View
141
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Diagnostic biologique du paludisme
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Cycle biologique de Plasmodium sp
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Cycle biologique de Plasmodium sp
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
• Diagnostic microscopique (frottis mince et goutte épaisse)
• Bandelette réactive
• Biologie moléculaire (en milieu de recherche principalement)
• Quantitative Buffy Coat malaria-test ou QBC test
Principaux moyens de diagnostic biologique du paludisme
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Diagnostic Biologique du Paludisme par Microscopie
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Diagnostic microscopique : technique de
référence
• frottis mince et goutte épaisse
• diagnostic d’urgence
• objectivant un parasite (forme asexuée / forme sexuée)– identifier l’espèce plasmodiale– évaluer la parasitémie
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Diagnostic Biologique du paludisme
Les étapes
1- Prélèvement du malade2- Préparation et coloration des frottis sanguins3- Examen microscopique des frottis sanguins à la recherche
des plasmodies– négatif : confirmation– Positif : suivre l’étapes suivantes
4- Identification d’espèces de Plasmodium5- Estimation de la densité parasitaire
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Confection de la goutte épaisse
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’une goutte épaisse
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Confection de l’étalement sanguin : frottis mince
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’un frottis mince
OUI
NON
1 2
3
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Méthodes de coloration
Coloration de May Grunwald-Giemsa
Coloration de Giemsa
Coloration rapide ou panoptique (kit commercial type Kit Ral® ou Dade®)
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Plasmodium sp infectant l’homme
P. falciparum
P. malariae P. ovale
P. vivax
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Plasmodium know lesi
(www.cdc.gov/eid) False-colour electron micrograph of a rhesus red blood cell infected with a mature segmented schizont-stage P. knowlesi malaria parasite, which is about to release its invasive merozoite stages.
A thin blood smear stained with Giesma from a fatal human case of P. knowlesi malaria
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince
Aspect de l’hématie parasitée (taille de l’hématie parasitée)
Aspect du parasite (noyau et cytoplasme)
Aspect du cytoplasme de l’hématie parasitée(tâches, granulations)
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Examen de frottis mince
Examen de goutte épaisse
Plasmodium falciparum
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Plasmodium vivax
Examen de frottis mince
Examen de goutte épaisse
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Plasmodium ovale
Examen de frottis mince
Examen de goutte épaisse
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Plasmodium malariae
Examen defrottis mince
Examen de goutte épaisse
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Calcul de la densité parasitaire
Sur la goutte épaisse 8000 globules blancs (leucocytes) par µl de sang
Compter les parasites (forme asexuée) pour 500 leucocytes
Nb parasites relevés X 8000
Nb de leucocytes comptés
Nb parasites/µl de sang =
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Calcul de la densité parasitaire
Sur le frottis mince:
Compter le nombre d’hématies parasitées dans 100 champsde bonne qualité sans chevauchement des hématies, sansespace libre entre les hématies, au niveau de la queue dufrottis
Estimer le % d’hématies parasitées
Ramener la densité par µl de sang si nécessaire (Supposeravoir 5 000 000 d’hématies par µl de sang)
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Autres méthodes de diagnostic Biologique du Paludisme
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Détection des antigènes de plasmodies par immuno-chromatographique
migration d’un prélèvement de sang sur une membrane
Antigènes capturés par des anticorps monoclonaux fixés sur la membrane
révélation par de nouveaux anticorps monoclonaux couplés à un particule colorée révélatrice.
Bandelette réactive
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Test de Diagnostic Rapide: illustration
(http://www.diamedchina.com)
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Amplification d’un segment de l’ADN par la réaction enzymatique répétée (PCR endpoint ou PCR en temps réel)
Avec besoin en :• Équipement (thermocycleur …)• Personnel formé• …
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR Classique
- Préparation du mix- Amplification du mix- Migration sur gel agarose- Prise en photos du gel- Interprétation des résultats suivant la taille des bandes attendues
PCR en temps réel(RT-PCR)
- Sonde fluorescente- Quantification et caractérisation de l’amplicon formé à chaque cycle- Préparation du mix- Amplification- Interprétation des résultats suivant la température de fusion
(http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm)Mangold K. et all,2005. Real time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp. J. Clin. Microbiol, 5: 2435-2440.
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Illustration : résultat de diagnostic d’espèce par PCR classique
M 1 2 3 4 5
100pb
200pb
Légendes: M: marqueur moléculaire, 1: témoin négatif ; 2 et 4: P. falciparum (176 pb); 3 et 5: P. vivax (120 pb); 5: P. malariae (145 pb); pour P.ovale(780 pb) non figuré.
Palu
dism
e : d
iagn
ostiq
uer a
vant
de
trai
ter
Illustration d’un diagnostic d’espèce par RT-PCR
Courbe d’amplification Température de fusion (°C)
Contrôles positifs
Présente 74,8 +/- 0,1 P. falciparum
Présente 73,2 +/- 0,2 P malariae
Présente 76,5 +/- 0,1 P. ovale
Présente 77,7 +/- 0,2 P. vivax
Diagnostic biologique du paludisme
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar