SADRAJ

1. RAD U BIOLOKOJ LABORATORIJI..............................................1.1. OPTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI....................................................... 1.2. LABORATORIJSKA OPREMA............................................................................... 1.3. LABORATORIJSKO SUE................................................................. 1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH SUA................................................. 1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA............................................

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA....................................2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA....................................................................................... 2.1.1. Mehaniki dijelovi..................................................................... 2.1.2. Optiki dijelovi......................................................................... 2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA................................................................................ 2.3. UVANJE MIKROSKOPA.................................................................. 2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA........................................................................... 2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA...............................................................................

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA............3.1. METODE I TEHNIKE.............................................................................................. 3.2. SKVO PREPARAT................................................................................................ 3.2.1. Opti princip pripremanja skvo preparata.......................................................... 3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA................................... 3.4. PREPARAT VISEA KAP..................................................................

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA......................4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE........................................................................................ 4.1.1. Fiksativi koji se najee upotrebljavaju................................ 4.1.2. Fizika fiksacija........................................................................ 4.2. ISPIRANJE MATERIJALA..................................................................................... 4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA..................................... 4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA.................................................................... 4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM....................................................................... 4.6. OBILJEAVANJE PREPARATA............................................................................

5. BOJENJE PREPARATA.............................................................................5.1. BOJE I RASTVORI BOJA.................................................................................... 5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA............................................................................ 5.3. METODE BOJENJA................................................................................................ 5.3.1. Hematoksilinska metoda..................................................................................... Delafildov hematoksilin......................................................................................................... 5.3.2. Dvojno bojenje preparata................................................................................... 5.3.3. Ostale metode...................................................................................................... 5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAIN UPOTREBE...................

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATA....................................................................................................6.1. 6.2. 6.3. 6.4. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN............................................................... KALUPLJENJE......................................................................................................... PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA......................................................... PRIPREMANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA................................

1

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM......................................................... 6.6. UPOTREBA MIKROTOMA..................................................................................... 6.7. TEKOE PRI SJEENJU MIKROTOMOM......................................... 6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO....................................... 6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog ljepila........................................................... 6.9. RAZVLAENJE PARAFINSKIH PRESJEKA......................................... 6.10. DEPARAFINISANJE..............................................................................................

7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA........................................................... 8. SPECIFINE METODE PRIPREME CITOLOKIH PREPARATA...8.1. FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE ELIJE................................. 8.2. MACERACIJA........................................................................................................... 8.3. GLICERIN - ELATINSKI PREPARAT..................................................................

9. PRAKTINA UPOTREBA ELEKTROFOREZE............................9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK................................................................................ 9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK................................................................................ 9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA...................................................................

2

1. RAD U BIOLOKOJ LABORATORIJIPrilikom rada u biolokoj laboratoriji esto se koriste razliite hemikalije od kojih su neke dosta agresivne i nagrizaju materijale sa kojima dou u kontakt, izazivaju burne reakcije, ili su njihova isparenja tetna po zdravlje jer nagrizaju sluzokou usta, grla i nosa, mogu izazvati oteenje oiju itd. Neke hemikalije, kao to su npr. formalin, ksilol i druge imaju kancerogeno i teratogeno dejstvo, pa pri rukovanju sa njima treba biti posebno oprezan. Zbog svega ovoga se pri radu u biolokoj laboratoriji mora pridravati odreenih pravila.

1.1. OPTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI 1. Noenje radnog mantila smanjuje rizik kontaminacije odijela i raznoenje materijala izvan laboratorije. Time ujedno spreavamo prljanje i unitavanje odijela. 2. Pranje ruku se vri u toku rada prema potrebi, a na kraju rada je obavezno. 3. Ne preporuuje se rad sa ogrebotinama, a naroito ne sa otvorenim ranama na rukama. 4. U toku rada ne treba dodirivati oi, nos i usta. 5. Pri radu u laboratoriji nije dozvoljeno uzimati hranu, piti ni puiti. 6. Dugaka kosa treba biti svezana u rep da se ne bi spalila radom kraj plamenika ili piritusne lampe. 7. Radno mjesto se dezinfikuje odgovarajuim sredstvom kao to je 70% etanol ili 5% asepsol prije poetka i na kraju rada. 8. Nije poeljno pipetirati hemikalije ustima. Preporuuje se upotreba propipete. 9. Sa opasnim hemikalijama se radi u digestoru. Ako laboratorija ne posjeduje digestor, onda se obavezno radi kraj otvorenog prozora. 10. Upotrebljene pipete, epruvete i drugo sue treba odloiti u posebne posude sa dezinfekcionim sredstvom. 11.Po zavretku rada treba pospremiti i oistiti laboratoriju. 12. Oprema i hemikalije se ne smiju iznositi iz laboratorije.

1.2. LABORATORIJSKA OPREMA Da bi se omoguio normalan eksperimentalni rad svaka bioloka laboratorija treba posjedovati sledeu optu opremu: 1. Tehnika i analitika vaga 1. Vodeno kupatilo ureaj u kom se odrava destilovana voda na tano odreenoj temperaturi. Omoguuje izvoenje raliitih

3

biohemijskih, hemijskih i biolokih reakcija. 2. Sunica (minimum do 200C) ureaj za sterilizaciju razliitog, uglavnom staklenog posua (petrijevke, pipete, ae, menzure, erlenmajerice itd.). 3. Termostat (minimum do 44C) Za gajenje razliitih kultura (za klijanje sjemena biljaka, gajenje mikroorganizama itd.) neophodno je obezbijediti odreenu temperaturu to se postie u termostatima. Oni su najee metalni sa dvostrukim zidovima koji su obloeni nekim materijalom koji je slab provodnik toplote, npr. vatom. Izmeu zidova se nalazi voda ili vazduh, a zagrijavanje se vri grijaima. 4. Centrifuga (minimum do 5000 obrtaja u minuti) 5. Friider za uvanje razliitih hemikalija i materijala. 6. Mukalica ureaj za mijeanje rastvora. 7. Mikrotom za sjeenje tkiva prilikom pravljenja preparata. 8. Termometri (0-100C) 9. Eksikator za isuivanje u uslovima vakuuma. 10. Vakuum pumpa za filtraciju i obezbjeivanje vakuuma u eksikatoru. 11. Vrua ploa ureaj koji omoguuje zagrijavanje na tano odreenu temperaturu. 12. Magnetna mjealica 13. Spektrofotometar 14. pH-metar ureaj za odreivanje koncentracije vodonikovih jona u rastvoru. 15. Oksimetar ureaj za odreivanje koncentracije kiseonika u rastvoru. 16. Bunzenov plamenik - nastavak koji se instalira na plinsku bocu i slui za sterilizaciju plamenom. 17. piritusna lampa - takoe se koristi za sterilizaciju plamenom, u sluaju da laboratorija nema Bunzenov plamenik. 18. Set za bojenje niz povezanih posuda u kojima se vri bojenje preparata. 19. Destilator ureaj za proizvodnju destilovane vode. 20. Stalak za epruvete 21. Stalak za mikroskopske preparate 22. Propipeta gumeni nastavak koji se postavi na pipetu. Slui za uvlaenje tenosti u pipetu u onim sluajevima kada se ne preporuuje uvlaenje ustima, npr. ako su u pitanju opasne hemikalije sa tetnim isparenjima Naravno, pored ove, zavisno od specifinosti rada u laboratoriji, potreban je i niz drugih aparata. Ovde su pobrojani samo neki koji imaju najiru upotrebu.

1.3. LABORATORIJSKO SUE U biolokim laboratorijama se upotrebljava razliito stakleno sue izraeno od specijalnog stakla koje podnosi zagrijavanje na visoku temperaturu. 4

Epruvete su izraene od staklenih cijevi sa zaobljenim dnom i ravnim ivicama. Postoji nekoliko vrsta epruveta, ali se najee koriste epruvete duine 160-200 mm i prenika 16-20 mm. Petrijeve kutije se prave od stakla ili plastike. Imaju oblik spljotenog valjka i sastoje se iz dva dijela, poklopca koji ima neto vei prenik, i dna sa neto manjim prenikom, tako da nalijeu jedan u drugi. Najee se koriste petrijevke prenika 60 do 100 mm. Pipete su dugake, kalibrisane staklene cijevi koje su na donjem kraju izvuene u kapilarno suenje. Slue za odmjeravanje tenosti. Najee se upotrebljavaju pipete od 1, 5 i 10 ml. esto se upotrebljavaju i tzv. Pasterove pipete koje nisu graduisane. Erlenmajerove boce su stakleni sudovi u obliku kupe sa kraim ili duim grliem razliitog prenika. Njihova zapremina se kree od 10 do 5000 ml. Koriste se za pripremu i uvanje razliitih rastvora. Menzure su cilindrini stakleni sudovi sa ravnim dnom, a koriste se za odmjeravanje tenosti. Graduisane su, a zapremina im se kree od 10 do 2000 ml. ae su cilindrini stakleni sudovi ije ravno dno slui kao postolje. Krae su i ire od menzura.

1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH SUA

Pravilno pranje laboratorijskog posua predstavlja jedan od preduslova za uspjeno izvoenje eksperimenata. Sudovi se peru toplom vodom sa deterdentom, temeljno se ispiraju u mlazu tekue vode i potapaju se u hromsumpornu kiselinu u trajanju od 24 sata. Nakon toga se sudovi ispiraju u tekuoj vodi, ostavljaju u destilovanoj vodi 2-3h, a zatim se jo jednom ispiraju u destilovanoj vodi.

1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA

Za pripremu mikroskopskih preparata neophodna su ista predmetna i pokrovna stakalca. Stakalca koja su ranije koritena treba drati 2 sata u rastvoru pripremljenom od 100 dijelova sumporne kiseline, 50 dijelova kalijum dihromata i 1000 dijelova vode. Nakon toga ispiraju se vodom, kuhaju 20 minuta u 1% rastvoru NaOH i ispiraju destilovanom vodom. Zatim se potope u razblaenu hlorovodoninu kiselinu i ponovo se ispiraju destilovanom vodom. Ovako pripremljena stakalca se uvaju u 96% etilalkoholu. ak se i nova stakalca trebaju pripremiti prije prve upotrebe. Ona se kuhaju 10 minuta u 1% rastvoru NaOH, ispiraju se u destilovanoj vodi, potapaju u rablaenu hlorovodoninu kiselinu i ponovo ispiraju u destilovanoj vodi. Njihova istoa se moe provjeriti tako to se na suho stakalce stavi kapljica vode. Ako je stakalce isto kapljica e se 5

razliti, dok se na prljavom stakalcu formiraju kapljice.

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJAMikroskop je optiki instrument koji daje uvean lik malih objekata i njihovih detalja. Danas se koristi vie vrsta mikroskopa: svjetlosni, mikroskop sa tamnim poljem, faznokontrastni, fluorescentni, ultraljubiasti i elektronski. Budui da se u nastavi najvie koristi svjetlosni mikroskop, ovde e biti detaljnije opisan.

2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA

Postoje razliiti tipovi svjetlosnog mikroskopa, ali svi imaju nekoliko osnovnih dijelova koji se mogu podijeliti na mehanike i optike dijelove.

2.1.1. Mehaniki dijelovi

U mehanike dijelove mikroskopa spadaju: postolje, ruica, stoi sa mehanizmom za pomijeranje, tubus, kolijevka mikroskopa, zavrtanj kondenzora, makrometarski i mikrometarski zavrtanj. Stativ mikroskopa je napravljen od metala i u svom donjem dijelu je proiren, obino u obliku potkovice, u postolje (Slika 1a) na kome stoji mikroskop. Postolje je od tekog metala, tako da mikroskopu obezbjeuje stabilan poloaj. Kod novijih mikroskopa u njega je ugraen sistem za osvjetljenje. Postolje je preko nagibnog zgloba (Slika 1c) povezano sa gornjim dijelom stativa koji se zove ruica. Ruica (Slika b1) slui za prihvatanje, noenje i premijetanje mikroskopa i kao nosa drugih dijelova. Preko nagibnog zgloba mikroskop se iz vertikalnog dovodi u kosi poloaj, koji je esto povoljniji za rad Iznad nagibnog zgloba za stativ je privren stoi mikroskopa (Slika 1e). Na sredini stoia se nalazi otvor preko koga se postavlja preparat. Kroz otvor stoia prolaze svjetlosni zraci kojima se objekat koji posmatramo prosvjetljava. Stoi moe biti pokretan ili nepokretan. Ukoliko je pokretan pokree se pomou dva zavrtnja koji se nalaze na

6

ivici stoia, sa njegove lijeve i desne strane. Stoi se moe pokretati u svim pravcima i na taj nain je omogueno posmatrau da u vidnom polju mikroskopa, finim pomijeranjima, pronae odgovarajui dio preparata. Pokretan stoi je naroito koristan pri radu sa veim uveanjima koja zahtijevaju neznatna pomijeranja preparata. Tako mala pomijeranja gotovo je nemogue izvesti slobodnom rukom. Na nepokretnom stoiu preparat se pokree rukom sve dotle dok se lik objekta ne pojavi u vidnom polju mikroskopa. Na stoiu se nalaze dva metalna draa za preparat, koji su od velike koristi, ak i neophodni, ako se u toku rada mikroskop izvodi iz vertikalnog poloaja. Tubus (Slika 1d) je metalna cijev koja na gornjem kraju nosi okular, a na donjem, kod savremenih mikroskopa, pokretan revolver u kome se nalaze leita za objektive razliitog uveanja (Slika 1f). Okretanjem revolvera dovodimo objektiv eljenog uveanja u optiku osu mikroskopa. Objektiv je doveden u optiku osu mikroskopa onda kada metalno perce, privreno na stativu, upadne u zarez na revolveru koji se nalazi iza tog objektiva.

Tubus moe da bude postavljen vertikalno ili koso. Ukoliko je postavljen koso izmeu objektiva i okulara nalazi se prizma koja 7

prelama svjetlosne zrake i usmjerava ih u koso postavljen tubus. Tubus je sa stativom pokretno spojen preko kolijevke mikroskopa. Kolijevka mikroskopa je sistem zupanika koji se pokree pomou makrometarskog i mikrometarskog zavrtnja. Makrometarski zavrtanj (Slika 1i) slui za gruba pomijeranja tubusa na fokusno rastojanje pri kome je lik jasno vidljiv i upotrebljava se pri radu sa manjim uveanjima. Pomou mikrometarskog zavrtnja tubus se dovodi tano u 2. Objektiv Slika fokus. Mikrometarski zavrtanj (Slika 1j) se upotrebljava pri radu sa veim uveanjima. Zavrtanj kondenzora slui za podizanje i sputanje kondenzora, ime se regulie osvjetljenost preparata. 2.1.2. Optiki dijelovi

U optike dijelove mikroskopa spadaju okulari, objektivi i sistem za osvjetljavanje. Pomou optikih dijelova vri se osvjetljavanje i uveavanje lika objekta koji posmatramo. Sistem za osvjetljavanje se nalazi ispod stoia mikroskopa i sastoji se iz ogledala i kondenzora. Ogledalo zauzima nii poloaj i smjeteno je na pokretnoj osovini tako privreno u polukruni ram da se moe pokretati u svim pravcima (Slika 1k). Pokretljivost ogledala je veoma vana osobina, jer se zahvaljujui tome svjetlosni zraci, koji dopiru iz razliitih svjetlosnih izvora, mogu korisnije upotrijebiti u cilju osvjetljavanja preparata. Ogledalo je okruglo, na jednoj strani ravno, a na suprotnoj udubljeno. Pri korienju svjetlosti sa udaljenih svjetlosnih izvora (dnevna svjetlost) upotrebljava se ravna strana ogledala, a u sluaju da je svjetlosni izvor blizu (vjetaka svjetlost) upotrebljava se udubljena strana ogledala. Kondenzor se nalazi izmeu mikroskopskog stoia i ogledala (Slika 1l). Sagraen je iz vie soiva koja se nalaze u zajednikom prstenu. Kondenzor funkcionie kao sabirno soivo. Pomou njega se objekat osvjetljava irim svjetlosnim snopom nego to bi to bio inae sluaj kada bi svjetlost dolazila samo sa ogledala, to je od posebnog znaaja kada se radi sa velikim uveanjima. Drugim rijeima, objekat e biti prosvijetljen intenzivnijom svjetlou nego to bi bio u istim uslovima ako bi svjetlost dolazila samo sa ogledala. Kondenzor se moe sputati i podizati pomou zavrtnja (Slika 1m). Podizanjem kondenzora svjetlost se pojaava, a sputanjem se smanjuje. Neki mikroskopi imaju kondenzor tako montiran da se, osim u vertikalnom, moe pomijerati i u horizontalnom pravcu. U donjem dijelu kondenzora smjetena je iris-dijafragma (Slika 1n). Pomou nje se podeava koliina svjetlosti kojom se osvjetljava objekat koji posmatramo. Iris-dijafragma je sagraena od veeg broja polukrunih, elinih Ijuspica koje se, pomou jedne poluge, skupljaju ili ire i na taj nain stvaraju ui ili iri otvor za prolaz svjetlosti. Objektivi (Slika 1g) su manje ili vie sloeni sistemi centriranih soiva koja se nalaze u kratkom cilindru (SI. 2). Na svom gornjem dijelu cilindar ima navoje pomou kojih se uvre u leite na revolveru. Na 8

objektivu je urezana brojka koja oznaava koliko puta dati objektiv uveava lik posmatranog objekta. Soiva u objektivu su plankonveksna (ravnoispupena). Ravnom stranom su okrenuta objektu, a ispupenom prema oku. Od kvaliteta objektiva uglavnom zavisi i kvalitet lika objekta koji posmatramo. Objektiv daje stvaran, uvean i obrnut lik. Svaki objektiv karakterie njegova mo razdvajanja, fokusno rastojanje i uveanje. Slabiji objektivi imaju vee fokusno rastojanje: 50 do 60 mm, a jai 1 do 3 mm. Mo razdvajanja objektiva je njegova sposobnost da daje slike dve meusobno bliske take razdvojeno. U odnosu na nain upotrebe objektivi mogu biti suvi i imerzioni. Suvi objektivi su oni izmeu ijih se frontalnih soiva i preparata nalazi vazduh. (SIika 3 lijevo). To su objektivi manjih uveanja: 3,2x; 10x; 40x. Imerzioni objektivi su oni ije se frontalno soivo mora potopiti u kap tenosti (voda ili kedrovo ulje) koja se nalazi na preparatu iznad objekta koji posmatramo (SIika 3 desno). Imerzioni objektivi su veih uveanja (90x, 100x). .

Slika 3. ema presjeka suvog objektiva i preparata (lijevo) i imerzionog (desno). A - frontalno soivo objektiva B - pokrovno stakalce C predmetno stakalce Kvalitet mikroskopske slike zavisi, izmeu ostalog, i od koliine svjetlosnih zraka koji ulaze u objektiv. Upotrebom imerzionih objektiva, u odnosu na suve, pri ostalim jednakim uslovima, postie se ulazak veeg broja svjetlosnih zraka u objektiv. Naime, svjetlosni zraci pri upotrebi suvih objektiva prolaze kroz sistem: stakla (predmetna ploa) - vazduh - stakla (frontalno soivo objektiva). Usljed razliitog indeksa prelamanja pojedinih sredina (stakla: 1,53; vazduh: 1:0) dolazi do znatnog rasipanja svjetlosnih zraka pa manja koliina svjetlosti ulazi u objektiv (Slika 3 lijevo) Pri upotrebi imerzionog objektiva svjetlosni zraci prolaze kroz sistem: staklo (predmetna ploa) - tenost (kedrovo ulje) - staklo (frontalno soivo imerzionog objektiva). Poto je indeks prelamanja stakla 1,53 a kedrovog ulja 1,51, svjetlosni zraci prolaze kroz sredine priblino istih indeksa prelamanja, te je rasipanje znatno umanjeno. Zbog toga u objektiv ulazi mnogo vie korisnih svjetlosnih zraka (Slika 3 desno) nego to je to sluaj kod suvih objektiva, a time se u znatnoj mjeri poboljava i kvalitet mikroskopske slike. Treba napomenuti da su imerzioni objektivi specijalno graeni pa se zato samo oni mogu utapati

9

u kap tenosti na preparatu. Osim uljanih imerzionih objektiva postoje i takvi koji se utapaju u kapljicu vode. Neto jednostavnije od objektiva sagraeni su okulari. Njih moemo uporediti sa lupom. Okulari se nalaze na gornjem dijelu tubusa (Slika 1h) i na svakom je upisan broj (7x, 10x, 15x) koji oznaava njegovu mo uveanja. Mikroskopi koji imaju jedan okular se nazivaju monokularni, a oni koji imaju dva okulara binokularni. Postoje i mikroskopi sa dvostrukim okularima koji su namjeteni u horizontalnoj cijevi tako da dvije osobe mogu istovremeno posmatrati preparat.

2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA

Rezolucija ili mo razdvajanja mikroskopa moe da se formulie na sledei nain: to je veliina najmanjeg dijametra estice koju jasno vidimo ili najmanje rastojanje izmeu dve linije koje moemo odvojeno vidjeti u mikroskopu. Mo razdvajanja zavisi od numerike aperture objektiva, talasne duine svjetlosti i ugla pod kojim svjetlost pada. Ukoliko je numerika apertura vea, talasna duina svjetlosti manja i osvjetljenje koso, mo razdvajanja je bolja. Numerika apertura je mjera za mo razdvajanja objektiva i oznaena je na samom objektivu. Njene vrijednosti se kreu od 0,11 do 1,3. Razdvojna mo objektiva se izraunava tako to se talasna duina svjetlosti pri kojoj posmatramo podijeli sa vrijednou numerike aperture. Npr. ako je talasna duina svjetlosti 560 nm, a numerika apertura 1, razdvojna mo je 560 nm. To znai da taj objektiv razdvaja i ini vidljivim dva objekta koja su na meusobnoj udaljenosti od 560 nm. Jedna od osnovnih karakteristika mikroskopa je njegovo opte uveanje. Opte uveanje mikroskopa (Um) odreuje se kao proizvod uveanja objektiva (Uob) i uveanja okulara (Uok), a izraava se formulom: Um= Uob x Uok Ako objektiv uveava lik posmatranog objekta 90x, a okular 15x, tada e opte uveanje mikroskopa iznositi 1350x. Upotrebom okulara veeg uveanja (20x) nee se dobiti bolji kvalitet slike posmatranog objekta, jer smo preli granicu tzv. korisnog uveanja mikroskopa. Izraunato je da korisno uveanje mikroskopa nije vee od 1300 do 1450 puta. Postavlja se pitanje kako izabrati okular maksimalnog uveanja u okviru korisnog uveanja mikroskopa. Pretpostavimo da radimo sa objektivom 40x iji je aperturni ugao 0,65. Korisno uveanje je 1000 x 0,65 = 650x. Kada korisno uveanje podijelimo uveanjem objektiva koji koristimo (40x) dobiemo maksimalno korisno uveanje okulara, u datom primjeru 16x. Korienje jaih okulara negativno bi uticalo na kvalitet lika, jer se javlja difrakcija svetlosti.

10

2.3. UVANJE MIKROSKOPA

Pri radu sa mikroskopom posebnu panju treba obratiti na prenoenje mikroskopa. Mikroskop se iskljuivo prenosi ili pomijera na taj nain to se jednom rukom dri za ruicu, a drugom za postolje. Kao to je ve ranije napomenuto od kvaliteta optikih dijelova mikroskopa zavisi i kvalitet lika objekta koji dobijamo, pa prema tome okulare i objektive treba posebno uvati i njegovati. Njihova soiva treba da su uvijek ista. Na poetku i na kraju rada, a po potrebi i u toku rada, soiva treba oistiti mekom, i za tu svrhu specijalno napravljenom etkicom ili mekom krpom koja ne ostavlja tragove. Ukoliko se praina nalazi sa unutranje strane soiva ono se odvrne i na isti nain oisti, no ovu radnju bolje je prepustiti specijalizovanim radionicama. Soiva se nikad ne dodiruju prstima, niti se sa njih praina otklanja duvanjem. Pri mikroskopiranju se esto na metalnim dijelovima mikroskopa kondenzuje vodena para (usljed disanja) koju treba ukloniti brisanjem. Po zavrenom mikroskopiranju makrometarskim zavrtnjem podii tubus mikroskopa i ukloniti preparat, pokretanjem revolvera u optiku osu dovesti najmanji objektiv, a sve mehanike i optike dijelove obrisati i mikroskop vratiti u kutiju. Mikroskop treba uvati i kada se ne upotrebljava i to naroito od praine, toplote, neposrednog djelovanja suneve svjetlosti, vlage i isparenja raznih hemikalija.

2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Opte napomene. Pri mikroskopiranju se mogu koristiti dnevna difuzna ili vjetaka svjetlost. Iako je dnevna svjetlost veoma prijatna za rad, pri duoj upotrebi mikroskopa prednost ima vjetaka svjetlost. Visina stola i stolice treba da bude takva da posmatra moe due vremena udobno i bez naprezanja da radi. Pred poetak rada mikroskop se izvadi iz kutije, postavi na radno mjesto i mekom krpom paljivo oisti od praine. Poslije zavrenog mikroskopiranja preparat se skida sa stoia, u osu se postavlja najmanji objektiv, mikroskop se obrie i paljivo, drei ga jednom rukom za ruicu a drugom za postolje, stavlja u kutiju. Uzimanje i prenoenje mikroskopa vri se iskljuivo dranjem za ruicu i postolje istovremeno. Mikroskop se postavlja tako da ogledalo bude uvijek okrenuto svjetlosnom izvoru, a ruica mikroskopa posmatrau. Dovoenje objektiva u optiku osu mikroskopa. - Kada

11

mikroskop stavimo na radno mjesto dovodimo objektiv najmanjeg uveanja u optiku osu mikroskopa. Objektiv se dovodi u optiku osu mikroskopa okretanjem pokretnog dijela revolvera. Na revolveru se, prema svakom objektivu, nalazi ispupenje sa zarezom. Kada, okreui revolver, u zarez na njemu upadne perce koje se nalazi na fiksiranom dijelu revolvera ispod tubusa, uje se karakteristian zvuk, to je znak da se dati objektiv nalazi u optikoj osi mikroskopa. Traenje vidnog polja mikroskopa. Kada smo objektiv najmanjeg uveanja postavili u optiku osu mikroskopa pristupamo traenju vidnog polja. Mikroskopira se uvijek lijevim okom, a desno je otvoreno. Ovo je naroito vano pri crtanju preparata. Ma koliko tekoa takav nain rada u poetku bude izazivao, vremenom se uvjeba. Prema tome, jedno od pravila pri mikroskopiranju je da su oba oka otvorena. Takoe treba istai da se mikroskopira bez naoara, osim ako je posmatra jako kratkovid. Traenje vidnog polja vri se na sledei nain: gledajui kroz okular okreemo ogledalo prema svjetlosnom izvoru sve dotle dok ne ugledamo ravnomjerno kruno vidno polje mikroskopa. Pronalaskom vidnog polja mikroskop je pripremljen za rad pa se vri fokusiranje. Fokusiranje. Na stoi mikroskopa staviti preparat i pristupiti traenju jasnog lika objekta koji elimo da prouavamo. Preparat se stavlja na stoi tako da se objekat naeg ispitivanja nalazi preko otvora stoia i, od prilike, ispod soiva objektiva. Gledajui kroz okular paljivo pomijeramo preparat sve dok se u vidnom polju ne pojavi sijenka. Tada preparat vie ne pomijeramo ve pomou makrometarskog zavrtnja paljivo podiemo tubus sve dotle dok ne ugledamo jasan lik objekta koji posmatramo. Pri ovome tzv. malom uveanju (ono se kree od 8x do 10x) pregledamo preparat, uoimo njegove osnovne karakteristike, nacrtamo emu i izaberemo najpogodnije mjesto za detaljnije prouavanje grae pri veem uveanju. Zatim, ne pomijerajui preparat, okretanjem revolvera dovodimo u optiku osu mikroskopa objektiv veeg uveanja (40x, 45x). Pomou mikrometarskog zavrtnja izotrimo lik objekta koji posmatramo. Jedno od osnovnih pravila fokusiranja je da se tubus pri radu sa malim uveanjem prvo spusti na 0,5 cm od preparata, to se posmatra sa strane, a zatim gledajui kroz okular, tubus se podie sve dok se ne pojavi lik objekta u vidnom polju mikroskopa. Fokusira se uvijek odozdo na gore. Pokretanje tubusa pri upotrebi objektiva manjih uveanja vri se uvijek makrametarskim zavrtnjem, a pri radu sa objektivima veih uveanja iskljuivo se koristi mikrometarski zavrtanj za fokusiranje. Pri upotrebi imerzionih objektiva postupak je sledei: 1. pomou objektiva manjeg uveanja pronai lik objekta 2. podii tubus toliko da donja ivica objektiva bude udaljena oko 2 cm od preparata 3. na preparat staviti kap imerzionog ulja (kedrovo ulje) 4. okretanjem revolvera dovesti u optiku osu mikroskopa imerzioni

12

Slika 4. Okular mikrometar

Slika 5. Objektiv mikrometar

5. 6. 7. 8.

objektiv gledajui sa strane, polako i veoma paliivo sputati tubus sve dok se soivo imerzionog objektiva ne utopi u kedrovo ulje sputati objektiv sve dok ne doe u neposrednu blizinu preparata, a zatim fokusirati gledajui kroz okular poslije rada imerzioni objektiv odmah oistiti od ulja mekom lanenom krpom koju prethodno treba Iako natopiti ksilolom, ili jo bolje, medicinskim benzinom budui da ksilol nagriza soiva objektiva. Za ienje se nikada ne upotrebljava alkohol! Poslije ienja jo jednom obrisati objektiv mekom i suvom krpom i ostaviti ga na mjesto.

2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA

Veliina elije, odreene elijske komponente ili itavog organizma (ako je rije o organizmima mikroskopskih razmjera) se moe odrediti pomou okular-mikrometra koji se postavlja na svjetlosni mikroskop. Okular-mikrometar (Slika 4) je obino okruglo staklo koje se moe umetnuti u okular mikroskopa. Na njemu se nalazi skala koja je najee duine 5,0 mm i izdijeljena je na 50 podioka. Vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru se odreuje pomou objektivmikrometra. Objektiv-mikrometar (Slika 5) ima izgled predmetnog stakalca na kom je ugraena skala duine 1,0 mm, a podijeljena je na 100 dijelova. Prema tome, rastojanje izmeu dva podioka iznosi 0,01 mm ili 10,0 mikrometara. Vrijednost podioka na okularnom mikrometru se odreuje tako to se okularni mikrometar postavi u okular, a objektivni na stoi mikroskopa. Podeavanje objektivnog mikrometra se vri tako to se prva lijeva crta na njemu (oznaena sa 0) poklopi sa prvom lijevom crtom na okular-mikrometru (takoe oznaena sa 0). Zatim se skale prate udesno dok se ne pronae mjesto gdje se poklapa podiok objektiv sa podiokom okular-mikrometra. Izbroji se broj podioka i poto se zna da vrijednost jednog podioka na objektiv-mikrometru iznosi 0,01 mm, izrauna se vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru. Na primjer, ako se poklopi etvrti podiok na objektiv-mikrometru i esnaesti podiok na okular-mikrometru, vrijednost jednog podioka okular mikrometra iznosi: 0,01x4/16 = 0,0025 mm ili 2,5 mikrometara. Kada se dobije vrijednost jednog podioka na okular mikrometru na stoi mikroskopa se stavi preparat i izmjeri veliina posmatranog objekta. Vrijednost podioka se odreuje za svaku kombinaciju objektiva i okulara.

13

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

esto se u biolokim laboratorijama pripremaju privremeni mikroskopski preparati koji se koriste kratak vremenski period, nakon ega dolazi do njihovog isuivanja i deformacije posmatranog materijala.

3.1. METODE I TEHNIKE

Pod pojmom mikroskopske tehnike podrazumijeva se opis postupaka koji je primijenjen, kako pri neposrednom posmatranju ivog materijala, tako i metode pripremanja privremenih i trajnih preparata. Obradu materijala i pravljenje mikroskopskih preparata mogue je podijeliti u nekoliko radnih faza: ubijanje i fiksiranje, ispiranje, sijeenje (slobodnom rukom ili mikrotomom), bojenje, inkluzija u materiju u kojoj moe da se sauva due vremena. Sve one zajedno ine jedinstven postupak iji je krajnji cilj dobijanje privremenog ili trajnog mikroskopskog preparata. Prije nego to se pristupi pravljenju preparata neophodno je izvriti prethodna orijentaciona posmatranja na ivom materijalu u cilju provjeravanja podobnosti materijala u vezi sa postavljenim zadatkom, odreivanja najpogodnijeg fiksativa i ustanovljavanja karaktera tkiva od kojih je organ sagraen, jer od svega toga zavisi primjena odgovarajuih mikrotehnikih postupaka. Osim toga, prouavanja na ivom materijalu sama po sebi su veoma znaajna, esto i nezamjenjiva (na primjer: kretanja citoplazme), i zato, kad god je to mogue, treba vriti paralelno prouavanje na ivom i fiksiranom materijalu. Ove dve metode se uzajamno dopunjuju, a nikako jedna drugu ne iskljuuju.

3.2. SKVO PREPARAT

U savremenoj mikroskopskoj tehnici, posebno pri prouavanju procesa elijske diobe, odreivanju broja hromozoma i analizi kariotipova, primjenjuje se tehnika pravljenja skvo preparata (engleski: squash - gnjeiti, spljeskati). Skvo preparati su po svome karakteru najee privremeni, ali i oni se mogu posebnim postupkom prevesti u trajne. Osnovna karakteristika skvos preparata je da se materijal 14

poslije fiksiranja, ispiranja i bojenja macerira i na mikroskopu posmatra i analizira ustvari macerirano tkivo. S obzirom na iroku primjenu ove metode postoji niz specifinih postupaka u svim navedenim fazama rada. 3.2.1. Opti princip pripremanja skvo preparata Skvo preparati se prave od mladih biljnih organa ije se elije nalaze u fazi intenzivne deobe (vrhovi korjena, mladi pranici, mladi koleoptili i mladi listovi). Materijal se esto prije fiksiranja mora jo i specijalno obraditi, posebno ako se javljaju tekoe pri brojanju hromozoma. Najei reaktivi koji se u tu svrhu upotrebljavaju su hloralhidrat, kolhicin, paradihlorbenzol, 8-hidroksihinolin i u poslednje vrijeme enzimi (citaza). Pri radu sa ovim reaktivima nuno je zatititi ruke gumenim rukavicama. . Hloralhidrat sa koristi u vidu 0,3 do 1 % vodenog rastvora. U ovom reaktivu materijal se dri 1 sat, a zatim se isto toliko dugo ispira u vodovodnoj vodi i jo 2 do 4 sata ostavlja u vlanoj komori, pa tek onda fiksira. Hloralhidrat se koristi u cilju postizanja skraivanja hromozoma. . Prije fiksiranja materijal, na kome elimo da ispitujemo broj, raspored i grau hromozoma, obrauje se 0,01 - 0,05% rastvorom kolhicina u trajanju od 2 sata. Zasien rastvor paradihlorbenzola se takoe koristi kao sredstvo u prethodnoj obradi vrhova korjenia. Zasien rastvor dobija se rastvaranjem 5 do 10 grama kristala paradihlorbenzola u 500 ml destilovane vode. Ovaj rastvor se u zatvorenoj posudi ostavlja u termostatu 10 do 12 sati na temperaturi od 60C. U ovako pripremljenom rastvoru materijal sa dri 2 do 3 sata prije fiksiranja i to na temperaturi izmedu 12 i 16C. 8-hidroksihinolin se upotrebljava kao 0,002 M rastvor pri temperaturi od 10 do 14C. Materijal u njemu provodi 3 sata i poslije ispiranja u vodovodnoj vodi se fiksira. Za skvo preparate materijal se najee fiksira u glacijalnoj siretnoj kiselini i apsolutnom alkoholu u odnosu 3:1 ili u fiksativu Karnoa. Vrijeme koje materijal provodi u fiksativu odreeno je izborom fiksativa i karakteristikama samog materijala. Tako na primjer u fiksativu Karnoa materijal ostaje 2 do 12 sati. U zavisnosti od prirode materijala, u navedenim granicama, odreuje se vrijeme fiksiranja. Materijal na kome elimo da brojimo hromozome fiksira se na niim temperaturama koje se kreu izmedu +2 i +3C. Poslije fiksiranja objekti se ispiraju u 70% alkoholu. U ovom alkoholu materijal moe ili da se konzervira iIi se iz njega odmah dalje sprovodi. Objekti se poslije ispiranja maceriraju. Maceriranje se obavlja na vie naina: prokuhavanjem u boji, 45% glacijalnom kiselinom, 40-45% propionskom kiselinom, u 1 n sonoj kiselini. Sledea faza u pravljenju skvo preparata je bojenje. Za bojenje 15

se koristi vie boja: acetokarmin, acetorsein, acetolakmoid i metilensko plavo. Pripremanje boja. Acetokarmin. 1 do 2 gr karmina rastvoriti u 45 ml glacijalne siretne kiseline i 55 ml destilovane vode. Rastvor boje uparavati 30 do 60 minuta. Kada se ohladi tamno crveni rastvor karmina se profiltrira i ostavlja u dobro zatvorenoj posudi sve do upotrebe. Acetorsein. 1 gr orseina rastvoriti u 45 ml vrele siretne kiseline i ostaviti da se ohladi. Kada se rastvor ohladi dodati 55 ml destilovane vode, dobro izmijeati, profiltrirati i boja je spremna za upotrebu. Acetolakmoid. 2 gr lakmoida rastvoriti u 100 ml 45% siretne kiseline i uparavati do suve.supstance (oko 2 sata). Kada se zavri uparavanje, ponovo dodati siretnu kiselinu do nivoa zapremine na poetku uparavanja. Prije upotrebe boja se filtrira. Metilensko plavo. 100 do 500 mg metilenskog plavog rastvoriti u 100 ml destilovane vode. Poslije filtriranja boja se moe koristiti. Iz boje se materijal prenosi na predmetno stakalce u kap 45% siretne kiseline iIi u hloralhidrat (5 gr hloralhidrata rastvoriti u 2 ml destilovane vode), prekriva se pokrovnim stakalcem i pritie. Pritiskanje se vri preko filter papira, najbolje obinom gumicom za brisanje. Pritisak treba da bude takve jaine da se pod njegovim dejstvom tkiva razdvoje na pojedinane elije, a da se pri tome ne razbije stakalce. Na ovaj nain napravljen je privremeni skvo preparat. U cilju jasnijeg sagledavanja pravljenja skvo preparata naveemo jednu od veeg broja ema koje se koriste u mikroskopskoj tehnici: fiksiranje: glacijalna siretna kiselina - apsolutni alkohol (3:1) u trajanu od 2 sata ispiranje: u 70% alkoholu (sve dok se osjea miris siretne kiseline) u vodi maceracija: u 1n sonoj kiselini na 60C nekoliko sekundi ili minuta, ili samo prokuhavanje u boji bojenje: bojenje u acetokarminu, acetorseinu i acetolakmoidu traje 3 do 5 minuta. Pri bojenju se materijal zagrijava. Kada se maceriranje vri u boji onda ona treba vie puta da prokljua, a to se postie primicanjem i odmicanjem epruvete plamenu piritusne lampe. Skvo preparat: materijal se prenosi na predmetno staklo u kap 45% siretne kiseline iIi hloralhidrata, pokriva se pokrovnim staklom, pritie i spreman je za mikroskopsku analizu.

Od privremenih, mogue je posebnim postupkom dobiti trajan skvo preparat. Jedan od naina za pravljenje takvih preparata predloili su K on e r i i Fer a j I d, a sastoji se u sledeem: 16

privremeni skvo preparat postavlja se na povrinu pareta suvog leda 1 do 1,5 minuta. Zatim se nekim instrumentom udalji pokrovno stakalce, a na predmetnom ostaje zalijepljen materijal. Ovako pripremljen preparat dalje se sprovodi kroz 96% alkohol, apsolutni alkohol, apsolutni alkohol-ksilol u odnosu 1: 1, ksilol i na kraju se preko materijala stavlja kanada balzam i pokriva se istim pokrovnim stakalcem. U svakom od navedenih agenasa preparati ostaju 2 do 5 minuta.

3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM IZ USTA

Budui da su u ustima stalno prisutne rastvorene hranjive materije i sitni komadii hrane, kao i stabilni uslovi vlanosti i temperature, usna upljina predstavlja veoma povoljno stanite za rast razliitih vrsta mikrooorganizama. Tu se mogu nai brojne bakterije iz rodova Streptococcus, Micrococcus, Staphylococcus, protozoe kao to je Entamoeba gingivalis, gljivice Candida, Aspergilus, Penicillium, Saccharomyces itd. Za pripremu preparata sa mikroorganizmima iz usta materijal se moe uzeti struganjem plaka sa povrine zuba, sa povrine desni, sa sluzokoe obraza itd. Budui da se na svakom od ovih mikrostanita razlikuju uslovi ivota, i mikroorganizmi koji ih nastanjuju e biti razliiti. Takoe, blagim struganjem akalicom sluzokoe obraza moe se dobiti materijal za posmatranje elija sluznice obraza. MATERIJAL predmetno stakalce, Bunzenov plamenik ili piritusna lampa, vata, 70% alkohol, sterilna akalica, bakterioloka eza, marker, tipaljka (nije obavezna)

POSTUPAK 1. Sterilisati radnu povrinu 70% alkoholom, uzeti isto stakalce i oznaiti ga markerom. 2. Flambirati ezu na plamenu do usijanja, saekati da se ohladi i prenijeti petljom eze dvije kapljice vode na sredinu predmetnog stakalca. 3. Uzeti sterilnu akalicu i njom zahvatiti malu koliinu materijala koji se nalazi izmeu zuba. 4. Zahvaeni materijal prenijeti u kap vode na stakalcu, dispergovati ga i napraviti razmaz. 5. Iskoritenu akalicu baciti u kantu za smee. 17

6. Ostaviti preparat da se osui, a zatim ga fiksirati na plameniku. 7. Da bi se mikroorganizmi iz usta mogli lake uoiti poeljno ih je obojiti afraninom ili kristal violet bojom. Potrebno je preliti razmaz jednom od ovih boja i saekati 30 sekundi da djeluje. 8. Zatim se boja izlije i ispere destilovanom vodom. 9. Preparat osuiti na vazduhu ili ga prisloniti na filter papir. Nikako se ne smije brisati filter papirom! 10. Ovako pripremljen preparat se posmatra pod imerzionim objektivom. Imerzioni objektiv ima veu mo uveanja od klasinog objektiva. Na preparat se stavi kapljica kedrovog ulja u koju se zatim uranja objektiv. Izotravanje slike se vri mikrovijkom da se ne bi slomilo stakalce. Radi lakeg uoavanja mikroorganizama potrebno je da osvjetljenje preparata bude maksimalno i kondenzor mikroskopa sputen. Ako je preparat dobro pripremljen na njemu se mogu uoiti mikroorganizmi razliitih oblika.

3.4. PREPARAT VISEA KAP

Za prouavanje ivih elija fitoplanktona, zooplanktona i drugih mikro-organizama, tj. njihovog razmnoavanja, pokretljivosti, sporulacije itd, kao i za izolaciju mikrooorganizama, koristi se preparat visea kap . Za pripremu ovakvih preparata potrebna su specijalna predmetna stakalca koja imaju udubljenje u sredini. POSTUPAK 1. Oko udubljenja predmetnog stakalca namazati tanak sloj vazelina (Slika 6a). 2. Na centar pokrovnog stakalca nanijeti suspenziju mikroorganizama. Ako se mikroorganizmi nanose iz tene kulture onda se samo sterilnom ezom uzme kap kulture i postavi na stakalce (Slika 6b). Ako se mikroorganizmi uzimaju sa vrste podloge onda se na pokrovno stakalce prvo stavi kap fiziolokog rastvora, a zatim se sterilnom ezom zahvati malo kulture i razmuti u nanesenoj kapljici. Budui da se neobojeni mikroorganizmi obino veoma slabo vide pod svjetlosnim mikroskopom, esto je neopho-dno na pokrovno stakalce dodati i kap metilenskog plavog. Boja mora biti razblaena 10 000 puta da ne bi ubila mikroorganizme. Metilensko plavo se priprema tako to se rastvori 0,3 g boje u 30,0 ml 96% etanola i doda se 100 ml destilovane vode. Ovako pripremljenu boju treba razblaiti 10 000 puta mijeanjem 0,01 ml boje i 100 ml destilovane vode. Kap razblaenog metilensko plavog se izmijea sa suspenzijom mikroorganizama na pokrovnom stakalcu. 3. Predmetno stakalce okrenuti i pritisnuti na pokrovno stakalce tako da kap

18

sa kulturom mikroorganizama ostane u centru udubljenja (Slika 6c). 4. Zatim predmetno stakalce paljivo okrenuti tako da kap sa kulturom ostane visiti na pokrovnom stakalcu iznad udubljenja predmetnog stakalca. 5. Pritisnuti ivice pokrovnog stakalca da se dobro zalijepe za vazelin (Slika 6d). 6. Ovako pripremljen preparat posmatrati pod velikim uveanjem mikroskopa ili u imerziji. Posmatra se ivica kapljice u zatamnjenom vidnom polju.

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH PREPARATAJednom pripremljen privremeni preparat se moe koristiti samo kratak vremenski period, budui da veoma brzo dolazi do njegovog isuivanja i deformisanja posmatranog materijala. Da bi preparat bio upotrebljiv dui vremenski period, pa i nekoliko godina, potrebno je primijeniti nimalo jednostavan niz postupaka za pripremu trajnih preparata.

4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE

Prva i veoma vana faza u obradi materijala jeste ubijanje i fiksiranje. Ubijanje i fiksiranje materijaia obino se vri istim agensima. Cilj fiksiranja je ne samo da se ubije objekat, ve da se brzim i ravnomjernim prodiranjem, i to u to kraem vremenu, prekinu ivotni procesi, a da se pri tome gotovo nita, ili to je mogue manje izmijeni objekat, tako da ovaj i kasnije pokazuje u najtananijim detaljima istu grau koju je imao dok je bio iv. Jedan od osnovnih preduslova uspjenog fiksiranja je stanje samog materijala i zato ga uvijek treba fiksirati dok je jo svje. Najbolje je da se ova faza pripremanja preparata vri odmah nakon to je uzet materijal (npr. ako je rije o biljnom materijalu na samom mjestu gdje biljka raste). Uspjeh fiksiranja zavisi jo i od brzine prodiranja fiksativa, a ona opet zavisi od prirode i veliine materijala koji se fiksira. Sitniji objekti fiksiraju se 19

cijeli, a krupniji (u sluaju biljnog materijala korijen, stablo, list itd.) se sijeku na manje dijelove veliine od 0,5 do 3,0 cm. Pri sijeenju krupnijih biljnih organa na manje dijelove vodi se rauna o orijentaciji. Tako na primjer cilindrini organi se sijeku popreno, a list normalno na centralni nerv. Fiksiranje se vri u odgovarajuim staklenim sudovima kao to su: epruvete, teglice, mjerni sudovi i slino. Poto se sastav fiksativa tokom vremena mijenja potrebno je pri fiksiranju koristiti znatno veu koliinu fiksativa u odnosu na zapreminu objekta koji preparujemo. Jednom upotrebljen fiksativ vie se ne upotrebljava. Ako materijal due vremena stoji u nekom fiksativu, fiksativ treba povremeno zamijeniti svjeim. Materijal u koji fiksativ prodire pravilno, a to znai brzo i ravnomjerno, ubrzo pada na dno. Da bi sa donje strane objekta fiksativ i dalje ravnomjerno prodirao, na dno suda u kome se vri fiksiranje stavlja se vata ili filter papir. Moe se desiti da iako su sve pripremne radnje dobro sprovedene neki objekti ne potonu, ve ostaju na povrini. Jedan od uzroka ove pojave moe da bude sama priroda materijala, odnosno da je bogat intercelularima koji su puni vazduha. Ukoliko ustanovimo da materijal ne tone zato to je ispunjen vazduhom, treba na posudu u kojoj se vri fiksiranje pripojiti vakuum pumpu koja e svojim radom odstraniti nepoeljan vazduh i omoguiti prodiranje fiksativa u sve dijelove materijala. U sud sa fiksativom, pored materijala koji se obrauje, stavlja se cedulja (etiketa) veliine 1-1,5 x 3 cm na kojoj su ispisani neophodni podaci o objektu: ime vrste, datum i mjesto uzimanja materijala, naziv organa koji se preparuje itd. Za etiketiranje se upotrebljava vri bijeli papir, a na njemu se podaci ispisuju iskljuivo obinom grafitnom olovkom. 4.1.1. Fiksativi koji se najee upotrebljavaju 95% etil alkohol 95% etil alkohol upotrebljava se kao fiksativ samo za materijal koji e se u daljem postupku sijei rukom pomou ileta. Ovaj fiksativ se ne preporuuje za materijal koji e biti podvrgnut finijim analizama, jer izaziva kontrakciju citaplazme. Da bi se izbjegla kontrakcija citoplazme, a iskoristila dobra svojstva alkohola, upotrebljavaju se fiksativi koji u sebi sadre glacijalnu siretnu kiselinu. Fiksativ Karnoa (Carnoy) Priprema se po sledeoj recepturi: Apsolutni alkohol Hloroform 6 ml 3 ml

20

Glacijalna siretna kiselina

1 ml

Ovaj fiksativ brzo prodire. Materijal se u njemu fiksira 6 do 12 sati, a moe i krae. Vrijeme fiksiranja zavisi od veliine i prirode materijala. Tako na primjer za vrhove korjena crnog luka dovoljno je fiksiranje od 10 do 15 minuta. Poslije fiksiranja materijal se ispira u apsolutnom alkoholu sve dok se osjea miris siretne kiseline. Ukoliko se u daljem postupku ne primjenjuje parafinska metoda, materijal se moe uvati (konzervira se) u 80% etil alkaholu. Fiksativ Karnoa nalazi iroku primjenu u citolokim i embriolokim istraivanjima. Farmerov fiksativ Priprema se po sledeoj recepturi: Apsolutni alkahol Glacijalna siretna kiselina 6 ml 1 ml

Farmerov fiksativ se upotrebljava na isti nain i u iste svrhe kao i fiksativ Karnoa.

Alkohol-formalin Priprema se po sledeoj recepturi: 50% etil alkahol 35 ili 40% prodajni formalin 100 ml 5 ml

Alkohol-formalin je veoma pogodan za fiksiranje materijala na terenu, jer istovremeno vri i konzervaciju, tako da u njemu objekti mogu da ostanu do konane obrade. Kao fiksativ koristi se pri anatomskim istraivanjima, a moe da se upotrebi i za fiksiranje njenijeg materijala. Formalin Priprema se po sledeoj recepturi:

21

35 ili 40% prodajni formalin voda

2-4-6 ml 98-96-94 ml

2-4% formalin je dobar fiksativ za alge i gljive. Materijal se u fiksativu dri do obrade. Prije obrade materijal se ispira vodom, jer pare formalina, koje se iz neispranog materijala odvajaju, nadrauju oi i sluzne pokoice. Fiksativ Navaina a) Jai rastvor: 1 % hromna kiselina 40% (prodajni) formalin Glacijalna siretna kiselina b) Slabiji rastvor: 1 % hromna kiselina Destilovana voda 40% (prodajni) formalin Glacijalna siretna kiselina 15 ml 17 ml 2 ml 1 ml 10 ml 4 ml 1 ml

1 % rastvor hromne kiseline moe se napraviti u veoj koliini, a kompletan fiksativ neposredno prije upotrebe. Materijal se fiksira 24 sata, zatim se paljivo i dugo ispira tekuom vodom (ak i do 24 sata). Zatim se vri dehidratacija kroz seriju alkohola sve vee koncentracije. U 80% alkoholu materijal moe da se konzervira ili se postupak nastavlja dalje parafinskom metodom, koja e detaljno biti opisana u daljem tekstu. Ovaj fiksativ pogodan je za finija anatomska i embrioloka istraivanja. Fiksativ Buena (Buin) 40% prodajni formalin ....................................................................... 25 ml Pikrinska kiselina (zasien rastvor u 70% etil alkoholu) . . . . . . . . . . 75 ml Glacijalna siretna kiselina .................................................................5 ml Fiksiranje traje 24 sata. Ispiranje se vri u 70% alkoholu sve dotle 22

dok iz materijala izlazi uta boja. Dehidrataciju obaviti kroz seriju alkohola sve vee koncentracije. U 80% alkoholu materijal se moe konzervirati, ili se dalje sprovodi po principima parafinske metode. Upotrebljava se u iste svrhe kao i fiksativ Navaina. Fiksativ FAA (formalin-acetoacid-etil alkohol) Priprema se na sledei nain: 70% etil alkohol 40% (prodajni) formalin Glacijalna siretna kiselina 90 ml 5 ml 5 ml

U ovom fiksativu materijal ostaje 24 sata, a zatim se ispira u 70% alkoholu 1 sat. Dehidratacija i konzerviranje vre se na isti nain kao i poslije upotrebe Navainovog i Buenovog fiksativa. Vrlo je pogodan fiksativ za citoloka istraivanja.

4.1.2. Fizika fiksacija

Ako se pripremaju preparati sa mikroorganizmima mnogo je jednostavnije izvriti fiksaciju fizikim, umjesto hemijskim putem. Fiziki se preparati fiksiraju toplotom tako to se suvi razmaz brzo prenese iznad plamena 5 do 6 puta, vodei rauna da materijal na predmetnom stakalcu bude okrenut na gore. Treba napomenuti da se na ovaj nain usmruju samo vegetativni oblici mikroorganizama, dok sporegeni opstaju, pa treba biti posebno paljiv pri rukovanju sa patogenim materijalom.

4.2. ISPIRANJE MATERIJALA

U fiksativu materijal ostaje krae ili due vrijeme. Vrijeme fiksiranja je uvijek naznaeno u metodici i razliito je za pojedine fiksative. Da bi dalji mikrotehniki postupci mogli pravilno da se odvijaju neophodno je poslije fiksiranja materijal dobro isprati. U emu e se ispiranje obaviti zavisi od sastava fiksativa. Ako u njegov sastav ulazi alkohol onda se ispiranje vri alkoholom one koncentacije koja je upotrebljena i pri pravljenju fiksativa. Na primjer: ako je fiksiranje vreno u fiksativu Karnoa, u iji sastav ulazi apsolutni etil alkohol, onda se ispiranje vri apsolutnim alkoholom, dok e materijal fiksiran u

23

Buenovom fiksativu biti ispiran 70% alkoholom. Ako je za fiksiranje korien vodeni rastvor neke materije, ispiranje se obavlja tekuom vodom i to najmanje u vremenu od jednog do tri sata, a esto i due. Najjednostavniji, ali ne i najbolji, nain ispiranja je esta promjena vode ili alkohola u staklenim posudama u kojima se materijal fiksira. Mnogo je bolje pronai mogunost stalnog proticanja vode preko fiksiranog materijala. Jedan od dobrih, ali komplikovanijih naina ispiranja je upotreba aparata koji predstavlja bateriju cjevica koje se uvode u posude u kojima se nalazi materijal koji se ispira. Cjevice se uvode u posude kroz gazu, kojom su ove zatvorene, i dovode do dna. Putanjem vode preko prikljuka na slavini u vie posuda istovremeno, ravnomjerno i stalno protie voda onoliko vremena koliko je predvieno da ispiranje traje (od 1 do 24 sata). Materijal se moe ispirati i na drugi nain. Fiksirani objekti se zajedno sa etiketama prebace u vreice od gaze. Naravno da se pri ovom postupku podrazumijeva da se materijali iz razliitih posuda ne mijeaju ve da svaki ima svoju vreicu. Svaku vreicu pri vrhu dobro vezati koncem, tako da iz njih nita ne moe ispasti. Ovako pripremljene vreice stavljaju se u jedan iri sud u koji se, kroz lijevak, puta vodovodna voda. Materijal u vreicama ispira se onoliko vremena koliko je za ovu fazu rada metodikom predvieno.

4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA

Apsolutni alkohol i 96% alkohol, kao i fiksativi u iji sastav oni ulaze istovremeno i dehidriraju i konzerviraju materijal. Meutim, ako je fiksiranje obavljeno u nekom od fiksativa u iji sastav ulaze alkoholi nie koncentracije, onda se poslije ispiranja dehidratacija vri postepeno alkoholima jae koncentracije, a konzervacija se obavlja u 80% alkoholu. Ako konzerviran materijal po svojoj prirodi ne sadri vee koliine vode u sebi (dijelovi drvenastih biljaka, vegetativni organi kserofita i slino) konzervans se mijenja jedanput u dve do tri godine. Ali ako se konzerviraju objekti ija su tkiva bogata vodom potrebna je ea promjena konzervansa, posebno na poetku ovog procesa. Tvrd materijal, kao to je na primjer drvo, obino se uva u nekom od sledeih konzervansa: jedan dio 95% etil alkohol i jedan dio vode tri dijela 95% etil alkohola, dva dijela vode i jedan dio glicerina jedan dio 95% etil alkohola i jedan dio glicerina

Kada se materijal fiksira u nekom od vodenih fiksativa, ispiranje se vri, kao to je ve ranije reeno, vodom, a do alkohola u kome e se uvati (80%) dovodi se postepeno kroz seriju alkohola sve vee koncentracije (proces dehidratacije). U principu, njeniji objekti se poslije ispiranja u vodi uvode u 10% alkohol i dalje se provode kroz 24

sledeu seriju alkohola: 20% - 30% - 40% - 50% - 65% - 75% - 85% 95%. Tvri materijal se uvodi u 20% alkohol, a dalje proces dehidratacije tee kroz sledee alkohole: 40% - 65% - 85% - 95%. Ukoliko se ne potuje princip postepenog dehidriranja doi e, usljed brzog izvlaenja vode, do promjena na materijalu, koje se obino manifestuju smeuravanjem elijskih zidova, ali i na druge naine. Pojedini autori odreuju razliito vrijeme stajanja u rastvorima alkohola, meutim, zadovoljavajui rezultati postiu se dranjem materijala 20 do 30 minuta u svakom od ova 3-4 rastvora alkohola. U alkoholima vee koncentracije materijal ostaje od jednog do dvanaest sati. Vrijeme dehidratacije zavisi od prirode i veliine objekta koji se tretira, tako da, u okviru datih granica, za svaki objekat treba odrediti najpogodnije vrijeme. Promjena alkohola vri se na vie naina. Najee se alkohol, u kome je materijal ve stajao odreeno vrijeme, paljivo odlije i odmah se umjesto njega sipa alkohol potrebne koncentracije. Za vrijeme sprovoenja kroz alkohole posude su dobro zatvorene i otvaraju se samo radi zamjene alkohola. Pravljenje alkohola odreene koncentracije (procenta) U procesu dehidratacije neophodno je materijal postepeno sprovoditi kroz seriju etil alkohola sve vee koncentracije (20-40-65-7585-95%). Od 95% ili 96% alkohola dobiemo svaki drugi alkohol nie koncentracije primjenjujui sledeu tabelu: Etil alkohol % % Alkohol u ml Voda u ml 96 10 86 96 15 81 96 20 76 96 30 66 96 40 56 96 50 46 96 60 36 96 70 26 96 80 16

Tabela 1. Pravljenje alkohola odreene koncentracije Na tablici su oznaene formule za alkohole razliite koncentracije od 10 do 80%. Procenat alkohola za svaki pojedini sluaj oznaen je srednjim brojem u svakoj koloni. Na primjer: ako elimo da od 96% napravimo 40% alkohol postupiemo na sledei nain 96-40= 56, a to znai da treba uzeti 56 ml destilovane vode i 40 ml 96% alkohola. Tako dobijeni rastvor sadrzi 96 ml 40% alkohola. Drugim rijeima, svaku eljenu koncentraciju alkohola dobiemo ako u menzuru sipamo onoliko mililitara 96% alkohola koliki procenat elimo da napravimo i do 96 mililitara dolijemo destilovanu vodu. Na primjer: elimo da napravimo 23% alkohol. U menzuru treba sipati 23 ml 96% alkohola i izvriti dopunu destilovanom vodom do 96-tog podioka (dodati 73 ml vode).

25

4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA

U okviru anatomskog praktikuma rijedak je materijal koji se moe posmatrati pod mikroskopom bez prethodnog sjeenja. Materijal se sijee slobodnom rukom pomocu ileta ili brijaa i specijalnim aparatom mikrotomom. Za sjeenje na mikrotomu objekti se prethodno moraju pripremiti relativno sloenim postupkom. Meutim, sjeenje mikrotomom neophodno je primjeniti pri citolokim, embriolokim, pa i mnogim histolokim istraivanjima ili pak kada je objekat toliko sitan i njean da ga drugaije nije mogue isjei. Dvije najee metode pravljenja presjeka za preparate jesu parafinska metoda i metoda sa smrznutim tkivom, koje e opirno biti opisane u poglavljima 6 i 7.

4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM

Da bi se preparat mogao ouvati dui period vri se njegova inkluzija u kanada balzam. Inkluziranje u kanada balzam vri se na taj nain to se na predmetno staklo, izvaeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek paljivo prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na isto predmetno stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem ostavljaju se, zatieni od praine, najmanje 24 sata u horizontalnom poloaju. Za to vrijeme, zahvaljujui isparavanju ksilola u kome je kanada balzam rastvoren, ploica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je preparat gotov i moe se staviti u kutiju za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati jo nisu definitivno osueni, pa zato treba sa njima jo izvijesno vrijeme postupati paljivo da se ploica ne pomjeri.

4.6. OBILJEAVANJE PREPARATA

Svako predmetno stakalce mora da bude obiljeeno tj. numerisano. Numeracija se vri specijalnim olovkama ili markerima iji se trag na staklu ne brie u vodi, alkoholu i ksilolu. Ovakve olovke se mogu nabaviti u trgovinama koje prodaju laboratorijski materijal. U sluaju da do takvih olovaka ne moe da se doe pripremamo tu koji ima sve potrebne osobine (ne brie se). U tom cilju treba izmijeati jednake dijelove tua, bjelanceta i glicerina i tome dodati kristali timola ili fenola. Pri upotrebi ovako napravljenog tua, poslije numerisanja (obiljeavanja), predmetno stakalce treba lako zagrijati, ali 26

samo na mjestu gdje je ispisana oznaka. Ovako obiljeena predmetna stakalca nee izgubiti numeraciju pri daljoj obradi preparata. Istovremeno sa obiljeavanjem preparata vodi se i evidencija u posebnoj svesci. Evidencija treba da bude to potpunija kako bi se analiza gotovih preparata mogla lake i preciznije izvriti. Kada itav postupak pravljenja preparata bude zavren (deparafinisanje, bojenje, inkluzija u kanada balzam) na predmetna stakalca lijepi se etiketa na kojoj su zabiljeeni svi potrebni podaci koji se odnose na preparat.

5. BOJENJE PREPARATAPri prouavanju anatomske grae, bilo na privremenom ili trajnim preparatima, u najveem broju sluajeva, vri se bojenje. Za svaki objekat, u zavisnosti od njegove strukture i cilja rada, odabira se odgovarajui fiksativ i boja. Pri pravljenju anatomskih preparata najee se primjenjuje diferencijalno bojenje, odnosno bojenje sa vie boja. Prema nainu rada bojenje moe biti progresivno ili regresivno. Pri progresivnom bojenju presjeci se stavljaju u slab rastvor boje, tako da se vremenam obojenost preparata poveava. Na ovaj nain se na primjer boji hematoksilinom. ee se primjenjuje regresivan nain bojenja, pri emu se preparati prvo preboje, a zatim se u tzv. procesu diferenciranja uklanja viak boje sve dotle dok se ne dobije eljena nijansa. Diferenciranje je, prema tome, uklanjanje vika boje putem ispiranja. Diferenciranje se vri u rastvarau u kome je i boja, kojom se preparat boji, rastvorena, a intenzitet obojenosti preparata se stalno kontrolie mikroskopom. Boje se najee upotrebljavaju kao zasieni vodeni ili alkoholni rastvori (najee odgovaraju 1-2% rastvoru boje), mada se neke vrlo lijepo rastvaraju u karanfilievom ulju (na primjer oran, svijetlo zeleno i druge). 5.1. BOJE I RASTVORI BOJA

Prema porijeklu boje za bojenje preparata mogu biti prirodne i vjetake. Prirodne boje su ekstrakti dobijeni iz biljaka, ivotinja ili minerala, npr. karmin, afranin, lakmus, orcein i druge. Vjetake boje se dobijaju sintetskim putem iz katrana kamenog uglja. Budui da je u poetku razvoja industrije katranskih boja anilin sluio kao ishodini materijal, sintetske boje se jo nazivaju i anilinskim bojama. Boje se kupuju u trgovinama i nalaze se u vrstom stanju, najee u obliku kristala ili u prahu. Rastvor se moe pripremiti prema tzv. direktnom nainu, kada se boja rastvara direktno u destilovanoj vodi, ili indirektnom nainu, kada se prvo pripremi zasieni alkoholni rastvor

27

Slika 19.Benzolov prsten boje. To je matini rastvor od kog se poslije pravi razblaeni rastvor boje u destilovanoj vodi. Vodeni rastvori su manje postojani pa je preporuljivo pripremiti matini rastvor koji moe due stajati, a od njega se lako priprema pravi rastvor za bojenje. Matini rastvor se pravi u 96% alkoholu tako to se u odreenu koliinu alkohola postepeno dodaje boja dok se ne pojavi talog koji se dalje ne rastvara. Rastvor se ostavi 2-3 dana u termostatu na 30C, a zatim se prema potrebi pravi rastvor za bojenje. Na 100 ml destilovane vode dodaje se matinog rastvora: Fuksin 10 ml Gencian violet 15-20 ml Metilensko plavo 20-30 ml

5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA

Boje za bojenje preparata su ciklina jedinjenja koja u osnovi sadre benzolov prsten (Slika 19) za koji su vezane hromoforna i auskohromna grupa. Hromoforna grupa je odgovorna za obojenost, a auksohromna grupa omoguuje vezanje jedinjenja sa molekulima elije (npr pikrinska kiselina ima utu boju jer sadri hromofornu nitro grupu NO2, dok je za njeno vezivanje sa elijskim molekulima odgovorna auksohromna hidroksilna grupa OH- ). Boje se u zavisnosti od njihovog ponaanja pri elektrolitikoj disocijaciji dijele na kisele i bazne. Kisele boje imaju afinitet za bazne elijske komponente jer sadre karboksilnu ili hidroksilnu grupu koje pri disocijacijaciji imaju negativan naboj. Ove boje imaju vei afinitet prema citoplazmi pa se jo nazivaju i citoplazmatske boje i uglavnom je boje u crveno ili ruiasto. Za razliku od njih, bazne boje sadre amino grupu, koja pri disocijaciji ima pozitivan naboj, pa boje kisele elijske komponente, kao to je jedro, u plavo. Najee koritene kisele boje su eozin, kiseli fuksin, pikrinska kiselina i eritrozin, a od baznih boja se najee koriste metilensko plavo, kristal violet, bazni fuksin, gencian violet itd.

5.3. METODE BOJENJA

S obzirom na postojanje velikog broja boja koje se primjenjuju prilikom pravljenja preparata, opisaemo pravljenje i upotrebu samo onih boja koje se najee upotrebljavaju.

28

5.3.1. Hematoksilinska metoda Hematoksilin je boja biljnog porijekla, a dobija se iz drveta tropske biljke Haematoxylon campechianum. Za bojenje se koristi produkt oksidacije hematoksilina hematein. S obzirom da postoji vie naina za pripremanje ove boje, opisaemo pripremu Delafildovog i Hajdenhajnovog hematoksilina. Delafildov hematoksilin - Napraviti zasien rastvor amonijum alauna u vodi (amonijum alaun = aluminijum amonijum sulfat = alumen ammonium; formula: AINH4(SO4)2 + 12 H2O). - 1 gr hematoksilina rastvoriti u 6 ml apsolutnog alkohola. U 100 ml zasienog rastvora amonijum alauna u vodi dodati kap po kap hematoksilina rastvorenog u alkoholu. Ovako pripremljena boja stoji na svjetlosti 7 dana u boci koja je zatvorena vatom. Poslije 7 dana rastvor se profiltrira i dodaje mu se 25 ml hemijski istog glicerina i 25 ml metil alkohola. Kroz 4 sata (rastvor treba da potamni) ponovo se vri filtriranje. Profiltrovana boja se sipa u bocu koju potom treba dobro zapuiti i izloiti djelovanju svjetlosti ne manje od 2 mjeseca. Tek tada je boja spremna za upotrebu. Mnogi praktiari preporuuju da se ovako napravljena boja prije upotrebe razblai (na 100 ml destilovane vode dodati 30 ml pripremljene boje). Ovako razblaenim rastvorom boje preparati se neto due boje, ali je mogue izvesti preciznije bojenje. Delafildov hematoksilin je vrlo postojana boja. Prema podacima koje navodi ernberlen (Chamberlain, C., 1921) bila je upotrebljena i dala karakteristinu reakciju boja stara 20 godina. Duina bojenja (vrijeme bojenja) ovom bojom razliito je za pojedine preparate, a varira od 3 do 30 minuta. Ako je materijal poslije fiksiranja dobro ispran sa bojenjem ne smije biti problema. Naroito dobro treba isprati materijal ako je fiksativ sadrao neku kiselinu. Iz boje preparati se prenose u tekuu vodu i dobro se isperu. Za parafinske presjeke ispiranje traje 5 do 10 minuta, a za deblje preparate (sjeene rukom) 20 do 30 minuta. Pri ispiranju voda se mijenja sve dok se u njoj pojavljuju i najmanji znakovi tragova boje. Iz vode se preparati prebacuju u alkohole sve jae koncentracije (vidi: dehidratacija) i na kraju se preko ksilola inkluziraju u kanada balzam. Pri prebacivanju iz vode u alkohol na preparatima se moe obrazovati talog. Talog se odstranjuje provoenjem preparata kroz zakiseljeni alkohol koji se priprema tako to se na 100 ml 70% alkohola doda 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Iz ovog alkohola preparati se prenose u ist 70% alkohol u kome treba da promijene boju - od crvenkaste da postanu purpurni. Poto se prenoenjem iz zakiseljenog alkohola u ist uvijek prenesu i male koliine kiseline preporuuje se iIi viekratno ispiranje u istom 70% alkoholu ili se u 70% alkohol doda kap amonijaka koji neutralie dejstvo kiseline. Jedna od ee 29

upotrebljavanih ema za bojenje Delafildovim hematoksilinom je sledea: Bojenje (iz vode, 35% ili 50% alkohola) .........................3 do 30 min. Ispiranje u tekuoj vodi: za parafinske presjeke ............5 do 10 min. o zapresjeke iletom ................20 do 30 min. Dehidratacija: 35% alkohol.......5 minuta 50% alkohol...............................5 minuta 70% zakiseljeni alkohol.............u ovom alkoholu vri se diferenciranje koje se prati pod mikroskopom. 70% alkohol (nezakiseljen) preparate isprati vie puta 85% alkohol ............................................5 minuta 95% alkohol ............................................5 minuta 100% alkohol ..........................................5 minuta 100% alkohol i ksilol u odnosu 1:1 ..........5 minuta ksilol ........................................................5 minuta inkluzija u kanada balzam

Ako je poslije ispiranja u vodi preparat blijedo obojen treba ga ponovo vratiti u boju. - Ako u zakiseljenom alkoholu boja brzo blijedi (za 4 do 5 sekundi) treba smanjiti koliinu kiseline. - im se boja u 70% alkoholu pone mijenjati od crvenkaste u purpurnu, dalji tok rada kontrolisati pod mikroskopom. Ako se konstatuje da je preparat slabo obojen treba ga ponovo vratiti u boju, a ako je prebojen u zakiseljeni alkohol. Inkluziranje u kanada balzam vri se na taj nain to se na predmetno staklo, izvaeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kanada balzama i presjek paljivo prekrije pokrovnim stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na isto predmetno stakalce. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem ostavljaju se, zatieni od praine, najmanje 24 sata u horizontalnom poloaju. Za to vrijeme, zahvaljujui isparavanju ksilola u kome je kanada balzam rastvoren, ploica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim je trajni preparat gotov i moe se staviti u kutiju za preparate. Ipak treba napomenuti da preparati jo nisu definitivno osueni, pa zato treba sa njima jo izvijesno vrijeme postupati paljivo da se ploica ne pomjeri. Hajdenhajnov hematoksilin gvoa. Ovu boju je 1892. godine u tehniku pravljenja preparata uveo Hajdenhajn (Haidenhain) i do danas je ostala jedna od osnovnih boja pri pravljenju preparata. Za bojenje po ovoj metodi pripremaju se dva rastvora koji se nikada ne mijeaju. A - 2% - 4% vodeni rastvor feriamonium sulfata. B - 0,5% vodeni ili alkoholni rastvor hematoksilina.

30

Rastvor feriamonium sulfata ne boji preparate, ve samo slui kao tavilo, tj. priprema preparate da bolje prime boju. Ovaj rastvor se moe upotrebiti im se kristali feriamonium sulfata rastvore, a odrava se oko 2 mjeseca. Pripremanje hematoksilina. 1 gr hematoksilina rastvoriti u 10 mililitara 96% etil alkohola i dodati 90 ml destilovane vode. Sud zatvoriti vatom i ostaviti na svjetlosti 2 do 3 nedjelje da boja sazri. Prije upotrebe boja se razblai destilovanom vodom (1:1), tako da se dobije 0,5% rastvor hematoksilina. Proces sazrijevanja moe da se ubrza zagrijavanjem. U tom sluaju 1 gram hematoksilina stavlja se u 100 ml destilovane vode i zagrijava se sve do rastvaranja kristala boje. Ovaj rastvor vie puta mora da se filtrira i kada se ohladi moe da se upotrijebi za bojenje. Da bi se sprijeilo razvie mikroorganizama u boju se dodaje kristali timola. Hajdenhajnov hematoksilin gvoa moe da se upotrijebi vie puta za bojenje, ali se pri tome mora paziti da se u njega ne unese feriamonium sulfat. Zagaivanje boje feriamonium sulfatom uoava se lako, jer hematoksilin poinje da tamni. Boja moe da se upotrebljava due vremena (do 6 nedjelja, ali povremeno mora da se profiltrira i da se izvri proba da Ii je jo uvek upotrebljiva. Proba ispravnosti boje vri se tako to se u stakleni sud stavi nekoliko kapi hematoksilina iju upotrebljivost ispitujemo, i prelijemo ih vodovodnom vodom. Ako se voda oboji Ijubiasto hematoksilin je jo uvijek upotrebljiv, a ako boja vode bude uta ili prljavo Ijubiasta treba praviti novu boju. opta ema bojenja Hajdenhajnovim hematokslilinom gvoa: 1. Preparate staviti u 4% feriamonim sulfat ................6 do 12 sati 2. Dobro isprati tekuom vodom...........................10 minuta ili, ako se ispiranje ne vri tekuom vodom, vodu mijenjati vie puta (4 do 5 puta). 3. Prenijeti preparate u hematoksilin ........................ 12 do 14 sati 4. Isprati preparate tekuom vodom 5. Diferenciranje u 2% feriamonium sulfatu. Diferencirati svaki preparat pojedinano u petri kutiji i kontrolisati pod mikroskopom oduzimanje vika boje. Kada jedra budu jasno vidljiva preparate prenijeti u sud sa protonom vodom ....... ......................................1/2 sata do 1 sat 6. Dehidratacija se vri kroz seriju postupno jaih alkohola poevi od 35% zakljuno sa apsolutnim. Zatim se preko alkohol-ksilola i istog ksilola preparati inkluziraju u kanada balzam. Kao to se vidi opisani nain bojenja zahtijeva neto vie vremena. Meutim, ako preparator iz nekih razloga treba bre da radi moe se preporuiti sledei postupak: Preparate koji se nalaze u 4% feriamonim sulfatu staviti 30 do 40 minuta u

31

termostat na temperaturu 45C do 56C. Zatim ih isprati kao u prethodno opisanom postupku i uvesti ih u hematoksilin. Bojenje vriti takoe u termostatu pri istoj temperaturi i isto vrijeme kao i tavljenje. Diferenciranje se obavlja u 2% feriamonium sulfatu, a dehidratacija kao to je opisana u optoj emi. Hematoksilin brzo i lijepo boji celulozne elijske zidove, sluzi, citoplazmu i jedra Ijubiasto i javlja se kao jedna od iroko primjenjivanih boja u anatomskim, embriolokim i citolokim istraivanjima. Pri dvojnom bojenju daje lijepe kombinacije sa afraninom (koji boji odrvenjene zidove kod biljnih preparata crveno). Hematein je osnovna supstanca hematoksilina od koje u stvari i potie karakteristina boja. Poto je hemijski sastav hemateina poznat, ona se industrijski proizvodi kao sintetika boja i u potpunosti zamjenjuje hematoksilin, boju koja se dobija ekstrakcijom iz drveta biljke Haematoxylon campechianum. Hematein se priprema tako to se 0,5 ml hemateina rastvori u 25 ml 90% alkohola, a zatim je potrebno uzeti 25 grama stipse (KAl (SO4)2, x 12 H2O) i rastvoriti je u 500 ml vode. Spojiti rastvor stipse sa pripremljenom bojom i malo zagrijati da se stipsa rastvori. Kada se ovaj rastvor ohladi boja je spremna za upotrebu. afranin je boja koja daje dobre rezultate ako se kao fiksativ upotrebi alkohol ili neki od fiksativa koji sadri hromnu kiselinu. Boja se upotrebljava kao 1% vodeni ili, ee, alkoholni rastvor, a priprema se po sledeem receptu: afranin..............................................1 gr 95% etil alkohol.................................50 ml voda.....................................................50 ml

Parafinski preparati poslije deparafinisanja u boju se prenose iz 50% alkohola, a presjeci napravljeni od svjeeg materijala prvo se stavljaju u 95% alkohol 1/2 sata, pa se zatim prenose u boju. Presjeci pravljeni slobodnom rukom od materijala fiksiranog u alkoholu direktno se prenose u boju. Ako je materijal bio fiksiran u alkohol-formalinu presjeci se prvo sprovedu kroz 50% alkohol (10 minuta), pa se tek poslije toga boje. Vrijeme bojenja varira od 5 minuta do 24 sata, a zavisi od karakteristika tkiva koje prouavamo. Ako se radi o biljnim preparatima moe se rei da materijal u kome je stepen odrvenjenosti (lignifikacije) manje izraen treba bojiti due. Diferenciranje se vri pod mikroskopom u 50% alkoholu. Ako su presjeci prebojeni, a to se zna na osnovu vremena potrebnog za diferenciranje (za 5 do 10 minuta ne dobije se eljeni ton boje), treba u 100 ml alkohola, u kome se vri diferenciranje dodati 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Poslije upotrebe zakiseljenog alkohola preparate, iIi presjeke, dobro isprati istim 50% alkoholom tako da se kiselina potpuno odstrani. Dehidratacija se vri na ve opisani nain, kroz seriju alkohola sve jaih koncentracija poev od 70% do 100%, a u svakom ostaju po 5 32

minuta. Prije inkluzije u kanada balzam preparati iIi presjeci prolaze kroz ksilol-alkohol (1: 1) i ist ksilol (po 5 minuta u svakom). Pri dvojnom bojenju afranin daje lijepe kombinacije sa hematoksilinskim bojama, oran, svijetlo zelenim, vodenim plavim itd. Vodeno plavo (Wasserblau). Vodeno plavo upotrebljava se u vidu 1% vodenog rastvora, ali ljepe nijanse plave boje ova boja daje ako se pripremi na sledei nain: Napraviti zasien rastvor pikrinske kiseline (C6H3N307) u 50% alkoholu. U ovaj rastvor postepeno se dodaju kristali boje vodeno plavog sve dotle dok se ne dobije eljena nijansa plave boje. Boja moe da se napravi i tako to se boja rastvori u 50% alkoholu i tek tada treba postepeno dodavati rastvor pikrinske kiseline sve dotle dok se ne dobije eIjena nijansa plave baje. Ovom bojom se boje vrlo brzo, za 30 sekundi do 1 minuta, celulozni biljni elijski zidovi. Diferenciranje i dehidratacija vre se u 96% alkoholu. Pri dvojnom bojenju daje lijepe kombinacije sa afraninom i hrizoidinom. Oran G se upotrebljava kao 1% vodeni iIi alkoholni rastvor, a moe da se pripremi i kao zasien rastvor u karanfiliskom ulju (1 gr boje na 100 ml karanfiliskog ulja priblino odgovara zasienom rastvoru). Alkoholni rastvor ove boje pravi se u apsolutnom alkoholu. Boji celulozne biljne zidove u uto. Preparati iz vode prenose se u vodeni rastvor boje, a iz apsolutnog alkohola u alkoholni rastvor iIi u zasieni rastvor boje u karanfiliskom ulju. Bojenje sa oran G je kratko, oko 1 minuta. Diferenciranje se vri u onom agensu u kome je boja rastvorena. Oran G je pogodna boja za rad pri dvojnom iIi trojnom bojenju i daje dobre kontraste sa afraninom. Hrizoidin boji odrvenjene zidove uto, a upotrebljava se kao 1-2% vodeni rastvor. Vrijeme bojenja kree se od 5 do 20 minuta. Daje dobre kontraste sa svijetlo zelenim. Svijetlo zeleno. Ova boja se rastvara u vodi, alkoholu i karanfiliskom ulju. Vrlo brzo boji celulozne zidove, za 1 minut, i daje lijepe kombinacije sa afraninom. Najee se upotrebljava kao 0,5% ili 1% rastvor u 50% iIi 70% alkoholu. Najljepe nijanse zelene boje dobijaju se kada se rastvori u karanfiliskom ulju. Preparati se u boju uvode ili iz vode, ili iz 50%, odnosno 70% alkohola. Ako je boja rastvorena u karanfiliskom ulju, preparati ili presjeci se u boju prenose poslije apsolutnog alkohola. Bojenje traje 1 do 30 minuta, a diferenci-ranje se vri u karanfiliskom ulju. Poslije provoenja kroz ksilol-apsolutni alkohol (1: 1) i ist ksilol inkluziraju se u kanada balzam.

5.3.2. Dvojno bojenje preparata

Preparati se mogu bojiti jednom od odabranih boja kojom se istie

33

neki detalj u grai prouavanih organa, tkiva ili eiija. Meutim, ee se pri izradi anatomskih preparata primjenjuje metoda kombinovanja boja (diferencijalno bojenje), sa eljom da se jasnije istaknu razlike u grai. Na primjer, ako elimo da upoznamo grau provodnih snopia izabraemo dve boje od kojih e jedna bojiti ksilemski a druga floemski dio. Ako se odluimo za kombinovano bojenje preparata moramo voditi rauna da druga boja esto utie na prethodno upotrebljenu boju. Pri ovom nainu rada neophodan je strpljiv i paljiv postupak pri kome treba svaki detalj kritiki ocijeniti, kako bi se uoili svi uzroci koji bi, eventualno, doveli do nezadovoljavajueg rezultata. afranin i svijetlo zeleno. Pripremiti afranin i obojiti preparate kao to je ve opisano. Zatim izvriti dehidrataciju do onog alkohola u kome je rastvarena boja svijetlo zeleno (70% ili 100% alkohol). Do aspolutnog alkahola preparati se dovode i kada je boja svijetlo zeleno rastvorena u karanfiliskom ulju. Poslije diferenciranja preparati se prosvetljavaju u ksilolu i inkluziraju u kanada balzam. Svijetlo zeleno boji celulozne zidove zeleno, a afranin odrvenjene, kutinizirane i oplutnjale crveno. Primjer jedne opte eme rada za parafinske preparate od deparafinisanja do ukljuivanja u kanada balzam izgledao bi ovako: 1. ksilol 20 min. 2. ksilol-apsolutni alkohol 20 min. 3. apsolutni alkohol 10 min. 4. 95% alkohol 5 min. 5. 85% alkohol 5 min. 6. 70%- alkohol 5 min. 7. 50% alkohol 5. min. safranin 8. 50% alkohol (diferenciranje) 9. 70% alkohol 5 min. 10. 95% alkohol 5 min 11. apsolutni alkohol 5 min. 12. svijetlo zeleno u karanfiliskom ulju 13.karanfilisko ulje (diferenciranje) 14. ksilol-apsolutni alkohol 5 min. 15. ksilol 5 min. 16. kanada balzam Na ovaj nain mogu da se boje i preparati sjeeni slobodnom rukom od svjeeg ili fiksiranog materijala, samo je u tom sluaju proces neto skraen jer se iskljuuje prva faza rada (deparafinisanje) i poinje se ili od 95% alkohola ili od 50% alkohola.

34

Delafildov hematoksilin i afranin. Ako se odluite za ovu kombinaciju boja onda se preparati, poslije deparafinisanja, prvo boje hematoksilinom (vidi Delafildov hematoksilin), a zatim se isperu vodom i prenose u afranin. Dalji tok procesa tee na ve opisan nain (dehidratacija, inkluzija u kanada balzam). Svi neodrvenjeni elementi hematoksilinom se boje Ijubiasto, a odrvenjeni afraninom crveno. 5.3.3. Ostale metode Azan Ova metoda se tradicionalno koristi za bojenje vezivnog tkiva. Kolagena vlakna, bazalne membrane i mucin se boje plavo, jedra crveno, a miii i eritrociti narandasto-crveno. Trihromne metode bojenja (Masson) Postoji veliki broj trihromnih metoda u kojima se koriste kombinacije tri razliite boje radi specifinog bojenja i razlikovanja vezivnog tkiva od drugih tkiva (miia). Jedra i druge bazofilne strukture se boje plavo, kolagen zeleno ili plavo (u zavisnosti od varijante bojenja), a citoplazma elija, miii i eritrociti jasno crveno. PAS metoda (perjodna kiselina-Schiff) Za prikazivanje ugljenih hidrata (glikogen, glikoproteini) u tkivu koristi se PAS histohemijska metoda. Bazira se na oksidativnom dejstvu perjodne kiseline, pri emu se stvaraju aldehidne grupe, za koje se vezuje bezbojni ifov reagens koji nakon toga postaje ruiaste boje. Ovom metodom se selektivno boje bazalne membrane, glikogen i razliiti elijski sekreti glikoproteinske prirode. Bestov karmin Ova metoda se koristi za selektivno bojenje glikogena u tkivu. Posebna panja se obraa fiksaciji (hladni alkoholni fiksativi), poto se glikogen rastvara u vodi i samim tim se u toku rutinske fiksacije ispira iz tkiva. Alcian plavo Alcian plavo se upotrebljava za prikazivanje glikozaminglikana i proteoglikana, a esto se primjenjuje u kombinaciji sa drugim bojama. U kombinaciji sa tehnikom van Gieson navedene supstance se boje zeleno. Van Gieson Ova tehnika spada u grupu metoda kojima se boji vezivno tkivo.

35

Njome se kolagen boji crveno, a miino tkivo i eritrociti uto. I ova metoda se esto koristi u kombinaciji sa drugim metodama. Orcein i rezorcin-fuksin Ove metode se koriste za selektivno bojenje elastinih vlakana, a najee se koriste u kombinaciji sa drugim metodama. May-Grnwald Giemsa Koristi se za bojenje razmaza krvi i kotane sri. Sastoji se iz kombinacije baznih i kiselih boja (eozin, azur, metilen plavo), pa se jedra boje tamno plavo do ljubiasto, citoplazma svijetlo plavo, a eritrociti ruiasto. Srebro Postoji veliki broj metoda u kojima se upotrebljavaju razliita jedinjenja srebra. Najee se koriste za prikazivanje neurona i neuroglijskih elija, ali i za bojenje nervnih vlakana i drugih struktura. U zavisnosti od primijenjene metode, vidljivi talog je crne, braon ili zlatne boje. Rastvor srebra se koristi i u kombinaciji sa heksametilen tetraminom (metenamin-srebro) za prikazivanje bazalnih lamina, ali i za bojenje polutankih isjeaka. Osmijum tetroksid Pored toga to se koristi kao fiksativ u elektronskoj mikroskopiji, osmijum tetroksid se, zahvaljujui osobini da boji lipide, esto upotrebljava za bojenje mijelinskog omotaa, ili lipidnih kapljica u svjetlosnoj mikroskopiji. Toluidin i metilen plavo Ove bazne boje se najee koriste za bojenje polutankih epoksi isjeaka, ali i za prikazivanje metahromazije (mastociti) na klasinim parafinskim isjecima. Mogu se koristiti i u kombinaciji sa azurom. Bojenje preparata napravljenih iletom ili na mikrotomu bez inkluzije u parafin Svaki presjek, bez obzira da Ii je napravljen iletom, sjeen na mikrotomu od svjeeg ili fiksiranag materijala, ili je napravljen iz parafinskog kalupa, mogue je obojiti i napraviti privremeni ili trajni preparat. Presjeci napravljeni slobodnom rukom uz pomo ileta ili na mikrotomu od svjeeg ili fiksiranog materijala sprovode se kroz alkohole i boje iIi na predmetnom stakalcu (ako je u pitanju 1-2

36

preparata) ili u sahatnim staklima (ako ih je vie). Kako proces rada zahtijeva da presjeci prolaze kroz serije alkohola i boju to se namee pitanje kako ih prenositi iz suda u sud, a da se pri tome ne otete ili ne osue. Ovaj dio posla vri se na vie naina, a ovde e biti opisana dva najjednostavnija. 1. Presjeci se finom etkicom prebacuju iz jednog u drugo sahatno staklo. Za ovaj nain rada treba pripremiti onoliko sahatnih stakala ili drugih odgovarajuih sudova kroz koliko razliitih agenasa materijal prolazi do konanog uvoenja u kanada balzam ili neku drugu materiju. 2. U toku rada presjeci mogu ostati u jednom sudu (ne prebacuju se), a odlivanjem ili pipetiranjem izvlai se reagens u kome su stajali. Poslije ispiranja (istom porcijom reagensa u kome su bili) dodaje se nova, svjea porcija odgovarajueg reagensa. Jedna od estih kombinacija boja koja se pri ovom nainu rada upotrebljava je afranin - vodeno plavo i zato e na jednom primjeru upravo sa ovim bojama biti opisan nain rada. Presjeci napravljeni od fiksiranog materijala odmah se stavljaju u afranin u kome najee ostaju 10-30 minuta, a ponekad i 24 sata. Kada se izvade iz afranina presjeci se diferenciraju u 50% alkoholu i prenose u boju vodeno plavo. U toj boji ostaju do 10 minuta, a zatim se prenose u 95% alkohol. Ako su presjeci prebojeni diferenciranje vriti u zakiseljenom alkoholu (u 100 ml 95% alkohola dodati kap-dve sone kiseline) i kada se postigne odgovarajui ton boje presjek, prije daljeg sprovoenja, vie puta isprati istim (nezakiseljenim) 95% alkoholom. Diferenciranje se vri sve dok se alkohol boji, odnosno dok se ne ukloni viak boje i ne ispolje jasne razlike u obojenosti tkiva. Sva odrvenjena tkiva afranin e obojiti crveno, a celulozni i drugi neodrvenjeni zidovi bie plavi od boje vodeno plavo. Dehidratacija presjeka vri se u apsolutnom alkoholu koji se pri tome vie puta mijenja. Dehidratacija mora da bude potpuna, inae e se presjeci pri prenoenju u ksilol, to je dalji korak u ovom poslu, zamutiti. U ksilolu presjeci ostaju 5 do 10 minuta. Iz ksilola se prenose na predmetnu plou u kanada balzam, prekrivaju se pokrovnim stakalcem i poslije suenja od nekoliko dana trajni preparat je gotov.

5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVANJE I NAIN UPOTREBE

Pri prouavanju pojedinih struktura nekih biljnih organa esto je potrebno primijeniti neku od metoda za prosvjetljavanje. Na ovaj nain mogue je posmatrati, ne pravei presjeke, epidermis, stome u epidermisu, dlake, a istovremeno i odrediti duinu nervature (izraunava se na jedinici povrine lista), zatim broj stoma i slino. Najee upotrebljavani reagensi za prosvjetljavanje su sledei: Hloralhidrat

37

Hloralhidrat ..........................5 ml (moe i 8 ml) Voda ..........................2 ml Ovaj reagens se koristi za prosvjetljavanje debelih presjeka. Reagens hloralhidrat se moe upotrijebiti hladan, ali i zagrijan do kljuanja. Kada se upotrebljava zagrijjan bre prosvjetljava, ali i izaziva bubrenje elijskih zidova. Kalijum hidroksid Kalijum-hidroksid (K0H).......................5 gr Voda ili 96% etil alkohol.....................100 ml Djeluje isto kao i hloralhidrat. Preporuuje se za prosvjetljavanje herbarizovanog materijala.

avelova voda Rastvor A: Hlorni kre ....... 20 gr Voda .............. 100 ml Rastvor B: K2CO3 . . . . .. 15 gr Voda............ 100 ml Hlorni kre se razmuti u vodi i ostavi da odstoji dok pripremamo drugi rastvor (rastvor B). Zatim se oba rastvora izmijeaju i ostave da stoje nekoliko sati. Poslije tog vremena dobijeni rastvor se profiltrira i upotrebljava kao reagens za prosvjetljavanje. avelova voda moe da se napravi u veoj koliini. uva se u dobro zatvorenoj tamnoj boci i na zamraenam mjestu. Materijal koji se prosvjetljava prvo stoji u 96% alkoholu sve dotle dok ne pobijeli, odnosno izgubi zelenu boju. Zatim se prenosi u avelovu vodu u kojoj se proces izbjeljivanja dovrava. avelova voda je dobar reagens za prosvjetljavanje i naroito je efikasna kada djeluje na svjetlosti. Pod njenim dejstvom se razaraju citoplazma i hloloplasti i zato je pogodna za prosvjetljavanje biljnih objekata u kojima elimo dobro da vidimo elijske zidove. Iz alelove vode materijal se brzo prenosi u tekuu vodu i u njoj se nekoliko minuta ispira. Ovako pripremljen materijal posmatra se u vodi ili glicerinu. Ako elimo da materijal sauvamo due vremena postepeno se dovodi do 70% alkohola i u njemu se konzervira. Glicerin Glicerin . . . . . . . . . 1 dio Voda .. ................. 1 dio 38

Upotrebljava se kao medijum u kome se posmatraju presjeci. Moe da se upotrijebi i ist glicerin. Prosvjetljavanje krupnijih objekata se vri u vatrostalnom sudu. Stavljaju se u stakleni sud (epruveta) j paljivo se kuvaju u 50% alkoholu sve dok se iz njih izdvajaju mjehurii vazduha. Zatim se u epruvetu stavlja 0,25 gr KCl03. Kada se ova so rastvori dodati jo nekoliko kapi sone kiseline (HCl). Sve se zajedno promuka i ostavi na dnevnoj svjetlosti. ak se preporuuje da se izloi djelovanju direktne suneve svjetlosti. Vrijeme ekspozicije se kree, u zavisnosti od prirode materijala, od 1 minuta do 2 dana.

39

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATAVe je ranije napomenuto da se na preparatima sjeenim slobodnom rukom ne mogu vriti mnoge analize, posebno analize finijih struktura elijske grae. Pri citolokim, embriolokim pa i anatomskim prouavanjima esto je istraiva prinuen da presjeke pravi posebnim aparatom mikrotomom. Isto tako, pri analizama grae sitnih objekata, ili kada je potrebno, u cilju rjeavanja postavljenog problema, dobiti seriju preparata u nizu jedan za drugim, takoe se primjenjuje sjeenje mirkotonom. Objekti koji se sijeku mikrotonom moraju se prethodno, posebnim nainom, pripremiti. Postupak pripremanja objekata za sjeenje mikrotonom je dosta sloen i, generalno reeno, sastoji se u tome da se u fiksirane i dehidrirane objekte uvede odreena materija, u kojoj e poslije biti i zaliveni. U ovu svrhu najee se upotrebljava parafin, a rjee celoidin. Po parafinu u koji se inkluziraju objekti ova metoda je dobila ime parafinska metoda. vrsti objekti mogu se i direktno, bez inkluziranja u parafin, sjei mikrotomom. O tom postupku bie rijei kasnije.

6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN

Da bi materijal koji se preparuje mogao biti uveden u parafin potrebno ga je prethodno fiksirati, isprati i vrlo paljivo, provodei ga kroz seriju alkohola, dehidrirati. Za uvoenje u parafin dehidratacija materijala mora da ide i dalje od one koja je opisana u poglavlju "Dehidratacija i konzervacija materijala". Naime, materijal treba da ostane u 96% alkoholu ne manje od 1 do 2 sata, a zatim se prebacuje u apsolutni alkohol. U apsolutnom alkoholu I materijal stoji ne manje od jednog sata, a zatim se prebacuje u novi apsolutni alkohol (AAI II apsolutni alkohol II). Sitni objekti i u AAI II ostaju 1 sat, a krupniji mogu i da prenoe. Da bi se omoguilo natapanje materijala parafinom potrebno je agens kojim se vrila dehidratacija (AAI) zamijeniti agensom koji ne sadri vodu, a u kome se parafin rastvara. Takvih tenosti ima vie: kedrovo ulje, terpentin, benzol, toluol, hloroform, ali se najee upotrebljava ksilol (Xy). Iz apsolutnog alkohola materijal se postepeno prevodi u neki od navedenih agenasa, a pri tom procesu istovremeno dolazi i do prosvjetljavanja materijala. Prosvjetljavanje je znaajan proces, jer pokazuje da je alkohol zamjenjen agensom u kome se parafin rastvara i da se moe poeti sa inkluzijom (uvoenjem) parafina. Za prosvjetljavanje i zamjenu alkohola koriste se manje koliine agensa, toliko koliko je potrebno da se prekrije materijal koji se sprovodi. Postupak koji se pri tome primjenjuje najee je sledei: 40

1 dio ksilola i 3 dijela apsolutnog alkohola......................................... 1 sat 1 dio ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ............................................1 sat 3 dijela ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ........................................1 sat ist ksilol I ..........................................................................................1 sat odnosno do prosvjetljavanja meterijala, a moe i da prenoi ist ksilol ll ........................................................................................1 sat Vrijeme dranja materijala u svakom od ovih rastvora zavisi od prirode i veliine objekta, ali nije manje od navedenog vremena. U sudove sa materijalom, koji je doveden do ist