ表达关系的研究采用直线相关分析（ｌｉｎｅｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）。

２　结　　果

２．１　细胞株 ＮＦκＢ的活化　　免疫荧光法检测细胞株 ＮＦκＢ的活化结果。荧光显微镜下显示：Ａ组的 Ｋ５６２细胞荧光强度弱，说明未经任何干预的 Ｋ５６２细胞 ＮＦκＢ活化少，且主要在胞浆中表达，细胞核内表达很少（图 １Ａ）；Ｂ组经 ＡＤＲ处理后的 Ｋ５６２细胞核内荧光强度明显增强，可见 ＮＦκＢ已被活化而核内移（图 １Ｂ）；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后再用 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｃ组）细胞核内荧光强度比 Ｋ５６２细胞（Ａ组）稍强，但明显弱于单独用 ＡＤＲ处理组 （Ｂ组）（图 １Ａ，１Ｂ，１Ｃ）；Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）细胞核内荧光染色强阳性（图 １Ｄ）；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｅ组）细胞核内荧光强度较 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）明显减弱（图 １Ｄ，１Ｅ）

图１　各组细胞ＮＦκＢ免疫荧光强度与分布。Ａ：Ｋ５６２细胞组；Ｂ：Ｋ５６２细胞用ＡＤＲ处理２４ｈ组；Ｃ：Ｋ５６２细胞用 ｐｕｅｒａｒｉｎ

干预２４ｈ后，ＡＤＲ处理７２ｈ组；Ｄ：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞组；Ｅ：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞用ｐｕｅｒａｒｉｎ处理２４ｈ组。

Ｆｉｇ．１ＳｔｒｅｎｇｔｈａｎｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎＮＦκＢｏｆｔｈｅ５ｇｒｏｕｐｓ．Ａ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ；Ｂ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲ２４

ｈ；Ｃ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ２４ｈ，ＡＤＲ７２ｈ；Ｄ：Ｋ５６２／ＡＯ２ｃｅｌｌｓ；Ｅ：Ｋ５６２／ＡＯ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ２４ｈ．

８１２

Ｐｕｅｒａｒｉｎ逆转Ｋ５６２／ＡＯ２耐药的分子机制　陈进伟，等

２．２　细胞株中 ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达　　在光学显微镜下观察各实验组细胞的 ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达结果显示：Ｋ５６２细胞空白对照组（Ａ组）细胞浆不着色（图 ２Ａ）；经 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｂ组）着色和 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）比较明显，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达很强（图 ２Ｂ，２Ｄ）；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后再用 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｃ组）着色明显较未经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预单独用 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｂ组）浅（图 ２Ｂ，２Ｃ）。经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预 ２４ｈ的 Ｋ５６２／ＡＯ２细 胞 （Ｅ组）着 色 较 未 经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干 预 的Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）浅（图 ２Ｄ，２Ｅ）。各组均

随机选取多个细胞视野用彩色病理图文报告分

析系统进行 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的平均灰度（Ａ）值定量分析，结果显示：经 ＡＤＲ处理后的 Ｋ５６２细胞（Ｂ组）和 Ｋ５６２／ＡＯ２细 胞 （Ｄ组）ｓｕｒｖｉｖｉｎ表 达 较Ｋ５６２细胞（Ａ组）显著增强；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后再用 ＡＤＲ处理的 Ａ５６２细胞（Ｃ组）的 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达较只用 ＡＤＲ处理的 Ａ５６２细胞（Ｂ组）明显降低。经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预后的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｅ组）的ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达较未经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）明显降低（表 １）。灰度值越高，ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达越低。

图２　免疫组织化学染色检测各组细胞ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达。Ａ：Ｋ５６２细胞组；Ｂ：Ｋ５６２细胞用ＡＤＲ处理２４ｈ组；Ｃ：Ｋ５６２细胞用ｐｕ

ｅｒａｒｉｎ预处理２４ｈ后，ＡＤＲ处理７２ｈ组；Ｄ：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞组；Ｅ：Ｋ５６２／ＡＯ２细胞用ｐｕｅｒａｒｉｎ处理２４ｈ组。

Ｆｉｇ．２Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｏｆｔｈｅ５ｇｒｏｕｐｓ．Ａ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓ；Ｂ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲ

２４ｈ；Ｃ：Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ２４ｈ，ＡＤＲ７２ｈ；Ｄ：Ｋ５６２／ＡＯ２ｃｅｌｌｓ；Ｅ：Ｋ５６２／ＡＯ２ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｂｙｐｕｅｒａｒｉｎ２４ｈ．

表１　ＡＤＲ和 ｐｕｅｒａｒｉｎ对各组细胞 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的影响

（ｘ±ｓ，ｎ＝５）

Ｔａｂ．１　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｉｎｔｈｅＫ５６２，Ｋ５６２／ＡＯ２ｃｅｌｌ

ｌｉｎｅｓｔｒｅａｔｅｄｂｙＡＤＲａｎｄｐｕｅｒａｒｉｎ（ｘ±ｓ，ｎ＝５）

　　　组别 细胞ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的Ａ值

Ａ组（Ｋ５６２空白对照） ２８９．４５±３８．６４

Ｂ组（Ｋ５６２＋ＡＤＲ） １５２．８８±１５．１１

Ｃ组（Ｋ５６２＋ＰＵ＋ＡＤＲ） ２２８．６４±３４．２３△△

Ｄ组（Ｋ５６２／ＡＯ２） ９０．６５±１０．６１

Ｅ组（Ｋ５６２／ＡＯ２＋ＰＵ） １２３．８１±２１．８２＃＃

　　与Ａ组比较， Ｐ＜０．０１；与 Ｂ组比较，△△Ｐ＜０．０１；与 Ｄ

组比较，＃＃Ｐ＜０．０１。ＰＵ表示ｐｕｅｒａｒｉｎ

２．３　细胞株 ｐｇｐ表达　　流式细胞仪检测各实验组细胞 ｐｇｐ表达，结果显示：Ｋ５６２／ＡＯ２空白对照组细胞（Ｄ组）和经 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｂ组）ｐｇｐ表达明显高于 Ｋ５６２空白对照组细胞（Ａ组）；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ预处理后再用 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞（Ｃ组）ｐｇｐ表达显著低于未经 ｐｕｅｒａｒｉｎ预处 理 单 用 ＡＤＲ处 理 的 Ｋ５６２细 胞 （Ｂ组）；经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预 ２４ｈ后 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｅ组）ｐｇｐ表达低于未经 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预的 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞（Ｄ组）ｐｇｐ的表达（表２）。说明 ｐｕｅｒａｒｉｎ能有效地抑制 ＡＤＲ诱导 Ｋ５６２细胞的 ｐｇｐ表达，同时也能使 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞的 ｐｇｐ表达下降。

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中南大学学报（医学版），２００８，３３（３）　

表２　各组ｐｇｐ的表达（ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ｔａｂ．２　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｇｐｏｆｔｈｅ５ｇｒｏｕｐｓ（ｘ±ｓ，ｎ＝３）

　　组别 细胞ｐｇｐ阳性率（％）

Ａ组 （Ｋ５６２空白对照） ３．７３±０．５１

Ｂ组 （Ｋ５６２＋ＡＤＲ） ８７．４４±４．８６

Ｃ组 （Ｋ５６２＋ＰＵ＋ＡＤＲ） ３４．２５±１．８７△△

Ｄ组 （Ｋ５６２／ＡＯ２空白对照） ９４．５０±５．９０

Ｅ组（Ｋ５６２／ＡＯ２＋ＰＵ） ８０．１６±４．０９＃＃

　　与Ａ组比较，Ｐ＜０．０１；与Ｂ组比较，△△Ｐ＜０．０１；与 Ｄ组

比较，＃＃Ｐ＜０．０１。ＰＵ表示ｐｕｅｒａｒｉｎ

２．４　各组细胞 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达和 ｐｇｐ表达的相关

性分析　　对每组 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达灰度值及 ｐｇｐ表

达阳性率进行相关性分析，结果显示 ｐｇｐ表达

高低与 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达灰度值负相关（ｒ＝－０．９４９，

Ｐ＜０．０１），即 ｐｇｐ表 达 与 ｓｕｒｖｉｖｉｎ表 达 呈 正相关。

３　讨　　论

临床上白血病化疗时剂量不足或化疗不能耐

受须反复用药，常引起白血病细胞耐药。如同在

实验室中用 ＡＤＲ诱导 Ｋ５６２成 Ｋ５６２／ＡＯ２一样，

化疗药物在诱导细胞凋亡的同时也诱导耐药细

胞的形成。本实验用 ＡＤＲ刺激 Ｋ５６２细胞 ２４ｈ

后，ＮＦκＢ明显活化并核内移。受 ＮＦκＢ调控的

下游基因 ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ在 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２，

Ｋ５６２／ＡＯ２细胞中表达都明显增强。Ｋ５６２／ＡＯ２

的 ＮＦκＢ更是高度活化，ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达

更为明显。实验结果与目前药物所致细胞耐药

和凋亡受阻的研究［４５］完 全相符。有学者认为

ＡＤＲ也是通过 ｃａｓｐａｓｅ信号瀑布诱导细胞凋亡的，

在其活化 ｃａｓｐａｓｅ家族的同时也可激活依赖 ＰＩ３Ｋ

的 ＰＫＢ／Ａｋｔ细胞存活通路而使 ＮＦκＢ活化，下游抗凋亡基因的表达增强，这是 ＮＦκＢ活化的主要

途径。次要途径是在 Ｐ３８／ＭＡＰＫ信号通路激活

后使 ｐ６５磷酸化和从前体蛋白 ｐ１０５形成 ｐ５０，

ｐ５０／ｐ６５异源聚体活化并进入核中发挥转录活性［６］。Ｐ３８／ＭＡＰＫ信号通路恰恰也是 ＡＤＲ诱导

细胞凋亡的一个主要通路。长期一定浓度的

ＡＤＲ杀伤白血病细胞（Ｋ５６２）的同时也活化 ＮＦ

κＢ，上调下游耐药、抗凋亡基因 （ｐｇｐ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ

等）的表达，是 Ｋ５６２／ＡＯ２耐药形成的机制之一。且 ＡＤＲ作用的时间越长，ＮＦκＢ的活化越完

全，下游抗凋亡和耐药基因更加高度表达，是白

血病化疗过程中形成白血病细胞高度耐药的一

个重要原因。

Ｐｕｅｒａｒｉｎ是从传统中药葛根的根茎中提取的纯的黄酮类化合物，其主要成分为异黄酮［７］。研

究发 现 Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ等 黄 酮 类 化 合 物 可 以 促 进

ＴＮＦ、阿霉素、足叶乙甙等一些因素对肿瘤细胞的毒性作用［６］。Ｔａｋａｄａ等［８］研究发现，ＴＮＦ可诱导

ＨＬ６０细胞的 ＮＦκＢ活化，并向核内转移，多种

蛋白表达增加，如 Ｂｃｌ２，Ｍｃｌ１，ＣｙｃｌｉｎＤ１，ＶＥＧＦ，

ＣＯＸ２，ＭＭＰ９，ＩＡＰｓ等。而经 Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ预处理

后，ＮＦκＢ活化受到明显的影响，核内转移的

ＮＦκＢ减少，其下游基因的表达也明显受到抑

制。笔者先前的研究显示 ｐｕｅｒａｒｉｎ能增加 Ｋ５６２

和 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞对 ＡＤＲ的敏感性（增敏 １．４２

倍），并能逆转 Ｋ５６２／ＡＯ２细胞的耐药（逆转倍

数为 ９．４３）。为研究其分子机制，本研究用 ｐｕｅｒ

ａｒｉｎ分别干预 ＡＤＲ处理的 Ｋ５６２细胞和 Ｋ５６２／

ＡＯ２，结果与 Ｔａｋａｄａ等［８］和 Ｋｈｏｓｈｎａｎ等［９］的研究

结果一致。Ｐｕｅｒａｒｉｎ对耐药细胞株 Ｋ５６２／ＡＯ２的

ＮＦκＢ活化以及 ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达有明显的

抑制作用，且有高度的相关性。说明 Ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ

是通过抑制 ＮＦκＢ的活性，下调 ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ

基因表达，从而逆转白血病细胞的耐药。用 ｐｕｅｒ

ａｒｉｎ预先干预，再用 ＡＤＲ刺激 Ｋ５６２细胞株后，其

ＮＦκＢ活化及核内移较预先未加 ｐｕｅｒａｒｉｎ干预的

Ｋ５６２细胞明显受到抑制，ｐｇｐ和 ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达

也明 显 减 少，但仍 高于没 有用 阿霉 素刺激的

Ｋ５６２细胞。推测 ｐｕｅｒａｒｉｎ逆转耐药是通过抑制

ＮＦκＢ活化的主要途径即 ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ存活通路，

而不能抑制 Ｐ３８／ＭＡＰＫ信号通 路这 一次 要途

径［８］。由此提示如果先用黄 酮 类 化 合 物阻止

ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ这条主要存活通路，再用 ＡＤＲ进行诱

导凋亡时，ＡＤＲ就不能通过活化 ＮＦκＢ产生抗凋

亡作用，从而预防和阻止白血病细胞耐药形成，

增强 ＡＤＲ对肿瘤的杀伤作用。

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（本文编辑　郭征）

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