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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Regulación de la Glutatión-S-Regulación de la Glutatión-S-Transferasa (GST) de TriatomaTransferasa (GST) de Triatoma
infestans y su importancia en elinfestans y su importancia en elproceso de intoxicación porproceso de intoxicación por
insecticidas organofosforadosinsecticidas organofosforados
Sívori, José Luis
1993
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Sívori, José Luis. (1993). Regulación de la Glutatión-S-Transferasa (GST) de Triatoma infestansy su importancia en el proceso de intoxicación por insecticidas organofosforados. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2556_Sivori.pdf
Cita tipo Chicago:Sívori, José Luis. "Regulación de la Glutatión-S-Transferasa (GST) de Triatoma infestans y suimportancia en el proceso de intoxicación por insecticidas organofosforados". Tesis de Doctor.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1993.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2556_Sivori.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Regulación de la Glutatión-S-Transferasa (GST) deTriatoma infestans y su importancia en el proceso de
intoxicación por insecticidas organofosforados.
Autor : Sívori José Luis
Director : Dr. Edgardo WoodLugar de trabajo : Centro de Investigaciones de Plagas e Insecticidas
(CIPEIN-CITEFA/CONICET)
Tesis presentada para optar al título de Doctor en Ciencias QuímicasAño 1993
:3.(,1)
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A Esther N.
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Reginaldo L.
AGMDECDWENTOS
Quiero agradecer muy especialmente al Dr. Edgardo Jorge Wood, director yconsejero de estudios de esta tesis, con quien me he iniciado en la investigación
entomotoxicológica, por su interés en todo momento, sus valiosas opiniones ypor su constante colaboración, tanto en lo académico como en lo humano.
Agradezco :
Al Dr. Eduardo Nicolas Zerba director del Centro de Plagas e Insecticidas
(CIPEIN) por sus enseñanzas y consejos durante la realización de este trabajo.
A la Dra. Susana Amstein de Licastro por sus consejos en la síntesis y
purificación de varios compuestos utilizados en este trabajo así como en lainterpretación de algunos resultados.
A la Dra. Maria Inés Picollo de Villar por sus valiosas opiniones en el area
biológica.
A la Dra. Norma Casabé de Malkenson por su enorme colaboración en la
corrección de este trabajo.
A la Sra. Susana de Segovia, quien cuida nuestro insectan'o, por suexcelente predisposición para entregamos las vinchucas y por el apoyo quesiempre me brindó.
A mis compañeros del CIPEIN (en orden alfabético): Lic. Raúl Alzogaray,Lic. Adriana Casadio, Dra. Andrea Fontan, Paola Gonzalez Andino, Héctor
Masuh, Emilia Seccacini de Leguizamon, María Segovia de de Anivas, Lic.
Claudia Vassena los cuales siempre mantuvieron un ambiente alegre desolidaridad y compañerismo que permitió realizar con gusto mi tarea.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
(CONICET) y a CITEFA, instituciones a las que pertenece el Centro de
Investigaciones de Plagas e Insecticidas (CIPEIN), en especial al CONICET yaque a través de sus becas y subsidios se concretó este trabajo.
A las siguientes instituciones por su cooperación: Organización Mundialde la Salud (a través de su UNPD/World Bank/WHO Programme for Researchand Training in Tropiacal Diseases); SECYT (a través de su ProgramaNacional de Enfermedades Endémicas)
Al Dr. Eto por la donación de algunas saligeninas cíclicas fosforadas.
Al Lic. Dan'o Bongiovani por la realización de los espectros de RMN lH.
A la Lic. Patricia Rodaro por su constante apoyo moral y por respetar y
saber compartir mi gran interés por la ciencia.
Finalmente agradezco a mis familiares, que siempre me apoyaron en todolo que tuvieron a su alcance permitiendo en gran medida la realización de este
trabajo.
Llegará una época en la que una investigación diligente y prolongada sacará a la
luz cosas que hoy están ocultas....Por lo tanto este conocimiento sólo se podrá
desarrollar a lo largo de sucesivas edades. Llegará una época en la que nuestros
descendientes se asombrarán de que ignoráramos cosas que para ellos son tan
claras...Muchos son los descubrimientos reservados para las épocas futuras,cuando se haya borrado el recuerdo de nosotros.
Nuestro universo sería una cosa muy limitada si no ofi'eciera a cada época algoque investigar...La naturaleza no revela sus misterios de una vez para siempre.
Séneca, Cuestiones naturales,libro 7, siglo primero
Abreviaturas utilizadas
Ache
AqATATC
BHABP
cDNA
CDNB
CPM
DNA
DPM
DTNB
GSH
GSSG
I-3-A
PTA
PTA-EST
QRNA
SZHBG
SBF
SCP
SNC
SPNBGTCATEPP
AcetilcolinesterasaFase acuosa
Azul de TimolAcetilüocolina2-ter-butil-4-metoxi-fenol
Butóxido de piperonilo
copy DNAClorodinitrobenceno
Cuentas por minutoAcido desoxirribonucleico
CPM/% Eficiencia
5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoato)Glutatión reducido
Glutatión oxidado
Glutatión-S-Transferasa
Indol-3-acetonit1iloIndol-3-caibinolIoduro de acetiltiocolina
Constante de disociación
Constante de inhibición
Constante de Michaelis
MetanolPeso molecular calculado como movilidad relativaexpresado en Daltons
RNA mensajeroOrganofosforadoFase orgánicaFeniltioacetato
Esterasas inespecíficasQuercetinaAcido iibonucleico
S-(2-hidoni-bencil)-glutatiónSulfobromoftaleína
Saligeninas cíclicas fosforadasSistema nervioso central
S-(paIa-nitro-bencil)-glutatiónAcido tricloroacético
Tetraetilpirofosfato
Indice
INDICE
PAG.
I. INTRODUCCIÓN
1. INTRODUCCIÓN 1
2. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN ............................ .. 3
3. GST EN NO-VERTEBRADOS 9
3.1. Efecto de selección 10
3.2. Efectos del desan'ollo 11
3.3. Distribución tisular 12
4. PROPIEDADES FÍSICAS 14
4.1. Pesos moleculares y estructura de las
subunidades 14
4.2. Puntos isoeléctn'cos 19
4.3. Métodos de aislamiento 19
5. PROPIEDADES CATALÍTICAS 21
5.1. Sustratos 21
5.2. Inhibidores 24
5.2.1. Aspectos generales 24
5.2.2. Unión de ligandos e inhibición 25
5.3. Inductores 33
5.4. Estudios cinéticos 40
5.4.1. pH óptimo 40
5.4.2. Constantes de Michaelis 41
5.5. Mecanismo de catálisis 41
Indice
6. REACCIONES DE LAS GST CON
INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS ............................ ..
6.1. Introducción
6.2. Reacciones generales
6.2.1. Conjugación O-alquil
(dealquilación GSH dependiente)
6.2.2. Conjugación O-ari]
(dean'lación GSH dependiente)
6.3. Ruptura no enzimática de los
metabolitos
6.4. Rol de las GST en la toxicidad
selectiva
6.5. Mecanismo de resistencia
7. EL Triatoma infestans Y LA
ENFERMEDAD DE CHAGAS
PROPÓSITO DEL TRABAJO
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
2. OBTENCIÓN DE ENZIMAS
2.1. Glutatión-S-Transferasa y
PTA-Esterasas
2.1.1. Purificación de GST y
PTA-EST de vinchuca
2.2 Ache
2.3. Obtención de microsomas
2.4. GST comerciales
48
49
51
53
55
56
57
5 8
62
64
65
65
65
66
u.)
Ulah
O\
7.
Indice
. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA
3.1 . GST
3.2. PTA-EST (no especificas)
3.3. Ache
. DETERMINACIÓN DE PROTEÍ’NAS
. APLICACIÓN DEL TÓXICO
5.1 . Inyección
5.2. Tópico
5.3. Oral
5.4. Film tela
. INHIBIDORES UTILIZADOS
6.1. Quercetina
6.2. Azul de timo]
6.3. Squobromoflaleína
6.4. S-(2-hidonibencil)-glutatión
6.5. S-(p-nitrobencil)-glutatión
DETERMINACIÓN DE I50
8. ESTUDIOS CINÉTICOS
9.
8.1. Determinación de Km y Vmáx
INDUCTORES UTILIZADOS
10. DETERMINACIÓN DE LA DOSIS
LETAL 50 (DLso)
10.1. Tratamiento estadístico de los
resultados
11. TÉCNICA DE WASH-OFF
66
66
67
68
69
70
70
70
70
71
71
7l
72
72
73
73
73
74
74
75
76
76
77
Indice
12. SÍNTESIS DE COMPUESTOS
12.1 Síntesis del aducto S-(2-hidroxibencil)
glutatión
12.2. Síntesis del desmetil fenitrotión
(O-metil-O-3-metil-4-nitrofenil
fosforoüonato)
13. COMPUESTOS RADLACTIVOS
13.1. 14C-Fenitrotión
13.2. l“C-Etil-Paratión
14. AUTORRADIOGRAFÍA
15. ENSAYOS IN VITRO
15.]. Medición de la actividad demetílante
de la GST sobre el 14C-Fenitrotión
15.2. Micro incubación (metabolismo in
vitro)
16. ENSAYOS IN VIVO
16.1. Toxicocinética de 14C-Fenitrotión
16.2. Metabolismo in viva del
1“C-Fenitrotión
III. RESULTADOS
l. Ensayos “ in vitro "
1.1. Estudios de inhibición con colorantes
del üifenilmetano y algunos flavonoides
1.1.1. Tipo de inhibición producido
porlaQ, SBFyAT
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77
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79
79
79
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80
80
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82
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84
85
Indice
1.2. Estudios de inhibición con saligeninas
cíclicas fosforadas y compuestos
GS-bencil sustituidos
1.2.1. Síntesis y caracterización del
S-(2-hidroxi-bencil)—glutatión
1.2.2. Tipo de inhibición producido
por los compuestos GS-bencil
sustituidos
2. ENSAYOS 'INVIVO’
2.1. Ensayos realizados con Querceüna
2.2. Ensayos realizados con Azul de Timol
2.3. Inducción
2.4. Toxicocinética del 14C-Fenitrotión
3. BIOTRANSFORMACIÓN IN VITRODE
INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS
3.]. Degradación GSH-dependiente
3.2. Sintesis y caracterización de] desmetil
Fenitrotión
3.3. Análisis cualitativo y cuantitativo de los
metabolitos del 14C-Fenitrotión
3.4.
3.5.
Efecto producido por la Quercetina
Análisis cuantitativo de los metabolitos
polares y no polares l“C-Paratión
3.6. Análisis cualitativo y cuantitativo de los
metabolitos del 14C-Parafión
3.7. Estudios realizados con microsomas
4. BIOTRANSFORMACIÓN av nro DEL
“C-FENI'I'ROTIÓN
n o o u u . - o c o o u o a o o c c p a c s a s . a 0 a no
91
92
93
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100
104
108
114
115
115
117
120
121
122
123
124
124
Indice
IV. DISCUSIÓN 123
V. RESUMEN Y CONCLUSIONES 143
VI. BIBLIOGRAFÍA 146
I. INTRODUCCIÓN
IntroducciónPág. l
l. INTRODUCCION
La habilidad que poseen los organismos vivos para metabolizar
compuestos tóxicos hacia sustancias de menor toxicidad y más fácilmenteexcretables constituye una herramienta esencial para su supervivencia.
Uno de estos caminos detoxificantes involucra la conversión de
sustancias hidrofóbicas en compuestos más hidrofilicos. La transformaciónenzimática de estas sustancias es realizada en parte por las glutatión-S
transferasas, que son un grupo de enzimas que catalizan el ataque
nucleofílico del grupo tiol de] tn'péptido glutatión sobre gruposelectrofilicos de un segundo sustrato (generalmente compuestos
orgánicos).
FIX+GSH——> GSR+XH
co-nu-cuz—coou
Hs—cuz—<::H
NH-CO-CHz-CHz-(ÏH-COOH""2
Glutatlón Reducldo | GSI-l]
El efecto de esta reacción es la conversión de una molécula
lipofílica reactiva, en una molécula conjugada no reactiva y soluble enagua, la cual puede ser fácilmente excretada después de un mayorprocesamiento si fuese necesario (l).
Si bien el sitio de unión para el glutatión es casi completamente
específico, estas enzimas muestran una remarcable falta de especificidadhacia el sustrato electrofílico, pudiendo catalizar la conjugación de unamplio espectro de compuestos. Este grupo de compuestos incluye a los
alquil y aril halogenuros, carboxilatos, sulfatos, fosfatos, ésteres, epóxidos,nitratos orgánicos, tiocianatos e hidroperóxidos (l) (2) (3) (4).
Además de sus propiedades catalíticas, algunas GST puedenrealizar una detoxificacíón pasiva por absorción reversible de tóxicosorgánicos potenciales (aniones), actuando también como proteínastransportadoras intracelulares de ciertas moléculas orgánicas,comportándose como un equivalente intracelular de la albúmina en elplasma sanguíneo (5).
IntroducciónPág. 2
Las GST pueden tener alta concentración en la célula (aprox 0.]mM), con lo cual la absorción de un ligando sobre la enzima puede reducir
apreciablemente la concentración del tóxico libre.Ligandos como el hemo, SBF y bilirrubina pueden unirse
fuertemente a las GST de rata, e hígado humano (6). Las evidencias
presentadas sobre la unión de estos ligandos a la enzima, indican que lamisma puede tener lugar en un sitio que llamaremos "Ligandina" distintodel sitio catalitico (7). Sin embargo en otras circunstancias el ligando
puede aparecer unido al sitio catalíúco e inhibir la reaccióncorrespondiente (8).
Los estudios sobre las GST han sido realizados principalmente en
mamíferos; y el motivo ha sido la probable relevancia que tienen estasenzimas en la farmacología y oncología humana, ya que estas proteínas
son generalmente consideradas como las responsables de la detoxificaciónde sustancias mutagénicas, carcinogénicas y otros compuestos químicosnocivos (9). Recientemente se encontró que ciertas formas de GST son
expresadas en altos niveles en células tumorales (10). Esto abre la
posibilidad de utilizar esta expresión en diagnósticos clínicos de tejidos
neoplásicos y preguntarse sobre el papel que cumplen las GST en eldesarrollo de resistencia a drogas, a menudo encontrada en tratamientosquimioterapéuticos.
Ademas de los estudios realizados sobre enzimas de vertebrados,
han sido de considerable interés las glutaüón-S-transferasas de organismosno vertebrados. Este interés, apunta a develar el rol que desempeñan estas
enzimas en la protección del organismo hacia compuestos tóxicos
exógenos, provenientes del medio ambiente. La observación de elevados
niveles de GST puede ser asociada con la tolerancia hacia pesticidas,teniendo este aspecto una sustancial dimensión económica en el caso de
plagas de cultivos y sanitaria en el caso de insectos vectores (4) (l l).Por las caracteristicas de estas enzimas el énfasis de los estudios
realizados en no-vertebrados ha recaído primordialmente sobre el efectoprotector más que sobre la naturaleza misma de estas proteínas. Comoresultado de ésto, las GST de organismos no-vertebrados han recibidohasta el presente un escrutinio poco detallado comparado con el realizadoen mamíferos.
IntroducciónPág. 3
2. NOMENCLATURA Y CLASIFICACIÓN
A menudo se asume que el rol principal desempeñado por las GSTes la detoxificación de electrófilos reactivos, pero aún no está totalmente
comprendida su función. Los sustratos "naturales" de estas enzimas sonaún desconocidos, consecuentemente las múltiples formas de las GST, no
pueden ser distinguidas claramente por el criterio tradicional basado en laespecificidad hacia distintos sustratos.
Una de las primeras clasificaciones de las distintas formas de GST
fue realizada por Boyland y Chasseaud (l) quienes introdujeron lostérminos, aril-transferasas, epoxi-transferasas, alquil-transferasas, aralquiltransferasas y alqueno-transferasas. En ese momento, la evidenciadisponible sugería que las GST podían ser distinguidas sobre la base de
sus especificidades hacia distintas familias de sustratos electrofïlicos.
Sin embargo, la posterior separación y purificación de van'as formas
de enzima demostraron consecuentemente que estas mostraban un
solapamiento en la especificidad hacia distintos electrófilos y que suactividad no estaba limitada a un solo tipo de grupo fimcional del segundo
sustrato. Por ejemplo, la proteína aislada como "epóxido-transferasa" fuetambién activa con alquil y aranuil halogenuros (12), y dos isoformas de
"aril-transferasa" fueron ambas activas cuando se utilizó un epóxido comosustrato (13).
Por lo tanto, la nomenclatura original fue reemplazada pordesignaciones basadas en las propiedades fisicas o estructurales de la
proteína, más que sobre la base de sus propiedades enzimáticas. Se ha
dejado de lado la nomenclatura basada en la especificidad hacia sustratos,ya que casi todas las investigaciones fueron realizadas con sustratos queposeen poca relevancia biológica, como son los cloronitrobencenos ehidrocarburos halogenados.
La identificación prácticamente reciente de un tipo de GST en tejidode rata con una alta actividad hacia los 4-hidroxialquenales (14), los cualesconstituyen una clase de sustrato que pueden ser formados in vivo, sugiereel descubrimiento de una verdadera "alqueno-transferasa"; y abre laposibilidad en un futuro de reintroducir la nomenclatura que indique lafunción de las enzimas. Sin embargo, en el presente este tipo denomenclatura no tiene una fundamentación sólida.
IntroducciónPág. 4
Jacoby y sus colaboradores sugieren que hay 6 formas de GST, lascuales han sido identificadas en hígado de rata y que podrían ser
nombradas empíricamente como GST E, D, C, B, A y AA, en orden deelución de una matriz de intercambio iónico de carboximetilcelulosa (15
17). Una séptima forma anteriormente identificada por Gillham (18), quemostró ser particularmente activa hacia el menafiilsulfato, fue nombradatransferasa M.
Las dos isoenzimas de glutatión "aril-1Iansferasa", formas I y II,
fiieron identificadas como transferasas C y A reSpectivamente (13).
Las GST citosólicas son proteínas diméricas, y fueron Mannervick
y Jensson quienes evidenciaron que las seis formas principales de enzimaencontradas en hígado de rata pueden ser consideradas como
combinaciones homo y heterodiméricas de cuatro subunidades diferentes,y esta combinación a su vez provee distinta especificidad hacia losdistintos sustratos.
El descubrimiento de que las propiedades enzimáticas de estas
proteínas djméricas reflejaba la composición de sus subunidades, conducea sugerir que las GST pueden ser nombradas sobre la base de sussubunidades constituyentes (19). En varios workshops realizados se ha
acordado denotar cada subunidad diferente de GST con números arábigos
(20). En conformidad, la transferasa A en la nomenclatura de Jakoby,consiste en dos subunidades idénticas llamadas "3", y fue renombradacomo "GST de rata 3-3". La transferasa C, es un heterodímero formado
por las subunidades 3 y 4 y fue llamada "GST de rata 3-4". A su vez sehan aislado 8 subunidades enzimáticamente distintas en rata.
La Tabla l muestra las enzimas de rata designadas por númerosarábigos y sus designaciones previas.
IntroducciónPág. 5
Tabla lNomenclatura de las GST cltosóllcasde rata
Nomenclatura Nueva Nomenclatura Nomenclatura Designaciónprevia previa alternativaRef :6, 17, 21-23 Ref :19 de Subum'dades
Un sistema adicional para nombrar las subunidades de las GST de
rata está basado en sus movilidades relativas en una electroforesis en gelde poliacn'lamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Originalmente,
se distinguieron las subunidades Ya, Yb e YC en orden de movilidaddecreciente (24). Los Mr estimados para estas subunidades se encuentranentre 21,000 y 29,000, pero la secuenciación posterior de aminoácidos
mostró que el verdadero Mr era cercano a los 25,000. Se sabe que ladeterminación de los valores de Mr relativos depende del grado deentrecmzamiento del gel de poliacrilamida (26).
En la discusión sobre la nomenclatura, fueron adoptados variosprincipios importantes (21). El nombre de la enzima debe especificar laespecie biológica, pero no el órgano del cual ha sido obtenida la misma.Las subunidades deberían ser numeradas secuencialmente en el orden en
que éstas han sido descubiertas y caracterizadas.
En la extensión de la nomenclatura hacia otras especies demamíferos, se ha decidido que las GST de otras especies sean nombradaspor los mismos principios, pero independientemente de las enzimas de rata
(27). La razón es que el presente conocimiento no es suficiente parahomologar enzimas de diferentes especies, y establecer unacorrespondencia entre las mismas.
La Tabla 2 muestra las enzimas de ratón identificadas y el nombreutilizado. La cepa de ratón de la cual la enzima ha sido obtenida debe ser
IntroducciónPág. 6
indicada por una letra (27). Consecuentemente, la forma enzimática GT8.7 de la cepa CD-l ha sido designada GST de ratón C l-l, la forma F3 dela cepa DBA/2] transferasas D l-l, y la forma MIII de la cepa NMRItransferasa N 1-1.
Tabla 2Nomenclatura de las GST cltosóllcas de ratón
Nota: Las transfer-asasC l-l, D l-l yN l-l son idénticas o erm'massanamenterelacionadasdeu'esccpasdiferentes
Se cree que las transferasas de ratón l-l son la misma proteína en
las tres cepas, y la letra solo sirve para distinguir posibles variantes en lascepas. Esta van'ación en las proteínas puede estar relacionada con las
conocidas diferencias de sensibilidad entre distintas cepas de ratón haciaciertos compuestos tóxicos.
Adicionalmente se han aislado GST con menor abundancia, peroéstas todavía no han sido nombradas. Por ejemplo, el pulmón de rata y
ratón contiene varias formas menores las cuales poseen puntosisoeléctricos cercanos a la neutralidad o levemente acídicos.
En rata las GST son el producto de una familia de supergenes lacual aparece constituida como mínimo por tres familias de multi-genes.Estas familias de multigenes (a, p. y 11:)han sido descriptas en rata, ratón y
hombre (28) y fueron originalmente definidas en términos de especificidadcon respecto a distintos sustratos y de la susceptibilidad hacia van'osinhibidores.
I-Iay una marcada homología entre los miembros de esas familias
tanto intra como inter especies.
Las GST humanas fileron originalmente designadas con letragriegas. Cinco proteínas básicas han sido pun'ficadas del citosol del hígadohumano y fueron nombradas 0L, B, y, 5 y e en orden a sus puntos
isoeléctricos crecientes. En vista de las similitudes en sus propiedadesenzimáticas e inmunológicas y el marcado polimorfismo en la expresiónde las transferasas básicas, las isoenzimas originales no pueden ser
IntroducciónPág. 7
rigurosamente identificadas con enzimas purificadas posteriormente. Poresta razón, a veces simplemente se refieren colectivamente comotransferasas (OL-e)o "transferasas básicas".
Sin embargo, tres enzimas básicas humanas, 2 homodímeros y su
correspondiente heterodímero, han sido recientemente aisladas ycaracterizadas.
Una enzima distinta con un punto isoeléctn'co cercano a laneutralidad fue llamada GST r1 (29). Un tercer tipo, la GST 1:, ha sido
aislada de placenta. Esta enzima es probablemente idéntica a la proteínaácida aislada primeramente de eritrocitos y designada como transferasas r.
Las transferasas acídicas de órganos humanos como el pulmón,riñón etc., también parecen corresponder a la transferasa 1LLa designación
de GST 1: ser-áutilizada hasta que se realice una mejor caracterización de
la proteína aislada de placenta; y entonces se pueda utilizar a ésta como
referencia para realizar comparaciones.Los tres principales tipos de GST humanas han sido clasificados
sobre la base de sus puntos isoeléctricos como "básicas", "cercanas a la
neutralidad" y "acídicas". Sin embargo algunos informes sugieren que lasformas acídicas de la enzima están relacionadas estructuralmente con las
"básicas".
Consecuentemente, es más racional referirse a las distintas
transferasas citosólicas de mamíferos por las tres clases definidasestructuralmente, clase alfa, mu y pi.
Los números arábigos no han sido todavía adoptados para nombrar
las GST humanas ya que el polimorfismo de las enzimas humanas ha
hecho muy dificil la identificación de las múltiples formas. Tampoco unanomenclatura similar unificada ha sido propuesta para las transferasas delmaiz o de otras especies biológicas.
En suma a las GST citosólicas, se ha identificado una enzima unida
a membrana (30). Esta proteína fue aislada por primera vez de la fracciónmicrosomal de hígado de rata y es referida generalmente como GST
microsomal, pero a su vez está presente en otras fracciones subcelulares
(31).
En suma; la expresión de las múltiples formas de GST difieren deun tejido a otro, y a su vez puede ser alterada su actividad por drogasinductoras del metabolismo (32).
IntroducciónPág. s
La presencia de diferentes formas de tnnsferasas también cambiadrásticamente durante la transición del estado fetal al adulto (33-35).Además en ratón, se han encontrado diferencias relacionadas con el sexo
en la expresión hepática de una forma enzimática especifica, la cual está
aparentemente bajo el contIol de la testosterona (36).
IntroducciónPág. 9
3. GST EN ORGANISMOS NO-VERTEBRADOS
Uno de los aspectos más sorprendentes de estas enzimas es su
amplia distribución, siendo muy pocos los organismos descriptos como noposeedores de este mecanismo detoxificante.
Los niveles de actividad encontrados varían ampliamente tanto intra
como inter especie, sin embargo se pueden realizar algunas comparaciones
entre especies cuando se utiliza CDNB como sustrato. Este compuesto ha
probado ser muy activo con virtualmente todas las GST testeadas. De estamanera, este método es utilizado para dar una medida de la suma de laactividad catalítica de todas las formas de enzima presentes en los
preparados (37).El método de ensayo, originalmente desarrollado por Cohen et al.
(1964), es ahora realizado utilizando las condiciones desarrolladas por
Habig et al. (1975). La adopción generalizada de este ensayo como método
standard ha permitido la comparación de datos de una amplia variedad de
organismos.Desafortunadamente, las condiciones standard no han sido
adoptadas para otros sustratos utilizados comúnmente, como por ejemploel 3,4-dicloro-nitrobenceno DCNB (38), lo que dificulta las comparaciones
entre resultados publicados por distintos laboratorios.
Los estudios realizados revelan la amplia distribución que poseenestas enzimas.
El valor más alto de actividad específica informado fue el del
homogenato realizado con Phyllopertha hortícolae (19000 nmol/min/mg);Myzus persicae (8000 nmol/min/mg) y BIatelIa germánica (6000nmol/min/mg) (39).
Una actividad similar medida a pH 6.5 fue obtenida para Ischnuraelegans (6000 nmol/min/rng) (40). Bajo esas mismas condiciones estas
actividades son comparables con las obtenidas con homogenatos de
hígado de rata los cuales poseen un valor entre 800-1200 nmol/min/mg(40).
Hay por lo tanto, variaciones de una especie a otra; en la actividadtotal, así como en las propiedades cualitativas.
Los homogenatos de bacterias, generalmente muestran baja oindetectable actividad (2-8 nmol/min/mg proteínas) con CDNB (41-42), y
IntroducciónPág. 10
algunos hongos estudiados muestran tener una modesta actividad (41)(43).
Sin embargo, es virtualmente imposible predecir con facilidad la
actividad de los homogenatos crudos de otros organismos sobre la base de
su posición taxonómica (40). Se han estudiado gran cantidad de especiesanimales (38-40) (44-45) y se ha encontrado una amplia variación de
actividad dentro de grupos de organismos relacionados.
Por ejemplo dentro de un grupo de 19 coleópteros, la actividad
medida usando CDNB como sustrato varió en un rango de 30. Entre 8
dípteros, el rango fue de lO y entre 8 cnidarias, el rango fue de 100 (39).
Ocho especies de lombrices de tierra presentaron una variación de lOveces. En algunas plantas estudiadas las actividades informadas fueron
desde casi cero a 1200 nmol/mg/min (1 l) (46).
Un estudio realizado por Stenersen et. al. (1987) sobre la actividad
GST de 72 especies animales, encontró que todas las preparacionestesteadas salvo l mostraron actividad frente al CDNB, 28 mostraron una
actividad no detectable con ácido etacn'nico y 27 (mucho de los cualeseran invertebrados marinos) mostraron actividad no detectable con DCNB.
La actividad GST puede verse afectada por factores tales como laselección y el desarrollo así como por su localización tisular.
3.1. Efecto de selección
Dentro de una especie, la capacidad total de conjugar GSH puede
mostrar una amplia variación dependiendo de la historia genética de la
cepa. La selección, particularmente en los casos de tolerancia ainsecticidas, puede conducir a un marcado aumento en la actividadenzimática.
Los datos en la literatura concernientes a la actividad de GST en
moscas muestran una variación de aproximadamente 30 veces entre 12
cepas estudiadas cuando se utilizó DCNB como sustrato (47-50) (4).Tomando la cepa multiresistente Rutger como el 100% de actividad, elrango de actividades de las otras especies fueron del 25-30% para lascepas suceptibles como NAIDM y Chiba-D hasta de 400-700% para lacepa altamente resistente a fosforados como la Hirokawa y Cornell R.
Las evidencias presentadas por Clark et al. (50) demuestran que en
estos últimos casos de cepas de moscas altamente resistentes, las GST
IntroducciónPág. ll
representaban el 6% del total de las proteínas solubles. En contraste, en
Drosophila Melanogaster, las actividades de conjugación de CDNB para
la cepa Berlin K. Hikone-R y Karnas 60 (51) fueron comparables (230i20nM/min/mg). Las actividades de conjugación con cis- y trans-stilbenooxidado variaron en un factor de 2 con las cepas Oregon R-C, Hikone-R y
II k A 15 (52).
3.2. Efectos del desarrollo
Las actividades enzimáticas pueden ser marcadamente afectadas poreventos ocurridos durante el desarrollo. En Lucilia cuprina, las actividades
enzimáticas alcanzan un pico durante el estado pupal cayendo cerca del
15% durante la mayoría del estado adulto. Las actividades en la aparición
son 3-5 veces mayores que en la madurez (53). Un patrón similar es
informado para el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegyptae(Louisville) (54). Similarmente en la mosca del repollo, Delia floralis, losniveles enzimáticos son máximos en el estado larva] y pupal, declinando a
la mitad de esos picos en la forma adulta (39). En contraste, en Triatoma
infestans (vector de la enfermedad de Chagas) las actividades con CDNB
aumentan progresivamente desde huevos, hasta ninfa V para alcanzar elmáximo nivel en adulto. En esta especie hay una sustancial diferencia
sexual: el macho posee una actividad 70% mayor que la hembra (55). ElTenebrio moIítor (el coleóptero gusano de la comida) muestra mínimas
actividades en el estado pupal y por otro lado, Hylobucs abietis muestramuy poca variación durante su ciclo de vida (39).
En Heliothis virescens. se ha encontrado que la conjugación con
DCNB puede variar en un factor de 3 dentro de un mismo estado (56).
En la mosca doméstica, la actividad de la enzima responzable delmetabolismo (glutatión-dependiente) del lindane y compuestos
relacionados alcanza un pico a los 3-4 dias después del surgimiento paradeclinar posteriormente (57). La actividad de la GST medida con DCNBno es detectable en los huevos de mosca doméstica, alcanzando su máximo
nivel en la larva de 9 dias, declinando suavemente en la pupa para declinarfinalmente alos días 3-5 del adulto.
La actividad en la hembra fue cerca de dos veces la de los machos.
La actividad GST de los insectos resistentes de la cepa Rutger fue mayor
IntroducciónPág. 12
que en la cepa susceptibles CSMA tanto en ambos sexos como en todoslos estados de desarrollo (58).
3.3. Distribución tisular
Dado el amplio rango de especies bajo cosideración, con la
correspondiente variación en la funciones anatómicas y fisiológicas, no es
posible hacer una comparación detallada entre las distintas especies. Sinembargo en los estudios en los que se ha considerado la disuibución tisularde la enzima aparece casi invariablemente actividad enzimática en todos
los tejidos estudiados.Tanto en animales marinos (45) como en insectos (vinchuca) (55),
la actividad más alta fue encontrada en genitales, en tejidos expuestos a
sustancias químicas ambientales como las branquias (59) (45), intestino
(55) (53) (39) (60), cutícula (53), así como en órganos excretores como la
glándula verde en crustáceos (59) (45), nefrones en gusanos (39) y túbulos
de Malpighi en insectos (55). Organos con ñmciones análogas al hígado devertebrados, como el cuerpo graso en insectos (60) (53) o el
hepatopáncreas de moluscos o crustáceos (45) (61) (59) también mostraronun alto nivel en la actividad de GST.
Las actividades relativas hacia los distintos sustratos varían de
acuerdo con el tejido utilizado, cuando se utilizan como material biológicoinvertebrados marinos (45) o Lucílía cuprína (53) . Los diferentes tejidos
muestran distintos espectros de actividad GST, el cual puede representar lanecesidad de detoxificación de ese tejido en particular.
En plantas, como en animales, las GST son encontradas
prácticamente en todas partes. En el maíz la actividad específica con
respecto al CDNB file de 0.9, 1.1, 1.6 y 0.6 umol/min/mg) en hojas, hojas
verdes, raices y brotes respectivamente (46).
También se encuentra una alta actividad específica en el látex deHevea brasilíensis (0.17 pinol/min/mg proteína) la cual es 10 veces mayor
que la actividad específica de la enzima en hojas, tallo y semillas.La actividad de conjugación hacia el fluordifen fue detectada en
raíces, hojas y tejido calloso del algodón, maíz, maní, porotos, soja,
tomate, pepino y calabaza.Las comparaciones cuantitativas no han sido realizadas, pero los
datos cualitativos sugieren que las actividades enzimáticas varían entretejidos (62). Por lo dicho, está clan que dentro de una población, hay
IntroducciónPág. 13
factores intn'nsecos (por ej. programa de desan'ollo, historia génetica) los
cuales pueden afectar la medida de los niveles de actividad de GSTsustancialmente.
Sumando a los factores intrínsecos a su vez pueden superponerselos exu-ínsecos, debido a factores ambientales.
Por lo tanto, los resultados pueden variar potencialmente en un
amplio rango de actividades GST, tanto dentro de una población de una
dada especie, como dentro de un mismo individuo en sus distintos tejidos.
IntroducciónPág. 14
4. PROPIEDADES FÍSICAS
4.1. Pesos moleculares y estructuras de las subunldades
La multiplicidad de formas de las GST en los distintos organismoscrean grandes problemas en la identificación de las formas individuales.
En rata, por ejemplo, hay evidencias acerca de la existencia de másde 12 GST citosólicas y al menos l GST microsoma].
Esto hace prácticamente imposible la identificación de una forma en
particular, a menos que haya sido realizada su caracterización completa .El problema de la identificación aumenta, cuando nuevas fuentes de
enzimas son investigadas, o cuando se estudian los cambios en la actividad
enzimática producidos por inductores o durante el desarrollo de losorganismos.
Consecuentemente, se utilizan un conjunto de caracteristicas, paralograr la identificación de una forma enzimática, que involucra la
especificidad de sustratos, sensibilidad a inhibidores, reacciones con
antisueros específicos y propiedades fisicoquimicas de las proteínas.
Tabla 3Caracteristicas flslcoquímlcas de las GST de rata
Isoenz. Clase Apar.Sub Sub Mr aa PuntoMra Subb isoelec.
a Valores relativos estimados por elecuoforsis en gel de poliacrilamidawodecil sulfato de sodiob No se incluye el residuo metionina N-tenninalCTodavía no clasifimda
Ref (63)
IntroducciónPág. 15
Tabla 4Característlcas flslcoquímlcas de las GST de rata
Isoenzima Clase Apar. Sub Ptmto
a Valores relativos estimados por electroforesis en gel de poliacrilamidawodecil sulfato de sodioRef. (63)
Las formas individuales de las GST citosólicas identificadas en
diferentes especies a su vez no tienen una relación obvia entre unas yotras.
Los pesos moleculares de las GST de los invertebrados estudiadoscaen dentro del rango de los 36.000-50.000 (Tabla 5). Casi
invariablemente, consisten en dos subunidades, las cuales pueden o no ser
idénticas, con pesos moleculares informados entre 20.000-27.000. Lospesos moleculares citados para el cúmulo de enzimas nativas son de
alrededor de 38.000 (promedio 43.000 i 8000) y para las subunidades unpromedio de 24.900 i 3100.
Los pesos moleculares aparentes de las enzimas tanto de mamíferoscomo de insectos, han sido determinados en su mayoría por cromatografia
de permeación por geles (SDS-PAGE), por lo tanto algunas de las
variaciones informadas pueden ser debidas a artefactos experimentales.
Esta técnica puede ser afectada significativamente por el pH, la fuerza
iónica, así como por la pureza de los reactivos utilizados (64), lo quejustificada el amplio rango de pesos moleculares informados.
Introducción
Pág. 16
Tabla 5
Pesos moleculares y estructura de las subunldades de no-vertebrados
Especie Peso molecular x 10-3 PM Subnld x 10-3
Liamlapidópteros Sl 25
Gallen’a mellonella 40-50 24.6
W'Lseanacervinata
Dípteros
Musca domestica 54/37 19
22.7
20, 26
22
23.5
50 23
40 25, 23
36, 37 ——
Ceran'ti:capitaram 43 21, 22
Drosophüa malanogaster 63 28, 35.8
Delia floran's —— 25, 26
Calh'phora vomiteria — 25
Coleópteros
Costelytra zealandica 39 23.5, 22.8, 23.7
Phyllopertha horn'cola --- 23
chüópten
Per-¡planetaamericana 35-37
Hlmenópten
Apis mellg'fera 38.5 —
'cnidos
Rhizogbphusrobim' — 25MinasSaccharomycar 250
HumPura-¡um oxgvsporum —— 25
Rhizoczomasolani _ 25
IntroducciónPág. 17
cumDaphm'a magna 55-62 27.5
28
30.2
Callinectes sapidus 40.3 22.3
22.4
nlnode
AsteriaJ rubeus 26, 26.8
DMHeüx aspersa 37 ———HMMoniesa expansa 37
Enchytreidafoerida 46
Lumbn'au mbellus 37
Tubifa mszfex 30-38
Etsenia unicolor 27, 25, 28
Hana_rh
Dugesia gema 37
Pen'paloidesnovaaealandiae 40
indoggg
Hydra atlenuata 25
mmZea may: 45
50
Pis-wn san'vum 47, 82
37, 75, 150
En estudios donde se han comparado enzimas nativas deinvertebrados con preparaciones enzimáücas de hígado de rata, se haencontrado que los pesos moleculares de las enzimas de invertebrados sonsimilares o levemente menores (64) (39).
En suma a los casos antes mencionados, hay casos informados los
cuales no parecen ajustarse al modelo general.
En preparacciones parcialmente purificadas de moscas altamenteresistentes, (cepa Comell A), Motoyama y Dauterman (65) informaronpara la enzima nativa un peso molecular de 57.000, y uno de 36.000 para
IntroducciónPág. is
la forma más purificada por electroforesis de la enzima. Un peso molecularinusualmente alto también es informado para GST de Drosophíla
Melanogaster tipo salvaje (66). El peso molecular de la enzima nativa,determinado electroforéticamente, fue de 63.000 y ésta parece estar
constituida por subunidades de 35.000 y 28.500. Estas subunidades, quedifieren sustancialmente en tamaño molecular, aparecen
inmunológicamente relacionadas.
Otro peso molecular inusualmente alto (Mr 250.000) es elinformado para la enzima de Saccharomyces cereviseae. En este caso nohay información disponible acerca de la estructura de las subunidades (67).
Un comportamiento complejo también es informado para la enzimaDDT-dehidroclorinasa de mosca. Es apropiado considerar este
comportamiento aquí ya que se ha sugerido que la DDT
dehidroclon'nación puede ser una reacción catalizada por alguna GST(68). La DDT-dehidroclorinasa de Musca domestica, altamente resistente
al DDT, ha sido caracterizada como un monómero de Mr 40.000 el cualpolimeriza en presencia de altas concentraciones de DDT en dímeros,trímeros y tetrámeros (69). Los trímeros y los tetrámeros parecen sercatalíticamente activos, mientras que los monómeros y dímeros no. El
glutatión sirve para estabilizar a la enzima en la forma activa, pero otrostioles convierten la enzima en la forma monomérica. Esta enzima contiene
8 grupos cisteína por monómero y fue caracterizada como una lipoproteína(70).
Estas observaciones contrastan con las obtenidas en otros estudios
sobre DDT-dehidroclorinasa realizados por Ishida y Dahm (57). Estosinformaron que la forma activa de DDT-dehidroclorinasa de mosca y la
enzima conjugante de lindane y compuestos relacionados, tienen un pesomolecular de 36.000. En este caso, la actividad de dehidroclorinación fue
medida con concentraciones de DDT mucho más bajas que las informadaspor Dinamarca et al. (69) como capaces de producir la polimen'zación.
Resultados similares fueron obtenidos por Clark y Shamaan (68)para una enzima aislada de una cepa de moscas relativamente susceptible.
La forma activa de la enzima parece tener un peso molecular de 48.000 Mry posee subunidades de 23.000 y 25.000.
Las observaciones realizadas anteriormente no están necesariamente
en conflicto. Berger y Young (71) presentaron evidencias sugiriendo quelas moscas susceptibles y resistentes posee distintas DDT
InnoducdónPág. 19
dehidroclorinasas, ya que estas enzimas poseen diferentes especificidades
de sustratos. Quizás una comparación sistemática de las enzimas de
diferentes cepas de moscas podn'a clarificar sobre éste punto.
4.2. Puntos lsoeléctrlcos
Se han determinado los pI de las GST provenientes de una gran
variedad de organismos, generalmente por isoelectroenfoque (44) (72) ocromatoenfoque (61) (73).
En el caso de las GST de moscas parece que las enzimas que
poseen un pI mayor que pH=6.5 son cataliticamente más versátiles que lasde pl menor. A pesar de estos indicios todavía no es posible realizar unacorrelación entre pI y función.
Un caso interesante es el de las 12 isoenzimas aisladas del gusano
marino Tubifex tubifex (73). El análisis de los datos presentados muestran
que los Km con respecto al CDNB varían sistemáticamente con el pI de lasdistintas GST.
Sin un conocimiento mayor es imposible conocer la significancia
que tiene esta relación (si que existe alguna); pero la posibilidad de queexistan relaciones entre las propiedades fisicas de estas proteínas y suspropiedades catalíticas, exige una mayor exploración sobre este punto.
4.3. Métodos de aislamiento
Relativamente pocas han sido las GST de organismos no
vertebrados purificadas a homogeneidad, lo que dificulta apreciablementela comparación de las propiedades fisicas y químicas de estas enzimas.
La purificación enzimática es un item importante tanto desde el
punto de vista de la pureza enzimológica como de las propiedadesfuncionales de las mismas. La importancia de una isoenzima en particularno puede ser establecida inequívocamente hasta que no se conocefehacientemente su especificidad de sustrato, lo cual no puede serrealizado con preparaciones enzimáticas impuras.
Diferentes métodos han sido utilizados en la purificación de lasGST. La DDT-dehidroclorinasa de una cepa resistente de moscas fire
aislada utilizando las técnicas clásicas de precipitación (salting-out) yadsorción en geles (74). También se utilizó con un alto grado de eficiencia
Inu'odncdónPig. 20
la cromatografía de intercambio iónico en la obtención de enzimasaltamente purificadas de Ceratitis capitata (75). Una enzima de estaespecie fue purificada en un factor de 212 veces con un 11% derendimiento, utilizando una secuencia de técnicas que involucraba
cromatografía de intercambio (DEAE), precipitación con sulfato deamonio, cromatografía de permeación y cromatografía sobrehidroxiapatita.
Una poderosa innovación técnica fire la introducción de lacromatografia de afinidad. Se han utilizado dos métodos en la purificaciónde las GST de organismos no-vertebrados.
El primero de ellos explota la afinidad que tienen estas enzimas por
el producto de la reacción catalítica (76). El ligando tanto el conjugado de
GST o la SBF (un colorante derivado del trifenilmetano) es inmovilizadoen una matriz de agarosa (49) (76). Las GST se unen selectivamente al
soporte partiendo casi de homogenatos crudos. Luego la enzima puede sereluída de la man-iz utilizando soluciones de SBF (0.1-5 mM) o en otros
casos soluciones de GSH (1-5 mM).
La ona matriz de afinidad utilizada con éxito es la que usa comoligando al GSH unido a la matriz de agarosa por sus grupos sulfidrilos
(77). Como eluente se utiliza una solución de GSH de pH elevado (aprox.
9.6). El uso de GSH como eluente es preferido ya que éste no inhibe a laenzima y a su vez estabiliza el preparado enzimático.
Esta técnica ha sido utilizada para purificar las enzimas de Fusaría,Tubifex tubifex, Drosophila, Tribolium castaneum etc. (78) (73) (66) (43).
Estas ténicas son capaces de producir purificaciones espectaculares,ejemplo de esto es la purificación de 300 veces obtenida para Drosophila(66), 700 veces para Fusarium oxysporum (78) y de 600 veces paraGalleria melIoneIIa (76).
Aunque estas técnicas son muy atractivas, está informado quealgunas GST de mamíferos no se pueden unir a las matices de afinidadbasadas en el GSH. También hay evidencias de que sucede lo mismo enalgunos insectos.
Además de las matrices mencionadas anteriormente, otros dos tiposde columnas fueron utilizadas para la purificación de enzimas demamíferos (ninguna en insectos). Una utiliza S-hexil-L-glutatión unido aSepharosa activada por bromuro cianógeno (79) y otra utiliza GSH unido aSepharosa a través de la lisina (80).
IntroducciónPág. 21
5. PROPIEDADES CATALÍTICAS
5.1. Sustratos
Hay una extensa evidencia en la literatura que muestra la grancantidad de organismos capaces de detoxificar un amplio rango dexenobióticos electrofilicos por conjugación con el GSH. Esta ampliadefensa bioquímica está basada en dos propiedades. Una es la posesión de
múltiples formas de GST y otra es el amplia especificidad hacia diferentessustratos presentado por cada una de ellas.
Numerosos compuestos electrofilicos pueden servir como sustratos
de las GST (81) (82). Muchos de estos sustratos son compuestos
altamente reactivos que pueden reaccionar con grupos nucleófilos enproteínas, ácidos nucleicos y por lo tanto causar efectos tóxicos,mutaciones y cáncer. Originalmente, el ataque nucleofílico catalizado porlas GST consideraba solamente la posibilidad de que éste fuera hacia un
átomo de carbono electrofilico. Posteriormente se estableció quenitrógenos electrofilicos en ésteres nitratos, átomos de azufre entiocianatos orgánicos y oxígeno en hidroperóxídos orgánicos también
pueden servir como blancos alternativos en la reacción catalizada por lasGST (83).
Muchos de los sustratos utilizados son producto de la industriaquímica moderna los cuales no poseen relevancia biológica. Más aún,
muchos de estos compuestos presentan comparativamente baja actividadenzimática. Sin embargo, son herramientas muy valiosas para lacaracterización e identificación de las diferentes formas de GST.
Uno de los sustratos más importantes usado en varias especiesbiológicas para casi todas las formas de GST es el l-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB). Este compuesto fue utilizado originalmente comosustrato de las "aril-transferasa", pero posteriormente fire reconocido como
un "sustrato general" para las GST (84).
"02N02 '
noz©—c¡ +GSH-—h“©4402 +"Her
IntroducciónPág. 22
Aunque este sustrato constituye un elemento muy importante en ladetección de la actividad transferasa, también se sabe que existen ciertas
formas enzimáticas que presentan baja actividad con el CDNB. La enzima
de rata GST 5-5 y dos transferasas de maiz (85) son ejemplos de enzimasque muestran baja actividad con este sustrato.
Muchos son los sustratos que se han utilizado en el testeo de las
GST de nuevas fuentes de enzima. En algunas especies biológicas ciertas
formas de GST han sido distinguidas claramente por sus diferencias enlas actividades hacia diversos sustratos. Las enzimas de maíz mencionadas
anteriormente, las que poseían baja actividad con respecto al CDNB,fueron activas con el herbicida atrazina (85). En estudios anteriores de
algunas GST de animales se encontró que diferentes formas enzimáticas
en el mismo tejido mostraban cierto grado de especificidad cruzada haciadiferentes sustratos, los cuales distinguían claramente los perfiles de
actividades (84).
Por ejemplo, el hígado de oveja contiene GST que muestran altaactividad hacia el metil-paratión (dimetil p-nitrofenil fosforotionato) ybaja actividad con S-crotonil-N-acetilcisteamina, así como otras GST conrelaciones opuestas de actividades. El concepto original de "aril
tranferasa", "epoxido-tranferasa", etc. no es aplicado estrictamente para
describir la especificidad de sustratos (1). Se han encontrado GSTs
estructuralmente relacionadas en rata, ratón y hombre que muestran altaespecificidad hacia ciertos compuestos característicos los cuales han sidoutilizados en la clasificación de las enzimas de mamíferos.
Las GST clase Alfa son muy activas con el hidroperóxido cumeno.Se cree que esta reacción ocurre en dos etapas que involucra unintermediario inestable, el ácido glutatión sulfénico (GSOH) (86).
es s":9-?©—-. o—c@l l
H0 CH3 H CH3
GSOH+ GSH—-t esse + H20
Posteriormente el glutatión reducido es regenerado a partir delglutatión oxidado (GSSG) por la acción de la glutatión reductasa.
GSSG + NADPH+ H*———. 2 asu + MDP“
IntroducciónPíg. 23
La GST clase Mu ha mostrado ser muy activa con los epóxidos
(87) (88). Un epóxido (óxido trans-estilbeno) ha sido utilizado
particularmente en la identificación de las enzimas humanas clase Mu
(89).
©H
0
Las transferasas clase Pi muestran comparativamente una altaactividad con el ácido etacrínico ((2,3-dicloro-4-(2-metilenobutiril)fenoxil) ácido acético).
Cl
074.1
La reacción es una adición a un derivado carbonílico (143
insaturado, pero esta estructura por sí misma no distigue la clase Pi de
otras GST. Los mejores representantes de este tipo sustratos son los 4
hidroxialquenales (90) pero la clase Pi muestra baja actividad,comparativamente, hacia estos compuestos.
a OnfOH
Dentro de una clase, las isoenzimas presentes en la misma especiebiológica, también pueden ser distinguidas por el uso de sustratosadicionales. Por ejemplo la GST de rata clase Mu 3-3, 4-4 y 6-6 presentan
todas una alta actividad con el óxido trans-estilbeno. Sin embargo la GST3-3 tiene alta actividad con el SBF y baja actividad con el trans-4-fenil-3buten-Z-ona.
IntroducciónPág. 24
CH3
La GST 4-4 tiene baja actividad con la SBF y alta actividad con eltrans-4-fenil-3-buten-2-ona mientras que la 6-6 no presenta diferencias deactvidades entre los dos sustratos (63).
5.2. Inhibidores
5.2.1. Aspectos generales
Los estudios de inhibición son aproximaciones clásicas realizadas
en el estudio de enzimas tanto in vitro como in vivo (91-93).
Los inhibidores que son análogos de los sustratos, pueden ser
utilizados para explorar el mecanismo de catálisis y las características delsitio activo. Algunos de éstos también pueden ser utilizados como ligandos
en cromatografia de afinidad.En el caso de isoenzimas o de multiples formas enzimáticas con las
mismas actividades catalíticas, los estudios de inhibición pueden ayudar adistinguir las diferentes especies enzimáticas.
Consecuentemente, existe un número razonable de inhibidores
efectivos para GST que se listan en la Tabla 6. Estos inhibidores han sido
ensayados en un gran número de GST provinientes de distintas fuentes,
entre ellas citosol de rata, mosca, isoenzimas de humano, rata y ratón, maízetc.
Los valores absolutos no son comparables, ya que los datos
originales incluyen valores de 150,verdaderas constantes de inhibición (Ki),o simplemente porcentajes de inhibición a una dada concentración deinhibidor. Además, el uso de diferentes especies biológicas hace en
algunos casos imposible la comparación de las efectividades relativas delos diferentes compuestos.
Los derivados del GSH son sustratos y análogos de productos por
lo que los convierte en posibles inhibidores de GST.
IntroducciónPág. 25
5.2.2. Unión de ligandos e inhibición
Una importante fimción de las GST, al menos en algunos
mamíferos, es la que realizan uniendo reversiblemente ciertos compuestos,
proceso que constituye tanto un mecanismo de detoxificación pasiva como
un sistema de transporte intracelular. La tmión de estos compuestos ocurre
en un segundo sitio "ligandina", distinto del sitio activo o catalítico (7),
pero en ciertos casos algunos ligandos estudiados se unieron al sitio
catalitico produciendo la inhibición de la enzima (8).El descubrimiento de que esteroides como los ácidos biliares y
derivados de hormonas esteroides son inhibidores relativamente fuertes,
indica la posible presencia de un sitio de unión para este tipo de estructuras
y sugiere la posibilidad de que las GST posean algún rol en elmetabolismo de los mismos (5).
Similarmente, la fuerte unión de la hematina y derivados
porfirínicos sugiere la posibilidad de que alguna forma enzimática cumplafunciones de transporte intracelular (94).
En el caso de enzimas de invertebrados, hay un gran número de
estudios sobre unión de ligandos, pero éstos estuvieron orientados
principalmente hacia sus propiedades inhibitorias.
Los tipos de inhibidores pueden agruparse en 3 clases:
a) Inhibidores naturales
b) Contaminantes ambientales, pesticidas y sinergistas quepuedan inhibir las enzimas
c) Inhibidores utilizados in vitro en estudios mecanísticos.
a) Inhibidores naturales
Es una observación común que los homogenatos crudos de novertebrados pierden a menudo la actividad GST rápidamente. En muchoscasos no se detecta actividad enzimática a menos que se remuevanpreviamente los inhibidores endógenos (62).
En el caso de las preparaciones de insectos, ocurre un fenómeno
similar y la depresión en la actividad GST puede ser correlacionada con laoxidación del homogenato. La inhibición en estos casos puede serprevenida mediante el agregado de albúmina, GSH o cisteína (95). Se
IntroducciónPág. 26
sugiere que en los insectos los responsables de la inhibición son las
quinonas y los polifenoles endógenos . Se ha investigado el poderinhibidor de varios compuestos quinónicos y sus precursores,
observándose que los que poseen grupos hidroxilos en las posiciones 1,2 o
1,4, o grupos cetónicos en la 1,4, presentan una particular potencia
inhibitoria. Se ha informado que la Nafto-l,4—quinona, la 5-hidroxi-l,4—
nafioquinona (Juglona), la ubiquinona y la benzoquinona fueroninhibidores muy efectivos presentando valores de [50 de 1.2, 1.0, 1.7 y 7.7
x 10'5 M respectivamente (95-96).
La vitamina K1 también está informada como inhibidora de lasenzimas de moscas (96) y del árbol Hevea brasiliensis.
La inhibición por quinonas también es observada en crustáceos ymoluscos (40). En Costelytra zealandica la actividad de las GST de los
homogenatos crudos decae rápidamente; pero ésta puede ser prevenida por
el rápido fraccionamiento de la preparación enzimática o por la inclusiónde GSH, cisteína u otros tioles al medio de homogenización (72).
Una posible explicación de este fenómeno es que la inactivación es
producida por las quinonas endógenas que reaccionan con los gruposnucleofílicos de la proteína.
La enzima que cataliza la conjugación de la atrazina en el maíz, es
fuertemente inhibida por quinonas tipo la dihidrato-tetrahidro-l,4-quinonay N-(p-dimetil-aminofenil)-l,4-naftoquinona. El modo de inhibición de
estos compuestos todavía no es bien conocido. Parece probable que lasquinonas inhiban las GST por algunos de los tres caminos siguientes:
l) por una modificación covalente de la proteina2) por una competencia con el sustrato electIofilico por el
sitio catalítico sobre la enzima
3) por formación espontánea de un aducto con el GSH elcual podría inhibir a la enzima actuando como un análogodel producto.
Otros compuestos presentes naturalmente que pueden inhibir lasGST son el hemo y sus metabolitos. Está informado que la hematina y la
bilirrubina inhiben las GST de Drosophila. con Ki: 60 nM y Ki apar.= 10¡LMrespectivamente (97).
IntroducciónPig. 27
En Eisenia foetr'da elevadas concentraciones de bilirrubina y deácido litocólico (100 uM) causan una perceptible inhibición de las GST;
pero no hay evidencias de una fuerte unión del ligando a la proteína comoocurre en mamíferos.
La bilirrubina se une en forma relativamente débil (Kd = 43 HM) en
el caso de la GST de Galleria mellonella, mientras que el ácido litocólico
no parece unirse (98).
Lo observado para GST de rata y humano (que la enzima asumeuna conformación distinta "ligandina" cuando une compuestos tipo la
bilirrubina) no ha sido descripto para el caso de las GST de invertebrados.
b) Contaminantes ambientales y pesticidas
Las GST pueden ser inhibidas por compuestos xenobióticos
presentes en el medio ambiente, los cuales pueden haber sido introducidosen forma intencional o accidental.
Las GST de organismos acuáticos como Asellus aquaticus,Notonecta glauca y Lymnaeaparegra son inhibidas significativamente poruna concentración de 0.5 mM de fenoxiacético halogenado y ácido
fenoxipropiónico (40). Las enzimas Daphm'a magna son inhibidas por
fenoles clorados los cuales pueden ser probables contaminantes acuáticos
(99).
Los fenoles tienen coeficientes de partición octanol/agua quecorrelacionan con el poder inhibitorio de estos compuestos, sugiriendo quela inhibición se produciría por una partición con el sitio hidrofóbico deestas enzimas (sitio H).
De las seis isoenzimas estudiadas, una fue particularmente sensible
hacia el 2,4-diclorofenol. El pentaclorofenol inhibió tres de las seis
isoenzimas, oscilando los valores de 150entre 0.5-2 mM para los diferentesfenoles.
Las GST de plantas encargadas de la detoxificación de ciertosherbicidas, parecen ser vulnerables a la inhibición por parte de otrosherbicidas. La enzima de Pisum sativum encargada de metabolizar elfuorodifen es inhibida por el niu'ofen y también por herbicidas de la clase
de las anilidas y carbanilatos (62).
Esto se presenta como una oportunidad clara para la utilización deinteracciones sinergistas por adición de herbicidas.
Introducción
Pág. 28
La enzima de Zea mays que conjuga la atrazina, es inhibida por su
análogo no halogenado el cual compite con la atrazina (Ki del mercapto4,6-bis(isopropil amino)-S-I1iazina = 7.8 x 10'5 M) y también con otrastriazinas halogenadas (100).
Los herbicidas tipo acetanilatos y carbanilatos también producenuna sensible inhibición. La posibilidad de explorar estas interacciones se
pone de manifiesto en el uso de una alrazina como sinergista de elcompuesto Tridifano (2-(3,5-d.iclorofenil)-2-(2,2,2-u'icloroetil)oxi1ano).
Este compuesto es sustrato de las GST tanto de plantas como de animales
y el conjugado producido es un potente inhibidor de transferasas de ambasfuentes de enzima. El conjugado compite con el GSH y tiene un valor deKi de 8 uM para la transferasa de maíz. El sinergismo observado con la
atrazina es justificado por estas propiedades del conjugado.El conjugado también inhibe la conjugación del GSH con
pentacloronitrobenceno, fluordifen y propaclor en porotos y de metaclor ensorgo.
Una importante ruta de detoxiñcación del insecticida
organofosforado diazinón en moscas es mediada por las GST produciendouna reacción de conjugación.
El conjugado Tridifano-GSH fue también un potente inhibidor deeste tipo de recciones compitiendo nuevamente con el GSH. El Ki aparentees de 2 uM. Se demostró que el Iridifano sinergiza la toxicidad del
diazinón en moscas. El mecanismo de sinergismo propuesto tanto para la
atrazina en plantas como para el diazinón en insectos es probablemente elmismo, derivado de la formación del conjugado entre GSH y tridifano que
resulta un potente inhibidor (10]).Los análogos del DDT y compuestos como el N,N-dibutil-p
clorobenceno sulfonamida pueden sinergizar la acción del DDT en moscas
resistentes y parece actuar inhibiendo la DDT-dehidroclorinasa de moscas(102).
c) Inhibidores de laboratorio
Los estudios que apuntan a elucidar el mecanismo de catálisis de lasenzimas incluyen el análisis de la inhibición por productos.
El conjugado S-(2,4-djniu'ofenil)-l-glutatión ha sido empleado comoinhibidor en un gran número de especies. En Ceratitis capitata el modo de
Introducción
Pág. 29
inhibición fue no competitivo con respecto al CDNB con un Kiaproximado de 20 HM (103). La enzima principal en Galleria mellonella
fue inhibida por este conjugado y parece actuar en forma no-competitiva
con respecto a los dos sustratos, cayendo el Ki aparente de este compuestoen el rango de 70 a 150 uM, dependiendo de las condiciones empleadas(60).
Otro producto utilizado es el ión cloruro, que muestra ser un débil
inhibidor. En la GST de Galleria mellonella el ión cloruro parece sercompetitivo con respecto al CDNB y no competitivo con respecto al GSHcon Ki aparentes de 160 mM para los dos sustratos (60). Los efectos
inhibitorios no parecen debidos a un cambio en la fuerza iónica ya quevariaciones en las concentraciones del bufi'er fosfato no produjeroncambios en la reacción catalítica.
Muchos trabajos realizados utilizan como herramientas colorantes
derivados del trifenilmetano (15). Por ejemplo la SBF, puede actuar como
sustrato de algunas GST, pero en la mayoría de los casos este compuesto
es un potente inhibidor de GST de una amplia variedad de fiientes que
inhibe fuertemente las GST de homogenatos crudos de insecto y en menorgrado las GST de hígado de rata y conejo.
La DDT-dehidroclorinasa de moscas es inhibida fuertemente poreste tipo de colorantes (102). La efectividad en la inhibición pareceaumentar con el grado de halogenación de la molécula.
También las enzimas de plantas mostraron gran sensibilidad a lainhibición por colorantes del trifenilmetano (62) (100).
Estudios detallados sobre enzima aislada de Galleria mellonella
indican para la SBF y el verde de bromo cresol (VBC) un modo de
inhibición bastante complejo (98) (104). Estos coloranteS inhiben
claramente por competencia con e] sustrato CDNB lo cual es compatiblecon el comportamiento informado para otras especies. Los valores de Kdinformados para la SBF fue de 0.2 11My de l.l ¡.LMpara VBC a pH 7.4.
Los valores de Ki obtenidos ,cuando se utilizó el CDNB como sustratovariable, fueron de 0.48 ¿LMpara SBF (pH 6.5) y 1.5 ¡LMpara VBC (pH
7.4). La gran proximidad de los valores de Kd y Ki para estos doscolorantes sugiere fuertemente que el sitio de unión ocurre en el sitiohidrofóbico del centro catalítico.
Introducción
Pág. 30
Sumado a estas observaciones, el GSH suprime parcialmente launión de estos ligandos, produciendo los colorantes un tipo de inhibición"competitiva mixta" con respecto al GSH (104).
Se sugiere que los colorantes del trifenilmetano actúan como
análogos de sustratos (inefectivos), los cuales caen dentro del sitio
hidrofóbico pero también caen parcialmente sobre el sitio de unión del
GSH, lo cual impide pero no elimina la unión del mismo (98).Esta sugerencia explicaría algunas caracterizaciones realizadas en
las que se indicaba que los colorantes tipo ftaleínas eran competitivos conrespecto al GSH (104).
La fuerte unión a la enzima de este tipo de colorantes es explotadoen el diseño de soportes para columnas de afinidad SBF-GSH, las cuales
han sido utilizadas en la purificación de GST de insectos, mamíferos yplantas (46) (49) (76). El GSH ha sido utilizado como eluente en la enzima
de plantas, lo que sugiere que compite con el colorante por el sitio deunión. Otras enzimas, como las de moscas (49) y Costelytra zeaIadica (72)no pueden ser eluidas del soporte con GSH pero si con SBF. Esto sugiere
que los sitios de unión en estas enzimas difieren significativamente. Lasenzimas de este tipo, las cuales no son afectadas por concentracionesmoderadas de GSH, son un buen blanco in vivo para la utilización de
análogos de sustrato como sinergistas.Un número limitado de estudios fueron realizados pam observar el
efecto de los reactivos de sulfidrilos sobre estas enzimas. La preincubaciónde las GST de G. mellonella con reactivos de sulfidrilos como iodoacetato,
pCMB, N-etil-maleimida y 2,2'-ditiopin'dina resulta en una moderadainhibición de la actividad enzimática (20-45%) (60).
La enzima responsable de la conjugación de la atrazina en Zea maysno fue afectada fuertemente por la acción de reactivos como el ión HgH
(100).Por otro lado la enzima que cataliza la detoxificación del diazinón
en Periplaneta americana es fuertemente inhibida por la presencia de lmM de pCMB con una concentración de 2 mM de GSH (105). También seensayaron posibles agentes oxidantes de grupos tioles como ferrocianurode potasio, o-iodosobenzoato y N-bromosuccinimida, los cuales inhibieronfuertemente la enzima. Alguna de las inhibiciones pero no todas puedenser anibuidas a la disminución del GSH por formación de inhibidores tipo
mercapturos o por la formación de GSSG.
IntroducciónPág. 31
Las GST de Moniezm expansa y el nematodo Ascari suum fueron
fuertemente inhibidos por los iones Hg2+y Cu2+(l mM) en presencia de 5mM de GSH.
En contraste la enzima responsable del metabolismo del diazinón en
cucaracha no fue afectada por la presencia de iones metálicos pero sí fue
fuertemente inhibida por agentes quelantes como la o-fenantrolina y la 8
hidroxiquinolina (105).
La DDT-dehidroclorinasa de moscas altamente resistentes presenta
32 grupos sulfidrilos por teu'ámero activo (69-70). La inhibición de estaenzima con pCMB se incrementa progresivamente con el número degrupos tioles afectados, hasta producir e] 100% de inhibición cuando los
32 grupos han reaccionado.
Existe alguna evidencia de que alguno de los SH es crítico para elmecanismo de catálisis.
En general, las GST no son inhibidas significativamente por tiolescomo el mercapto etanol, cisteína y ditiou'eitol salvo la enzima de porotos
encargada del metabolismo del fluordifen y la enzima encargada de laconjugación de la atrazina en el maíz, las cuales si son fuertementeinhibidas (62) (100).
Introducción
Tabla 6Inhibidores de GST
INHIBIDORWS-qufoglutan'ónS-meu'lglutatiónS-etflglutatiónS-n-propílglutan'ónS-n-buu'lglutan'ónS-n-pcnu'lglutafiónS-n-hexilglutaliónS-n-hepülglulau'ónS-n-octílglutatiónS-n-fenilpropilglutafiónS-n-bencílglumiónS-p-bromobmcilglutan’ónS-(2,4-diníu'ofenil)glutafiónS-(2-cloro-4-nítrofeníl)gluta.tiónS-(sulfobromoftaleín)glutaüónS-(propaclor)glu¡al.iónS-(atrazine)glutatión
e
PurpurogalinaAlizarínaQuercetinagolgnntesBís-(3,5-díbromo—4-hídroxifenil)metanoBis-(3,5-dibromo-4-hidroxifeníl)metanol3,3',5,5'-Teu'abromo-4,4'-dihídronbenzofenona3,5-Dibromo-4-hidroxífenilflalidaRodamina BSulfobromofialeína3,6-DíbromoaüfobromoftaleínaFenolfialeínaTeuabromofenolfialeína
Tetrabromofenolfialeüla isopropíl estarLeucobmzaminaFenolteuabromofialeínaAzul de bromotimolVioleta de broma cresolVerde de bromo cresol
Rojo de clorofenolAzul de bromofenolAzul de TeuabromofenolRojo fenolFluoresccínaEosina
Rosa de bengalaEMColaloGlicocolaloTaurodeoxicolatoLítocolaxo
E3
++11+Ï1+11Ï+++++I
iÏÏiÏHHHIHIIÏIHHII-Ï
Ï+++
Pág. 32
Introducción
De ados e o o nero es
l7B-Esuadioldisu1fatoEsu'adíol-3-smfatoEstradiol-17-sulfatoCoru'sol monosulfatoPorflrlnasv ‘ ' ‘ "00'-díacedlhematoporfirinaMesohemo
HematoporfirínaProtoporfirinaIXCoproporfirinalUroporfirinaIHeman'naBílirrubinaRamada:S-(Trifano)-glu1atión2,4-Diclorofenoxiacetato2,4,5-Triclorofenoxíacetato
Ioduro de cadmioCloruromacúricoAcetato mercúrícoCloruro metilmercúrr'coClonn'o de cobreCloruro de cadmio
Ref (63)
5.3. Inductores
Los inductores pueden ser :
a) componentes naturales presentes en la dieta
1ï+111ïïIIÏÏ
ir:
++Iiti
Pág. 33
En los últimos años, se ha hecho aparente que en muchas especies
invertebrados, la producción de GST es un proceso que respondemarcadamente a la acción de inductores.
Estos efectos, parecen tener gran significancia en ciertas instancias
del control de plagas, donde la historia de la peste en cuestión, en términosde contactos con esas sustancias químicas, puede afectar profundamente la
respuesta a esas o a otras sustancias como agentes de control.Es conveniente categorizar las causas de inducción química en tres
b) componentes ambientales, como pesticidas y compuestosrelacionados
c) inductores utilizados en el laboratorio para el estudio delproceso de inducción en sí mismo.
IntroducciónPág. 34
a) Inductores naturales
Estudios sobre insectos fitófagos muestran que la dieta puede tener
un importante efecto sobre la síntesis de GST.
En la oruga tardía (Spodoptera frugiperda) los niveles de estasenzimas (utilizando DCNB como sustrato) en el sexto estado larval fueron
elevados 6, 7 y 8 veces sobre los controles después de alimentarse sobre
maiz, nabo y hojas de mostaza respectivamente (106). El perejil y lazanahoria como alimento conducen a un incremento en la actividad de 20
y 40 veces (107).
Estos incrementos ocurrieron después de dos dias de alimentación
sobre las dietas testeadas. Los valores de Km aparentes para DCNB no
cambiaron con las alteraciones en la actividad, por lo tanto se concluyó
que los cambios observados fueron cuantitativos más que cualitativos.
Sustancias químicas, probablemente encontradas en estas plantas,fueron testeadas como inductores enzimáticos. El indol-3-carbinol, indol
3-acetonitiilo y la flavona provocaron un incremento de 4, 18 y 7 veces
respectivamente (107) cuando se utilizaron en la dieta en un nivel de dosisdel 0.2% .
Los principios activos mayoritarios en las hojas de zanahoria fueronidentificados como el furano-cumarina y la xantotoxina. Utilizandoxantotoxinas sintéticas en la dieta al 0.05%, provocaron un incremento de22 veces en la actividad de conjugación de DCNB, así como la actividad
de la enzima microsomal heptacloro-epoxidasa y la reducción de la aldrinepoxidasa y bifenil-hidrolasa.
Patrones de inducción similares fueron vistos en cepas de insectos
susceptibles y resistentes a insecticidas. Virtualmente se produjeroniguales cambios en la actividad de GST-cuando se utilizó ioduro de metilocomo sustrato.
Efectos similares son informados para el gusano cortador
(Spodoptera eridania), en el cual una alimentación con aleloquímicoscomo pinenos, limonenos y terpinenos condujo a un incremento de 2 a 3
veces la actividad de conjugación del DCNB (108). Una dieta con
cumarina produjo un aumento de 7 veces en la actividad.Este tipo de efecto puede tener significancia toxicológica y esto fue
establecido por Yu (106), quien demostró que los incrementos en laactividad de GST inducidos por manipulación en la dieta dieron como
IntroducciónPág. 35
resultado un incremento en la tolerancia al diazinón, metamidofós y meti]
paratión. Larvas alimentadas sobre garbanzos mostraron valores de LC502-3 veces mayores que las larvas alimentarias sobre soja.
Actuando en oposición a los inductores enunciados anteriormente,
los inhibidores también pueden tener efectos sobre los niveles enzimáticos
de las plagas fitófagas.
La quercetina está informada como depresora de la actividad GSTen el sexto estado larval de Spodoprera frugiperda (109), como también
ocurre con la miricetina (107).
El stigmasterol y el ergosterol reducen la actividad en S. erídanía dela 3 veces (108).
El principio activo de las hojas de tomates salvajes, la 2
u'idecanona, causa una depresión de la actividad GST en la oruga del brotedel tabaco Heliothis virescens (110).
Por lo expuesto parece ser que los organismos que entren en
contacto con aleloquímicos como rutina, caso de los insectos fitófagos
como la Spodoptera, podrían poseer un sistema de detoxificación amplio yflexible, el cual podría aumentar rápidamente su actividad hasta el nivel
apropiado para detoxificar esas sustancias químicas. En contraste, los
predadores que se alimentan de organismos fitófagos no tendrían un
sistema de detoxificación tan poderoso, ya que su presa ya habría llevado acabo las reacciones de detoxificación.
Esto, parece ser el caso de los sistemas estudiados por Yu (l l l) enel cual el predador Podisus maculivem‘ris mostró tener mucho menos
actividad de conjugación con DCNB o p-nitrofenílacetato como sustratosque cualquiera de las cinco especie de fitófagos estudiadas.
No hubo, sin embargo, alguna correlación entre la actividad
conjugante y el grado de polifagia en los organismo presa.
También es de interés la observación de que en las parejas
predador-presa la actividad de conjugación con CDNB (l l l) y óxidoIIans-B-etilestireno (112) fue más grande en el predador que en cualquier
presa.
Esto sugiere la existencia de múltiples GST las cuales, las que sonmás activas con CDNB no estarían funcionalmente relacionadas con las
que son activas con DCNB y p-nitrofenilacetato.
IntroducciónPág. 36
b) Plaguicidas y contaminantes
Dosis subletales de plaguicidas y compuestos químicamente
relacionados pueden tener efectos substanciales sobre la expresión de losgenes GST en organismos invertebrados.
La exposición por 24 hs de Daphnia magna a pentaclorofenol(PCP) o a CDNB resultó en un incremento del 95% en la actividad de
conjugación del CDNB pero no tuvo efecto sobre la actividad de
conjugación del acido etacrínico. Preexposiciones a CDNB o a PCP,conducen a un incremento en la tolerancia al PCP, pero ninguno de los dos
compuestos confirió resistencia hacia el CDNB (99).Exposiciones a dosis subletales del insecticida piretroide permetrina
en Apis mellifera , conducen a un aumento de 2 veces en la actividad GSTcon respecto al DCNB después de 2 dias de tratamiento (107). Otros
insecticidas químicamente diferentes, como el carbaril, malatión,
metoxiclor y dibenzofluorón no fileron efectivos en este aspecto.Una modesta inducción en la actividad GST de moscas fue vista
después del tratamiento con dosis subletales de una variedad deinsecticidas (48). De esos testeos, el DDT fue el más potente dando un
50% de incremento en la actividad, el metilparoxón 31% y el paratión28%.
La actividad GST en Trogoderma granarium usando CDNB como
sustrato, es aumentada a las 5 hs de exposición, o eventualmente a 24 hs,
cuando se utilizan dosis letales de varios fumigantes. Este grupo incluye al
bromuro y ioduro de metilo, fosfmas, acrilonitrilo, tetacloruro de carbonoy óxido de etileno. Los rangos de aumento en la actividad fueron desde el
40% para el tetracloruro de carbono al 186% para el acrilonitrilo (113). Eldibromuro de etilo no produjo estos efectos.
A menudo se ha puesto atención en los efectos subletales de
insecticidas sobre la producción de GST en mosca. Es bien conocido que
la actividad DDT-dehidroclon'nasa, la cual puede ser propiedad de algunaGST en mosca, es afectada por este tipo de tratamientos.
Dosificando moscas de la cepa resistente Isolan B con insecticidasciclodienos como el dieldn'n, aldrin y epóxido heptacloro, aumenta laactividad DDTasa en 34, 74 y 42% respectivamente a las 24 hs delnatamiento.
Introducción
Pág. 37
Una cepa resistente a DDT respondió al pretratamiento con dieldriny aldrin con un aumento aproximado del 100% (114). Capdevila et. al.(115) informó que la DDT-dehidroclorinasa en moscas DDT-resistentes
(cepa P2/sel) fue incrementada cerca del 50% después de una exposición a
dosis subletales de DDT. La respuesta fue máxima a 10 hs. Aquí, fueronpresentadas evidencias de que la síntesis de novo estaba involucrada. La
dosis óptima de DDT fue de lO ¡Lg/mosca,y no se observó respuesta con
dosis menores a 5 ug/mosca. Las grandes cantidades requeridas paraproducir esta respuesta sugieren que este efecto tiene poca relevancia encepas no resistentes de moscas.
La administración de un sinergista como el butóxido de piperonilo
en la dieta por tres días, condujo a un incremento aproximado de 2 vecesen la actividad de estas enzimas. Lo mismo ocurre cuando se utilizan
análogos de la hormona juvenil (6,7-epoxi-3,7-dietil-l-[3,4(metilenodioxi)fenoxil]-2-octano) (l 16).
Se ha puesto gran interés en la inducción de GST de plantas por
herbicidas seguros (safener) de la clase de la dicloroacetamida.
El pretratamiento de plantas maiz recién nacidas con compuestoscomo el N,N-dialil-2,2-dicloroacetamida (R-25788), incrementa tanto el
contenido de GSH (en un factor cercano a 3) como la actividad GST (en
un factor de 2) los cuales contribuyen a la degradación de compuestosfitotóxicos como el sulfóxido EPTC (117-118). La GST así inducida, es
también activa hacia herbicidas como la acetanilida, alaclor (46) y
metaclor (l 19). Por lo tanto el tratamiento de las plantas recién nacidas con
safener, protege a éstas contra la acción de herbicidas, incrementando
específicamente de esta manera, la acción hacia este tipo de compuestos.Estudios detallados sobre este sistema muestran que la planta recién
nacida de maíz (híbrido 3708A), normalmente contiene una transferasadenominada GST I. El tratamiento con safeners resulta en un aumento de
la producción de GST I más una síntesis adicional (nueva) de GST II (46).Además del R-25788, muchas otras dicloroacetamidas producen un
incremento de la actividad GST en maíz (118). También compuestos no
relacionados como el ácido carboxílico 2-cloro-4-(trifluormetíl)-5-tiazol,ester-bencilico, anhídrido naflálico y el 0t(cianometoxi)
bencenoacetonitn'lo producen una respuesta similar en maiz y sorgo, peromenos marcado (46).
IntroducciónPág. 38
Estudios en el cDNA han demostrado que el nivel del mRNA que
codifica para la subunidad de el homodimero GST I, se incrementa 3-4veces en tejido de semillas tratadas con safeners (120).
Una tercera GST de maiz (GST III) un homodímero de subunidad
Mr 26.000 es inducible por tratamiento con safeners, como la GST II, ytiene gran actividad con alaclor al igual que la GST I (121).
No sólo los safeners producen estos efectos en maiz. Se ha
demostrado que el tratamiento de las plantas de maiz recién nacidas con elherbicida tiocarbamato EPTC, conduce a un incremento de 3 veces en la
actividad de GST. El efecto es detectable con una concentración baja de 20
uM de EPTC. Los tiocarbamatos molinato y cicloato producen en maiz
una respuesta similar (122).
c) Inductores de laboratorio
Han sido llevados a cabo estudios de laboratorio con un cierto
número de probables inductores.En Musca domestica. el fenobaibital demostró ser un efectivo
inductor de la actividad de GST (123). La actividad de conjugación con
DCNB fue incrementada por un factor de 3 en dos cepas de moscas (una
suceptible y otra resistente al diazinón) por altas dosis del barbitúrico(1000 ppm). Una tercera cepa altamente resistente al insecticida
organofosforado tetraclorvinfos, no tuvo respuesta. La actividadenzimática alcanza su nivel máximo a las 48 hs de tratamiento.
Resultados similares, pero no idénticos, fueron obtenidos porHayaoka y Dauterman (48), quienes examinaron la respuesta a]
tratamiento con fenobarbital al 0.25% en ocho cepas de moscas con
grados variables de resistencia. La respuesta varía con la cepa y el sexo,
llegando a un incremento cercano al 10% en la cepa multirresistente
Hirokawa y cerca de 3.5 veces en la cepa resistente a dimetoato 40 r2. Lacepa Comell-R resistente a tetmclorvinfos, también es capaz de serinducida.
Parece no haber correlación entre el grado de resistencia y el gradode inducción de las enzimas.
Estudios sobre preparaciones enzimáticas de cepas de moscasinducibles y no inducibles, no mostraron diferencias en las constantes
aparentes de Michaelis con respecto al DCNB (48). Por lo tanto se
IntroducciónPág. 39
concluye que el efecto del fenobarbital fire puramente cuantitativo, no
produciendo alteraciones cualitativas en los tipos de GST presentes.Antes de que se obtenga mayor información, conviene mantener la
mente abierta sobre la naturaleza de los cambios producidos por laadministración del fenobarbital.
Pretratamientos de moscas susceptibles CSMA con fenobarbital,
producen un incremento en la protección contra insecticidasorganofosforados. Los valores de DL50para meti] paratión, metil paroxón,
azinfosmetil y metildatión ñieron incrementados en 186, 280, 133 y 195%
con respecto alos valores controles (48).Estos cambios reflejan que e] efecto neto corresponde al menos a un
factor de protección de 2, aunque la actividad de las oxidasas de funciónmixta de moscas, las cuales activan los compuestos fosforotionatos hacia
su forma tóxica oxón, también son incrementadas por este tratamiento
(124).
Lucih‘a cuprina responde al fenobarbital con una inducción de 3-4
veces con respecto a la actividad del CDNB y DCNB (53).La situación no es tan clara en Drosophila Melanogaster. Se
informa que ésta mosca no responde a la administración del fenobarbital(125). El compuesto B-nafioflavona tampoco fue efectivo, pero la
administración de pentametilbenceno (0.5%) en la dieta, en el tercerestadio larval, conduce a un incremento del 70% en la actividad
conjugativa con CDNB. No hubo cambios en la actividad con ácidoetacrínico mediante este tratamiento, sugiriendo que diferentes enzimasson las responsables de las dos actividades.
Por otro lado, se ha informado que larvas de D.Melanogasterresponden marcadamente al fenobarbital, en menor grado hacia losbifenilopoliclorados y ambiguamente hacia la B-nafioflavona (51). Estos
resultados fueron obtenidos después de 24 hs de pretratamiento de larvascon el compuesto adicionado a la dieta en un nivel de 0.1-0.2%. Tres cepas
de mosca fueron testeadas. El grado de inducción resultante osciló entre40-60% para fenobarbital, de 25-35% para los bifenilopoliclorados y de-16 a +40 para B-nafioflavona.
Un contexto inusual de consideración acerca de la inducción de
GST, la cual puede ser apropiadamente considerada aquí, es encontrada enel caso del metabolismo de diniuito-isosorbide en Tetrahymena
thermophila. El S-mononitrato-isosorbide es una droga usada en el
IntroducciónPág. 40
tratamiento de la angina. Una ruta para su preparación es vía la denitracióndel dinitrito-isosorbide. Esta reacción es llevada a cabo por las
Tetrahymena cultivada en presencia de dinitn'to-isosorbide con
relativamente alta especificidad produciendo 5-nitrato, por lo que éste
sistema está siendo investigado como un proceso biotecnológico (126). Alas concentraciones de dinitn'to-isosorbide utilizadas (Smg/ml), se encontró
que las GST eran inducidas en un factor de 2 y la actividad con CDNBalcanza niveles de 60-100 mol/min/mg, 50-80 veces más alto que los
reportados por Lau et al. (41).
5.4. Estudios cinéticas
5.4.1. pH óptimo
Los valores de pH óptimos que poseen las enzimas estudiadas caen
dentro del rango de 6.5-9. El pH más bajo (aprox. 6.5) está asociado consustratos heterocíclicos como el diazinón y la atrazina (100).
Pabst informó gran variación en los pH óptimos de la GST A de
hígado de rata como resultado de la utilización de distintos sustratos (127).
Puesto que la ionización de un átomo de nitrógeno heterocíclico podríaafectar la afinidad de los sustratos con la enzima, cabría la posibilidad de
que los bajos pH óptimos informados sean una caracteristica del sustrato
utilizado más que una propiedad de la enzima. Para las GST de moscas el
pH óptimo varía marcadamente con la composición del buffer usado (47).
Este efecto también fue observado en otras enzimas pero en general la
composición del buffer no afectó las propiedades cinéticas de estasenzimas.
Es necesario una comprensión más detallada de las respuestasenzimáticas a los cambios de pH y composición del buffer para poderutilizar estos resultados en la clasificación y comparación mecanística dediferentes GST.
Algimas aproximaciones hacia este tipo de estudios fueron losrealizados con preparaciones de Costelytra zealandica. Los estudios serealizaron en el rango de pH 6-10 tanto con homogenatos crudos (104)como con enzima purificada (72). Los datos obtenidos fueron analizadosde acuerdo con un mecanismo random de equilibrio rápido y se examinó la
influencia del pH tanto en la variación de Vmáx como en las constantes de
Introducción
Pág. 41
Michaelis. Se observó que a valores bajos de pH 6-7 se produce unaionización que afecta la unión a la enzima tanto del CDNB como del GSH,
así como la Vmáx. Se sugirió que el grupo ionizado responsable podría serun residuo hisüdina (37) tanto en la enzima de insecto como en la de
hígado de oveja.
Otra ionización ocurre a pKa 9.36. Esta ionízación pareceinvolucrar dos grupos básicos que estaría involucrados en la unión del
GSH a la enzima. En este caso la Vmáx y la constante de Michaelis para el
CDNB no se vieron afectadas (72). Sobre la base de los valores de pKa yde la susceptibilidad de estos grupos a ser acetilados, se ha propuestotentativamente que los mismos podrían ser residuos de lisina (37) (104).
5.4.2. Constantes de Michaelis
En la Tabla 7 se presentan algunas KIn de organismosinvertebrados. Los datos presentados fueron obtenidos en una granvariedad de condiciones experimentales (128).
Las preparaciones enzimáticas utilizadas fueron desde homogentosimpuros hasta enzimas altamente purificadas. Algunos análisis cinéticos
fueron realizados al pH óptimo de la enzima mientras que otros fueron
elegidos por las propiedades de la reacción en estudio.
Los Km aparentes fueron determinados en algunos casos porvariación en la concentración de un sustrato a una sola concentración fijadel otro. Otros más detallados van'aron ambos sustratos en un amplio
rango de concentraciones.
A pesar de las reservas debidas a la diferencias en las condiciones
empleadas en la determinación de los Km para el GSH se puede observarun determinado comportamiento. De 49 valores de Km exüactados de laliteratura se observa que estos caen en un rango bastante estrecho 0.1-0.7mM. Este análisis sugiere que la mayoría de estas enzimas operaríannormalmente en un rango próximo a la saturación de GSH (58) (129), ya
que las concentraciones de GSH in vivo se encuentran entre 0.5-10 mM.También los datos sugieren la posibilidad de que estas enzimas tengan unmecanismo en común para unir el GSH.
IntroducciónPág. 42
Tabla 7
Km aparentes de algunas GST de organismos no-vertebrados
Organismo pH Snstrato Km (mM) pH deOpflmo ensayo
Zea mays CDNB 6.7 6.5mana 0.04 6.8
Pis-wnsativum 9.4 Fluordifen 0.015 8.0GSH 0.74 8.0
7.6 Ac. 0.1-0.4 7.5Cinámico 1-4 7.5
GSHFumn'um — CDNB 0.13 6.5
GSH 0.37 6.5
Costelytra zealmldica 8.3 CDNB 0.85 8.3GSH 1.6 8.3
pI 8.78.3 DCNB 1.13 3.3
GSH 0.26 8.3
pl 4.38.3 DCNB 1.12 8.3
GSH 0.20 8.3Galleria mellonella 8.0 CDNB 0.57 6.5
GSH 0.07 6.5
Drosophila melanogaster 7.3 CDNB 0.35 7.1GSH 0.71 7.1
7.4 CDNB 0.13 7.4GSH 0.45 7.4
Tribolium castaneum — CDNB 0.027 7.0GSH 0.36 7.0
5.5. Mecanismo de catállsls
Hasta el momento han sido pocos los estudios realizados eninvertebrados, tendientes a develar la naturaleza del sitio activo de lasGST.
Hay algunos estudios realizados por Clark con enzimas aisladas deinsectos tales como Costelytra zeaIandica (72) (104) y Galleriamellonella (60) (98).
No existe una información detallada acerca de la estructura yñmción del sitio activo de las GST, sin embargo se pueden sacar algunas
consideraciones generales, ya que existen considerable cantidad deevidencias en la literatura acerca del sitio activo de las enzimas de
mamíferos.
IntroducciónPág. 43
La suma de estas evidencias estan sintetizadas en el modelo
propuesto por el grupo de Mannervik (28).Según Mannervik, la enzima está compuesta por dos subunidades
(enzima dimérica), y posee dos sitios activos independientes, uno sobrecada subunidad.
A su vez, cada sitio activo tiene un sitio de unión para el glutatión
(sitio G-) y adyacentemente, un sitio de unión, parcialmente hidrofóbico,
para el sustrato electrofilico (sitio H-).Estudios en el equilibrio de unión de los colorantes del
trifenilmetano en Galleria meIIoneIla indican que estos colorantes
compiten con respecto al CDNB por la unión con el sitio hidrofóbico, y
que también parecen interferir, pero no impedir, la unión del GSH al sitio
G- (98). La explicación fisica más simple de esta observación es que lossitios G y H están situados muy cerca uno del otro y que la unión GSH cae
parcialmente en la región hidrofóbica pudiendo de este modo interferir conla unión de ligandos hidrofóbicos excepcionalmente largos.
La unión del GSH a la enzima, es altamente específica y pareceinvolucrar en el caso de mamíferos uniones iónicas entre residuos argininay los grupos car‘boxilodel GSH (130).
En la GST de Costelytra zealandr'ca se encuentran dos gruposbásicos ionizables (pKa apr.= 9.2) que afectan la constante de inhibición
del GSH (Kig) (72) (104). Basándose en esta observación, se ha sugeridoque estos grupos básicos están involucrados en la unión del GSH a la
enzima mediante interacciones iónicas con sus grupos carboinOS.
Con los valores de pKa de los grupos básicos sobre la enzima, y la
susceptibilidad de la enzima a la inactivación reversible por anhídridoacético se ha sugerido que un residuo lisina estaría de acuerdo con lasobservaciones anteriores (37).
La ionización de este grupo no afecta el Km del CDNB o DCNB ytampoco afecta los valores de Vmáx, por lo tanto no parece involucrado enla reacción catalítica misma.
La alta especificidad presentada hacia el sustrato üólico GSH, se
contrapone con la baja especificidad presentada hacia el sustratoelectrofilico.
Existen sugerencias de que el GSH induce cambiosconformacionales en la enzima, lo cual explicaría la elevada especificidad
IntroducciónPág. 44
observada por este sustrato, que hace que la proteína adquiera laorientación adecuada para que la catálisis ocurra.
Sólo el GSH y moléculas estrechamente relacionadasestructuralmente son consideradas capaces de inducir los cambios
conformacionales necesarios (63).
Esta propuesta además de explicar la especificidad tiólica,
explicaría algunas desviaciones observadas en la cinética enzimática deMichaelis Menten.
Se propone que los sustratos se unen en forma random y reaccionandirectamente el uno con el otro, no informándose evidencias de
intermediarios enzima-sustratos, que impliquen uniones covalentes.
Las evidencias cinéticas presentadas, sobre un amplio y variado
número de especies, se ajustan a un mecanismo cinético randombimolecular secuencial.
En algunos informes se indica que la cinética enzimática se
aproximaba a un mecanismo random de equilibrio rápido. En otros casosse informó un comportamiento más complejo, siguiendo un mecanismorandom de estado estacionario.
En ningún caso se confumó un mecanismo ping-pong. Esto es
importante ya que este comportamiento cinético indicaría la presencia deun intermediario enzima-sustrato unidos covalentemente (128).
Uno de los componentes esenciales en el mecanismo de catálisis es
la activación del grupo tiol del GSH, presumiblemente por deprotonación,asistida por una base.
Otro punto esencial es la activación del sustrato electrofilico. El
análisis de la activación de estos componentes ha sido de mayor dificultad,ya que los sustratos utilizados a menudo no son fisiológicos.
El descubrimiento de que las GST tiene una muy alta especificidadhacia los 4-hidroxialquenales, y el conocimiento de que estos compuestospueden representar sustratos biológicamente importantes, sienta las basespara un análisis más detallado del mecanismo de catálisis.
La conjugación del GSH con los 4-hidroxialquenales, esfundamentalmente la adición a un compuesto carbonílico (1,3 insaturado.
La estructura básica de los alquenales, está constituida por la unión doblecarbono-carbono y el grupo carbonilo adyacente, el cual activa el dobleenlace.
Introducción
#2 oEste sistema de dobles enlaces conjugados puede ser reconocido en
varios de los sustratos metabolizados por las GST, y puede ser una de lasestructuras determinantes para la cual la enzima está especializada (14)(90) (131).
En suma a los alquenales, la trans-fenilbutenona, el ácido etacrínico
y las quinonas, son sustratos que contienen estos elementos electIofilicosen su estructura.
La configuración carbonil (1,5 insaturada, se encuentra a su vez en
Mg. 45
numerosos productos naturales, algunos de los cuales han sido utilizadoscomo sustratos de GST. Algunos ejemplos son la peperina encontrada en
la pimienta negra y el citral que es el componente principal de los aceitesescenciales de los cítricos.
La reacción de adición hacia los carbonos a,[3-insaturadosnormalmente involucran el ataque nucleofilico sobre el carbono [3 del
alqueno. Se conoce que las bases incrementan la reactividad de losalquenos, favoreciendo el ataque nucleofilico. Además, la reacción es
facilitada por la protonación del oxígeno del grupo carbonilo, el cualincrementa la electroñlicidad del carbono B.
Consecuentemente, se propone que el sitio activo de las GST que
catalizan este tipo de reacciones, podría tener una base (B), que facilite ladeprotonación del grupo tiol del GSH, y un ácido (HA), polan'zando eloxígeno del grupo carbonilo (63).
B/=/=0esn HA
f
BH+/=/=0HGS' A
En principio, un ácido de Lewis como un metal podría servir alsegundo requerimiento, pero no hay evidencias de que los metales seanesenciales en el funcionamiento de las GST.
Finalmente, un protón tendría que ser entregado al carbono a del
alqueno. Esta etapa final requiere la presencia de un donor de protones, elcual podría ser el ácido conjugado de la base original, formando parte del
IntroducciónPág. 46
sitio activo de la enzima, o simplemente un ión hidronio proveniente del
medio acuoso en el cual procede la reacción.
Debe notarse que el requerimiento de una base y un ácido, para la
mayor eficiencia de la catálisis, también es aplicado a la reacción entre
epóxidos y GSH.La protonación del oxigeno de la estmctura oxirano incrementa la
electrofilicidad del átomo de carbono adyacente.
La naturaleza química de los grupos propuestos en el sitio activo no
es conocida, pero un imidazol de un residuo histidina es una posible base,
y un grupo carboxilo de un ácido glutámico o aspártico podn'an actuarcomo posibles ácidos de Brcbnsted.
En el caso de Costelytra zealandica una ionización críticacineticamente hablando, ocurre en el rango de pH 6.5-7.0. Esta ionización
afecta los valores de Vmáx así como las constantes de Michaelis y de estemodo la reacción catalítica directamente (104).
Estas observaciones podrían ser compatibles con la presencia de un
residuo histidina en el sitio activo que incrementada la nucleofilicidad delGSH (37).
Experimentos de inactivación química, apoyan la participación deun residuo histidina en la reacción catalítica de la lransferasa de hígado derata 3-3, en la ¡Ianferasa de hígado humana y también posiblemente en laenzima de Costelytra (104).
Puede ser significativo que todas las estructuras primariaselucidadas, tienen una histidina en la vecindad de la posición nro 165 (nros
154 a 168), (132) y una secuencia Asp-Gly cercana a la posición nro 65,
excepto para la enzima microsomal, pero hay varias posiciones alternativasque se pueden proponer como gmpo ácido, que permitirían incluirla dentrodel modelo propuesto.
La nucleofilicidad del grupo tiol también puede ser realzada por lareducción en la solvatación del grupo (133). Hay evidenciascircunstanciales que sustentan la hipótesis de que ésto puede ser un factorsignificante en e] caso de las enzimas de insectos.
Se ha sugerido que la DDT-dehidroclorinasa en moscas suceptibles,es en efecto una GST (68). Se ha propuesto un mecanismo para explicarcomo la transferasa puede catalizar dos tipos de reacciones diferentes: unala sustitución nucleofílica con un compuesto como el DCNB y otra, unaeliminación E2 con uno del tipo DDT.
IntroducciónPág. 47
El modelo propuesto requiere que en los dos casos haya un grupobásico sobre la enzima (otra vez un residuo histidina) que tienda aincrementar la concentración del anión tiolato por abstracción del protóndel GSH.
El tiolato puede de esta forma proceder a realizar el ataque
nucleofílico sobre el centro electrofilico del sustran pertinente, o actuar
como una base, que puede realizar una eliminación E2 de ClH del DDTpor abstracción del hidrógeno de la posición C-2.
No obstante, la formulación de los posibles requerimientos para elmecanismo de catálisis, será útil para el diseño de modificaciones químicasracionales del sitio activo en experimentos de mutagenicidad, lo que
permitirá desentrañar las verdaderas relaciones estéricas entre los grupos
catalíticos de la enzima, el grupo tiol del GSH y la molécula del sustratoelectrofilico.
A su vez, este conocimiento permitirá el diseño racional de
inhibidores específicos de GST en insectos o de insecticidas quimicos de
espectro de acción reducido más seguros para los mamíferos y menoscontaminantes para el ambiente.
IntroducciónPág. 48
6. REACCIONES DE LAS GST CON INSECTICIDASORGANOFOSFORADOS
6.1. Introducción
Los insecticidas sufren transformaciones catalizadas por enzimas
tales como las oxidasas de función mixta microsomal (MFO), fosfatasas,
esterasas, GST etc. las cuales producen la oxidación, hidrólisis, reducción
y conjugación de estos xenobióticos dentro de los organismos vivos.Estos sistemas enzimáücos son encontrados en una amplia variedad
de organismos, y en general las reacciones mediadas por éstas enzimas son
consideradas como un mecanismo de defensa hacia esos tipos de
compuestos a los cuales están expuestos los organismos durante el cursode su evolución.
En general las reacciones de conjugación, como las producidas porlas GST, son precedidas por otras reacciones, particularmente poroxidaciones mediadas por las MFO.
Por esta razón, las reacciones de conjugación son consideradas
usualmente como un mecanismo secundario de detoxificación; por lo tantohan recibido menor atención en los estudios de metabolismo de
insecticidas que las reacciones de fase I.
Recién a principios de 1960 se sugiere en algunos estudiosrealizados, la participación relevante de las GST en el metabolismo de losinsecticidas (134) (135).
Se ha visto que estas enzimas catalizan la conjugación deinsecticidas tales como los organofosforados (OP), carbamatos y clorados.
La conjugación de los dos primeros grupos con las GST es directa
mientras que para el último se requiere una previa oxidación producida porlas MFO. Estas generalizaciones excluyen las enzimas de ciertas especiesde insectos, las cuales son capaces de catalizar directamente la conjugaciónde lindane y sus análogos con el GSH (57) (136)
Se ha observado que las reacciones producidas por las GST tienencaracteristicas diferentes a muchas de las reacciones de conjugaciónestudiadas. Por este motivo, la reacción de conjugación de xenobióticos
con GSH catalizada por las GST puede ser vista como un proceso de
IntroducciónPág. 49
detoxificación primario (137). Esta reacción de conjugación constituye el
primer paso de una serie de reacciones metabólicas. Posteriormente losconjugados sufren una mayor metabolización y son finalmente excretadoscomo ácido mercaptún'co (l) (3) (138).
A pesar del considerable progreso obtenido, todavia se encuentranalgunos problemas en la identificación de las enzimas involucradas en un
camino particular del metabolismo de los insecticidas OP.La dificultad radica en que la presencia de metabolitos in vivo no
puede ser atribuida solamente a un sistema enzimático en particular, yaque se ha demostrado que diferentes enzimas o sistema de enzimas,
pueden reaccionar en un sitio común de la molécula de OP para dar unmetabolito final con idéntica estructura química. (137) (139) (140)
Por lo tanto deben realizarse con muchos recaudos los análisis de la
O-dealquilación y O-dearilación de los 0,0-dialquil-aril fosforotionatos o
fosfatos, ya que estas reacciones también pueden ser el resultado de la
conjugación, hidrólisis y oxidación efectuadas por las MFO.
6.2. Reacciones generales
Uno de los primeros indicios acerca de la participación de las GST
en el metabolismo de los insecticidas OP fue dado por los trabajosrealizados con el insecticida fosforado diclorvos (DDVP) (134).
En estos trabajos se encontraron dos metabolitos principales, unocomo resultado de la ruptura de la unión P-O-metil, y otro como resultado
de la P-O-vinil. En esos estudios la O-demetilación del diclorvos, paraformar el metabolito desmetilado, no puede ser atribuida a una reacciónproducida por las GST ya que las preparaciones utilizadas no estaban
libres de enzimas microsomales, (MFO, hidrolasas) las cuales podían ser
las responsables de la producción de este metabolito.
La participación de las GST en el metabolismo de los insecticidas
OP fue confirmada por primera vez por Shishido y Fukarni (135) (141)quienes informaron la desmetilación del metil-paratión producida por elsobrenadante de un homogenato de hígado de rata, así como de algunasespecies de insectos, cuando se utilizaba GSH como cofactor. En lafracción soluble del homogenato de hígado de rata, los principales
metabolitos encontrados cuando se utilizó paratión, paroxón y fenitrotióncomo sustratos fueron: el ácido O-metil-O-p-nitrofenil-tiofosfóiico
IntroducciónPág. 50
(desmetil-paratión 81.8%), ácido O-metil-O-p-nitrofenil-fosfórico(desmetil-paroxón 90%) y ácido O-metil-3-meti]-4-nitIofenil-tiofosfórico(desmetil-sumitión 78.6%).
Los estudios realizados en cucaracha americana, revelaron la
presencia de estos metabolitos pero no en las cantidades encontradas en loshomogenatos de hígado de rata. Los valores correspondientes a este
insecto fueron : desmetil-paratión 23.6%, desmetil-paroxón 20% ydesmetil-sumition 15.6%.
En ratas, también se observó que en mitocondrias, la única
hidrólisis significativa ocurre en la unión P-O-vinil, mientras que en lafracción soluble, ambas uniones fueron atacadas (tanto la P-O-vinil como
la P-O-metil). El orden de actividad en la degradación del metil-paratión,metil-paroxón y sumitión hacia metabolitos solubles excretables en aguaencontrado con el homogenato de higado de rata fue : soluble >
mitocondria = microsomas lavados (135).
Finalmente estudios posteriores confirmaron que las GST catalizan
dos tipos diferentes de reacciones con los OP, la conjugación O-alquil y laO-aril (137) (142). En resumen, los tipos generales de reacciones de las
GST con OP pueden ser clasificadas como sigue:
Ro ii R xl o u
R0>PS*Y I'w>Ps—v + GS-R¡ [l]|
xRo IIx l
“lo u Ho>P0-Y +GS—R¡ [n]R0>P0—Y x
l R'0>ii>ou e GS Y- mR¡O l l
R xx 1° ||
nlo>go Y R2>90" + GS-Y [IV]R2 _ x
R|O>II *R2 PSG YOH (v1
R¡=Alqull, R2=NII , X=360, Y="Leavlng group"
IntroducciónPág. Sl
A continuación se listan algunos OP que sufren estos tipos dereacciones :
Tabla 8
TIPOS DE REACCION COMPUESTO ORGANOFOSFORADOI azinfoetil
análogo oxigenado del Azinfosmeu'lmalau'ón
II meti] pamtiónmeti! paroxónctil paraliónetil paroxóniso-prop" paroxónfenitrotiónfenitroxóndiazinóndiazioxónbromofosem'mfosdiclrovosetil diclrovosclorfenvinfosteu'aclorvinfosfenclorfos (ronnel)mevinfos
dimetil amen] sulfonilgfenil fosfaloH1 diazinón
diazioxón
n-propil diazinóniso-propil diazinónetil paralióneu'l paroxónmeti]pmfiónmetí! paroxón
IV EPN
análogo oxigenada del EPNV ¡EN
6.2.1. Conjugación O-alqufl(dealqu1lación GSH dependiente)
Como se lista en la Tabla 8, la mayoría de los compuestos OPestudiados como sustratos de las GST fueron fosforotionatos
((RO)2P(S)OR') o fosfatos ((RO)2P(O)OR'). Sólo unos pocos estudioshan sido llevados a cabo con fosforoditioatos ((RO)2P(S)SR') ofosforotiolatos ((RO)2P(O)SR').
En el azinfosmeti], un fosforoditioato, la conjugación O-alquil es laprincipal ruta de metabolismo, obtenida tanto con homogenatos de hígado
IntroducciónPág. 52
de rata (143) como de mosca (144). Este tipo de reacción también fue
demostrada en numerosas especies (145).Los resultados sugieren posibles diferencias en la naturaleza de
estas enzimas; ya que la enzima extraída de hígado de rata no fue activahacia el análogo oxigenado del azinfosmetil, un fosforoüolato, mientras
que la enzima de mosca si presentó actividad hacia este compuesto.
Otro ejemplo de conjugación O-alquil de fosforoditioatos fuedemostrada con el malatión (136) (146) .
En contraste con los fosforoditioatos y fosforotiolatos, la
conjugación O-alquil de fosforotionatos y fosfatos ha sido informada paraun gran número de compuestos (Tabla 8).
Aparentemente tanto las GST de mamíferos como las de insectos
tienen preferencia hacia los sustratos que son compuestos metoxi. La
conjugación O-alquil es extremadamente lenta o casi inapreciable cuando
los grupos metoxi son reemplazados por grupos etoxi o grupos alquilo decadena más larga (105).
x xCH30\ ll II
x x
>>::Z:8>'¿°v>3:11:89!“>.'::;í3::;8[X=S o 0.Y=Arilo"Lcwing Group")
Esta observación está de acuerdo con la especificidad presentada
por las GST de higado de rata hacia sustratos tipo haluros de alquilo (147).
CH3Y > CZHSY > n-CaH7Y > ¡so-C3H7Y
[Y=| o Br]
También se observa que la toxicidad del etil-paratión en rata esmayor que la del metil-paratión y sumitión.
Comparando fosforoüonatos con sus correspondientes fosfatos,aparece generalmente el tio como mejor sustrato que el oxo (136) (105).
S 0no Il no ¡IR0>P0Y > Ro POY
(X: S o 0.Y=Arilo"Leaving Group")
En cambio, Shishido y Fukami informaron que el metil-paroxón, unfosfato, fue metabolizado más rápido que el metil-paratión, unfosforotionato, por la fracción de hígado de rata.
A menudo en este tipo de estudios se excluye la participación de lasMFO, y es probable que el resultado obtenido por Shishido y Fukami fuera
Introducción
Pág. 53
debido a la inclución de otro sistema enzimático como la paraxonasa (o Aesterasa) en el sistema, una enzima que se conoce que hidroliza sólo a losfosfatos (148).
Un descubrimiento interesante fue el realizado por Morello et al.(149) (150) quien observó los efectos sobre isómeros geométricos delmevinfos en la conjugación O-alquil.
El isómero cis fue un buen sustrato de conjugación para la enzimade higado de rata, mientras que el isómero trans fue metabolizado en la
unión vinil-fósforo por un mecanismo de hidrólisis GSH independiente.Como esta preparación enzimática usada fue un sobrenadante crudo, nodebe ser descartado una posible competencia de la mezcla de diferentesenzimas por e] isómero trans.
A pesar de todo, está establecido que la estructura de los "leavinggroup" de los insecticidas OP, afectan significativamente la velocidad de
conjugación O-alquil
6.2.2. Conjugación O-arll (dearllación GSH dependiente)
Hasta hace poco la ruptura de la unión aril-fosfato de muchos
organofosforados era considerada como un proceso hidrolíticoexclusivamente.
En 1966 , Fukami y Shishido examinaron el efecto del GSH sobre
la degradación del diazinón y su análogo oxigenado, diazoxón, utilizandocomo fuente de enzima hígado de rata y la fracción soluble del cuerpo
graso de cucaracha. Ellos sugirieron que la ruptura de la unión aril-fosfato
podia ser catalizada por una enzima GSH-dependiente, similarmente a loocurrido en la desmetilación del etil-paratíón y sumitión.
Plapp y Casida (151) mostraron que el ácido dietil-fosforotioico(DEPTA) es el principal metabolito del paratión in vivo tanto en ratascomo en cucaracha.
Nakatsugawa et a1. (152) sugirieron que hay tres mecanismosposibles para 1adegradación del paratión hacia DEPTA :
l) Oxidación microsomal2) Hidrólisis por esterasas o fosfatasas
3) Dearilación enzimática GSH-dependiente
IntroducciónPág. S4
Experimentos in vivo utilizando un homogenato de higado de rata y
3'SS-paratión como sustrato, indicaron que la ruptura de la unión aril
fosfato fue debida en su mayor parte a las oxidasas microsomales, y enmenor proporción a la fracción soluble no-oxidativa que requería GSHcomo cofactor (GST).
Shishido et al. (105) estudiando la conjugación O-aril del diazinón,
encontraron que un incremento en la longitud de la cadena alcoxi producíauna disminución en la velocidad de reacción.
Sin embargo, existe la dificultad de evaluar el efecto de los grupos
alcoxi sobre la velocidad de la conjugación O-aril porque:i) con estos compuestos la conjugación O-alquil toma lugar
concomitantemente
ii) las preparaciones enzimáticas usadas en estos estudiosincluyen una mezcla de diferentes formas de GST, cada
una de las cuales posee diferente especificidad desustrato.
De acuerdo con estos autores (135) la conjugación O-aril, juzgadacomo la formación de ácido dietil-fosforotioico, fue mayor que la
conjugación O-alquil cuando se incubó enzimas de hígado de rata con etil
paratión en presencia de GSH. Sin embargo cuando fueron evaluados elmetil-paratión, metil-paroxón y fenitrotión, predominó la conjugación O
alquil sobre la O-aril.Una observación similar fue informada por Hollingworth et al.
(153) cuando comparó la conjugación del meti] y etil-paroxón. Con el
primer compuesto la conjugación O-alquil fue mucho mayor que la O-aril,mientras que para el segundo compuesto la situación fue la opuesta.
sic]CH30 Il
P-O N02 + GSHCH30
Mcfllpanflon[paroxon] l
filo} CH 0 filo,CH 0
3 >P-0-©—N02 3 >P-—OHH0 CH30
q, ‘f
GSm3 GS©—N02
Introducción
Flo]C H 0
z 5 >P—O—©—N02 + GSHC2H50
Etilpnration[parmn] l
lsllol filo]c H o c H o
z 5 >p—o@uoz 2 5 P-OHH0 czuso'I' 'Ü'
css-cua GS©_N02
Otro caso de conjugación O-an'l es la informada para el EPN, un
fosfonotioato, y para su análogo oxigenado (EPNO), un fosfonato (154).
No hay evidencias de conjugación O-alquil en estos compuestos. Sinembargo la O-dealquilación ocurre, y se ha concluido que esta reacciónoxidativa es catalizada por las MFO.
Comparando los fosfonotioatos y fosfonatos teniendo en cuenta la
Pág. ss
conjugación O-aril, los estudios sugieren que los fosfonatos son mejoressustratos que los fosfonotioatos.
6.3. Ruptura no enzimática de los metabolitos
Muchos de los estudios realizados con las GST fueron llevados a
cabo con insecticidas marcados radioactivamente. La ruptura noenzimática de los fosforotionatos y fosforoditioatos puede ocurrir durantela separación.
Motoyama y Dauterman (155) demostraron que el desmetil-paratión
fue hidrolizado no enzimáticamente sobre la silica gel a p-nitrofenol yácido mono-metil-fosforotioico. Esto también ocurrió cuando se almacenó
el compuesto en solución acuosa por un largo período.S S
CH3°>ÁL_0©_Noz _+ CH3O>iI3-0H + Ho—@—nozH0 H0
Desmefil parafion
La ruptura no enzimática de los metabolitos dealquilados no selimita solamente a los metabolitos metoxi. Lewis (156) también informó lahidrolisis del desmetil-diazinón.
A la luz de estos descubrimientos parece razonable creer quealgunas de las confusiones en estudios previos concernientes al estudio del
Introducción
Pág. 56
metabolismo de insecticidas OP puedan haber sido el resultado de rupturasno enzimáticas de los metabolitos.
6.4. Rol de las GST en la toxicidad selectiva
La variación de la actividad GST inter-especie e inter-cepa, juega enciertos casos un importante rol en la toxicidad selectiva de muchoscompuestos así como en los casos de resistencia.
La velocidad de ataque metabólico sobre diferentes partes de lasmoléculas de insecticidas también varía con los diferentes organismos.
Gran número de estudios sugieren que la reacción O-alquilcatalizada por las GST cumple un rol importante en la toxicidad selectiva
de ciertos insecticidas OP (142) (157) entre mamíferos e insectos, ya queesta reacción es mucho mayor en los primeros que en los segundos.
Esta idea está basada en experimentos realizados con algunosinsecticidas, en los que los grupos etoxi fueron reemplazados por gruposmetoxi dando como resultado un marcado descenso en la toxicidad de
estos compuestos en mamíferos. Sin embargo no se observó diferencias detoxicidad en insectos.
Este descenso de la toxicidad en mamíferos ha sido atribuida a un
incremento en la O-dealquilación producida por las GST (135) (141).Las diferencias entre el metabolismo in vivo de los insecticidas
organofosforados entre mamíferos e insectos, pueden ser resumidas de lasiguiente manera :
MAMíFEROS INSECTOS
La unión P-O-metilo es destruida La unión P-O-metilo y P-O-etilo nomás fácilmente que la P-O-etilo. son destruidas significativamente.
IntroducciónPág. S7
6.5. Mecanismo de resistencia.
La importancia de las GST como mecanismo de resistencia ha sido
postulado para distintas especies, así como también para distintos tipos deinsecticidas OP (146) (158).
El desarrollo de resistencia hacia un determinado insecticida OP es
frecuentemente acompañado por resistencia cruzada hacia otros
compuestos OP. Por lo tanto es razonable suponer que en estos casos más
de un mecanismo biológico (GST, MFO, alteración de las propiedades dela enzima blanco, la acetilcolinesterasa) está involucrado.
La importancia de las GST en los mecanismos de resistencia parecevariar con la estructura del insecticida involucrado, así como con la
presencia de otros factores asociados con el organismo.Se ha informado la participación de las GST en la resistencia de
moscas hacia el diazinón y diazoxón (156) (159). Se observó que estas
cepas resistentes poseían mucha más actividad GST que las cepas
suceptibles. Sin embargo estudios genéticos posteriores (160) demostraronque las GST no jugaban el rol principal en el mecanismo de resistencia al
diazinón; sino que estas cepas resistentes poseían una alta actividad MFO,y que la degradación producida por estas enzimas, aparecía como laresponsable en el mecanismo de resistencia al diazinón (159).
El rol de las GST en la resistencia al paratión también fueconsiderada de menor importancia (161).
En contraste, se sugirió que el incremento en los niveles de O
dealquilación del azinfosmetil, es debido principalmente a la acción de las
GST (144). Esta conclusión fue sostenida por la rápida diminución en losniveles de resistencia por la sustitución de los grupos alcoxi. (144) (162).
La información obtenida hasta el presente sugiere que las reaccionesproducidas por las GST juegan un papel muy importante en los casos de
resistencia hacia compuestos metoxi, mientras que en los casos deresistencia hacia compuestos etoxi el rol de las GST es de menorimportancia.
IntroducciónPág. 58
7. El Triatoma infestans Y LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
El Triatoma infestans es un hemíptero de la familia de los
Redúvidos que tiene una importancia sanitaria por ser el vector del Mal de
Chagas. En la Argentina se lo conoce con el nombre de "vinchuca" que
proviene de una voz quechua que significa "lo que se deja caer". Hay másde un centenar de especies conocidas de vinchucas en el mundo, pero sólo
16 especies habitan nuestro país. No todas tienen importanciaepidemiológica en la transmisión del agente causal de la enfermedad deChagas.
En nuestro medio hay una sola especie que convive habitualmente
con el hombre en el interior de sus viviendas y se alimenta de su sangre y
es el Triatoma infestans. Las hembras ponen hasta 200 huevos en su vida,la metamorfosis es holomorfa y pasa por cinco estadios ninfales antes dellegar a adultos. Todas las formas son hematófagas y aún las inmadurasson vector del mal. Toda la metamorfosis en condiciones de laboratorio
dura 7 meses y la vida del adulto puede ser de 15 meses. Los adultos
puden tomar hasta 0.5 ml de sangre por vez, pero la resistencia a] ayuno es
notable: las ninfas del V estadio pueden estar hasta 200 dias de ayuno.
La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana representa
epidemiológicamente una serie de interacciones complejas entrel) Un ciclo zoótico mantenido entre los mamíferos salvajes y
los Triatominos silvestres.
2) Un ciclo zooantropótico (intradomiciliaiio) que involucraa los mamíferos domesticos y los humanos
3) Un ciclo antropótico (peridomiciliaiio) entre humanos yTriatominos domésticos, involucrando infecciones
congénitas e infecciones por transfusiones de sangre.La enfermedad se mueve entre los distintos ciclos por invasión de
las viviendas por vectores silvestres o huéspedes, y por la infección dehumanos o animales domésticos en el campo. El Tripanosoma cruzi es elparásito que se aloja en el intestino de la vinchuca, donde se desarrolla yreproduce, y es el agente causal de la enfermedad. No todas las vinchucas
están infectadas con el parásito, para estarlo deben alimentarse de unanimal u hombre cuya sangre posea el parásito circulante.
IntroducciónPág. 59
í \Tripomastigotes Amastigotes
(sangre) (tejidos)
Epimastigote ‘(luz intestinal
Ciclo de la enfermedad de Chagas
El Chagas no es una enfermedad tropical como algunos creen, sudistribución geográfica es en el continente americano entre el paralelo 42°N hasta 45° S, donde se estima que el 25% de la población continental seencuentra en riesgo de contraer la enfermedad y entre 16-18 millones depersonas infectadas (las que sufrirán daño cardíaco permanente), de lascuales solo el 30% desarrolla los síntomas clínicos de la enfermedad.
Solamente en la Argentina la enfermedad afecta a 4 millones de personas,
de las que 500,000 tienen complicaciones cardiacas. Un 35% de lapoblación productiva de la provincia del Chaco se encuentra afectada, y secalcula que alrededor de 1.500.000 trabajadores de todo el país seencuentran parasitados. Esto resulta un problema dramático y es un factorde perturbación para la actividad productiva de vastas regiones del país. Sedebe aclarar que el estar infectado o parasitado no significa necesariamenteestar enfermo. Se estima que un 20% de los parasitados se enfermarán, esdecir sufrirán daños de mayor o menor gravedad.
IntroducciónPág. 60
p T.W
- T.pamdpamb
- T.¡Intentan-P.mcgth
- R.¡robin-T.amm
Distribución de las especies más frecuentes de vinchucas, vectoras delT. cruzi, en América latina
La enfermedad de Chagas es originan'amente una enfermedad ruralasociada con la pobreza, pero se urbaniza a través de los bancos de sangre
o debido a migraciones internas de personas que transportan con ellos alvector. Hay localidades en Sudamérica donde el 100% de las viviendasestán infectadas con vinchucas, y a veces con hasta 8000 insectos porrancho, donde el 80% de los insectos está infectado.
La infestación de las vinchucas con el parásito persiste
indefinidamente y aumenta con la edad del insecto, no siendo perjudicialpara él. Las personas infectadas lo estarán siempre pues no se conoce cura
IntroducciónPág. 61
ni protección inmunológica hasta el momento. La enfermedad no tienesólo implicancias sanitarias sino profundas consecuencias económicas paraLatinoamérica debido a la alta proporción de incapacidad fisica presente
entre la gente infectada.Los habitantes de las zonas endémicas que aprendieron a vivir con
estos intrusos dentro de sus habitaciones están "donando" litros de sangre
por año alos insectos y esto se agrava si se tiene en cuenta que por el nivelsocioeconómico de las victimas ya hay instalado un cuadro demalnutrición.
Cuando esto sucede desde el nacimiento, en pleno desarrollo
corporal y neurológico, pueden quedar secuelas de insuficiencia en el SNC
que redundarán en limitaciones intelectuales cuando adulto.En la actualidad, la única manera de reducir la incidencia de la
enfermedad es controlando al vector en la forma más eficaz posible.
El control biológico de vinchucas es impracticable hasta el
momento, y los insecticidas utilizados en las Campañas Nacionales no son
suficientemente efectivos y carecen en general de poder ovicida, lo que es
crítico para evitar las reinfestaciones de las viviendas fumigadas.
Sin embargo el control químico de los Triatominos surge como la
única alternativa posible de interrupción eficaz del ciclo epidemiológico dela enfermedad. En consecuencia la investigación sobre el vector, sobre elmodo de acción de los insecticidas y sobre las rutas de biotransforrnación
de los mismos, pueden aportar pautas básicas para un control eficaz de la
plaga sanitaria mediada por vector más importante de nuestro país, y devarios paises de Latinoamérica.
Propósito del trabajoPág. 62
PROPÓSITO DEL TRABAJO
El propósito general de esta tesis apunta a desarrollar el conocimientobásico sobre la capacidad detoxificante (dependiente de glutatión) de
xenobióticos lipofilicos en Triatoma infestans.El estudio del arsenal biotransforrnador con que cuenta una dada
plaga y los mecanismos de acción de los insecticidas, permiten diseñarestrategias químicas de control racionales y no meramente empíricas. Esteúltimo enfoque contiene al tema "Regulación de la GST de Triatoma
infestans y su importancia en el proceso de intoxicación por insecticidasorganofosforados".
En los paises centrales se vuelca gran esfuerzo en el control racional
de plagas. En cambio en América latina en general y en nuestro país en
particular, las investigaciones entomotoxicológicas no están todavía losuficientemente desarrolladas como para proveer soluciones a las
problemáticas vinculadas a insectos plaga.El CIPEIN está desarrollando esta línea desde hace 15 años y ha
contribuido a través del dictado de cursos y tesis doctorales a formarrecursos humanos en esta área.
Los resultados alcanzados en esta tesis conforman una parte delproyecto global del CIPEIN (PID N° 302430088) denominado " Nuevas
alternativas y mecanismos en el control químico de insectos plaga deimportancia nacional " como así también en el Proyecto extraordinario N°
357 BID-CONICET denominado " Innovaciones en el control químico delos vectores de la enfermedad de Chagas ".
El conocimiento alcanzado sobre la GST de Triatoma ínfestans y suvalor como defensa bioquímica permitirá su aplicación en el desarrollo detácticas para el control del vector.
Los propósitos particulares del presente trabajo son:
a) Encontrar inhibidores de la actividad de la GST in vitro e in vivo
que permitan bloquear esta defensa bioquímica de los insectos.
b) Obtener evidencias experimentales que demuestren una mayorsusceptibilidad a uiatomicidas organofosforados cuando se los tratapreviamente con inhibidores de la GST por distintas vías de ingreso(tópico, oral, inyección, film). Esto está directamente vinculado a labúsqueda de nuevas formas de sinergismo de triatornicidas.
Propósito del trabajoPág. 63
c) Proveer evidencias que permitan explicar el fenómeno de
sinergismo entre inhibidores de GST e insecticidas OP.
d) Estudiar el efecto de los aductos de saligeninas cíclicas fosforadascon GSH sobre la actividad de la GST.
e) Estudiar los tipos de inhibición producidos por los distintosinhibidores de la GST.
Í) Proponer un modelo para el sitio activo de la GST que permita
predecir inhibidores efectivos a través de un análisis de relación estructuraactividad.
g) Estudiar la acción de ciertas sustancias químicas como eventualesinductoras de este camino biotransformador con la intención de estar en
condiciones de explicar la tolerancia a insecticidas.
h) Desarrollar metodologías que permitan el estudio de labiotransformación in vitro de OP marcados con sin inhibidores de GST
i) Estudiar la toxicocinética de insectos tratados con insecticidas OP
y con OP más inhibidores de GST con el fm de obtener claves que
permitan sentar las bases racionales para un posible mecanismo deinteracción tóxica entre triatomicidas e inhibidores de este caminodetoxificante.
j) Estudiar cuali y cuantitativamente los metabolitos producidos invivo en ambos tipos de tratamientos.
Del estudio de la regulación de la GST en Tinfestans y de surelevancia en el proceso de intoxicación por insecticidas, surgirán
estrategias de control químico indudablemente más eficaces; es decir más
potentes, más selectivas y menos contaminantes.
II. MATERIALES
I YMETODOS
Materiales y métodosPág. 64
PARTE EXPERIMENTAL:
MATERIALES Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
Los insectos utilizados para nuestras experiencias son vinchucasadultas (macho) Triatoma infestans (Klug) provenientes de una colonia
criada y mantenida en nuestro laboratorio (CIPEIN) libres de Tripanosoma
cruzi, desde el año 1974 bajo temperatura y humedad controladas alimentadas
sobre palomas una vez a la semana. La temperatura se mantiene entre 28-30°C y la humedad entre el 60-70%.
Esta colonia se formó a partir de ejemplares silvestres y del insectario
del Instituto del Diagnóstico y Tratamiento del Mal de Chagas "Dr. MarioFatala Chaven".
En los casos que fue necesario se identificaron los distintos estadioslarvales según características standardizadas en nuestro laboratorio.
2. OBTENCIÓN DE ENZIMAS
2.1. Glutatlón-S-transterasa y PTA-Esterasas
Disección:
Se separó la cabeza y el contenido intestinal de las vinchucas adultas
machos utilizando pinzas y tijeras de disección.
Homogeneización:
Se realiza colocando las vinchucas machos (entre 5 a 10 insectos)libres del contenido intestinal y de la cabeza en tubos de vidn'o del
homogeneizador previamente enfriados en hielo. Se agrega l m1 de aguadestilada por insecto y se homogeneiza con un SorvaJl Omni-Mixer 17106
con "pestle" de teflón para tubos de 5 y 10 m] de capacidad sobre baño dehielo.
El homogenato así obtenido se filtró por lana de vidrio, quedandoretenida en ésta los restos de cuticula.
El filtrado constituyó la fracción cruda del preparado de GST y PTAEST de vinchuca.
Materiales y métodosPág. 65
Cuando se utilizaron ninfas I se colocaron 5 insectos en 0.02 ml de
agua destilada y se homogeneiza con un Sorvall Omni-Mixer 17106 con
"pestle" de teflón para tubos de l ml de capacidad sobre baño de hielo. En
este estadio el material biológico esta muy standardizado en cuanto a peso (lO
ninfas I = IO i l mg) y a proteínas totales del homogenato realizado (260 d:
20 mg).
2.1.1. Purificación de GST y PTA-EST de vinchuca
La fracción cruda se cenm'fugó a 10.000 g durante lO min en una
centrífuga refrigerada modelo RS-18 Tomy Seiko Co.,LDT.
El sobrenadante se filtró a través de lana de vidn'o para eliminar la
grasa en suspensión, quedando de esta manera listo para ser utilizado como
fuente de enzima (GST y PTA-EST). El precipitado se descarta.
2.2. Ache
Con las cabezas separadas se prepara el homogenato para la obtenciónde Ache.
A éstas se les agrega 0.5 ml de ClNa 0.15 M (por cabeza) siendo más
tarde homogeneizadas en un Sorval] Omni-Mixer.Luego el sobrenadante se filtra a través de lana de vidrio obteniéndose
de esta manera la fuente de enzima.
2.3. Obtención de microsomas
Se colocaron 10 vinchucas adultas en un tubo de vidrio de lO ml
perteneciente al equipamiento del potter más lO ml de buffer Tris ClH 0.05 M
pH = 8.5 más 0.15 M KC] siendo homogeneizadas en un Sorvall Omni-Mixer
17106 con "pestle" de teflón para tubos de lO ml de capacidad sobre baño dehielo.
La fracción obtenida se centrifugó a 10.000 g durante 10 min en una
centrífuga refrigerada modelo RS-18 Tomy Seiko Co.,LDT.
El sobrenadante se filtró a través de lana de vidrio para eliminar lagrasa en su8pensión. El precipitado se descarta. Posteriormente elsobrenadante es centn'fugado a 105.000 g durante 60 min en una ultra
centrífuga Hitachi SSP-7. El sobrenadante de utiliza como fuente de GST(soluble) mientras que el precipitado (microsomas) es resuspendido en bufferTris ClH 0.05 M.
Materiales y métodosPág. 66
10 insn 0ml buffer Tris cm 0.05 MpH 0.5 + 0.15 M KCI
10.000 g 10 mln
Pcllct Sobrenadante[descarto]
105.000 g 60 min
Pellet SobrenadanteMICROSOMAS CHOSOL
2.4. GST comerciales
Se utilizó GST de hígado de conejo obtenida de Sigma Chemical C.O. La
actividad enzimática expresada como (unidades/mg prot.) con 1.0 mM de
CDNB y 2.5 mM GSH fue de 150.
También se utilizó GST de hígado de porcino obtenida de Sigma ChemicalC.O. La actividad enzimática expresada como (unidades/mg prot.) con 1.0
mM de CDNB y 2.5 mM GSH fue de 62.
Una unidad es la conjugación de un micromol de sustrato con GSH por min a
25 °C y pH = 6.5.
3. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
3.1. GST:
La capacidad de conjugación de la GST fue medida mediante un
procedimiento descripto por Habig, et. al. (1974) (15). La actividadenzimática fue determinada monitoreando los cambios de absorbancia a 340
nm y 25 oC en un espectrofotómetro doble haz Shimatzu UV-160 durante 3min.
N02 GST "o?
"0@CI +GSH—» GS@NOZ +H*+CI'340 nm
Materiales y métodosPág. 67
Procedimiento:
Se colocó en celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico, 0.1 ml de la
preparación enzimática en 1.78 m1de buffer fosfato de Na y K 0.1 M pH 6.5,
0.1 ml de GSH 50 mM en igual buffer y 0.02 ml de CDNB 50 mM enacetonitrilo. Como blanco de reacción se utilizó la misma mezcla de
incubación en ausencia de GSH igualando el volumen final con el agregadode 0.1 m1 de bufi'er.
Se calculó la actividad de la siguiente forma:
E = 9.5 mhílicm"
Act _ mM de producto fumado _ ¿AIDS-¡mmmin E
En todos los casos la actividad enzimática específica es expresadacomo ¡1Mde -(S-DNB)-Glutatión formado/min x mg Prot
3.2. PTA-EST (no específicas):
La actividad de esterasas inespecificas file determinada por el métodocolorimétrico de Ellman (x163)midiendo los cambios de absorbancia a 412 nm
en un espectrofotómetro doble haz Shimatzu UV-160.
(u) Esterasas (n)
©>>S--C-CH3 ———+ SH+H0-C-—CH3PTA
N02 N02
'ooc© s—s@ coo‘DTNB
N02 1 N02
@s-s@coo»-s@cooAmarillo A = 412 nm
Materiales y métodosPág. 68
Procedimiento:
Se colocó en celdas de plástico de l cm de paso óptico, 0.05 ml de
preparado enzimático en 1.0 ml de solución 10 % de DTNB en buffer fosfato
0.2 M pH 7.2 más 0.05 ml de solución 20 mM de PTA en etanol (abs). Comoblanco de reacción se utilizó la misma mezcla de incubación en ausencia de
PTA igualando el volumen final con el agregado de 0.05 ml de buffer.El producto de la reacción es el anión 5-tio-2-nitrobenzoico que es
altamente coloreado (Em : 13.600 a 412 nm).La actividad específica se calculó de la siguiente forma :
E = 13.500 M-Ifcm'ï
__nmoles de sustrato hldrollzado _ AM8 I minmin 13_5
Act. x1.1x103
ÁctEqu nmoles de sustrato hidrolizadomin x mg de proteinas
3.3. Ache:
La actividad de la Ache fue determinada por el método colorimétricode Ellman (163) midiendo los cambios de absorbancia a 412 nm en un
espectrofotómetro doble haz Shimatzu UV-160.o
_ n
' o HO-C-CH3CH " " Ache
l 3]3—N—[CH2]2—S—C—-CH3___+ r ++
IATC _ _[6H313 N [CH2]2—SH
"02 N02
DTNB
no2 l N02+
lCH313—N-[CH2]2—s—s@ coo’+ “s@ coo'Amarillo A = 412 nm
Materiales y métodosPág. 69
Procedimiento:
Se colocó en celdas de plástico de l cm de paso óptico, 0.2 ml de
preparado enzimático en 1.0 ml de solución 10 % de DTNB en buñer fosfato0.2 M pH 7.2 (buffer-cromógeno) más 0.05 ml de solución 12 mM de IATC
en agua.En la celda de referencia se colocó buffer-cromógeno y sustrato,
descontándose de esta forma la autohidrólisis del mismo. Se hicieron también
las correcciones debidas a la liberación de color no específicas por
componentes del preparado enzimático, incubando tejido en buffercromógeno sin sustrato.
El producto de la reacción es el anión 5-tio-2-nitrobenzoico que es
altamente coloreado (Em : 13.600 a 412 nm).
La actividad específica se calculó de la siguiente forma :
E = 13.600 M'1Icm"
m _ nmoles de sustrato hidmlizado _ ¿MIS Í mi"min 13.5
x1.25xm3
m Esp____nmoles de sustrato hidrolizadomin x mg de proteínas
Cuando se menciona actividad enzimática específica tanto para Achecomo para PTA-EST se refiere a la hidrólisis de l nmol de ATC ó PTA/min x
mg Prot a 22°C y pH 7.2
4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Las proteínas se determinaron por el método de Lowry (164). Se
realizó una curva standard con albúmina de suero humano (Sigma). Se usó un
blanco con l ml de agua y 4 ml de solución alcalina de cobre, de dejó 10 mina temperatura ambiente y luego se agregó 0.40 ml de reactivo de Folin
Ciocalteau diluido 1+2, se esperó 30 min a temperatura ambiente para luegoleer a 660 nm en un espectrofotómeu'o Shimatzu UV-l 60.
Materiales y métodosPíg. 70
5. APLICACIÓN DEL TÓXICO
Los métodos más comunes de aplicación de tóxicos al insecto son porinyección intracelomática, por métodos de contacto y por alimentación oral.
5.1. Inyección :
La inyección en el flujo hemolinfático se realiza a nivel de las
membranas intersegmentales, generalmente en la parte ventral del abdomen.
Todos los insecticidas inyectados deben estar en soluciones acuosas,
emulsiones o suspensiones. Cuando deben usarse solventes orgánicos, éstos
deben estar diluidos al 90% o más. Este método de inyección se utiliza paraestudiar la máxima actividad potencial del compuesto y eliminar la barrera de
penetración cuticular. Es un método usado con aquellos compuestos pocopenetrantes y que poseen interés teórico.
Los insectos utilizados fueron inyectados con una jeringa Hamilton delO ul y una aguja N° 30.
La zona a inyectar es la membrana intersegmental entre el cuarto y
quinto segmento abdominal ventral. Se introdujo la aguja por el costado
derecho del insecto en la forma lo más paralela posible a la superficie del
cuerpo, y se incorporó las distintas sustancias en forma lenta cuidando que nosaliera hemolinfa.
Para este procedimiento las vinchucas debieron ser inmovilizadas en
un cepo especialmente diseñado tomándolas por el tórax.
5.2. Tópico :
Los métodos de contacto evalúan la capacidad de penetración y la
toxicidad del compuesto.
La aplicación tópica se realiza colocando el tóxico en solución
acetónica (u otro solvente volátil) sobre la superficie ventral del abdomen. Ladosis aplicada es proporcional al peso corporal y el dato de toxicidad se
expresa como dosis letal para el 50% de la población (DL50) en ng decompuesto/g de peso del insecto.
5.3. Oral :
A semejanza con la inyección, la administración de tóxicos por via oralse aplica a aquello compuestos que tienen dificultad para atravesar la cutícula.
Materiales y métodosPág. 71
Los insectos son pesados individualmente y luego colocados en un
alimentador artificial diseñado por el Dr. Josué Nuñez. Aquí los insectos seenfrentan a una solución del tóxico (la concentración del mismo se especifica
en cada experiencia) en ClNa 0.15 M más ATP 10'3 M el cual es un fagoestimulante.
Luego los insectos son pesados nuevamente, detenninándose de esta
manera la cantidad de tóxico ingerido.
5.4. Film tela:
Este es otro método de contacto utilizado para lo cual se preparan telastipo liencillos 100% lana 10 x lO cm y se las trata con 2 ml de la sustancia aestudiar. Una vez secadas las telas se colocan los insectos sobre las mismas
cercando a éstos con anillos de vidrio de 5 o lO cm de diámetro de acuerdo al
estadio en estudio. Se tapa el anillo de vidrio con tela de gasa.
6. INHIBIDORES UTILIZADOS
Cuando se utilizaron inhibidores se agregaron 0.02 ml de éste (la
concentración del mismo se aclara en cada experiencia), restándose del buffer
igual volumen, siguiendo posteriormente el protocolo indicado para cadaexperimento en particular.
6.1. Querceüna
Se preparó una solución de quercetina 10'2 M en acetona para elestudio de inhibición in vitro, mientras que para los estudios in vivo se
preparó una solución 10‘2 M en acetona más 10% de glicerol para lograr una
mejor penetración del compuesto a través de la cutícula.Para los estudios in vitro se agregaron 20 ul de la solución antes
mencionada a un volumen final de 2 ml, con lo que la concentración final dequercetina fue de 10'4 M. En el caso de los estudios in vivo, se topicaron 5 ul
de la solución indicada, lo que significaba 17 ug de quercetina/insecto.
Materiales y métodosPág. 72
Querceflna
6.2. Azul de timo]
Se preparó una solución para tópico de AT 10'2 M en etanolzacetona
1:1 más 10% de glicerol. .
Cuando se utilizó la inyección como vía de ingreso se utilizó unasolución de AT 10'2 M en solución fisiológica inyectándose 2 ul de la
misma, mientras que para los estudios de inhibición in vitro se utilizó una
solución de AT 10'2 M en agua destilada.
SOaH
(o)Azul de timo]
6.3. Sulfobromoftaleína
Se preparó una solución para los estudios de inhibición in vitro 10'4 Men agua destilada, de la cual se obtuvieron las distintas diluciones.
SOaH scan"° e °"Br COOHBr Br
Br
Sulfobromoftaleína
Materiales y métodosPág. 73
6.4. S-(Z-Mdroxibencflyglutatlón
Se preparó una solución para los estudios de inhibición in vitro de 10'2M en buffer fosfato 0.02 M pH=8, de la cual se obtuvieron las distintasdiluciones.
0" CO-NH-CH2—COOHI
ocuïenNH- CO- CHz- GHz-CH- COOH
I
NHZ
S-(2-hidroxibencil)—glutatlón
6.5. S-(p-nltrobencflyglutaüón
Se preparó una solución para los estudios de inhibición in vitro de 10'2M en buffer fosfato 0.02 M pH=8, de la cual se obtuvieron las distintasdiluciones.
l
S-CH2—CHl
NH- CO- 0H2- CHZ-CH- COOHI
MHz
S-(p-nltrobencflyglutaüón
7. DETERMINACIÓN DE 150
La 150 es la concentración molar de inhibidor necesaiia para disminuirla actividad enzimática a la mitad.
El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente forma :
AMISJmin , - ¿Ahsfmin, sin mh con lnh
96 Inhibicicm = x 100
A Ahs ! mlnsin lnh
Materiales y métodosPág. 74
Se graficó % de inhibición vs pI (-Log de la concentración molar del
inhibidor) obteniéndose una recta de la que se calcula gráficamente el pIso
siendo 10 'Pïso igual a I50.
s. ESTUDIOS CINÉTICOS
Se estudió el tipo de inhibición producido por los compuestos antesmencionados. Para lo cual se calcularon los valores l/V y l/S para la reacciónenzimática variando la concentración de uno de los sustratos manteniendo el
otro constante y variando a su vez la concentración del inhibidor utilizando
los homogenatos purificados como se menciona anteriormente. Cuando sevarió la concentración de CDNB ésta fue desde 0.5 a 0.0625 mM mientras la
concentración de GSH se mantuvo constante en 2.5 mM. Cuando se varió la
concentración de GSH ésta fue desde 0.375 a l mM mientras la concentración
de CDNB se mantuvo constante en 0.5 mM. A su vez estos puntos fueron
calculados en por lo menos 3 niveles de concentración de inhibidor la cual se
indica en cada experimento en particular.Los resultados se expresaron de acuerdo al método de Lineweaver
Burk observándose las variaciones que producen estos compuestos en los
parámetros cinéticos (Krn y anáx), determinando de esta forma el tipo deinhibición producido con respecto a cada uno de los sustratos.
8.1. Determinación de Km y Vmáx
Se calcularon los valores l/V y l/S para la reacción con y sin inhibidorcomo se menciona anteriormente.
Los resultados se expresaron de acuerdo al método de Lineweaver
Burk calculándose gráficamente los valores de Km y Vmáx.Las concentraciones de los inhibidores utilizados se expresa en cada
experimento en particular.
Materiales y métodosPág. 75
9. INDUCTORES UTILIZADOS
Se utilizaron distintos compuestos con el pr0pósito de exaltar la
actividad de las GST. Estos compuestos se administraron en distintos estadios
por distintas vías y en distintas concentraciones las cuales se detallan en cadaexperimento en particular.
Cuando se utilizaron adultos las mediciones se realizaron con 5
insectos por nivel. El peso promedio de los mismos file de 0.18 i 0.03 g.Cuando se utilizaron ninfas I se utilizaron lO insectos por nivel. El peso de las
10 ninfas I file de ¡Oil mg. Se prepararon las siguientes soluciones:
3-metil-colanu'eno
acetona + 10% aceite de oliva
acetona + 10% aceite de oliva
Fenobarbítona acetona+
Flavona acetona + ¡0% aceite de oliva
lndoI-3-acetoniu'ilo acetona + 10% aceite de oliva
Indol-3-carbinol acetona + 10% aceite de oliva
A partir de estas soluciones madres se prepararon distintas diluciones lascuales se detallan en cada experimento en particular.
Materiales y métodosPág. 76
10. DETERMINACIÓN DE LA DOSIS LETAL 50 (DL50)
Se seleccionaron los insectos cuidadosamente por estadio, sexo y peso.
Los insectos ayunados durante 7 días se imnovilizaron colocándolos en
posición dorsal en un cepo diseñado especialmente con lo que se facilitó la
aplicación de los tóxicos por tópico.Los insectos fueron pesados al mg en una balanza analítica Sartorius.
Se prepararon las soluciones de los compuesto OP en acetona y de losdistintos inhibidores de GST.
Se topicaron 5 ul de las soluciones preparadas con una microjeringa
Hamilton de 50 ul provista de un "repeating dispenser".
La topicación se realizó en la parte ventral de los insectos y los
controles se topicaron de igual manera pero sólo con el solvente. Se utilizaron
entre 4 y 5 vinchucas por nivel de concentración.
Los cuidados posteriores al tratamiento fueron: tanto los insectostratados como los controles se colocaron en frascos de plástico perfectamente
limpios y tapados con una tela de gasa que permite el intercambio de aire.
Todos los frascos tienen en su interior un papel plegado que permite que losinsectos se trepen a él. Los frascos debidamente rotulados se colocaron en una
incubadora con la mismas condiciones a las de la crianza para no variar sumetabolismo. Se observaron los resultados de mortalidad a 24 y 48 hs
procediendo por último al cálculo de la DL50_
10.1. Tratamiento estadístico de los resultados
Cálculo de DL50 : Para el cálculo se utilizó el programa Standard
Pack de Hewlett Packard HP-85 con modificaciones realizadas según (165).El programa calcula la pendiente de la curva y los límites de confianzautilizando el método de Litchfield y Wilcoxon.
Test de Student : Para el cálculo se utilizó el programa Excel deMicrosoft. Dentro de las opciones ofrecidas por el programa se utilizó (t-Test:
Two Samples Assuming Unequal Variances)
Materiales y métodosPág. 77
11. TÉCNICA DE WASH-OFF
Para la realización de esta técnica es necesario tener la superficie de los
insectos libre de excrementos. Con este propósito los insectos son sumergidos
en tres baños de agua destilada lográndose de esta manera la remoción totaldel excremento.
Posteriormente se administra 5 ul del compuesto en estudio por tópico
en la región ventral de Triatoma infestans adulto. Los insectos sonmantenidos en distintos lotes en una cámara termostatizada a 30 oC para su
posterior análisis.Luego a distintos tiempos se van tomando lotes de insectos,
extrayéndose el compuesto remanente sobre la superficie del mismo. Para locual los insectos son colocados individualmente en viales, con 5 ml del
solvente adecuado para la extracción del compuesto de la superficie del
insecto, en un incubador termostatizado con agitación Dubnofi'.En el caso de la quercetina la extracción se realiza con metano],
mientras que para el azul de timol se realiza con agua.
Posteriormente el compuesto en solución es colocado en tubos desu concentraciónA.ensayo, determinándose espectrnf'ntnmcfii
comparando contra curva de calibración.
En el caso de la quer'cetina la medición se realiza a 374 nm, mientras
que para el azul de timol, la solución es tratada con 0.0] ml de carbonato de
sodio al 10%, para lograr su viraje al azul, realizándose luego la medición a600 nm.
12. SÍNTESIS DE COMPUESTOS
12.1. Síntesis del aducto S-(Z-hldroxlbencllyglutaüón
El S-(2-hidroxibencil)-glutatión fue obtenido no enzimáticamente apartir de GSH y Salitión aplicando el método de Frankel et al. (166) con
algunas modificaciones.
En efecto, la obtención del aducto se realizó partiendo de lmmol deGSH más l mmol de salitión en 1 ml de EtOH y 1.2 ml de NaOH 2 N a 30 °Cdurante l hr.
Materiales y métodosPág. 78
Emma! mmm pm II formulandelcontandoentre 68H y SGP.
x
u R H 0 T )'(/n_ 2 I
Gt: —->Gli/gw"SGP: *
Ïaligion lGSH
Rms CC:S-(2-hidroxibencill-glutation
Luego la mezcla fue levemente acidificada. Los productos de lareacción fueron resueltos mediante TLC prepamtiva, utilizando
butanolzacéticozagua (4:1 :2) como solvente de corrida.
Posteriormente se utilizaron algunos reveladores clásicos de gruposfuncionales para obtener una idea aproximada de los productos de reacciónobtenidos.
Luego cada una de las bandas resueltas sobre la placa cromatográficafue raspada y extraída 3 veces con 2 ml de MeOH.
Se redujo volumen hasta 1 ml y 20 ul de las soluciones así obtenidas
fueron enfrentadas a la GST de vinchuca para ver los efectos producidossobre la actividad de la misma.
Los reveladores que se utilizaron para la identificación de los gruposfuncionales fueron :
- Luz UV
- Ninhidrina- Acido sulfanílico diazotado
- Molibdato de amonio-cloruro de estaño
Posteriormente se le realizó un RMN H al compuesto que inhibía las
GST en un espectrómetro Varian EM 360 de 60 MHz utilizando D20 comosolvente, revelando que se trataba del S-(2-hidroxibencil)-glutatión (167).
Materiales y métodosPág. 79
12.2. Síntesis del desmetil fenitrotión (O-metll-O-3-metll-4-nitrofenflfosforotioato)
Una mezcla de fenitrotión (3.6 g) y INa (1.93 g) en 100 ml de acetona
fueron reflujados durante 3 hs. La acetona fue evaporada bajo presión
reducida en un rotavapor-R Buchi. El residuo fue suspendido en 20 ml deagua y extraído con cloroformo. La solución acuosa fue tratada con AmberliteIR 120 (H+) y el filtrado fue liofilizado en un liofilizador Labconco (168). Al
compuesto obtenido se le realizó un RMN H en un espectrómetro Varian EM
360 de 60 MHz utilizando CD3OD como solvente y un espectro IR en un
espectrómetro Nicolet.
í °“°H0MO noDesmetíl-Íenitrotión
13. COMPUESTOS RADIACTIVOS
13.1. 14C-Fenitr0tlón
El 14C-Fenitrotión fue donado por Sumitomo Chemical Company,Limited. Se preparó una solución de l"'C-fenitrotión en acetona (10 ul=1400
DPM). La pureza radioquímica del 1‘lC-Fenitrotión es de 99.1% con una
radiactividad específica de 141 mCi/g.
sl °"3o
\ —0 N0criao/P 2
13.2. l‘lC-Etil-Paratión
El 14C-Paratión fue obtenido de Pathfinder Laboratories Inc.. Se
preparó una solución de 14C-Paratión en acetona (10 ul=1768 DPM). La
pureza radioquímica del 14C-Paratíón es de 98% con una radiactividadespecífica de 9.6 mCi/mmol.
Materiales y métodosPág. 80
\, s1‘CHacHZO II
>P—0—@ No2CH3CH20
14. AUTORRADIOGRAFÍA
La autorradiografia se realiza en cuarto oscuro utilizando placas para
radiograña médica 3M (R 20.3 x 25.4 cm). Esta placa se coloca sobre la TLCcon los bordes previamente marcados con tinta radiactiva para que una vezrevelada la placa radiográfica se pueda superponer exactamente sobre la TLC.Para el revelado se utiliza revelador fotográfico y fijador TAC.
15. ENSAYOS IN VITRO
15.1. Estudio dela degradación GSH-dependiente del 14C-Fenitrotión
El sistema de incubación consistió en 1.57 ml de buffer fosfato 0.1 M
pH 6.5-8.5 más 0.3 ml de la preparación enzimática (equivalente a 0.3 deinsecto). Luego se agregó 0.1 ml de GSH (50 mM) más 10-30 ul de
“C-fenitrotión en acetona (1o ul = 1400 DPM).
Las reacciones fueron incubadas durante l h a 30-45 °C y terminada
con el agregado de 1 ml de TCA 5%.
Para los test de inhibición, se agregó 20 ul del inhibidor a la mezcla de
incubación y se descontó este volumen al buffer para mantener un volumenfinal de 2 m1.
Las condiciones óptimas fueron establecidas en pH 8, 37 °C y 30 ul de14C-fenitrotión (4200 dpm).
El protocolo seguido se muestra en la siguiente figura.
Q°° Est
Materiales y métodosPág. BI
Los metabolitos fueron extraídos de la fase acuosa con tres porciones
de cloroformo (4 ml). Se reduce el volumen a 5 ml bajo corriente de
nitrógeno.De la fase clorofórmica se toma una alícuota de 30 ul y junto con 10
ml de líquido de centelleo Aquasol-Z, New England Nuclear, USA fuecuantificada en un contador de centelleo líquido automático (LSC) BeckmanLS-7000.
A la fase acuosa remanente (2 ml) conteniendo los metabolitos
solubles, se le agregan 20 ml de Aquasol-Z, New England Nuclear, USA y secuantifica en un contador de centelleo líquido automático (LSC) BeckmanLS-7000.
15.2. Micro incubación ( metabolismo in vitro)
La biouansformación de los xenobióticos lipofílicos en insectosdemostró ser uno de los factores más importantes en la modulación de la
toxicidad de los mismos. En consecuencia resulta relevante disponer demetodologías que permitan el estudio de los caminos detoxificantes deinsecticidas OP en insectos vectores.
Como consecuencia de la imposibilidad de poder analizar los
metabolitos del fenitrotión utilizando las técnicas clásicas utilizadas paramamíferos, se puso a punto la técnica de micro incubación.
La micro incubación propone un cambio de escala de tal magnitud quehace posible identificar y cuantificar los metabolitos producidos in vitro portejidos de insectos y ponderar la acción de sustancias tales como losinhibidores.
El sistema de incubación consistió en 0.1 ml del extracto enzimático
más 0.05 ml de GSH 0.25 mM y 0.01 ml de 14C-FenitIotión con
especificaciones exactamente iguales a las mencionadas anteriormente.Cuando se utilizó algún inhibidor se agregó 5 ul de éste (la concentración se
especifica en cada experimento en particular) igualando el volumen en el restode los tubos con el bufier utilizado en la realización del extracto enzimático.
Este sistema se incuba a 37 °C durante l hr. Posteriormente se siembra el
extracto en forma cuantitativa en una placa de sílica gel F-254 y se desarrolla
con butanolzacéticozagua 4:1:2. Finalizado este paso se procede aautorradiografiar la placa.
Materiales y métodosPág. 82
Finalizada esta etapa aparecen en la placa radiográfica numerosas
bandas, que son fragmentos de la molécula insecticida portando el carbonoradiactivo.
Cada una de estas bandas se marcan con lápiz de grafito sobre la TLC.
Concluida la demarcación de las bandas, son raspadas con un cutter de la
TLC y colocadas en un vial con lO ml de Aquasol y cuantificadas en un
contador de centelleo líquido automático (LSC) Beckman LS-7000.
16. ENSAYOS IN VIVO
16.1. Toncoclnéflca del 14C-Fenltrouón
Tópico de 14C-Fenitrotión:
Se topicaron las vinchucas adultas con 0.05 ml de 1"C-Fenitrotjón en
acetona (lOul=l4OO DPM) y se mantuvieron en cámara durante 24 hs. La
pureza radioquímica del l“C-Feniti'otión es de 99.1% con una radiactividad
específica de 141 mCi/g.
1) Cuantificación de lo no penetrado en el insecto medido por la técnica deWash off:
Se lavan los insectos enteros con 3 x 5 ml de acetona. Se toma una
alícuota de 0.5 ml y junto con lO ml de Aquasol fue cuantificada en uncontador de centelleo líquido automático (LSC) Beckman LS-7000.
2) Cuantificación de lo penetrado en cabeza:
Se separa la cabeza del insecto y se homogeneiza con 10 ml de
Aquasol en un vial de centelleo. El vial fue cuantificado en un contador decentelleo líquido automático (LSC) Beclcman LS-7000.
3) Cuantificación de lo penetrado en el cuerpo:
3.1) Compuestos no polares solubles en éter:
El resto del insecto es homogeneizado y se extrae con 3 x 5 ml de éter.
Materiales y métodosPág. 83
Se toma una alícuota de 0.5 m1 y junto con 10 ml de Aquasol fue
cuantificada en un contador de centelleo líquido automático (LSC) BeckmanLS-7000.
3.2) Compuestos polares solubles en metano]:
Posteriormente se extrae con 3 x 5 ml de metano]. Se toma una
alícuota de 0.5 ml y junto con 10 ml de Aquasol fue cuantificada en un
contador de centelleo líquido automático (LSC) Beckman LS-7000.
4) Cuantificación de lo no extraíble (carcaza):
Los tejidos restantes luego de las dos extracciones fueron colocados enlO ml de Aquasol y cuantificados en un contador de centelleo líquidoautomático (LSC) Beckman LS-7000.
5) Cuantificación de la excreta:
El recipiente que contenía al insecto file enjuagado con 10 ml de
Aquasol y cuantificado en un contador de centelleo líquido automático (LSC)Beckman LS-7000.
16.2. Metabolismo in vivodel l"C-Fenitrottón
Para el estudio de los metabolitos del fenitrotión in vivo se procede
igual que en el estudio de la toxicocinética de este insecticida OP.
En este caso se reduce el volumen de la fase etérea y metanólica hastaaproximadamente 0.1 ml bajo corriente de nitrógeno.
Estos extractos son sembrados en forma cuantitativa en una placa desílica gel F-254 y se desarrolla la fase metanólica con butanolzacéticozagua
4:] :2 mientras que la fase etérea se desarrolla con hexano:acetona:clorofonno
40:20:3 (x2). Finalizado este paso se procede a autorradiografiar la placa
siguiendo el mismo procedimiento para cuantificar las bandas que e] seguidopara la micro-incubación.
III. RESULTADOS
ResultadosPia. 84
RESULTADOS
l. ENSAYOS " IN¡mo "
1.1. Estudios de inhibición con colorantes del trifenflmetano y algunosflavonoides
La actividad específica de GST en homogenatos de vinchuca macho
expresada como mM de S-(DNB)-Glutatión/min x mg Proteínas es de 0.03 i0.01.
Trabajos anteriores de nuestro laboratorio (169) demostraron que unaserie de colorantes del trifenilmetano y algunos flavonoides fueroninhibidores in vitro de la GST de vinchuca.
Los compuestos ensayados en solución acetónica 10'2 M fueron :Eosina, Verde de Bromo Cresol, Azul de Timo], Azul de Bromofenol, Azul
de Bromotimol, Sulfobromoflaleína, Gosipol y Quercetina.
Luego de este muestreo inicial elegimos la quercetina, la
sulfobromoftaleína y el azul de timo] por ser los mejores inhibidores in vitrode la GST.
En primer lugar se midió la capacidad inhibitoria de estos compuestos
como 150 dando 8 x10'7 M, 1 x 10'6 y l x 10'5 M para la Q, SBF y AT
respectivamente (Tabla l).
Tabla l 2 % de inhibiciónde GST de vinchuca obtenido utilizandodistintas concentracionesde inhibidor con GSH=2.5 mM y CDNB=O.5 mM.
pl = 4-09 ll]
pI % Inh pl % Inh pl % Inh
7.0 7.0 16:}:2
6.3 40:8
6.0 53i3 5.7 58i2
Los resultados t SD son el promedio de 4 experimentos independientes
Figura l 2 ¡5o de Queroetina, Sutfobromoflaleínay Azulde Timo!
Resultados
GSH=2.5mM : CDNB=0.5mM
X inhibición«Innll"!
n l
4 s
pl=ioslll
INHIBIDOR
+ Ouemetlna
n Sulfohmmoflaleína
I Azul de 11m0!
1.1.1. Tipo de Inhibición producido por la Q, SBF y A T
Posteriormente se indagó sobre el tipo de inhibición producido por laquercetina, sulfobromoflaleína y azul de timo] para lo cual se realizaronestudios de cinética enzimática. Luego con los datos obtenidos se realizaron
las representaciones gráficas de Lineweaver-Burk (Tablas y Figuras 2 a 7).
Se trabajó con preparados de GST de vinchuca (materiales y métodos) cuyas
constantes cinéticas son Km(CDNB)=0.26 mM, Km<GSH)=0.70 mM y Vmáx=52 ¡LM/min x mg. Prot.
Mg. as
Tabla 2 : Datos 1/s y 1N de la inhibiciónproducida por o, 0.5 y 1.o pMde Q utilizando
CDNB (0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato Constante (2.5 mM).
V : pM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
1/v (x 10 +3)l/S ( o) un
M1) 0 0.5 1.02.o 33i2 53:t2 655:]
2.7 35:}:2 67zt2 85:1:2
4.0 45:!:3 93:5 l115:228.0 673-3 152:I:4 196i3
Los resultados t SD son el promedio de 2 experimentos independientes
ResultadosPág. 86
Figura 2 : Gráficode Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por Q
utilizando CDNB (0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato constante en
una concentración de 2.5 mM
V : pM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
a l l l l l
-4 -2 8 2 4 6 8 18
iiicnual
Tabla 3 z Datos 1/s y 1N de ia inhibiciónproducida por o, 0.5 y 1.o pM de Q utilizando
GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNB oomo sustrato Constante (0.5 mM)
V: pM-(S-DNB)-giutatiónlmin x mg proteína
1/V (x 10 +3)
0.40 29i20.80 4 ¿:2
.00 37d:3 43:1:2
Los resultados t SD son el promedio de 2 experimentos independientes
ResultadosPág. 87
Figura 3 2 Gráficode Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por Q
utilizando GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato constante en
una concentración de 0.5 mM.
V : uM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
o 1 l i
—2 -1 a 1 2
1¡(Gsm
Tabla 4 : Datos 1/s y 1N de ia inhibiciónproducida por o. 0.5, 1.o y 2.o ¡JMde SBF utilizando
CDNB(0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato Constante (2.5 mM)
V : pM-(S-DNB)-giutatiónlmin x mg proteína
1/v (x 10 +3)l/S (SBF) un
(mn-1) 0 0.5 1.0 2.02.0 29:8 60:8 81i2 lO8:I:3
2.7 32i4 66i3 90:8 119dz54.0 41:i:3 79i4 l 18:}:4 l43i4
8.0 63i5 119:t:4 163-45 215i4
Los resultados t SD son el promedio de 3 experimentos independientes
ResultadosPág. 88
Figura 4 2 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por SBF
utilizando CDNB(0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato constante en
una concentración de 2.5 mM
V : pM-(S-DNB)-glutatión/min x mg proteína
11v
SDP (I'll)
8'2 ’ I: signal 1 8
rilcnual
Tabla 5 : Datos 1/3 y 1N de la inhibiciónproducida por o. 0.5. 1.o y 2.o pMde SBF utilizando
GSH (1 —3.75 mM) como sustrato variable y CDNB como sustrato Constante (0.5 mM)
V : uM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
l/V (x 10 +3)1/S (SBF) [LM
mui-1) o 0.5 1.o 2.o0.27 22th 38th 44:t2 52:l:1
0.40 24:l:2 413:] 47:l:2 56:l:2
0.80 29th 49:l:2 57:l:2 68:l:3
1.00 31th 54i3 62i2 75:1:2
Los resultados t SD son el promedio de 3 experimentos independientes
ResultadosPág. s9
Figura 5 ZGráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a le inhibiciónproducida por SBF
utilizando GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato constante en una
V : uM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
concentración de 0.5 mM
Hv ¿a
sm? (un) 1'
Itcigm 8.- 8.o
“5‘ + ¡3.5 '
s 1.8 a.n 2.8
a l l L
-2 -1 a 1 2
1¡[GSH]
Tabla 6 : Datos 1/s y 1N de la inhibiciónproducida por o. 5 y 1o pM de AT utilizando
CDNB (0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato Constante (2.5 mM)
V : uM-(S-DNB)-glutatión/min x mg proteína
1/V(x 10 +3)1/S ( AT) ¡1M
_(m_M'1) 0 5 102.0 31th 48:1:3 58i3
2.7 35i2 57d:3 76:l:3
4.o 41:t:3 7l:t:2 96:!z4
8.0 64d:3 119:1:3 169i4
Los resultados :t SD son el promedio de 2 experimentos independientes
ResultadosPág. 9o
Figura 6 2 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por AT
utilizando CDNB(0.125 -0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato constante en
una concentración de 2.5 mM.
V : uM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
H‘V8.2
nde! (IM)
I z sigma
I B
+ 5
8:1 " fl 10
8-4 -Z B 2 4 6 8 18
ÍHCDNB]
Tabla 7 : Datos us y 1N de ia inhibiciónproducida por o, 5 y 1o uMde AT utilizando GSH
(1 - 3.75 mM) como sustrato variable y CDNB como sustrato Constante (0.5 mM)
V : uM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
1/V (x 10 +3)l/S ( AT) uM
(mM'1) 0 5 10
0.27 24d:2 3212 46dzl
0.40 25i2 35zt2 50i20.80 30i3 41i3 55:i:2
1.00 32d:3 43i4 58zt3
Los resultados 1 SD son el promedio de 2 experimentos independientes
ResultadosPág. 91
Figura 7 2 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónprodueida por AT
utilizando GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato constante en
una concentración de 0.5 mM
V : pM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
UV
fl de T (PH)
It SigueI 8
"’85 ' + S
í 18
g l 1
-3 -2 -1 8 1 2
ÏHGSH]
1.2. Estudios de inhibición con saligeninas cíclicas fosforadas ycompuestos GS-bencil sustituidos
Continuamos nuestros estudios sobre la inhibición de la GST de
vinchuca utilizando saligeninas cíclicas fosforadas y aductos de glutatión con
saligeninas cíclicas fosforadas como posibles inhibidores de este grupo deenzimas (167). Las saligeninas son fosfatos cíclicos (SCP) que tienencaracterísticas biológicas muy interesantes contra los mtrópodos plaga (Fig8).
ResultadosPág. 92
Figura 8 : Saligeninascíclicasfosforadas (SCPs)
X
ll
\¡|_-,___ R
SCPs
X R
Salition S OMeSalioxon 0 0Me¡(-1 O PhK-2 0 OPh
En primer lugar ensayamos la capacidad inhibitoria de estosfosforados cíclicos a una concentración 0.1 mM sobre la actividad in vitro de
la GST de vinchuca (Tabla 8).
Tabla 8 : Actividad in vitm de la GST de vinchuca en presencia de las SCPs (0.1 mM)
SCPs Act. GST
1.2.1. Síntesis y caracterización del S-(2-hidroxi-bencll)—glutatión
Posteriormente se sintetizó un aducto entre el GSH y el Salitión comose detalla en materiales y métodos. Los resultados obtenidos se resumen en
la figura 9.
ResultadosPig. 93
Figura 9 : Análisispor TLCdelos productos de reacción del salitióny GSH
Slllm pl GOF264p--—-——‘-—-'— r
Buhml-Aoatloo-Aoun (4:12!) m UV Nlnhldrln- Mollb.M. aulhnll. - InnNlirlifiodlo
. . 0.77 + - + - —
Q 0.50 + — - —
. 0.a + -— + +
g m + + - + +
O O o-oe + + - -
II" .‘Hbl ‘IliblQ
Como se observa en la figura anterior (Fig. 9), el único compuesto
capaz de inhibir la GST fue el de Rf= 0.20.Este compuesto absorbe la luz UV, da reacción positiva con
y ácido sulfanílicodiazotadoy negativacon el reactivodemolibdato. Según estos resultados la molécula debe presentar un grupo
aminoácido, un grupo fenol, y ausencia de grupo fosfato. Se identificó al
inhibidor de la GST como el S-(Z-hidroxibencil)-glutatión (167). A su vez se
le realizó un RMN (protón) confirmando la identificación de este compuesto.
1.2.2. Tipo de inhibición producido por los compuestos GS-bencilsustituidos
Una vez terminada la fase de identificación y purificación del
compuesto, se prosiguió a realizar los estudios cinéticos.
También se utilizó otro compuesto GS-bencil sustituido comercial
(Sigma) el S-(para-nitro-bencil)-glutatión. La potencia inhibitoria de ambos
compuestos respecto a la GST expresada como 150 indicó que el SZHBG yel SPNBG poseen 150 del mismo orden 4 x 10'5 y 3 x lO'5 respectivamente(Tabla 9).
ResultadosPág. 94
Tabla 9 : % de inhibiciónde GST de vinchuca obtenido utilizandodistintasconcentracionesde inhibidor con GSH=2.5 mM y CDNB=O.5mM.
pl = -L°9 [I]
pI %Inh pI %Inh
36:t3
4.4
4.3 60i2 4.6
74:1:4 63i2
Los resultados t SD son el promedio de 2 experimentos independientes
Figura 10 2 Iso de compuestos S-bencilsustituidos SZHBGy SPNBG
GSH=2.5mM : CDNB=O.5mM
Z Inhikiciun
-°- S-(WHPWI
\ "’- S-(p'lltrohncHFN
Luego se estudió el tipo de inhibición producido por estos aductos.Los datos obtenidos se muestran en las Tablas 10 a 13 y Figuras 11 a 14.
ResultadosPág. 95
Tabla 10 : Datos 1/s y 1N de la inhibiciónproducida por o. 7. 35 y 7o pM de SZHBGutilizando
CDNB (0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato Constante (2.5 mM)
V : pM-(S-DNB)-glutatión/min x mg proteína
1/v (x 10 +3)1/8 (sznae) nu
(mM'1) o 7 35 7o2.0 33:1:2 413c3 75th 91:t3
2.7 37il 49:i:3 88sz 1l4i3
4.0 441-2 69d:4 l 17:}:3 l40:k3
8.0 67:1:2 893-3 l 62i3 2033-3
Los resultados t SD son el promedio de 2 experimentos independientes
Figura ll 3 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente e la inhibiciónproducida por SZHBG
utilizando CDNB(0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato constante en una
concentración de 2.5 mM
V : uM-(S-DNB)-giutatióerin x mg proteina
1JICDNB]
ResultadosPía. 96
Tabla ll : Datos 1/s y 1N de Ia inhibiciónproducida por o. 7. 35 y 7o pM de SZHBGutilizando
GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato Constante (0.5 mM)
V : pM-(S-DNB)-glutatíónlmin x mg proteína
l/V (x 10 +3)
1/S (szHaG) ¡uu y
(mM'1) o 7 35 7o0.27 22th 28zi:2 49zizl 81:1:2
0.40 253:] 32:1:2 64:i:2 97:1:2
0.80 30i2 42:8 108i3 187d:3
1.00 32:i:3 48:i:2 127d:3 213:!3
Los resultados i SD son ei promedio de dos experimentos independientes
Figura 12 2 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a Ia inhibiciónproducida por SZHBG
utilizando GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato constante en una
concentración de 0.5 mM
V : uM-(S-DNB)-giutatión/min x mg proteina
HV 7a
[I] PH
Biz'-. a I+ 7
x 35
011 ‘- n 7B
7
a
B l l
-2 —1 8 1 2
¡[[GSH]
ResultadosPág. 97
Tabla 12 : Datos 1/s y 1N dela inhibiciónproducida por o. 12.5. 25 y so pMde SPNBG
utilizando CDNB(0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato Constante (2.5 mM)
V : uM-(S-DNB)-glutatíónlmin x mg proteína
l/V (x 10 +3)1/S (SPNBG) HM
(mM‘1) o 12.5 25.0 50.01.6 25a 37H 59a 75:l:l2.o 3034 40:h2 67:l:3 86d:1
2.7 35th 45:l:3 78dz2 97:t2
4.o 37:t2 62:l:3 9912 120322
8.0 59:l:3 84i2 14624:] 190552
Los resultados 1:SD son el promedio de dos experimentos independientes
Figura 13 : Gráficode Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por SPNBG
utilizando CDNB(0.125 - 0.5 mM)como sustrato variable y GSH como sustrato constante en una
concentración de 2.5 mM
V : pM-(S-DNB)-glutatiónlmin x mg proteína
IN
IHCDNB]
ResultadosPág. 98
Tabla 13 : Datos 1/s y 1N de la inhibiciónproduoida por o. 12.5. 25 y so pMde SPNBG
utilizando GSH (1 - 3.75 mM)como sustrato variable y CDNBcomo sustrato Constante (0.5 mM)
V : pM-(S-DNB)-glutatiónlmín x mg proteína
11v (x 10 +3)
12.5 25.0
39ztl
40
0.80 l
1.00 31d:2 87:6
09dz2
4
Los resultados 1:SD son el promedio de dos experimentos independientes
Figura 14 1 Gráfico de Lineweaver-Burkcorrespondiente a la inhibiciónproducida por SPNBG
utilizando GSH (1 - 3.75 mM) como sustrato variable y CDNBcomo sustrato constante en una
concentración de 0.5 mM
V: pM-(S-DNB)-glutatiónlminx mg proteins
11V
[1]?"118])
-2 -1 8
1¡(Gsm
ResultadosPág. 99
2. ENSAYOS 'IN VIVO'
En base a los resultados obtenidos sobre la inhibición de la GST in
vitro analizamos la posibilidad de ensayar este efecto in vivo. En estos
primeros ensayos nos enfrentamos con la dificultad que tienen estos
compuestos para penetrar por tópico a través de la cutícula del insecto.Para mejorar la penetración se ensayaron diferentes mezclas de
solventes, siguiendo su comportamiento mediante la técnica de wash off
descripta en materiales y métodos.
En la Fig. 15 se muestran lascurvas de calibración obtenidas.
ABS. ABS.Es
Figura 15 t Curvasde calibraciónde
azul de ümol y quercatina¡.25 05
Compuesto K B
AT 26.98 -2.51 o , n/ .
Q 21.19 0.49 ° ‘ 4 '2 ° ¿5c=me+B lMaTlIm [qllm's
Finalmente para el caso de la quercetina la mezcla acetonazglicerol 9:1resultó como la más eficaz, mientras que para el azul de timol la mezclaacetonazetanol (1:1) más 10% de glicerol.
Tabla 14 Z% de penetración a 24 hs de insectos topieados con las siguientes soluciones :
(A) 5 pl de Azul de Timol 10'2 M en acetonasetanol 1:1 + 10% de glicerol . (B) 5 ul con una
solución 0.05 mglml de Fenitroüón en acetona + 5 ul de Azul de Timol 10.2 Men
acetonazetanol 1:1 + 10% de glicerol . (C) 5 pl de Quercetina 10‘2 Men acetona + 10% de
glicerol . (D) 5 ul de Quarcetina 10'2 Men acetona + 10% de glicerol + 5 ul de aeetona
% de Penetración de % de Penetración
ResultadosPág. 100
2.1. Ensayos realizados con Querceüna
En trabajos previos de nuestro laboratorio (55), se demostró la
capacidad que tiene la GST de biotransformar al fenitrotión (insecticidaorganofosforado), dando como resultado una molécula más hidrosoluble conmenor poder insecticida.
Nuestro propósito se centIó en tratar de sinergizar el efecto delfenitrotión mediante la coadminisuación de compuestos inhibidores de laGST. Por tal motivo comenzamos una serie de experimentos in vivo para
poder evidenciar este fenómeno. Tomando la quercetina como inhibidormodelo nos abocamos a la búsqueda de una dosis subletal comenzando atopicar este compuesto a distintas concentraciones 10,17,33 ¿Lg/insecto,
demostrando que a las mismas no se producía mortalidad. Finalmente seeligió para el cotratamiento una concentración de 17 ug de quercetina porinsecto.
Luego se observó el efecto de la quercetina en la mortalidad por
fenitrotión en vinchucas macho. Para lo cual se calculó una DL50 (dosis leía]50) para el fenitrotión y para el fenitrotión más quercetina. Los datos .se'
muestran en la Tabla 15 y 16, y la representación gráfica en la Fig. 16.
Tabla 15 : DL50del Fenitrou'ónen vinchucas macho adultas
Dosis ntest Muertos Probit LogDosis
0.30 10 0 1.9393 -0.5229
0.45 lO l 3.7184 -0.3468
0.60 10 2 4.1584 -0.2218
1.00 10 7 5.5244 0.0000
1.50 10 10 8.0607 0.1761
DL50 = 0.775 ¡ig/¡ns
Lim inf = 0.683 ¡ig/¡ns Limsup = 0.880 pgfins
ResultadosPág. 101
Tabla 16 2 DL50del Fenitrotión+ 17 ¡ag/msde Quercetina (tóp) en vinchucas macho
adultas
Dosis ntest Muertos Probit LogDosis
0.30 lO O 4.1584 -0.5229
0.45 10 6 5.5244 -0.3468
0.60 10 8 5.8416 -0.2218
1.00 10 10 8.0607 0.0000
DL50 = 0.411 pgfins
Lim¡nf= 0.359 pgfins Um sup = 0.472 pgflns
Figura 16 : DL5° del Fenitrotióny Fenitroüón+ Querceüna en vinchucas macho adultas
DL 50XMottalidad
99.99 .F .
+
+
50 I
_ . Fenitmtión. + Fenitrotiñn + Quercetina
0.01 I I I I I I I Ïl Ï I I Í I I I I
0.1 1 10Dosis
Como puede observarse en la Fig. 16 se obtiene para el cotratamiento
con quemetina un factor de sinergismo de 2. El factor de sinergismo está
definido de la siguiente manera:
DLFactorde sinergismo = 50 Fenmón
DLsu Fenitrolión + x
X : compuesto utilizado en el cotratamiento
ResultadosPág. 102
Posteriormente se realizó un estudio en fimción del tiempo del
proceso de intoxicación producido por el cotratamiento del fenitrotión másquercetina siguiendo el perfil bioquímico del insecto. Con este propósito semidió la actividad de, GST, PTA-EST, Ache a distintos tiempos.
Después de este análisis decidimos realizar nuestros estudiosenzimáticos a 24 hs de la topicación de los compuestos.
Tratando de aclarar el proceso de intoxicación de los insectos,
diseñamos un experimento en el cual se intercambiaba el orden de los
compuestos a topicar, para luego ver si se encontraban diferencias en lasenzimas mencionadas debido a éste tratamiento. Los resultados obtenidos se
muestran en las Fig. 17-18Para esta experiencia se utilizarán las siguientes abreviaturas:
Q+F : quercetina, 30 min, fenitrotión.
F+Q : fenitrotión, 30 min, quercetina.
Q : quercetina, 30 min, acetona.
F : fenitrotión, 30 min, acetonazglicerol 9:1.
C : Tópico de solventes solamente
In vitro se demostró que el fenitrotión no inhibe la GST, y que la Q+Finhibe en el mismo porcentaje que la quercetina sola (Fig. 19).
Figura 17 Z% de mortalidada distintas horas producido por los distintos tratamientos
56Mortalidad
- Control
Tanto el control como la quercetina produjeron 0% de mortalidad
ResultadosPág. 103
Figura 18 : Actividadesespecíficas de Ache, GST y PTA-ESTmedidas en los distintos
tratamientos
‘lüfl90’
F
Pm (Int)GST (Ext)
- MisST (IM)
Pm (Ext)
Figura 19 I Disminuciónde la actividad in vitrode la GST producida por los distintos
tratamientos
ma
z
flI:t
5. .GSI'
o c F'Q ¡PP Y Q
I’:anltrotlnn Quinto-tina
Posteriormente se analizó la Ache de cabeza y la GST y PTA-EST, de
dos regiones del insecto. Una de estas fue la cutícula (Ext) y la otra fue elinterior del mismo (Int), conteniendo todos los órganos internos evitando eltracto gastrointestinal. Los resultados pueden observarse en el (Fig. 17). Loque se observó fue una velocidad de mortalidad mucho mayor en lostopicados de Q+F que en el resto de las combinaciones ensayadas (Fig. 18).
Resultados
Pág. 104
2.2. Ensayos realizados con Azul de Timo]
En el caso del azul de timo] se ensayaron distintas vías de ingreso paraeste compuesto así como distintos estadios de insectos. En primer lugar se
realizó una DL50, cuyos resultados se muestran en la Tabla 17 y larepresentación gráfica en la Fig. 20.
Tabla 17 t DL50de Fenitrotión + 120 pgfms de Azulde Timo!(tóp) en vinchucas macho
adultas
Dosis ntest Muertos Probit LogDosis
0.25 10 4 4.7467 -0.6021
0.35 10 6 5.2533 -0.4559
0.45 10 2 5.8416 -0.3468
DL50 = 0.292 pgfins
Lirninf = 0.222 ¡ig/¡ns Lim sup = 0.385 pg/¡ns
Figura 20 : DLSOde Fenitmtión y Fenitrotión+ Azulde Timo!en vinchucas macho adultas
D L -5 0X Mortalidad
99.99 .
50I
I I Fenit'otiónn Fenitrolión + A de Timol
0'01 l l I I I l Í Ï I T I I I I I I Í
0.1 1 1 l]Dosis
Luego se ensayó en ninfas II por vía oral una solución de azul detimo] 10-3 M en ClNa 0.15 M y se midió GST y PTA-EST como se muestraen la Tabla 18.
ResultadosPág. 105
Tabla 18 : Actividadespecifica de GST y PTA-ESTde ninfas il tratadas con azul de timol
10'3 M en ClNa 0.15 M por via oral
PTA-EST 0.030i0.001
Son promedios de 2 determinaciones independientes
Figura 21 : Representación gráfica de la actividadespecífica de GST y PTA-ESTde ninfas
IItratadas con azul de timol 10.3 Men CiNa 0.15 M por via oral
7/./"uRO,
’n-"¡-'-OO'I.H
¿Á
También se siguió el perfil enzimátíco de los insectos tratados portópico con azul de timo] en una solución acetonazEtOH (1:1) 10% glicerol.
Tabla 19 : Actenzimática específica de ios insectos tratados por tópico con azui de timol
24 pgfins en una solución de acetonazEtOH (1:1) 10% glicerol y fenitrotión (F) 0.3 pg/ins.
Actenzimáticaesm'ficaEnzima solvente AT AT + F FAche 0.036:I:0.002 0.038i0.002 0.014:t0.002 0.029i0.002
PTA-EST 0.031:!:0.002 0.030zt0.004 0.024i0.004 0.022:I:0.004
GST 0.032:t0.003 0.017:t0.002 0.019zt0.003 003210003
Son promedios de 2 determinaciones independientes
ResultadosPág. 106
Figura 22 2 Perfilenzimática de los insectos tratados por tópico con azul de timol24 ugfins
en una solución de acetonazEtOH (1:1) 10% glicerol y fenitrotión 0.3 pgfins.
Act Espocltlca
l-soi-enteM (Mon FÍa. d
F ÉLuego se observó el efecto producido por la administración de azul de
timol vía oral en machos adultos alimentados por una hora. Durante esteperíodo los insectos incorporan aproximadamente 44 ug de azul de timo]. Laconcentración de la solución utilizada de azul de timol es de 10'3 M en ClNa0.15 M.
Tabla 20 ZDatos que representan la Actenzimática por insecto (machos adultos)
alimentados una hora con azul de ümol 10'3 Men ClNa 0.15 M
Act enzimática por insecto
Enzima control AT
Ache 0.050 0.052
PTA-EST 0.60:!:0.01 0.50zt0.01
GST 1.462t0.01 0.47i0.01
Son promedios de 2 detennineciones independientes
ResultadosPág. 107
Figura 23 i Gráficode la Act enzimáticafins(machos adultos) alimentados una hora con
azul de timo! 10-3 M en CINa 0.15 M
Int-ÑI-GO'IÜW¡’03
También se ensayó la inyección de azul de timo] (10'2 M) 2 ill/macho
más tópico de fenitrotión 10 ul (0.1 Ing/m1),observándose la mortalidad y el
efecto sobre la GST como se muestra en las Tablas 21 y 22 respectivamente.
Tabla 21 t % de Mortalidadde los insectos tratados por inyeccióncon azul de timo!
(10'2 M)2 ¡il/macho más tópico de fenitrotión 1o ul (0.1 mg/ml)
Fenitrotión
AT (iny) +
Tabla 22 : Act enzimática especifica de GST de los insectos tratados por inyeccióncon
azul de timol (10-2 M)2 ¡il/macho más tópico de fenitrotión 10 pl (0.1 mg/ml)
Act enzimática específica
Enzima agua AT AT + F FGST 0.038zk0.002 0.025i0.002 0.027zt0.003 0.036i0.002
Son promedios de 2 determinaciones independientes
ResultadosPág. 108
Figura 24 ZGráficoque representa le Actenzimática específica de GST de los insectos
tratados por inyección con azul de timol (10'2 M)2 tii/macho más tópico de fenitrotión 10 pl
(0.1 mg/ml)
_..g..-.—oo'vnu0-09 :7
-So|_t.nin! ¡fl-T" ’P 2 Penitrotion
2.3. Inducción
Se ensayaron distintas clases de compuestos como potencialesinductores que pueden ser agrupados de la siguiente forma:
1) Insecticidas
Organoclorados:
Tabla 23 : Efectos del tratamiento con DDTsobre la actividad de la GST de vinchucas adultas
Comp. ¡18 % del % del
Comp/im control control
75
9
75 67 5 108
DDT 93 76 122
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos con DDTindependientes unificados en un
homogeneto
*Datos que representan el promedio de 3 pooles independientes de 5 insectos cada uno
ResultadosPía. 109
Organofosforados:
Tabla 24 : Efectos del tratamiento con Salitión. Fenitrotióny Malatiónsobre la actividad de
la GST de vinchucas adultas
ug % del % del % del
Comp/im control control control
Salitión 7l
Salin'ón
53
0.5 137 99
Salitión 2 0. 121 70
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos con 0P independientes unificados en un
homogenato
También se realizó un experimento con Salitión en el cual se fueaumentando la dosis progresivamente y se midió la actividad GST de losinsectos tratados cada 24 hs.
Tabla 25 2 Efectos del tratamiento con Salitióna distintas dosis aumentadas en forma
progresiva sobre la actividad de la GST de vinci'iucas adultas
Compuesto. Trat. ug % del % del % del
SALITIÓN Comp/ms control control control
(ActJ') M (Act.EL24 hs l tópico 5 96 92 104
48 hs 2 tópicos 10 94 73 129
72 hs 3 tópicos 15 93 70 133
96 hs 4 tópicos 20 110 87 126
Se utilizóun iote de 20 vinchucas adultas tratadas y 20 controles de los que se realizaron
pooiesde5insectosparacada
También se ensayó el salitión en ninfas I utilizando la técnica de film.Se trató a las telas con 2 ml de una solución 0.05 tng/ml.
ResultadosMg.no
Tabla 26 : Efectos del tratamiento con Saliüón (film)sobre la actividad de la GST de ninfas |
Compumto. Tal. % del control
(Act/5.)Salitión Film tela 118:1:10
Datos que representan el promediode 2 podes de 5 insectos cada uno
Piretroides:
Tabla 27 Z Efectos del tratamiento con Tetrametn'na sobre la actividad de la GST de
vinchucas adunas
Compuesto. TraL "-3 % del % del °/odel
Comp/tm connol confiol conmol(AW)MMTetrameu'ina l tópico 320 94 103 91
Los datos representan la resultante de 5 hatemientos con tetametnna independientes
unificados en un homogenato
2) Inductores clásicos
Tabla 28 I Efectosdel namiento con ¡nductoresdásieoa sobre la actividadde la GST de
vinchucas aduitas
Compuesto. Tmt. ug % del % del % del
Comp/im control control control
(AcL/ins) (Prom (Act.ELFenobarbítona 2 tópicos 350 107 125 86
Fenobarbítal inyección 48 120 130 92
3-metil- l tópico 350 93 84 ll lcolantreno
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos con indudoms clásicos independientes
unificados en un homogenato
También se ensayó e] fenobarbital en ninfas I. Se alimentó las ninfas
con una solución 0.1 y l % (p/v).
ResultadosPág.lll
Tabla 29 : Efectos del tratamiento con Fenobarbital sobre la actividadde la GST de ninfas |
Compuesto. Tun. % del connol
FENOBARBH‘AL (AcL/S tm)
0.1 % aliment. 95i2
l % aliment. 1l7i4
Datos que representan el promedio de 2 pooles de 5 insectos cada uno
3) Compuestos de on'gen vegetal
Tabla 30 : Efectos del tratamientocon compuestos de origen vegetal sobre la actividadde
la GST de vinchucas adultas
Compuesto. Trat. ug % del % del % del
Comp/ms control control control
(Act-rm) (Pmb_’im) (Ac!-BEL
Indol-3-Acetonítn'lo l tópico 20 81 70 116
Indol-3-Acetonitrilo l tópico 200 109 86 127
Indol-3-Acetonitn'lo 2 tópicos 200 97 91 107
Indol-3-Carbinol l tópico 20 100 71 141
Indol-3-Carbinol l tÓjiCO 200 113 84 135
Indol-3-Carbinol 2 tópicos 200 124 100 124
Flavona l topico 20 88 81 109
Flavona l tópico 200 92 88 105
Flavona 2 tópicos 200 114 99 l 15
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos oon compuestos de on’genvegetal
independientes unificados en un homogenato
También se ensayaron estos compuestos en ninfas I utilizando la
técnica de film. Se trató alas telas con 2 ml de las sustancias al 2 % (p/v).
Resultados
Pág. 112
Tabla 31 2 Efectos del tratamiento con compuestos de origen vegetal sobre le actividad de
la GST de ninfas I
Compuesto. Tun. % del control
(Act/5 ins)
Indol-3-Aoetonitrilo Film tela l lOiS
Indol-3-Carbinol Film tela 103i3Flavona Film tela 105i4
Datos que representan el promedio de 2 pooles de 5 insectos cada uno
4) Plastificantes
Tabla 32 : Efectos del tratamiento con plastificantes sobre la actividadde la GST de
vinchucas adultas
Compuesto. Trat. [lg % del % del % del
Comp/ms coan control control
(Actfms) (Prom (Act.FEEL
DEF l tópico 9420 145 233 62
DOF l tópico 7350 100 83 120
DBF 1 tópico 8570 140 150 93
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos oon plastificentes independientes
unificados en un homogenato
También se ensayó DOF en ninfas I. Se trató a las telas con 2 ml de
las sustancias al l % (p/v).
Tabla 33 2 Efectos del tratamiento con DOFsobre la actividad de la GST de ninfas |
Compuesto. Trat. % del control
DOF (At:th ins)
1 día Film tela l37:t:4
3 días Film tela 13413
7 días Film tela 83d:7
Datos que representan el promedio de 2 pooles de 5 insectos cada uno
ResultadosPág. 113
5) Herbicidas
Tabla 34 : Efectos del tratamiento con 2,4 Dsobre la actividadde la GST de vinchucas adultas
Compuesto. Tmt. ng % del % del % del
Compfms control control
(Act/ina) (Prat/ms) (Act. E_s&)_
2,4 D l tópico 160 98:t10 86i15 ll4:t15
Datos que reptesentan el promediode 4 pooles 'ndependientes de 5 insectos cada uno
control
6) Solventes
Tabla 35 2 Efectos del tratamiento con eolvontes sobre la actividadde le GST de vinchuces adultas
% del conu'ol
(ActJíns)
Etanol vgpores 100
Phorone cono. l tópico 63
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos oon solventes independientes unificado: en
un homogenato
Compuesto. Tmt.
7) Otros
Tabla 36 : Efectos del tratamiento con posibles inductoreesobre la actividadde la GST de
vinchucas adultas
%del %del %dcl
control control oomnol
94 92 102
60
00 94 --— —
100 18 — —l 00 95 — —
Los datos representan la resultante de 5 tratamientos con posibles indudores independientes
unificados en un homogeneto
ResultadosPág. 114
2.4. Toxicoclnéflca del 14C-Fenltrotlón
Se estudió las diferentes etapas que sigue este insecticida marcado
al ser topicado sobre el insecto (M y M). Se siguió el perfil de insectos
topicados con F (Tablas 37-39) y con F + Q (Tablas 38-40). A su vezdentro de estos grupos se observaron insecto con mayor diuresis los
cuales fiieron analizados aparte.
Tabla 37 z DPM's obtenidas en el estudio de la toxicocinéficedel 14C-FENITROTIÓNen
vinchucas macho
DPM %Cabeza 6 :tl li 0.2
WashOff 59:t21 10:t4Éter 226 :l:37 38 :t 1
MeOH 181121 31 ¿4Excreta 73 d:9 12 :t 2
Carcaza 50 i 19 8 d:3
TOTAL 594 :t 9 100 d:2
Promedio de 7 insectos tratados en forma independiente
Tabla 38 : DPM's obtenidas en el estudio de la toncocinética del 14C-FENlTROTlÓN+
QUERCETINAen vinchucas macho
DPM %
Cabeza 7 á: l l :t 0.2
Wash Off 69 :I:6 ll d: l
Éter 274 :l:36 42 :t 6
MeOH 147 i 35 23 :t 6Excreta lll ¿:26 l7i4Carcaza 38 d:7 6 i l
TOTAL 646 :i:27 100 i l
Promedio de 6 insectos tratados en forma independiente
Resultados
Pág. 115
Tabla 39 : DPM's obtenidas en el estudio de la toxicocinéficadel 14C-FENITROTIÓNen
vinchucaa macho con mayor diuresis
DPM %
Cabeza 5 :tl 110.2WashOfi 65i8 10:1:1
Éter 171 ¿7 27 ¿:1
MeOH 131i22 21 :t4Excreta 236 :t 8 37 i l
Carcaza 29 i 3 5 ilTOTAL 637 i 10 100 :t 2
Promedio de 3 insectos tratados en forma independiente
Tabla 40 : DPM's obtenidas en el estudio de le toxicocináticadel “(S-FENITROTIÓN+
QUERCEHNAen vinchucas macho con mayor diuresis
DPM %
Cabeza 5 i l l i 0.2WashOff 50i 13 8i2
Éter 197 d: 38 3o a: 6
MeOH 153i61 23i9Excreta 223 d:33 33 i 5
Carcaza 38 i 12 6 i 2
TOTAL 666 d: 10 100 :i:2
Promedio de 3 insectos tratados en forma independiente
3. BIOTRANSFORMACIÓN INVHRODE INSECTICIDASORGANOFOSFORADOS
3.1. Degradación GSH-dependlente
La GST de Triatoma infestans fue utilizada como mente de enzima
para los estudios de degradación de insecticidas organofosforados. Lametabolización enzimática del fenitrotión fue medida como se indica en
materiales y métodos. También se utilizó GST de hígado de porcinocomercial provista por Sigma para ser comparada con la GST de vinchuca.
Mg. 116
En la Tabla 41 se muestran las DPM obtenidas con 30 ul de cada fase.
Tabla 41 : DPM's obtenidas en el estudio de la degradación GSH-depondientedel 14o
Fenitrofión
DPM (30M) DPM TOTAL
PROTOCOLO Aq Or Aq Or %2m] 2m] Rec.
QCO 6.4 21.7 429 4125 108
GST VM, 14.0 18.8 938 3140 97
GST pam-m 21.0 20.9 1407 3490 118ESTERASAS 5.3 19.4 384 3240 86
También se realizó la incubación de OP marcado con dos inhibidoresde GST :
l) quercetina (10‘3M)
2) SZHBG
Este último inhibidor fue ensayado en dos concentraciones distintas a
10“ M (GST+SZHBG)y 10'6 M (GST+SZHBG-).En la Tabla 42 se muestran los resultados obtenidos.
Tabla 42 : DPM'sobtenidas en el estudio de la degradación SSH-dependiente del 1“c
Fenitroüón en presencia de inh¡bidores de GST
DPM (30g!) DPM TOTAL
PROTOCOLO Aq Or Aq Or %2m] 2m] Rec.
QCO 9.1 18.4 610 3073 88GST 15.0 20.9 1005 3490 107
GSTmnm 9.7 22.1 650 3691 103Gsrmmn 10.4 23.2 697 3374 109
681mm. 16.4 18.6 1099 3106 100ESTERASAS 7.3 21.3 489 3557 96
Mg. 117
3.2. Síntesis y caracterización del desmetfl-Fenm'oüón
Se sintetizó el desmetil-fenitrofión (M y M) para milizarlo comopatrón en las corridas cromatográficas donde se estudian los metabolitos delfenitïotíón. Una vez concluida la etapa de síntesis se prosiguió a la
caracterización del compuesto. Se realizó un espectro IR del mismo y se locomparó con el del fenilIotión. En la Figura 25 se muestra el espectro IRobtenido para el fenitrotión (rojo) y para el desmetil-fenitrotión. También sele realizó un espectro RMN tanto a] fenitrotión como al desmetil-fenitrotíón.
Los espectros RMN obtenidos se muestran en las Figuras 26 y 27.
Figura 25 : Espectrois eonespondienteaal Fenitroüón(rojo)y al deametil
Fenitrotión (azul)
1TRANSMITTANCE
8I
ll“ [75 l tb dl 97'l “LI I
¡AVENUMBERS
P63.ua
Figura 26 : Espectro RMN(protón)del Fonitrotiónen 00013 (60 MHz)
. “¡T °"=*cuao
h 0H30>P N02H
1| e
8
a 2.70
b
c (singuletc) 7.10 - 7.40
8.10
Píg. 119
Figura 27 z Espectro RMN(protón)del desmoül- Fenitroüónen w300 ( so MHz)
ab 2.60
c (singulete) 7.20 - 7.47
Resultados
Pág. 120
3.3. Análisis cualitativo y cuantitativo de los metabolitos del 14€Fenitrotlón
Se incubó l4C-Fenitrotión (solución detallada en M y M) y GST devinchuca siguiendo la técnica de micro incubación. Se sembraron los
extractos y se corrió la placa en butanolzacético:agua 4:1:2. En la Fig. 28 se
muestran las bandas obtenidas sobre la placa radiográfica después de 7 días
de exposición.
Figura 28 2 Bandas obtenidas sobre la placa radiográfica(7 días de exposición)después
de incubar GST de vinchuca con 14C-Fenitrotión utilizando butanolzacáficozagua 4:1 :2 como
solvente de desarrollo
R1
1.0rr0-37---Oo
os_ --—- e" o
0.4__ o
0.2- .
u_¡¡_ l 1 I lControl GST EST 1 2 3 5 6
l
4
trienmtión 2: 4-nitro-3-metllfenol 3: Desmetil fenitrotlón4: S-p-nitrobencil-glutaüón 5:51neül-glmafl6n 6: Glumlón
Posteriormente estas bandas fueron raspadas y cuanüficadas
obteniéndose una recuperación promedio de la radiactividad del 80%. Losvalores obtenidos expresados en DPM para cada banda se muestran en laTabla 43.
Resultados
Pág. 121
Tabla 43 2 DPM'sobtenidosdel raspado de las bandas obtenidas después de incubar
GST de vinchuca con 14C-Fenitrotión utilizando butanolzacéücozagua 4:1:2 como solvente de
desarrol|o
Rf Control % GST % EST %
0.80 1076 98 987 93 1001 97
0.62 26 2 79 7 34 3
Total 1102 100 1066 100 1035 100
3.4. Efecto producido por la Quercefina
Se incubó l4C-Fenitrotión (solución detallada en M y M) y GST deconejo con y sin quercetina (Sul 10-2 M) siguiendo la técnica de micro
incubación. Se sembraron los exüactos y se corrió la placa en
butanolzacéticozagua 4:1:2. En la Fig. 29 se muestran las bandas obtenidas
sobre la placa radiográfica después de 12 días de exposición.
Figura 29 2 Bandas obtenidas sobre la placa radiográfica(7 días de exposición)después
de incubar GST de hígado de conejo con 14C-Fenitrotión y 14C-Fenitrotión + Quercetina
utilizando butanolzacétioozagua 4:1:2 como solvente de desarrollo
RI1.0
L.
"-3" - - o.0.5 "" 0
L
0.4 '- o
0.2 - o
L 9‘ 0.0 L | l l l I
\ Conejo Conejo+0 1 2 3 4 5 6
1:Fen¡tmu6n 2: 4-nltro-3-mcülfenol 3: Desmefil fcnltmflón4: S-p-nittohcncil-glutatlón 5: S-metll-qluultlón 6: Glulatlón
Resultados
Pág. 122
Posteriormente estas bandas fueron raspadas y cuantificadas
obteniéndose una recuperación promedio de la radiactividad del 86%.Los valores obtenidos expresados en DPM para cada banda se muestranen la Tabla 44.
Tabla 44 2 DPM's obtenidos del raspado de las bandas después de incubar GST de hígado de
conejo con 14C-Fenitrotión y 14C-Fenitroüón + Quercetina utilizando butanol2acáticozagua 4:1:2
como solvente de desarrollo
Rf Conejo % Cogo + Q %0.80 1061 88 1189 97
0.62 140 12 34 3
Total 1201 100 1223 100
3.5. Análisis cuantitativo de los metabolitos polares y no polares14C-Paratjón
Se incubó 14C-Paratión (solución detallada en M y M) y GST de
vinchuca siguiendo la técnica de micro incubación. Se sembraron los
extractos y se corrió la placa en :
l) hexano: acetona: cloroformo 40 : 20 : 3 (dos veces) "metabolitos
no polares". Se imprime la placa durante 12 dias y se marcan lasbandas sobre la sílica.
2) Se despegan del origen los metabolitos restantes "metabolitos
polares" con butano]: acético: agua 4:1:2 hasta la primer marca dela corrida anterior. Se imprime la placa durante 15 días.
Se dividió la placa en dos sectores y las bandas obtenidas fueron
raspadas en dos conjuntos no polares por un lado y polares por el otro siendo
posteriormente cuantificadas.
Resultados
Pág. 123
Tabla 45 t DPM's de los metabolitospolares y no polares del 14C-Paratíónproducidospor
la GST de vinchuca.
Metabolitos Control % GST % EST %
No Polares 1609 96 1319 95 1489 97
Polares 70 4 68 5 50 3
Total 1679 100 1387 100 1539 100
%Rec. 95 78 87
3.6.Paratlón
Se incubó 1"'C-Paratión (solución detallada en M y M) y GST devinchuca siguiendo la técnica de micro incubación. Se sembraron losextractos y se corrió la placa en butanol: acético: agua 4:1:2. En la Fig. 30 se
muestran las bandas obtenidas sobre la placa radiográfica después de 43 días
de exposición.
Análisis cualitativo y cuantitaüvo de los metabolitos del 14€
Figura 30 2 Bandas obtenidas sobre la placa radiográfica(43 días de exposición)después
de incubar GST de vinchuca con 14C-Paratión utilizando butanoltaoéüoozagua 4:1:2 como
solvante de desarrollo
0.6 ’
0.4 '
ll.2
--u m a...
Control GST EST
Resultados
Pág. 124
Posteriormente estas bandas fueron raspadas y cuantificadasobteniéndose una recuperación promedio de la radiactividad del 87%. Losvalores obtenidos expresados en DPM para cada banda se muestran en laTabla 46.
Tabla 46 : DPM'sobtenidosdel raspado de las bandas después de incubar GST de
vinchuca con 14("rParatión utilizando butanolzacáticozagua 4:1:2 como solvente de desarrollo
Rf Control % GST % EST %
0.75 1302 89 1545 91 1362 94
0.57 105 7 109 6 56 4
0.46 55 4 41 3 36 2
Total 1462 100 1695 100 1454 100
3.7. Estudios realizados con microsomas
En primer lugar se midió la capacidad de conjugación de losmicrosomas utilizando CDNB como sustrato observándose que la actividad
correspondió a 1/10 de la actividad GST citosólica (0.004 mM de S-(DNB)Glutaúón/min x mg Proteínas).
A continuación se realizaron estudios sobre la degradación de
insecticidas organofosforados marcados. La metabolización enzimática delfenitrotión fue medida como se indica en materiales y métodos.
En estos experimentos se observó que la marca aparecida en la faseacuosa era independiente de la concentración de GSH.
Luego incubó 14C-Fenitrotióny l"C-Paratión (soluciones detalladas en
M y M) y microsomas de vinchuca siguiendo la técnica de micro incubación.Se sembraron los extractos y se comió la placa en butanol: acético: agua
4:1:2. En este experimento no se observó diferencias entre los controles (sinGSI-I)y los tubos en los que se estudiaba la actividad de la GST microsomal
(con GSH).
4. BIOTRANSFORMACIÓN 12vVIVODEL“(z-Famonón
Se indagó sobre los diferentes metabolitos de este insecticida marcado
producidos in vivo al ser topicado sobre el insecto. Los insectos fuerontopicados con F (Tabla 46) y con F + Q (inhibidor de GST) (Tabla 47)analizándose los metabolitos disueltos en MeOH y en Éter (M y M).
ResultadosPág. 125
También se analizó en forma cualitativa los metabolitos del 14C-fenitrotión
disueltos en MeOH en insectos topicados con F + TEPP (inhibidor deesterasas) y con F + BP (inhibidor de MFC).
Para el caso del F y F + Q se sembraron los extractos en placasseparadas y se corrió:
Fase etérea: hexano: acetona: cloroformo 40 : 20 : 3 (dos veces)
"metabolitos no polares". Se imprime la placa durante lOdías y se marcan las bandas sobre la sílica.
Fase Metanólica: butanol: acético: agua 4 : l : 2 "metabolitos polares".
Se imprime la placa durante 10 días y se marcan lasbandas sobre la sílica.
Figura 31 I Bandas obtenidas sobre la placa radiográfica(10 días de exposición)por el
sembrado de las fases atéreas después de topicar 140-Fenitrotióny 140-Fenitrotión +
Quercatina sobre vinchucas adultas utilizando hexano : acetona : cloroformo 40 : 20 : 3 (x 2)
como solvente de desarrollo
RI1.0
0.8 l- - _ o0.6 —
_ m m o0.4 — «a mai-w- o
L- ) “v'l M-‘v".1rmj e
n'z¡- er! 5.. mr
0.0- --——-n-."'¿¿¿F F+O 1 2 3 4 5 6
1:Fcnltmu6n Z:Hita-31mm! fenol 3: Pamxón4:8-p-niuobcncil-glutatión 5:Desmetil lenltrotión 6: S-mefil-glutatión
Posteriormente estas bandas fueron raspadas y cuantificadasobteniéndose una recuperación promedio de la radiactividad del 72%. Los
valores obtenidos expresados en DPM para cada banda se muestran en laTabla 47.
ResultadosPág. 126
Tabla 47 2DPM'sobtenidosdel raspado de las bandas correspondientes a las placas
sembradas con las fases etéreas después de topicar 14C-Feni|:rotióny 14C-Fenitrotión+
Quercetina sobre vínchucas adultas utilizando hexano : acetona : oloroformo 40 : 20 : 3 (x 2)
como solvente de desarrollo
Rf DPMF % DPMF+Q %0.69 238 :4:9 57 233 :t 3 60
0.45 s4 d: 2 20 66 :b 2 17
0.40 12i1 3 l3i1 30.31 Gil 1 83:10.26 Gi] l 7:l:l 20.18 39zt2 9 49i2 13
O 30:t1 7 llil 3TOTAL 450134 100 3873:11 100
Son promedios de 2 experimentos independientes
Figura 32 ZBandas obtenidas sobre la place mdiográfica(10 días de exposición)por e!
sembrado delas fases metanóliees después de topicar 14C-Fenitrotióny 14(Z-Fenitrotión+
Quemefina sobre vinehucas adultas utilizando butanol :aoétioo : agua 4 : 1: 2 como sotvente
de desarrollo
Rf1.0
L
[1.8 LL- _ - O.h"-5 n Mm .L
04 h V ¡kitesïf_ .0.2 r o
Gin- file-e
“ Q[La _ I l l I lF F+ 0 1 2 3 4 5 6
1: Fenitmfifin 2: 4-nllro-3-melllfenol 3: Desmcfll fcnllrollón
4: S-p-nitnbcndl-QIMtlón 5: Srmeühllutaüñn 6: Glutatlón
Posteriormente estas bandas fueron raspadas y cuantificadasobteniéndose una recuperación promedio de la radiactividad del 70%. Los
ResultadosPág. 127
valores obtenidos expresados en DPM para cada banda se muestran en laTabla 48.
Tabla 48 1DPM'sobtenidosdel raspado de las bandas correspondientea las placas
sembradas con las fases metanólicas después de topicar 14C-Fenitrotióny 14(D-Fenitrotión+
Queroetina sobre vinchucas adultas utilizando butano! :acétioo : agua 4 : 1: 2 como soivente
de desarrollo
Rf DPMF % DPMF+0 %0.76 69 :1:8 18 138 i 3 34
0.58 129 a: 6 34 123 :i:4 30
0.55
0.44 32 i 5 8 29 :i:4 7
0.38 24 :i: 3 6 26 :i: 4 6
0.30 47 a: 5 13 26 :t 4 6
8
8
0.26 40 :i: 3 11 32 :i: 4
0.14 34 i 3 9 33 a: 3
TOTAL 375 :L-9 100 409 :i: 3 100
Son promedios de 2 experimentos independientes
Figura 33 z Bandas obtenidas sobre la placa radiográfica(12 días de exposición)por el
sembrado de la fase metanóiica después de topicar 14C-Fenitrotión+ TEPP y “C-Fenitrotión
+ BP sobre vinchucas adultas ufilizando butano! :acético : agua 4 : 1: 2 como solvente de
desarrolloFlf
1.0
0.8 _ _ 0o0.6_ mn 0
V Wwe"0.4 '_ ¡i ¿,9 3' “:6:
— ‘ [email protected] .
m "‘-'I=«.1
¡Lo __ l l l I l !FiÏEH’ F+BP1 2 3 4 56
1: Fenitrotión 2: 4-nllm-3-mcfil fenol 3: Desmctil fenilmüón4! S-p-nitmhenciI-glulafión 5: S-mctiI-gluteflón 6: Glutaüñn '
IV. DISCUSION
Discusión
Pág. 128
DISCUSIÓN
Los resultados presentados sugieren que la GST de Triatoma infeszansno difiere fundamentalmente de las enzimas perteneciente a otros organismos,
sin embargo algunas característica deben mencionarse en forma individual.Una de estas características es que parece haber sólo una GST en
Triatoma infestans, en contraste con otras especies en las que se encuentranmúltiples GST (81) con la excepción informada para Galleria mellonella (60).A su vez esta transferasa sólo posee actividad significativa hacia el CDNB.
En trabajos anteriores de nuestro laboratorio (169) se había demostrado
que algunos flavonoides y colorantes del üifenilmetano eran inhibidores muy
efectivos de la GST de vinchuca. Los resultados sobre la potencia inhibitoria
de estos compuestos se muestran en la Tabla l indicando que la quercetina yla sulfobromofialeína poseen efectividades similares las cuales son 10 veces
superiores a la del azul de timol. Muchos trabajos realizados utilizan comoherramientas colorantes derivados del trifenilmetano (15). Por ejemplo la
SBF, puede actuar como sustrato de algunas GST, pero en la mayoria de los
casos este compuesto inhibe fuertemente las GST de una amplia variedad de
fuentes que incluye homogenatos crudos de insecto y en menor grado las GSTde hígado de rata y conejo. Estudios detallados sobre enzima aislada deGalleria mellonella indican para la SBF y el verde de bromo cresol (VBC) unmodo de inhibición bastante complejo (98) (104). Estos colorantes inhiben
claramente por competencia con el sustrato CDNB lo cual es compatible con
el comportamiento informado para otras especies. Los valores de Kdinformados para la SBF fue de 0.2 |J.My de l.l uM para VBC a pH 7.4. Los
valores de Ki obtenidos, cuando se utilizó el CDNB como sustrato variable,fueron de 0.48 uM para SBF (pH 6.5) y 1.5 uM para VBC (pH 7.4). La gran
proximidad de los valores de Kd y Ki para estos dos colorantes sugierefuertemente que el sitio de unión ocurre en el sitio hidrofóbico del centro
catalítico. Sumado a estas observaciones, el GSH suprime parcialmente la
unión de estos ligandos, produciendo los colorantes un tipo de inhibición"competitiva mixta" con respecto al GSH (104). Se sugiere que los colorantesdel trifenilmetano actúan como análogos de sustratos (inefectivos), los cualescaen dentro del sitio hidrofóbico pero también caen parcialmente sobre el sitiode unión del GSH, lo cual impide pero no elimina la unión del mismo (98).
Discusión
Pág. 129
Esta sugerencia explicaría algunas caracterizaciones realizadas en las
que se indicaba que los colorantes tipo flaleínas eran competitivos conrespecto al GSH (104).
El estudio del tipo de inhibición producido por el azul de timol
(colorante trifenilmetano) en GST de Triatoma infestans, demostró estar en
concordancia con el modelo enunciado, siendo este colorante competitivo
respecto al CDNB y no competitivo o "competitivo mixto" respecto al GSH
(Tablas y Figuras 6-7). En cambio la SBF mostró un comportamiento de
inhibición no competitivo respecto a ambos sustratos (CDNB y GSH) con lamisma fuente de enzima (Tablas y Figuras 4-5). Un comportamiento similaral AT es el presentado por el flavonoide quercetina el cual demostró ser
competitivo respecto al CDNB y no competitivo respecto a] GSH (Tablas y
Figuras 2-3).
Luego continuamos nuestros estudios sobre la inhibición de la GST
utilizando saligeninas cíclicas fosforadas las cuales tienen características muyinteresantes contra los artrópodos plaga (Figura 8). Por ejemplo, el insecticidasalitión es efectivo contra moscas resistentes a organofosforados (170). Los
efectos sinergistas de análogos del salioxón, K-l y K-2, con malatión fueron
descritos para una cepa de moscas resistentes a diazinón debido a lainhibición de las carboxilesterasas producida por las SCP (171).
En este caso el sinergismo parece ser debido a la inhibición de la
degradación por hidrólisis delos insecticidas OP.Uno de los mecanismos de resistencia evidenciado, en insectos
resistente a insecticidas organofosforados, es mediante una alta actividad de
las GST (172). Es conocido que las saligeninas inhiben las GST y producen
sinergismo con el fenitrotión en cepas de moscas resistentes a OP (172).Los resultados obtenidos sobre la actividad de la GST de Triatoma
infestans en presencia de salitión, K-l y K-2, se muestran en la Tabla 8. No seencontró inhibición en las condiciones de ensayo realizadas.
Se propone que el aducto formado entre las SCP como el salitión y el
GSH es el responsable de la inhibición de la GST (167). Por lo tantosintetizamos un aducto entIe el salitión y el GSH para ensayarlo como posible
inhibidor de la GST de Triatoma infestans. Los resultados obtenidos se
muestran en la Fig. 9. Se identificó al inhibidor como el S-(Z-hidi'oxi-bencil}
glutatión.Posteriormente estudiamos el tipo de inhibición producido por este
compuesto sintetizado por nosotros y por otro GS-bencil sustituido comercial
DiscusiónPág. 130
(SIGMA) el S-(p-nilrobencil}glutatión. La potencia inhibitoria de ambos
compuestos respecto a la GST resultó ser del mismo orden (Tabla 9 y Figura.10). Los estudios cinéticos indicaron que los conjugados eran competitivos
respecto al GSH y no competitivo con respecto al CDNB (Tablas 10-13
Figuras 11-14). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Shiotsuki(167) el cual utilizó como fuente de enzima GST de hígado de caballo.
Hasta el momento han sido pocos los estudios realizados eninvertebrados, tendientes a develar la naturaleza del sitio activo de las GST.
Hay algunos estudios realizados por Clark con enzimas aisladas de insectostales como Costelytra zealandica (72) (104) y Galleria mellonella (60) (98).
No existe una información detallada acerca de la estructura y función
del sitio activo de las GST de insectos, sin embargo se pueden sacar algunas
consideraciones generales ya que existen en la literatura evidencias acerca delsitio activo de las enzimas de mamíferos. La suma de estas evidencias están
sintetizadas en el modelo propuesto por el grupo de Mannervik (28).Según Mannervik, la enzima está compuesta por dos subunidades
(enzima dimén'ca), y posee dos sitios activos independientes, uno sobre cada
subunidad. A su vez, cada sitio activo tiene un sitio de unión para el glutatión(sitio G-) y adyacente un sitio de unión parcialmente hidrofóbico para el
sustrato electrofilico (sitio H-). Estudios en el equilibrio de unión de los
colorantes del tn'fenilmetano en Galleria mellonella indican que estos
colorantes compiten con respecto al CDNB por la unión con el sitio
hidrofóbico, y que también parecen interferir, pero no impedir, la unión delGSH al sitio G- (98). La explicación fisica más simple de esta observación es
que los sitios G y H están situados muy cerca uno del otro y que la unión
GSH cae parcialmente en la región hidrofóbica pudiendo de este modointerferir con la unión de ligandos hidrofóbicos excepcionalmente largos.
La unión del GSH a la enzima, es altamente específica y parece
involucrar en el caso de mamíferos uniones iónicas entre residuos arginina y
los grupos carboxilo del GSH (130).En la GST de Costelytra zealandica se encuentran dos grupos básicos
ionizables (pKa aprox.= 9.2) que afectan la constante de inhibición del GSH
(Kig) (72) (104). Basándose en esta observación, se ha sugerido que estosgrupos básicos están involucrados en la unión del GSH a la enzima medianteinteracciones iónicas con sus grupos carboinOS.
Con los valores de pKa correspondientes a los grupos básicos sobre laenzima, y a la susceptibilidad de la enzima a la inactivación reversible por
Discusión
Pág. 131
anhídrido acético se ha sugerido que un residuo lisina estan'a de acuerdo conlas observaciones anteriores (37).
La ionización de este grupo no afecta el Km del CDNB o DCNB ytampoco afecta los valores de Vmáx, por lo tanto no parece involucrado en lareacción catalítica misma.
Uno de los componentes esenciales en el mecanismo de catálisis es la
activación del grupo tiol del GSH, presumiblemente por desprotonación,asistida por una base. Otro punto esencial es la activación del sustrato
elecu-ofilico. El análisis de la activación de estos componentes ha sido más
complicado, ya que los sustratos utilizados a menudo no son fisiológicos.
Consecuentemente, se propone que el sitio activo de las GST podría
tener una base (B), que facilite la deprotonación del grupo tiol del GSH, y un
ácido (HA), que colabore en la activación del sustrato electrofilico (63).La naturaleza química de los grupos propuestos en el sitio activo no es
conocida, pero un imidazol de un residuo histidina es una posible base, y ungrupo carboxilo de un ácido glutámico o aspártico podrían actuar comoposibles ácidos de Bronsted (37) (104). También existe evidencia de que en
algunas GST habría un SH crítico para el mecanismo de catálisis (69-70).
Estudios de nuestro laboratorio demostraron que la GST de vinchuca
preincubada con reactivos de sulfhidrilos presentaba tres grados de inhibición;leve (O-33%) con 1,5-I-Aedans, BNPS-Escatol, N-etilmaleimida y 2,2'
dihidroxi, 6,6'-dinafiil disulfuro; moderada (35-50%) con pAF e
iodoacetamida y alta (SO-100%) con 2,2' ditiobis-S-nitropiridina, 5,5‘—ditiobis(a-Z-nitrobenzóico) y p-cloromercun'benzoato. La susceptibilidad a reactivos
de sulfhidrilos de la GST de vinchuca es mayor que la de Galleria mellonella
asemejándose más a la encontrada en GST de higado de rata (55). De acuerdocon estos resultados la GST de vinchucas tendrían residuos tiólicos
cataJíticamente importantes. La suma de todas estas evidencias se resumen en
la figura de la página 132.Concluidos los estudios de inhibidores in vitro se ensayó la inhibición
in vivo para lo cual se debió solucionar en primer lugar los problemas quetienen estas moléculas para atravesar la cutícula. En consecuencia se
ensayaron diferentes mezclas de solventes. Los resultados obtenidos semuestran en la Figura 15 y Tabla 14. También se analizó la influencia delfenitrotión en la penetración del azul de timo] observándose que éste noafectaba la misma (Tabla 14). Cuando la quercetina se aplicó en primer lugar
Discusión
Pág. 132
y luego se topicó acetona sobre la misma la penetración de la quercetinaaumentó en un 10% (Tabla 14).
Modelo propuesto para el sitio activo dela GST
En trabajos previos de nuestro laboratorio (55), se demostró la
capacidad que tiene la GST de biotransformar al fenitrotión (insecticida
organofosforado), dando como resultado una molécula ma's hidrosoluble con
menor poder insecticida. Nuestro propósito se centró en tratar de sinergizar elefecto del fenitrotión mediante la coadministración de compuestos inhibidoresde la GST. Por tal motivo comenzamos una serie de experimentos in vivo para
poder evidenciar este fenómeno tomando la quercetina como inhibidor
modelo. Se observó el efecto de la quercetina en la mortalidad por fenitrotión
en vinchucas macho. Los datos se muestran en la Tabla 15 y 16, y la
representación gráfica en la Figura 16 observándose que la coadministmciónde la quercetina producía un factor de sinergismo de 2. Tratando de aclarareste proceso decidimos intercambiar el orden de los compuestos a topicar.Nuestra hipótesis de trabajo se basaba en la idea de que la quercetina al sertopicada en primer orden debería inhibir la GST y como consecuencia de esto
al topicar luego el fenitrotión habría una menor degradación del insecticida, locual se evidenciaría en una mayor mortalidad de los insectos (Fig. 17) ó más
especificamente, una mayor inhibición de la Ache (blanco primario) (Fig. 18).Los resultados observados pueden ser justificados por una mayor penetraciónde quercetina en el caso de los insectos topicados primero con quercetina yluego con fenitrotión. En cambio cuando la inversión se realiza in vitro no
Discusión
Pág. 133
hubo diferencias en el porcentaje de inhibición de la GST ya que lasconcentraciones de quercetina en el medio de incubación eran iguales, noafectando este proceso la presencia de fenitrotión.
Otro inhibidor ensayado in vivo fue el azul de timol. Al igual que laquerceüna este colorante sinergizó la toxicidad del fenitrotión. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla l7 y Figura 20. En este caso se obtuvo un
factor de sinergismo de 3.
También se ensayó el AT en ninfas H via oral observándose que la
administración de este colorante por otra vía inhibe la GST (Tabla 18 y Figura21).
Tratando de comprender el sinergismo observado en la toxicidad porfenitrotión medimos la actividad de tres enzima la Ache, PTA-EST y GST.
En la Tabla 19 y Figura 22 se puede observar que el AT inhibe la GST y no
inhibe la Ache ni las PTA-EST. A su vez se observa una mayor inhibición de
la Ache en los insectos tratados con AT + F probablemente debido a una
menor degradación de este insecticida organofosforado. También se observóinhibición de la GST cuando vinchucas macho adultas fueron tratadas con AT
por via oral Tabla 20, Figura 23. Otra vía ensayada fue la inyección, en donde
también se observó inhibición de las GST y sinergismo en la toxicidad por
fenitrotión (Tablas 21-22, Figura 24).
Otro de los puntos a tratar en la regulación de las GST de vinchuca es
la inducción en la actividad de estas proteinas. En los últimos años, se ha
demostrado que en muchas especies de invertebrados, la producción de GST
es un proceso que responde marcadamente a la acción de inductores. Estosefectos, parecen tener gran significancia en ciertas instancias del control de
plagas, donde la historia de la plaga en cuestión, en términos de contactos con
esas sustancias químicas (inductores), pueden afectar profundamente la
respuesta a ésas o a otras sustancias como agentes de control.Tratando de evidenciar este fenómeno ensayamos una serie de
compuestos informados como inductores en otras especies de insectos que
pueden ser agrupados de la siguiente manera:
1) Insecticidas OrganocloradosOrganofosforadosPiretroides
2) Inductores Clásicos Fenobarbital, Fenobarbitona3-metil-colantneno
DiscusiónPág. 134
3) Compuestos de origen vegeta] Indol-3-AcetonitriloIndol-3-CarbinolFlavona
4) Plastificantes DEFDOF
DBF
5) Herbicidas 2,4 D
6) Solventes EtanolPhorone
7) Otros BHAGSH
BP
NEMCDNB
DCNB
Dosis subletales de plaguicidas y compuestos químicamenterelacionados pueden tener efectos substanciales sobre la expresión de losgenes GST en organismos invertebrados.
Una modesta inducción en la actividad GST de moscas se vio despuésdel tratamiento con dosis subletales de una variedad de insecticidas (48). De
esos testeos, el DDT fue el más potente dando un 50% de incremento en la
actividad, el metilparoxón 31% y el paratión 28%. En vinchucas machosadultas se observó un incremento en la actividad GST del 22% cuando se
utilizó DDT en dosis subletales (Tabla 23).
Exposiciones a dosis subletales de insecticidas como el carbaril,
malatión, metoxiclor y dibenzofluorón en Apis mellifera no fueron efectivos
en este aspecto (107). En vinchucas se ensayaron 3 insecticidas
organofosforados por tópico: fenitIoúón, malatión y salitión lográndose unincremento en la actividad GST del 46, 38 y 73% respectivamente (Tabla 24).
El saliu'ón también fue ensayado en ninfas I por tratamiento en film telaobservándose un 18% de aumento en la actividad de la GST (Tabla 26).
Exposiciones a dosis subletales del insecticida pineu-oidepermeuina en
Apis mellifera , conducen a un aumento de 2 veces en la actividad GST conrespecto al DCNB después de 2 días de tratamiento (107). Por el contrario en
Triatoma infestans no se observó un aumento en la actividad de la GST
DiscusiónPág. 135
cuando se utilizó teu'ametrina como inductor y CDNB como sustrato (Tabla
27).En Musca domestica, el fenobarbital demostró ser un efectivo inductor
de la actividad de GST (123). La actividad de conjugación con DCNB fue
incrementada por un factor de 3 en dos cepas de moscas (una susceptible yotra resistente al diazinón) por altas dosis del barbitúrico (1000 ppm). Una
tercera cepa altamente resistente al insecticida organofosforadotetraclorvinfos, no tuvo respuesta al inductor. Resultados similares, pero no
idénticos, fueron obtenidos por Hayaoka y Dauterrnan (48), quienes
examinaron la respuesta al tratamiento con fenobarbital al 0.25% en ocho
cepas de moscas con grados variables de resistencia. La respuesta varía con lacepa y el sexo, llegando a un incremento cercano al 10% en la cepamultirresistente Hirokawa y cerca de 3.5 veces en la cepa resistente a
dimetoato 40 r2. La cepa Comell-R resistente a tetnclorvinfos, también escapaz de ser inducida. Lucilia cuprina responde a1 fenobarbital con una
inducción de 3-4 veces con resPecto a la actividad del CDNB y DCNB (53).
En Triatoma infestans el fenobarbital fue ensayado por distintas vias y endistintos estadios. En vinchucas adultas no se observó inducción cuando se
administró la droga por tópico o por inyección (Tabla 28). En ninfas I seobservó un incremento en la actividad GST de 17% cuando se las alimentó
con una solución al 1% de fenobarbital (Tabla 29). También se observó un
incremento del 11% cuando se topicó vinchucas adultas con 3-metil
colantreno (Tabla 28).
En la oruga tardía (Spodoptera fimgipera'a) los niveles de actividad
GST (utilizando DCNB como sustrato) alimentadas sobre perejil o zanahoriaamnentan entre 20 y 40 veces (107). Sustancias químicas, probablementeencontradas en estas plantas como el indol-3-carbinol, indol-3-acetonitrilo y
la flavona provocaron un incremento de 4, 18 y 7 veces respectivamente (107)cuando se utilizaron en la dieta en un nivel de dosis del 0.2% .
En vinchuca adultas estos compuestos fueron testeados por tópico adistintas concentraciones obteniéndose un máximo de incremento en la
actividad GST del 27% para el indol-3-acetonitrilo 41 % para el indol-3carbinol y de 15% para la flavona (Tabla 30). También estos compuestosfueron ensayados en ninfas I por film tela obteniéndose 10, 3 y 5 % deaumento en 1aactividad reSpectivamente (Tabla 31).
Se ensayaron por tópico una sen'e de plastificantes como posiblesinductores el dietilfialato (DEF), el dioctilfialato (DOF) y el dibutilfialato
Discusión
Pág. 136
(DBF). De esta serie el DEF resultó ser inhibidor el DOF produjo un aumentoen la actividad GST del 20% y el DBF no afectó la actividad de la enzima
(Tabla 32). El DOF también fue ensayado en ninfas I por film telaobservándose un aumento en la actividad GST del 37% a las 24 hs de
exposición (Tabla 33).
El herbicida 2,4 D condujo a un leve aumento en la actividad GST
(Tabla 34). Por el contrario el tratamiento de vinchucas adultas a vapores deetanol y al tópico de phorone no condujeron a un aumento en la actividadGST (Tabla 35).
En moscas la administración de un sinergista como el butóxido de
piperonilo en la dieta por tres días, condujo a un incremento aproximado de 2
veces en la actividad de estas enzimas (116) mientras que en vinchuca
condujo a un incremento del 21%. También se ensayaron como posiblesinductores el BHA, GSH, NEM, CDNB y DCNB observándose que estos
compuestos no condujeron a un aumento en la actividad GST en las
condiciones ensayadas (Tabla 36).El estudio del mecanismo de acción de los insecticidas en insectos
plaga es fundamental para una estrategia de control racional. La toxicocinéticaconstituye el primer estudio revelador de las claves defensivas de los insectos.
La identificación y cuantificación de las diferentes etapas que sigue un
insecticida en el insecto, permite diseñar estrategias de sinergismo de los
principios activos mediante el uso de formulaciones toxicológicamente
inteligentes. Por tal motivo estudiamos las diferentes etapas que sigue el l“C
fenitrotión al ser topicado sobre vinchucas machos adultas. También se
analizaron estas etapas que sigue el insecticida en presencia de un inhibidorde GST. A su vez dentro de estos grupos se observaron insectos con mayor
diuresis los cuales fueron analizados aparte. Los datos obtenidos se muestranen las Tablas 37-40.
La toxicocinética a 24 hs del 14C-Fenit:rotión y 14C-Fenitrotión +
Quercetina en vinchucas demostró que :
Absorción: La penetración a través de la cutícula es la primera barrera dedefensa del insecto en la intoxicación por insecticidas de contacto, ya queentre 8-] 1% de la dosis original se extrae por wash-off y entre 4—8%quedaretenido en la cutícula. No se encuentran diferencias significativas entre los
dos tratamientos (p > 0.05).
Discusión
Pág. 137
Excreción: El 70% de los insectos tratados presentan una diuresis menor del
17% de la dosis aplicada. Los dos tratamientos demuestran una diferencia
significativa del 5% (p < 0.05). El tratamiento combinado resulta en unaexcreta mayor que no sen’a suficiente como defensa fisiológica en la
intoxicación por insecticidas organofosforados ya que presentan una mayorinhibición de la Ache y mayor mortalidad.
Blotransformaclón: El contenido de compuestos liposolubles en los dostratamientos presenta diferencias significativas (p < 0.05). En efecto laradiactividad interna soluble en éter etílico del tratamiento combinado
sugiere que la quercetina favorecería en un 4% la presencia de formas nopolares, básicamente fenitrotión y fenitroxón, dentro de los insectos.La radiactividad interna debida a metabolitos polares (hidrosolubles)
presenta una diferencia significativa (p < 0.05) entre los dos tratamientos.La presencia de quercetina provoca un 8% menos de metabolitos polares.Esto sugiere que la acción de la quercetina inhibin’a parcialmente ladetoxificación.
Entrada al blanco: La proporción de insecticida que penetra en el SNCmedida como la radiactividad presente en la cabeza del insecto resultó del1% en ambos tratamientos.
Toxicodlnamla: (unión al receptor)Consecuencias de la entrada al blanco: Se verifica in vivo una inhibición
significativamente mayor (p < 0.05) en los tratamientos combinados. La
presencia de quercetina o azul de timol favorecerían la inhibición de laAche en los insectos tratados.
El 30% de los insectos presenta una diuresis mayor al 33% y en esos casos
no se encuentran diferencias significativas en ninguna de las etapas de latoxicocinética
Los insecticidas en consecuencia sufren transformaciones catalizadas
por enzimas tales como las oxidasas de función mixta microsomal (MFO),fosfatasas, esterasas, GST etc. las cuales producen la oxidación, hidrólisis,
reducción y conjugación de estos xenobióticos dentro de los organismos vivosen general y en los insectos en particular.
DiscusiónPág. 138
En todos los organismos vivos terrestres, inclusive los insectos, gran
parte de la estrategia bioquímica detoxificante de xenobióticos lipofilicos sebasa en la serie de biotransformaciones antes mencionada que conducen a
metabolitos más polares y en consecuencia más hidrosolubles y másfácilmente excretables en pequeños volúmenes de agua.
Recién en los últimos años se pone de manifiesto la participación
relevante de las GST en el metabolismo de los insecticidas (134) (135). Las
GST constituyen la última clase de los mecanismos de detoxiñcación en ser
reconocidos importantes en la resistencia de insectos a insecticidas
(Motoyama y Dauterman 1975, Oppenoorth et. al. 1979). Sin embargo
actualmente se reconoce que las GST juegan un rol principal en la resistencia
a algunos OP en insectos y probablemente un papel secundario en laresistencia a otros compuestos como el yHCH (Tanaka et. al. 1981)
Nuestro interés se centró en investigar la participación de la GST de
Triatoma infestans en el metabolismo de insecticidas organofosforados. En laTabla 41 se muestra que la enzima de vinchucas adultas macho es capaz deproducir un 119% más de metabolitos hidrosolubles del 14C-fenitrotión quelos controles. También se observó una mayor cantidad metabolitoshidrosolubles cuando se utilizó GST de porcino comercial.
En muchas oportunidades la dificultad encontrada en la interpretaciónde los resultados radica en que la presencia de metabolitos in vivo no puede
ser atn'buida solamente a un sistema enzimático en particular, ya que se ha
demostrado que diferentes enzimas o sistema de enzimas, pueden reaccionaren un sitio común de la molécula de OP para dar un metabolito final con
idéntica estructura química. (137) (139) (140). Por lo tanto deben realizarse
con muchos recaudos los análisis de la O-dealquilación y O-dearilación de los
0,0-dialquil-aril fosforotionatos o fosfatos, ya que estas reacciones tambiénpueden ser el resultado de la hidrólisis, oxidación y conjugación efectuadaspor otras enzimas. Por tal motivo analizamos la formación de metabolitossolubles en agua en presencia de 2 tipos diferentes de inhibidores de GST:
quercetina y S-(2-hidroxibencil)—glutatión,éste último en dos concentracionesdiferentes. Se observó que en presencia de inhibidor la formación demetabolitos hidrosolubles era reducida a los valores controles, mientras quecuando se disminuyó la concentración del S-(2-hidroxibencil)-glutatión endos ordenes de magnitud se elevó la formación de metabolitos hidrosolubles alos niveles de la GST en ausencia de inhibidor. Los resultados obtenidos semuestran en la Tabla 42.
DiscusiónPág. 139
Continuando nuestros estudios, nos propusimos averiguar cuales eran
los metabolitos que componían la fase acuosa. Por tal motivo se sintetizó eldesmetil-fenitrotión para utilizarlo como patrón en las corridascromatográficas donde se estudian los metabolitos del fenitrotión. Una vez
concluida la etapa de síntesis se prosiguió a la purificación y caracterizacióndel compuesto. Se realizó un espectro IR del mismo y se lo comparó con eldel fenitrotión. En la Figura 25 se muestra el espectro IR obtenido para el
fenitrotión (rojo) y para el desmetil-fenitrotión (azul).
Al analizar los espectros se tuvo sospecha de que producto obtenidohubiera sufrido un reordenamiento bastante común en los fosforotionatos
llamado üono-tiolo. Esta sospecha se fundamenta en la desaparición de labanda a 720 crrrl la cual se encuentra presente en la muestra original defenitrotión y que puede ser asignada al grupo P=S.
Es bien conocido que la forma tiolo es termodinámicamente másestable que la tiono (173).
R0\P/S K R0\ /oA¡___. P K>>1
RO/ \0R' no/ \sn’
Utilizando las energías de unión se puede ver :
El - = (D’EP=O-DNP=S)" (Dc_o-Dc_s)= - = 4.5 Kcal/mOI
D = Energía de disociación
Los espectro RMN realizados tanto para el fenitrotión como para eldesmetil-fenitrotión confirmaron el reordenamiento. Los espectros RMNobtenidos se muestran en las Figuras 26 y 27. En el espectro del fenitrotión se
puede observar que los picos correspondientes a los metilos CH3-O-Paparecen 5 = 3.97 mientras que el metilo del desmetil-fenitrorión aparece a5 = 2.47 en concordancia con una estructura del tipo CH3-S-P. Todas estas
observaciones indican que el producto obtenido es el isómero S-alquilfosforotiolato.
Sin embargo el Rf presentado por este compuesto reordenado sobreuna placa de sílica gel F-254 utilizando butanolzacéticozagua 4:1:2 no difiere
en forma significativa del desmetil-fenitrotión.
Discusión
Pág. 140
A su vez, al tratar de averiguar cuales eran los metabolitos quecomponían la fase acuosa se encontró que los procedimientos clásicos para elestudio del metabolismo de xenobióticos en mamíferos no demostró
aplicabilidad en el caso de insectos. En consecuencia se ideó una metodología
(micro-incubación) la cual propone un cambio de escala de tal magnitud quehace posible identificar y cuantificar metabolitos producidos in vitro portejidos de insectos y ponderar la acción de sustancias tales como los
inhibidores. Siguiendo esta metodología se incubó 14C-fenitrotión y en las
condiciones empleadas se observó solamente 2 bandas (Fig. 28). En la Tabla
43 se muestran las DPM obtenidas del raspado de estas bandas, observándose
en presencia de GST un 232% más de marca en la banda de Rf = 0.62(metabolito polar) que en los controles. Esta banda puede ser asignada aldesmetil-fenitrotión.
Para descartar la posibilidad de que la banda observada fuera debida a
la participación de otros sistemas enzimáticos se realizó un experimentosimilar con GST purificada de conejo (comercial) con y sin inhibidor de GST
(quercetina). Es bien conocido que las GST de mamífero producen como
metabolito principal el compuesto desmetilado (105). Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 29 y Tabla 44. Aquí se puede observar queen presencia de inhibidor el porcentaje de desmetil-fenitrotión se reduce del12% al 3%.
Aparentemente tanto las GST de mamíferos como las de insectos
tienen preferencia hacia los sustratos que son ésteres del ácido fosfóricometilados. La conjugación GS-alquilo es extremadamente lenta o casi
inapreciable cuando los grupos metoxi son reemplazados por gmpos etoxi o
grupos alquilo de cadena más larga (105). Esta observación parece cumplirsetambién para el caso de la GST de vinchuca ya que prácticamente no seencuentra diferencia con los controles en cuanto a la producción demetabolitos polares cuando se utiliza l4C-etil-paratión como sustrato (Tabla45).
Tampoco se observan diferencias significativas en la cuantificación delas bandas obtenidas utilizando la técnica de micro-incubación. Los resultados
obtenidos se muestran en la Fig. 30 y Tabla 46. Lo mismo ocurre cuando se
utilizó GST microsomal de Triatoma infestans, pero en este caso con ambosinsecticidas OP marcados el 14C-fenitrotión y el 14C-etil-paratión.
Se analizó también la formación in vivo de metabolitos del l“C
fenitrotión y de este insecticida más una serie de inhibidores de distintos
Discusión
Pág. 141
sistemas enzimáticos con el fin de poder identificar los metabolitos
producidos. Los inhibidores ensayados fueron: quercetina (inhibidor de GST),TEPP (inhibidor de esterasas) y BP (inhibidor de MFO). El análisis
cualitativo del metabolismo in vivo mostró similitud de productos en los
distintos tratamientos (igual número de bandas con igual Rf, pero distintaintensidad de las mismas).
En el tratamiento de F y F+Q se analizaron los metabolitos disueltos en
Éter (metabolitos no polares) y en MeOH (metabolitos polares).En la Figura 31 se muestran las bandas obtenidas del sembrado de la
extracción etérea y en la Tabla 47 se muestran las DPM obtenidas para cadabanda. Se puede observar que no existen diferencias significativas en la
cuantificación de las bandas salvo en la que queda retenida en el origen,probablemente correspondiente a parte del desmetil-fenitrotión extraído enéter. En cambio el análisis cuantitativo de los metabolitos disueltos en la fase
metanólica de los tratamientos de fenitrotión y fenitrotión + quercetina indicóque en este último existe :
- Un 100% más de fenitrotión sin biotransformar
- Un 10% menos del desmetil-fenitrotión (principal metabolito de lasGST)
- Un 17% menos del total de metabolitos polares.
Esto indicaría que el sinergismo producido por la quercetina en laintoxicación por fenitrotión en vinchucas podría deberse en parte a lainhibición de la capacidad detoxificante (producción de metabolitos máspolares) mediada por la GST.
La utilización de los otros dos inhibidores el TEPP y el BP permitió
realizar algunas consideraciones sobre el origen de los metabolitos aparecidosin vivo. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 33. En el análisis
realizado se consideró que los metabolitos aparecidos en la calle de F + TEPPeran debidos principalmente a la acción de las MFO y GST mientras que losde la calle F + BP eran debidos a EST (esterasas inespecíficas) y GST.Teniendo en cuenta estas premisas cabn'a considerar que los metabolitos conRf menor que 0.44 serían debidos a la acción de las MFO ya que cuando seutilizó BP las bandas obtenidas por debajo de este Rf prácticamentedesaparecen y a su vez se asemejan considerablemente a los metabolitosencontrados in vitro (cuando la placa se deja marcar más tiempo) donde laacción de las MFO es nula debido a que este sistema enzimático utiliza comocofactor NADPH el cual esta ausente en el medio de incubación. La banda de
Discusión
Pág. 142
Rf = 0.44 podn'a ser el resultado de la acción combinada de los tres sistemas
enzimáticos para dar como resultado un metabolito común. En la siguientefigura se muestra la acción de estos sistemas enzimáticos sobre el fenitrotión.
Acción de la GST, Estatuas inespecíficas (fosfitasas) y MFO sobre el feniu’otión
“Fo MFO
EST l 14 l
CH-Olí 33 >p—0@ noz
CHa-O ï IEST
GST
GST MFO
MFO
Al no contar con los patrones suficientes resulta muy dificil unaasignación fehaciente de esta banda observada, sin embargo los resultadosindican que este compuesto es más polar que el desmetil-fenitrotión y ademáseste metabolito presenta en su estructura el anillo aromático conteniendo lamarca radiactiva. La dilucidación de las estructura de los metabolitos
obtenidos será motivo de nuevos experimentos.
En resumen los resultados presentados en este trabajo constituyen unaporte al conocimiento de la GST del vector de la enfermedad de Chagas. Su
inhibición e inducción por xenobióticos y su importancia en el proceso deintoxicación por insecticidas organofosforados. Finalmente la evidenciaexperimental obtenida revela que las vinchucas resultan más susceptibles a la
intoxicación por fenitrotión cuando se les inhibe la GST. El uso deinhibidores como la quercetina provoca una menor detoxificación delfosforado y una mayor inhibición de la Ache cerebral.
V. RESUMENY
CONCLUSIONES
Resumen y ConclusionesPág. 143
RESUNIEN Y CONCLUSIONES
l - La GST de Triatoma infestans es susceptible a la inhibición por algunos
flavonoides y colorantes del u'ifenilmetano. De estos compuestos la
quercetina la sulfobromoflaleína y el azul de timo] resultaron ser los más
potentes.
2 - El tipo de inhibición presentado por estos compuestos fue: competitiva conrespecto al CDNB y no competitiva con respecto al GSH para la Q y el AT
y no competitiva con respecto a los dos sustratos para la SBF.
3 - La GST de Triatoma infestans también es susceptible a la inhibición por
aductos formados entre saligeninas cíclicas fosforadas y glutatión. Se
sintetizó y purificó un aducto entre el salitión y el GSH y se identificó alinhibidor como el S-(2-hidroxi-bencil)-glutatión.
4 - El tipo de inhibición presentado por este compuesto y otro GS-bencil
sustituido comercial fue: no competitiva con respecto al CDNB y
competitiva con respecto al GSH.
5 - La toxicidad en vinchucas del fenitIotión más un inhibidor de GST, la
quercetina, demostró un factor de sinergisrno de dos respecto a la toxicidaddel fenitrotión sólo.
6 - También se demostró que el AT sinergiza la toxicidad del fenitrotión cuando
éste es administrado por distintas vías (tópico, oral, inyección) así como
cuando se utilizan distintos estadios de Triatoma infestans.
7 - La GST de Triatoma infesrans es susceptible a la inducción de su actividad
mediante la administración de diversas sustancias por diferentes vías. Loscompuestos más promisorios fueron : DDT, Salitión, Fenitrotión, Malatión,I-3-A, I-3-C y Flavona.
8 - La toxicocinética a 24 hs del 14C-Fenitrotión y 14C-Fenitrotión + Quercetinaen vinchucas demostró que :
Absorción: La penetración a través de la cuticula es la primera barrera dedefensa del insecto en la intoxicación por insecticidas de contacto, ya que entre
Resumen y ConclusionesPág. 144
8-1 1% de la dosis original se extrae por wash-off y entre 4-8% queda retenidoen la cutícula. No se encuentran diferencias significativas entre los dostratamientos (p > 0.05).
Excreción: El 70% de los insectos tratados presentan una diuresis menor del17% de la dosis aplicada. Los dos tratamientos demuestJan una diferencia
significativa del 5% (p < 0.05). El tratamiento combinado resulta en una
excreta mayor que no sería suficiente como defensa fisiológica en la
intoxicación por insecticidas organofosforados ya que presentan una mayorinhibición de la Ache y mayor mortalidad.
Blotransformaclón: El contenido de compuestos liposolubles en los dostratamientos presenta diferencias significativas (p < 0.05). En efecto la
radiactividad interna soluble en éter etílico del tratamiento combinado sugiere
que la quercetina favorecer-ía en un 4% la presencia de formas no polares,básicamente fenitrotión y fenitonón, dentro de los insectos.
La radiactividad interna debida a metabolitos polares (hidrosolubles) presentauna diferencia significativa (p < 0.05) entre los dos tratamientos. La presenciade quercetina provoca un 8% menos de metabolitos polares. Esto sugiere que
la acción de la quercetina inhibir-íaparcialmente la detoxificación.
Entrada al blanco: La proporción de insecticida que penetra en el SNC medidacomo la radiactividad presente en la cabeza del insecto resultó del 1% enambos tratamientos.
Toxicodlnámla: (unión al receptor)Consecuencias de la entrada al blanco: Se verifica in vivo una inhibición
significativamente mayor (p < 0.05) en los tratamientos combinados. La
presencia de quercetina o azul de timol favorecerían la inhibición de la Acheen los insectos tratados.
El 30% de los insectos presenta una diuresis mayor al 33% y en esos casos nose encuentran diferencias significativas en ninguna de las etapas de latoxicocinética
9 - La degradación del l4C-FenitrotLiónin vitro, medida como la formación demetabolitos hidrosolubles, producidos por la GST demostró serimportante. Esto estaría asociado a una menor toxicidad del insecticida lo
Resumen y ConclusionesPág. 145
que podría justificar el sinergismo observado al inhibir este camino
detoxificante. Cuando se estudia la degradación del 14C-Fenitrotión en
presencia de inhibidores de GST la producción de metabolitos
hidrosolubles cae a los valores controles (sin GSH o sin enzima).
lO - De los metabolitos hidrosolubles, el desmetil-fenitrotión sería el
mayoritario. Esto concuerda con lo hallado en mamíferos donde la GST de
conejo (comercial) produce una banda con igual Rf que la GST de
vinchuca la cual disminuye en presencia de quercetina (inhibidor de GST).
ll - En el estudio de la degradación del 14C-Paratión no se observó diferencias
con respecto a los controles en la producción de metabolitos hidrosolubles
cuando se incubó con GST. Es sabido que las GST de mamíferos degradan
con menor eficiencia los grupos CH3-CH2-O-P que los CH3-O-P lo queparece concordar con el caso de la GST de vinchuca.
12 - Tampoco se observó diferencias en la intensidad de las bandas encontradas
en TLC. Probablemente en la degradación del l4C-Paratión participen
otros sistemas enzimáticos (esterasas) que no utilizan al GSH comocofactor.
13 - La GST microsomal de vinchuca no demostró diferencias detectables en la
metabolización de ninguno de los dos l“C-OP utilizados.
14 - Al igual que lo observado en el metabolismo in vitro, el metabolito
principal del 14C-Fenitrotión producido por las GST in vivo resultó ser el
desmetil-fenitrotión. En efecto, cuando se coadministró quercetina laintensidad de la banda obtenida sobre la placa de TLC disminuyó. Con
menor Rf que el desmetil-fenitrotión aparece otro metabolito que podríadeberse a la acción de la GST. Los restantes metabolitos, de Rf aún
menores, se deberían a la acción de las MFO según la evidencias obtenidasusando BP.
15 - Finalmente la evidencia experimental obtenida revela que las vinchucasresultan más susceptibles a la intoxicación por fenitrotión cuando se lesinhibe la GST. El uso de inhibidores como la quercetina provoca unamenor detoxificación del fosforado y una mayor inhibición de la Ache
cerebral.W y
VI. BIBLIOGRAFIA
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