QIAGEN Rotor-Gene Q のHRM 機能によるメチル化 …H21年度バイオ実験機器部門ワークショップ「QIAGEN Rotor-Gene QのHRM機能によるメチル化定量解析

Ｈ２１年度バイオ実験機器部門ワークショップ

「QIAGEN Rotor-Gene Qの HRM機能によるメチル化定量解析

バイオ実験機器部門では

１．バイサルファイト処理ＤＮＡの特定遺伝子プロモーター部位のＰＣＲ増幅・シーケンスによるCpG

メチル化部位の決定

２．CpGメチル化依存性制限酵素処理法による特定遺伝子プロモーター部位のメチル化の定量

に関わる技術開発をこれまで実施してきています。

今回はＰＣＲ増幅物の高精度融解解析であるＨＲＭ技術による定量化の実現を目指した実験及び２．の項

目の実験を行います。

日程の概要：

日程は３日間で１日目に細胞や組織（参加者の方が持参していただいてもかまいません）から gDNA(ゲ

ノムＤＮＡ)の抽出を行います。２日目にgDNAのバイサルファイト処理を行います。３日目にQIAGEN

のRotor-Gene Qによる解析を行います。機器の取り扱い・解析法などの説明はQIAGENの技術者が行

ないます。なお、医学部の大学院セミナーとして位置づけられていますが、一般の研究者の方も参加頂け

ます（実験内容は初級レベルとなります）。

参加者の対象：

大学院生、及び一般の研究従事者の方を対象とします。

参加人数：～5名

申込み順に定員５名に達し次第締め切ります。

日程：平成２１年５月２７日（水）～２９日（金）

２７日（水）２８日(木) ２９日(金)

午後全日全日

＊全日拘束されることはありませんが、必要な時間には実験室に戻ることが可能なこと。

場所：臨床研究棟２階バイオイメージ解析室

受講料：大学院生：4千円、一般：8千円 … 受講料の支払いは原則、運営費交付金からとします。

今回のワークショップでは QIAGENの最新リアル

タイム PCR装置 Rotor-Gene Qの特徴的機能であ

る HRM(High Resolution Melt)を用いて、遺伝子の

メチル化を定量してみようと計画しました。

Rotor-Gene Q は下記ホームページを参照：

http://www1.qiagen.com/Products/Rotor-GeneQ.as

px#Tabs=t1

ヒトのゲノムの完全解読に伴って、研究者の興味はお互いに異なったバックグラウンドを持つ分化

段階、組織の種類、病気の状態において、等しい遺伝情報が如何に個々の細胞で発現するかを決定す

るエピジェネティックな変化を網羅的に捉えることに移ってきています。エピジェネティックスはゲ

ノムを超えて受け継がれるＤＮＡ配列情報以外のクロマチンの変化を記述すること言えます。

哺乳動物のエピジェネティックスではＤＮＡの化学修飾である CpG のメチル化、及び、ヌクレオ

ソームの構成成分であるヒストン蛋白のメチル化、アセチル化、リン酸化などがクロマチン構造と遺

伝子機能を調節する制御ネットワークに関係する主要な要素と見られています。その中でもDNAの

メチル化は長期的に遺伝子をサイレンシングするための機能を有しており、少なくとも哺乳動物では

高い忠実度で次世代の細胞に受け継がれる重要なエピジェネティックな情報といえます。

その他の支払方法を希望の方は通信欄にお書き下さい。

申し込み方法：

参加申込書に記入の上、平成２１年５月２２日（金）までにバイオ実験機器部門管理室まで

提出してください。

お問い合わせ先：バイオ実験機器部門・吉村（5577）まで。

― 以下に具体的なプログラムの内容を示します ―

具体的な実験手技（以下のような技術を体験し習得できます）

１．細胞・組織からのgＤＮＡ(ゲノムＤＮＡ)の抽出・精製

２． gDNAの濃度測定(スペクトル測定)

３． gDNAのバイサルファイト変換処理および制限酵素処理

４．ウェブサイト: MethPrimerによるエピジェネティック解析用プライマーデザイン

５．定量ＰＣＲ装置Rotor-Gene QおよびStepOneによる計測解析

＜日程＞

第１日目

午後

培養細胞・組織のライシスとプロテアーゼ消化の開始（オーバーナイト）

第２日目

午前

gDNAにRNase A Solutionを加え60min反応→反応中にウェブサイト: Meth primerでプライマー

設計→gDNA精製→gDNAを滅菌水になじませる

午後

gDNAの濃度測定→バイサルファイト変換反応（オーバーナイト）

バイサルファイト未処理ＤＮＡの制限酵素処理

第３日目

午前

バイサルファイト変換したDNAの精製→濃度測定

制限酵素処理ＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ定量

午後

HRM解析の反応液作成→HRM解析開始

総合討論

Ｈ２１年度バイオ実験機器部門ワークショップ参加申込書

所属（）職名（）

氏名（）

連絡先内線番号（）メールアドレス（）

所属長氏名（㊞）

きりとり線

通信欄

www.qiagen.com

HRM Report Experiment Information

Run Name EpiTect 2009-05-29 (1) 2009-05-29 (1)Run Start 2009/05/29 11:53:00 Run Finish 2009/05/29 13:55:09 Operator Fukui-1 Notes Run On Software Version Rotor-Gene 1.7.94 Run Signature The Run Signature is valid. Gain Green 8. Gain HRM 1.

HRM Analysis Information

Confidence Threshold 80 % Normalisation Region 1 72 - 72.8 Normalisation Region 2 79.2 - 80.3 Sample Page RIN1

Normalised Graph for HRM A.HRM

http://www.qiagen.com/

vio

テキストボックス

HRMによるメチル化解析結果

No. Colour Name Genotype Confidence %1 100%Methylated Variation 0.00

2 100%Methylated Variation 0.00







9 0%Methylated Unmethylated 97.64


11 Hela Unmethylated 81.49


13 Jurkat Variation 0.00


15 ACHN - Unmethylated 87.42


17 AVHN + Unmethylated 83.18

18 AVHN + Variation 78.92

This report generated by Rotor-Gene Q Series Software 1.7 (Build 94) Copyright 2008 Corbett Life Science, a QIAGEN Company. All rights reserved.ISO 9001:2000 (Reg. No. QEC21313)

www.qiagen.com


Run Name EpiTect 2009-05-29 (1) 2009-05-29 (1)Run Start 2009/05/29 11:53:00 Run Finish 2009/05/29 13:55:09 Operator Fukui-1 Notes Run On Software Version Rotor-Gene 1.7.94 Run Signature The Run Signature is valid. Gain Green 8. Gain HRM 1.


Confidence Threshold 80 % Normalisation Region 1 72.91 - 74.01 Normalisation Region 2 79.91 - 81.01 Sample Page RIN2



No. Colour Name Genotype Confidence %20 100%Methylated Variation 0.00
















36 AVHN + Unmethylated 85.47

37 AVHN + Variation 79.88


www.qiagen.com


Run Name EpiTect 2009-05-29 (1) 2009-05-29 (2)Run Start 2009/05/29 14:24:27 Run Finish 2009/05/29 16:34:36 Operator FUKUI-2 Notes Run On Software Version Rotor-Gene 1.7.94 Run Signature The Run Signature is valid. Gain Green 8. Gain HRM 1.


Confidence Threshold 90 % Normalisation Region 1 72.17 - 73.27 Normalisation Region 2 79.83 - 80.93 Sample Page RIN4 bis-2



No. Colour Name Genotype Confidence %1 100%Methylated

2 100%Methylated

3 100%Methylated

4 75%Methylated

5 75%Methylated

6 75%Methylated

7 50%Methylated

8 50%Methylated

9 50%Methylated

10 25%Methylated

11 25%Methylated

12 25%Methylated

13 0%Methylated

14 0%Methylated

15 0%Methylated

16 Hela

17 Hela

18 Hela

19 Jurkat

20 Jurkat

21 Jurkat

22 ACHN -

23 ACHN -

24 ACHN -

25 ACHN +

26 ACHN +

27 ACHN +


www.qiagen.com




Confidence Threshold 90 % Normalisation Region 1 73.2 - 74.3 Normalisation Region 2 92.8 - 93.9 Sample Page RASSF1


※PCR において、特異的な増幅が得られていなかったため、HRM 解析を実施することができておりません。



46 100%Methylated

47 75%Methylated

48 75%Methylated

49 50%Methylated

50 50%Methylated

51 25%Methylated

52 25%Methylated

53 0%Methylated

54 0%Methylated

55 ACHN -

56 ACHN -

57 ACHN +

58 ACHN +

59 NTC


www.qiagen.com




Confidence Threshold 90 % Normalisation Region 1 78.01 - 79.11 Normalisation Region 2 92.8 - 93.9 Sample Page BRCA1


※PCR において、特異的な増幅が得られていなかったため、HRM 解析を実施することができておりません。



31 100%Methylated

32 75%Methylated

33 75%Methylated

34 50%Methylated

35 50%Methylated

36 25%Methylated

37 25%Methylated

38 0%Methylated

39 0%Methylated

40 ACHN -

41 ACHN -

42 ACHN +

43 ACHN +

44 NTC


0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RIN1 RIN2 RIN4

HeLa

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RIN1 RIN2 RIN4

ACHN-

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RIN1 RIN2 RIN4

Jurkat

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RIN1 RIN2 RIN4

ACHN+

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

vio

テキストボックス

制限酵素法によるメチル化解析結果

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RASSF1

ACHN-

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

RASSF1

ACHN+

非メチル化

混在メチル化

高メチル化

参加者（４名）の感想（一部抜粋）

・プライマーの設計から，どのようにほしい部分が増幅されていく

か一通りわかったような気がして楽しかった。また，２通りの結

果を見比べることもできて非常に貴重な体験ができたと思う。

・正常組織とガン組織の比較や，今回解析した部分以外の遺伝子で

はどうなっているのか？ということなど，興味をそそられること

が盛りだくさんでした。

・普段はできない実験をじっくりと行うことができて良かったです。

いくら講義を聞いても実際に自分の実験・研究にも応用しようと

いう感じにはならないが，このワークショップに参加することで，

自分の行っている研究をもっと多角的に見る事ができるようにな

り，もっといろいろ研究したいと思った。

・一から丁寧に実践形式で教えて頂き大変感謝しております。今後，

ＰＣＲも取り入れた実験を予定しているので，もう一度今回教え

て頂いたものを復習して役立てたいと思います。

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QIAGEN Rotor-Gene Q のHRM 機能によるメチル化 …H21年度バイオ実験機器部門ワークショップ 「QIAGEN Rotor-Gene QのHRM機能によるメチル化定量解析

QIAGEN Rotor-Gene Q のHRM 機能によるメチル化 …H21年度バイオ実験機器部門ワークショップ「QIAGEN Rotor-Gene QのHRM機能によるメチル化定量解析