Regulación de la Expresión GØnica Regulation of Gene ... · de SIDA sufren LV. LV es ahora la infección oportunista de origen parasitario mÆs comœn entre las personas VIH-positivas

227

Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report

Regulación de la Expresión Génica

Regulation of Gene Expression

PARASITOLOGÍA MOLECULAR MOLECULAR PARASITOLOGY

Jefe de Línea / Group Leader: Carlos AlonsoPersonal Científico Scientific Personnel: José Manuel Pérez, José Mª. Requena, Manuel SotoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Víctor González, Luis QuijadaBecarios Predoctorales Graduate Students: Carolina Boceta, Ruth Larreta, Gloria Machado, Ana

Isabel RicoTécnico de Investigación Technical Assistance: Miguel A. Fuertes

Resumen de Investigación

Los parásitos del género Leishmania causa un espectro de enfermedades conoci-

das como leishmaniosis, consideradas como importantes problemas de salud pública.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) las leishmaniosis afectan actual-

mente a más de 12 millones de personas en 88 países en cinco continentes (Africa, Asia,

Europa, Norteamérica y Sudamérica), estimándose en unos 350 millones las personas

expuestas al riesgo de contraer la infección. La incidencia anual de nuevos casos está en

2 millones (1,5 millones de leishmaniosis cutánea y 500 000 de leishmaniosis visceral).

La infección por L. infantum es una enfermedad zoonótica en la que el perro es el

principal reservorio. La prevalencia de la infección en España, alcanza índices alar-

mantes (desde el 5% en la Comunidad de Madrid al 14% en las Islas Baleares). En los

últimos años se ha observado un aumento de los casos de leishmaniosis visceral (LV)

en humanos debido a su asociación con infección VIH y la expansión de la pandemia

que constituye el SIDA. La co-infección Leishmania/VIH se considera como una �enfer-

medad emergente�, especialmente en el sur de Europa, donde el 25-70% de los casos de

LV en adultos están relacionados con la infección por VIH, y del 1.5 al 9.5% de los casos

229


de SIDA sufren LV. LV es ahora la infección oportunista de origen parasitario más

común entre las personas VIH-positivas.

La actividad del grupo está centrada fundamentalmente en aspectos de la bio-

logía molecular de L. infantum y de la enfermedad producida en mamíferos. Leishmania,

y otros protozoos kinetoplástidos, presentan características muy peculiares de organi-

zación y expresión génicas, lo que hace que se les considere como eucariotas atípicos.

Así, la mayoría de los genes caracterizados se encuentran organizados en repeticiones

directas en tándem y son transcritos en RNA policistrónicos, que son procesados adi-

cionalmente por poliadenilación y �trans�-splicing. La expresión diferencial de los

mRNAs en Leishmania, y tripanosomátidos en general, implica mecanismos que operan

fundamentalmente a nivel post-transcripcional. En relación con este campo de la inves-

tigación, nuestro laboratorio viene trabajando en el estudio de los mecanismos de la

regulación de la expresión de genes de L. infantum, en concreto los codificantes para las

histonas H2A, H2B, H3 y H4, y el codificante para la proteína de choque térmico Hsp70.

Otro aspecto de la investigación de nuestro grupo es la caracterización de molé-

culas del parásito que resultan blancos de la respuesta inmune durante la infección.

Siguiendo este esquema se han analizado las características de especificidad y sensibi-

lidad de ciertas proteínas para el desarrollo de sistemas de serodiagnóstico. Se definie-

ron los epítopos reconocidos por las células B. Estas datos se utilizaron para construir

una proteína artificial (�quimérica�) constituida por las regiones más antigénicas. El

resultado ha sido una proteína rica en determinante antigénicos que constituye la base

de un sistema de diagnóstico sensible y específico de leishmaniasis con especial énfasis

en los aspectos patológicos. En la actualidad, el interés del grupo está centrado en el

estudio de las características de estas proteínas antigénicas de L. infantum para el desa-

rrollo, a corto plazo, de sistemas vacunales frente a la leishmaniosis canina que en un

futuro podrían ser aplicados a la enfermedad en humanos.

Durante los dos últimos años el grupo viene colaborando con el grupo dirigido

por el Prof. Ignacio Navarrete (Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura,

Cáceres) sobre sistemas de protección contra Leishmania en perros. Por otro lado, el

grupo también colabora con el grupo del Dr. Manuel C. López (Instituto de

Parasitología y Biomedicina �López-Neyra�, Granada) en aspectos relacionados con la

230

regulación de la transcripción en T. cruzi. También, se está colaborando con el grupo de

la Dra. Carmen Navarro-Ranninger (Departamento de Química Orgánica, Universidad

Autónoma de Madrid) sobre aspectos bioquímicos relacionados con la actividad anti-

tumoral de compuestos metálicos.

Research Summary

The protozoan parasites of the genus Leishmania are the etiological agents of

Leishmaniosis. The disease is known to have important implication in public health

worldwide. According to WHO 12 million people are affected by the disease in over 88

nations in tropical and subtropical areas (Africa, Asia, Europe, North- and South-

America). The estimated people at risk is 350 million. The annual incidence of new cases

is 2 million (1.5 million with cutaneuos leishmaniosis and 500.000 with visceral leish-

maniosis). The infection has a zoonotic character and the dog is the main reservoir. The

prevalence in Spain reaches alarming indices since it goes from 5% in the Madrid

Autonomy to 14% in the Baleares islands. In the last years the co-infection with HIV-

Leishmaniosis has been considered as an �emergent disease�, particularly in the South

of Europe. In that area 25-70% of the human LV in adults is correlated with HIV infec-

tion. About 1.5-9% of the people with AIDS cases are afflicted with leishmaniosis. Thus,

leishmaniosis is now one of the most important opportunistic parasite infections.

The activity of the group has been centered in aspects related with the biology of

L. infantum and the disease caused by the parasite in mammals. Leishmania is a proto-

zoon with very peculiar characteristics regarding the expression and regulation of their

genes in that they present trans-splicing with genes generally organized in tandem.

They are mostly regulated at the postranscriptional level. Our laboratory has been wor-

king in the mechanisms of expression of the H2A, H2B, H3 and H4 and of the heat

shock protein Hsp70.

Another aspect of the work carried out in the laboratory centers in the characteri-

zation of the parasite molecules that are used as targets of the immune responses

during infection. In this direction we have characterized the specificity and sensibility

of the immune recognition of certain proteins during natural infection in order to deve-

231

lop a specific serodiagnosis test. Thus, we have defined the epitopes that are recogni-

zed by B cells. These epitopes have been used to construct a quimeric protein rich in

antigenic determinants. The result has been the building of a protein that constitutes the

basis for a specific serodiagnostic test highly sensitive and specific for visceral leishma-

niosis particularly linked to pathology. At the present time the interest of the group is

also centered in the identification of proteins which can be used as instruments for the

development of protection against Leishmaniosis in dogs in the short term and also in

humans in the long term.

In the last few years the group has been collaborating and it continues to do so

with the group directed by Prof. Ignacio Navarrete (Facultad de Veterinaria,

Universidad de Extremadura, Cáceres) on the development of systems directed to

cause protection against Leishmania in dogs and in the characterization of the Q pro-

tein. The group also collaborates with the group directed by Dr. Manuel C. López

(Instituto de Parasitología y Biomedicina �López-Neyra�, Granada) in aspects correla-

ted with the genomic distribution of repetitive sequences and the expression of certain

genes in T. cruzi. Also we are collaborating with the group of the Dra. Carmen Navarro-

Ranninger (Departamento de Química Orgánica, Universidad Autónoma de Madrid) in

the identification of the biochemical pathways by which certain metallic agents behave

as antitumour drugs.

Publicaciones / Publications

� Quijada, L., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. Analysis of post-transcriptio-

nal regulation operating on transcription products of the tandemly linked

Leishmania infantum hsp70 genes. J. Biol. Chem. 272, 4493-4499 (1997).

� Berberich, C., Requena, J.M. and Alonso, C. Cloning of genes and expression and

antigenicity analysis of the Leishmania infantum KMP-11 protein. Exp. Parasitol. 85,

105-108 (1997).

� González, C.I., Thomas, M.C., Martín, F., Alcami, J., Alonso, C. and López, M.C.

Reverse transcriptase-like activity in Trypanosoma cruzi. Acta Trop. 63, 117-126

(1997).

232

� Morales, G., Carrillo, G., Requena, J.M., Guzman, F., Gomez, L.C., Patarroyo, M.E.

and Alonso, C. Mapping of the antigenic determinants of the Leishmania infantum

gp63 protein recognized by antibodies elicited during canine visceral leishmania-

sis. Parasitology 114, 507-516 (1997).

� Olivares, M., Alonso, C. and López, M.C. The open reading frame 1 of the L1Tc

retrotransposon of Trypanosoma cruzi codes for a protein with apurinic-apyrimi-

dinic nuclease activity. J. Biol. Chem. 272, 25224-25228 (1997).

� Quijada, L., Moreira, D., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. Efficient 5�-end

labeling of oligonucleotides containing self-complementary sequences.

BioTechniques 23, 658-660 (1997).

� Requena, J.M., Soto, M., Quijada, L. and Alonso, C. Genes and chromosomes of

Leishmania infantum. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 92, 853-858 (1997).

� Requena, J.M., Soto, M., Quijada, L., Carrillo, G. and Alonso, C. A region contai-

ning repeated elements is associated with transcriptional termination of

Leishmania infantum ribosomal RNA genes. Mol. Biochem. Parasitol. 84, 101-110

(1997).

� Soto, M., Quijada, L., Alonso, C. and Requena, J.M. Molecular cloning and analy-

sis of expression of the Leishmania infantum histone H4 genes. Mol. Biochem.

Parasitol. 90, 439-447 (1997).

� Araya, J., Cano, M.I., Gomes, H.B.M., Novak, E.M., Requena, J.M., Alonso, C.,

Levin, M.J., Guevara, P., Ramirez, J.L. and Franco da Silveira, J. Characterization

of an interspersed repetitive DNA element in the genome of Tryponosoma cruzi.

Parasitology 115, 563-570 (1997).

� Requena, J.M., Soto, M., Quijada, L. y Alonso, C. Antigenicidad e inmunogenici-

dad de las proteínas de choque térmico. Ars Pharmaceutica 38, 191-208 (1997).

233

� Soto, M., Requena, J.M., Quijada, L. y Alonso, C. Localización de epítopos en dis-

tintos antígenos de Leishmania infantum. Aplicación en el desarrollo de un sistema

de diagnóstico serológico. Ars Pharmaceutica 38, 273-283 (1997).

� Quijada, L., Requena, J.M., Soto, M. y Alonso, C. Mecanismos post-transcripcio-

nales en la regulación de la expresión de los genes hsp70 de Leishmania. Ars

Pharmaceutica 38, 305-317 (1997).

� Zamora, F., González, V.M., Pérez, J.M., Masaguer, J.R., Alonso, C. and Navarro-

Ranninger, C. Palladium (II) 4,5-diphenylimidazole cyclometalated complexes:

DNA interaction. Appl. Organomet. Chem. 11, 491-497 (1997).

� Zamora, F., González, V.M., Pérez, J.M., Masaguer, J.R., Alonso, C. and Navarro-

Ranninger, C. Pd (II) and Pt (II) complexes of 2-phenyl- and 2-benzyl-imidazoli-

ne: Synthesis, structural characterization, DNA modification and in vitro antileu-

kaemic activity. Appl. Organomet. Chem. 11, 659-666 (1997).

� González, V.M., Pérez, J.M. and Alonso, C. The berenil ligand directs the DNA

binding of the cytotoxic drug Pt-berenil. J. Inorg. Biochem. 68, 283-287 (1997).

� Berberich, C., Fuertes, M.A., Machado, G y Alonso, C. KMP-11, una proteína

abundante en la superficie de los kinetoplástidos. Ars Pharmaceutica. 38, 237-244

(1997).

� Soto, M., Requena, J.M., Quijada, L. and Alonso, C. Multicomponent chimeric

antigen for serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. J. Clin. Microbiol. 36, 58-

63 (1998).

� Rico, A.I., del Real, G., Soto, M., Quijada, L., Martinez-A., C., Alonso, C. and

Requena, J.M. Characterization of the Immunostimulatory Properties of

Leishmania infantum HSP70 by fusion to the Escherichia coli maltose-binding pro-

tein in normal and nu/nu BALB/c mice. Infect. Immun. 66, 347-352 (1998).

� González, V.M., Fuertes, M.A., P�rez, J.M. and Alonso, C. Kinetics of the salt-indu-

ced B- to Z-DNA transition. Eur. Biophys. J. 27, 417-423 (1998).

234

� Jiménez-Ruiz, A., Boceta, C., Bonay, P., Requena, J.M. and Alonso, C. Cloning,

sequencing, and expression of the PSA genes from Leishmania infantum. Eur. J.

Biochem. 251, 389-397 (1998).

� Ramirez, J.R., Berberich, C., Jaramillo, A., Alonso, C. and Vélez, I.D. Molecular

and antigenic characterization of the Leishmania (Viannia) panamensis kinetoplas-

tid membrane protein-11. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 93, 247-254 (1998).

� Marañon, C., Puerta, C., Alonso, C. and López, M.C. Control mechanisms of the

H2A genes expression in Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 313-324

(1998).

� Carriazo, C.S., Sembaj, A., Aguerri, A.M., Requena, J.M., Alonso, C., B£a, J., Ruiz,

A., Segura, E. and Moreno Barral, J. Polymerase chain reaction procedure to

detect Trypanosoma cruzi in blood samples from chronic chagasic patients. Diagn.

Microbiol. Infect. Dis. 30, 183-186 (1998).

� Quijada, L., Requena, J.M., Soto, M. and Alonso, C. Analysis of the antigenic pro-

perties of the L. infantum Hsp70: design of synthetic peptides for specific sero-

diagnosis of human leishmaniasis. Immunol. Letters 63, 169-174 (1998).

� Quiroga, A.G., Pérez, J.M., López-Solera, I., Masaguer, J.R., Luque, A., Román, P.,

Edwards, A., Alonso, C. and Navarro-Ranninger, C. Novel tetranuclear orthome-

talated complexes of Pd (II) and Pt (II) derived from p-isopropylbenzaldehyde

thiosemicarbazone with cytotoxic activity in cis-DDP resistant tumor cell lines.

Interaction of these complexes with DNA. J. Med. Chem. 41, 1399-1408 (1998).

� Quiroga, A.G., Pérez, J.M., López-Solera, I., Montero, E.I., Masaguer, J.R., Alonso, C.

and Navarro-Ranninger, C. Binuclear chloro-bridged palladated and platinated

complexes derived from p-isopropylbenzaldehyde thiosemicarbazone with cytoto-

xicity against cis-DDP resistant tumor cell lines. J. Inorg. Biochem. 69, 275-281 (1998).

235

� Quiroga, A.G., Pérez, J.M., Montero, E.I., Masaguer, J.R., Alonso, C. and Navarro-

Ranninger, C. Palladated and platinated complexes derived from phenylacetal-

dehyde thiosemicarbazone with cytotoxic activity in cis-DDP resistant tumor

cells. Formation of DNA interstrand cross-links by these complexes. J. Inorg.

Biochem. 70, 117-123 (1998).

� Quiroga, A.G., Pérez, J.M., Montero, E.I., Masaguer, J.R., Alonso, C. and Navarro-

Ranninger, C. DNA binding and in vitro antileukemic activity of dimeric and

tetrameric platinated complexes derived from p-isopropylbenzaldehyde thiose-

micarbazone. Appl. Organomet. Chem. 12, 809-813 (1998).

� Pérez, J.M., Camazón, M., Alvarez-Valdés, A., Quiroga, A.G., Kelland L.R.,

Alonso, C. and Navarro-Ranninger, C. Synthesis, Characterization and DNA

modification induced by a novel Pt(IV)-bis(monoglutarate) complex which indu-

ces apoptosis in glioma cells. Chem. Biol. Interact. 117, (1998).

� Quiroga, A.G., Perez, J.M., Alonso, C. and Navarro, M.C. DNA binding and

in vitro antileukemic activity of Dimeric and tetrameric platinated complexes

derived from p-Isopropilbenzaldehyde Thiosemicarbazone. Applied

Organometallic chemistry 12, 809-813 (1998).

� Berberich, C., Machado, G., Morales, G., Carrillo, G., Jimenez-Ruiz, A. and

Alonso, C. The expression of the Leishmania infantum KMP-11 protein is

developmentally regulated and stage specific. Biochim. Biophys. Acta 1442,

230-237. (1998).

Tesis Doctorales / Doctoral Theses

Luis Quijada Arteaga: �Leishmania infantum: organización de los genes hsp70, regula-

ción de su expresión y estudio de la antigenicidad de la proteína�. Universidad

Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

236

Graciela Carrillo Rosales: �Estudio de la inmunogenicidad de la gp63 y su implicación

en las etapas iniciales de la infección por Leishmania infantum�. Universidad Autónoma

de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Gloria Machado Rodríguez: �Desarrollo de un sistema experimental de infección por

Leishmania infantum y estudios de protección�. Universidad Autónoma de Madrid.

1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.

237

238

EXPRESIÓN GÉNICA EN LINFOCITOS T HUMANOS GENE EXPRESSION IN HUMAN T LYMPHOCYTES

Jefe de Línea / Group Leader: Miguel A. AlonsoBecarios Predoctorales Graduate Students: María del Carmen de Marco, Fernando Martín-

Belmonte, Jaime Millán, Rosa Puertollano, Mohammed Qaidi

Técnico de Investigación Technical Assistance: Carmen García


Las interacciones lípido-proteína parecen desempeñar un papel esencial en el

reclutamiento específico de ciertas proteínas en microdominios especializados presen-

tes en las membranas biológicas. Según este modelo, las membranas estarían pues com-

partimentalizadas en microentornos (GEMs) con una composición lipídica diferente del

resto de la membrana. Los GEMs ha sido relacionados con procesos en principio tan

dispares como la ruta apical de transporte que tiene lugar en células epiteliales polari-

zadas o la transmisión de señal en linfocitos T.

El gen MAL presenta un patrón de expresión tisular muy característico restringi-

do a ciertos tipos celulares como los linfocitos T, algunos epitelios polarizados, y las

células formadoras de mielina. El gen MAL codifica por una proteína integral de mem-

brana altamente hidrofóbica que posee la propiedad peculiar de poder ser extraída con

disolventes orgánicos junto con los lípidos celulares. Los estudios desarrollados ante-

riormente en nuestro laboratorio permitieron la identificación del proteolípido MAL

como componente permanente de los GEMs tanto en células epiteliales polarizadas

MDCK como en linfocitos T. Nuestros objetivos en los dos últimos años se han centra-

do principalmente en:


El análisis del papel de MAL como posible componente de la maquina-

ria de transporte apical en células epiteliales polarizadas

Nuestros resultados avalan la hipótesis de que en células epiteliales polarizadas

MAL sea un elemento de la maquinaria proteica de los GEMs posiblemente implicado

en la génesis de vesículas de transporte destinadas a la membrana apical. Además,

hemos identificado en el extremo carboxilo terminal de MAL distintos motivos peptí-

dicos que modulan su distribución intracelular y su acceso a los GEMs, y que podrían

regular el tráfico intracelular de dichas vesículas. Por otra parte, la identificación de

MAL en el epitelio tiroideo, y su localización apical apuntan a un papel de MAL en el

transporte apical también en el tiroides.

El aislamiento y caracterización de los GEMs y de la proteína MAL

en linfocitos T

El análisis de los GEMs de linfocitos T nos ha permitido determinar que MAL se

encuentra enriquecida más de 104 veces en estas membranas especializadas. En estas

mismas GEMs aparecen también altamente enriquecidas una gran variedad de proteí-

nas ancladas a la membrana por grupos glicosilfosfatidilinositol (GPI), el co-receptor

CD4 y tirosina quinasas de la familia Src como p56lck y p59fyn. La asociación de MAL

con p56lck en una fracción con características semejantes a endosomas sugiere que en

linfocitos T, además de otras posibles funciones, MAL podría estar organizando micro-

dominios de membrana para reclutar moléculas implicadas en fenómenos de transmi-

sión de señal y ponerlas en contacto con moléculas efectoras.

La identificación de una nueva familia de proteínas relacionadas con el

proteolípido MAL

Mediante comparación de secuencias con el banco de ESTs humanas (TIGR)hemos identificado una serie de proteínas estructuralmente relacionadas con MAL. Sucaracterización bioquímica nos ha llevado a agruparlas en una nueva familia denomi-nada �familia de los proteolípidos MAL�.

En resumen, el trabajo desarrollado sobre la proteína MAL en células epitelialesy en linfocitos T, y la identificación de la familia del los proteolipidos MAL nos lleva aproponer una función general para la familia de los proteolípidos MAL en la organiza-ción de microdominios especializados de membrana.

239

Research Summary

The confinement of proteins through lipid�protein interactions is emerging as a

new general mechanism to recruit specific proteins in specialized membranes.

According with this model, cellular membranes are organized in membrane micro-

compartments (GEMs) with a lipid composition different from that of the rest of mem-

branes. The existence of GEMs has been related to a variety of different cellular proces-

ses including apical transport in polarized epithelial cells and signal transduction in T

lymphocytes.

MAL gene expression is restricted to T lymphocytes, polarized epithelia, and

myelin-forming cells. MAL is a highly hydrophobic integral membrane protein displa-

ying lipid-like physical-chemical properties. Previous studies from our laboratory iden-

tified MAL as a component of GEM microdomains in both polarized epithelial cells and

T lymphocytes. During the last two years, our group has been mostly focused on:

The analysis of MAL as a possible element of the apical sorting machi-

nery in polarized epithelial cells

Our results using a heterologous expression system support a role for MAL in

GEM vesiculation. Moreover, the presence in the carboxyl terminus of distinct peptide

motifs that modulate the intracellular distribution of MAL is consistent with the hypot-

hesis that MAL might regulate membrane trafficking during GEM-mediated apical

transport. These observations highlight MAL as a good candidate as an element of the

machinery involved in apical transport in polarized epithelial cells.

Characterization of MAL in human T lymphocytes

The isolation and characterization of the GEM fraction of T lymphocytes demons-

trated that MAL is more than 104-fold enriched in these specialized membranes. This

fraction was also highly enriched in the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored

CD59 and CD55 antigens, the src-family tyrosine kinases p56lck and p59fyn and, to a

minor extent, the CD4 co-receptor. The association of MAL with p56lck in GEMs obtai-

ned from an endosomal-like membrane fraction suggests that MAL might assemble

GEM rafts for the recruiting of machinery involved in signal transmission.

240

241

Identification of a novel family of MAL-related proteolipids

Comparison of the MAL primary sequence with EST sequences in the TIGR data-

base have allowed us the identification of proteins displaying significant overall homo-

logy with MAL. Furthermore, the biochemical characterization of some of these pro-

teins led us to group them in a new family of MAL-related proteins sharing, in addition

to a similar structure, some unusual biochemical features such as lipid-like properties

and the ability to access into GEM microdomains.

In summary, our work on the MAL protein in both epithelial cells and T lymp-

hocytes, as well as the identification of a new family of MAL-related proteins, lead us

to suggest a general function for the MAL family of proteolipids in the assembly of spe-

cialized GEM microdomains.


� Puertollano, R., Li, S., Lisanti, M.P. and Alonso, M.A. Recombinant expression of

the MAL proteolipid, a component of glycolipid-enriched membrane microdo-

mains, induces the formation of vesicular structures in insect cells. J. Biol. Chem.

272, 18311-18315 (1997).

� Millán, J., Puertollano, R., Fan, L., Rancaño, C. and Alonso, M.A. The MAL prote-

olipid is a component of the detergent-insoluble membrane subdomains of

human T lymphocytes. Biochem. J. 321, 247-252 (1997).

� Alonso, M.A., Fan, L. and Alarcón, B. Multiple sorting signals determine apical

localization of a nonglycosylated integral membrane protein. J. Biol. Chem. 272,

30748-30752 (1997).

� Millán, J., Puertollano, R., Fan, L. and Alonso, M.A. Caveolin and MAL, two pro-

tein components of internal detergent-insoluble membranes, are in distinct lipid microen-

vironments in MDCK cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 707-712 (1997).

� Alonso, M.A. The MAL proteolipid in epithelial cells. In Medical and Biological

Papers, pp.: 351-372, Fundación Rodríguez Pascual: Madrid (1997).

242

� Tugores, A., Rubio, T., Rancaño, C. and Alonso, M.A. A tandem array of Sp-1 sites

and a reverse initiator element are both required for synergistic transcriptional

activation of the T-cell specific MAL gene. DNA Cell Biol. 16, 245-255 (1997).

� Pérez, P., Puertollano, R. and Alonso, M.A. Structural and biochemical similari-

ties reveal a family of proteins related to the MAL proteolipid, a component of

detergent-insoluble membrane microdomains. Biochem. Biophys. Res. Commun.

232, 618-621 (1997).

� López-Guerrero, J. A. and Alonso, M.A. Nitric oxide production by herpes sim-

plex virus type 1 does not alter the course of the infection in human monocytic

cells. J. Gen Virol. 78, 1977-1980 (1997).

� Martín-Belmonte, F., Kremer, L., Albar, J.P., Marazuela, M. and Alonso, M.A.

Expression of the MAL gene in the thyroid: the MAL proteolipid, a component of

glycolipid-enriched membranes, is apically distributed in thyroid follicles.

Endocrinology 139, 2077-2084 (1998).

� Luque, C.M., Lallena, M.J., Alonso, M.A. and Correas, I. An alternative domain

determines nuclear localization in multifunctional protein 4.1. J. Biol. Chem. 273,

11643-1649 (1998).

� Pombo, P.M., Ibarrola, N., Alonso, M.A. and Rodriguez-Peña, A. Thyroid hormo-

ne regulates the expression of the MAL proteolipid, a component of glycolipid-

enriched membranes, in neonatal rat brain. J. Neurosci. Res. 52, 584-590 (1998).

� Puertollano, R. and Alonso, M. A. A short peptide motif at the carboxyl terminus

is required for incorporation of the integral membrane MAL protein to glycolipid-

enriched membranes. J. Biol. Chem. 233, 12740-12745 (1998).

� Millán, J. and Alonso, M.A. MAL, a novel integral membrane protein of human T

lymphocytes, associates with glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins

and Src-like tyrosine kinases. Eur. J. Immunol. 28, 3675-3684 (1998).

243

� Puertollano, R. and Alonso, M.A. Targeting of MAL, a putative element of the api-

cal sorting machinery, to glycolipid-enriched membranes requires a pre-Golgi

sorting event. Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 689-692 (1999).

� Millán, J., Cerny, J., Horejsi, V. and Alonso, M.A. CD4 segregates into specific

detergent-resistant T-cell membrane microdomains. Tissue Antigens 53, 33-40

(1999).


Jaime Millán Martínez: �El proteolípido MAL como componente de los microdomi-

nios de membrana ricos en glicolípidos de células epiteliales y de linfocitos T�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.

244

BIOLOGÍA MOLECULAR DE MICROORGANISMOSEXTREMÓFILOS MOLECULAR BIOLOGY OF EXTREMOPHILIC MICROORGANISMS

Jefe de Línea / Group Leader: Ricardo Amils Personal Científico Scientific Personnel: Irma Marín, Francisco Santamaría, José Luis SanzBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Carlos Briones, Victor E. Buckwold, Consuelo

Durán, Felipe Gómez Becarios Predoctorales Graduate Students: Milton Alvarado, Elayne Culubret, Belén Diez,

Elena González-Toril, Enrique Marín, Patricia Rojas Técnicos de Investigación Technical Assistance: Raquel Mesa, Nuria Ródriguez Científicos Visitantes Visiting Scientists: Antonio Lazcano (U. Autónoma de Mexico), Angel

Sanhueza (U. de Chile), Ana Mª Amaro (U. de Chile), Carlos Jérez (U. de Chile), Lorelle Trinidad (U. de Baños. Filipinas), Rosana de Castro (U. Nacional de Mar del Plata. Argentina), Violaine Bonnefoy (CNRS de Marsella. Francia)


Biohidrometalurgia: ecología, biología molecular y biotecnología de

microorganismos acidófilos

Una parte importante del trabajo del laboratorio está centrado en aspectos aplica-

dos de la microbiología a la biohidrometalurgia, tanto en su vertiente básica de aisla-

miento y caracterización de microorganismos colonizadores de ambientes ácidos, como

en la aplicada, explorando sus posibles aplicaciones industriales. Las áreas de actuación

en este campo son las siguientes: i) ecología microbiana de ambientes acidófilos extre-


mos (río Tinto), ii) desarrollo de herramientas para estudios de ecología microbiana de

ambientes acidófilos extremos, iii) desarrollo de metodologías de identificación de

microorganismos procedentes de ambientes acidófilos basadas en la obtención de

patrones de macrorestricción en procariotas, obtención del cariotipo de algas y secuen-

ciación de ITS en hongos, iv) obtención de mapas físicos y genéticos de cromosomas y

elementos extracromosomales de microorganismos quimiolitótrofos acidófilos de refe-

rencia y aislados del río Tinto, v) expresión génica diferencial con el fin de detectar

genes relacionados con la quimiolitotrofía, vi) identificación y caracterización de micro-

organismos de interés biotecnológico: biolixiviación, secuestro específico de metales

(recuperación, remediación) y desulfuración de carbones.

Ecología microbiana de ambientes extremos terrestres como modelos de

vida en condiciones astrobiológicas

El desarrollo reciente de la astrobiología, búsqueda de vida fuera de nuestro pla-

neta azul, comporta necesariamente el establecimiento de sistemas de referencia terres-

tres que debido a sus propiedades pudieran desarrollarse en las condiciones detectadas

en ambientes extraterrestres. Los microorganismos capaces de crecer en ambientes

extremos de temperatura, salinidad, pH, radiación, presión, etc. son candidatos intere-

santes para este tipo de estudios. En nuestro laboratorio se están estudiando las posibi-

lidades de desarrollo de microorganismos quimiolitoautotróficos acidófilos y halófilos

extremos en distintos escenarios de interés astrobiológico: Marte y Europa.

Cocretamente se está valorando el interés de la biodiversidad que se observa en el río

Tinto (pH entre 2 y 2,5 y elevadas concentraciones de hierro y metales pesados) como

modelo de vida en condiciones marcianas.

Metanogénesis: Tratamiento anaerobio de aguas contaminadas

El tratamiento anaerobio de aguas contaminadas posee ventajas importantes

sobre los sistemas aerobios convencionales. A pesar de ello disponemos de limitada

información sobre la toxicidad de la mayoría de los compuestos de utilización o pro-

ducción industrial sobre este proceso. En esta línea de investigación se está valorando

el efecto inhibidor del proceso de metanogénesis producido por distintos compuestos

presentes en aguas contaminadas: i.e. metales pesados, antibióticos, compuestos orga-

245

noclorados, detergentes industriales, etc. Un aspecto importante lo constituye la identi-

ficación de los microorganismos sensibles a los distintos inhibidores, el grado de toxi-

cidad permitida, la capacidad de adaptación y/o recuperación de los consorcios a dis-

tintas condiciones de inhibición, con el fin de conocer los límites de tolerancia del siste-

ma y facilitar el diseño de tratamiento de aguas con alto contenido de sustancias tóxicas.

Funciotipo: el estudio de la evolución funcional del ribosoma

El laboratorio posee una amplia experiencia en la caracterización funcional de

ribosomas de microorganismos de distinto tipo (arqueas, bacterias y eucariotas) utili-

zando inhibidores de la síntesis de proteínas como marcadores funcionales de los ribo-

somas. Las curvas de inhibición generadas para los distintos pares ribosoma-antibióti-

co han mostrado interesantes homologías entre grupos filogenéticamente relacionados,

lo que ha abierto la posibilidad de utilizar esta información para estudiar la evolución

funcional del ribosoma (funciotipo). Los fenogramas obtenidos utilizando datos fun-

cionales son congruentes con los obtenidos por el método clásico de comparación de

secuencia de los SSU rRNAs lo que prueba el valor filogenético del analisis funcional.

En la actualidad se está trabajando en la ampliación del banco de datos de sensibilidad

de antibióticos y en el desarrollo de sistemas de análisis matemático que permitan la

intersección del espacio de secuencia (genotipo) con el espacio funcional (funciotipo).

Cambio de la expresión global de los genes de dinoflagelados nocivos

sometidos a stress

Los dinoflagelados constituyen un extenso grupo de protistas, generalmente repre-

sentado por algas planctónicas, que se encuentran tanto en aguas dulces como saladas.

En determinadas condiciones se produce un crecimiento muy elevado de estos microor-

ganismos dando origen a las denominadas mareas rojas. Hay mareas rojas inocuas, pero

en algunos casos los dinoflagelados pueden producir toxinas que se concentran en los

bivalvos filtradores y que pueden ocasionar severos daños a los consumidores de los

mismos. En el laboratorio se ha abierto una línea de investigación orientada al estudio de

la inusual organización genómica de dinoflagelados relacionados con la generación de

mareas rojas así como de la regulación de la expresión de sus genes en distintas condi-

ciones de stress ambiental posiblemente relacionadas con la producción de toxinas.

246

247

Sistemas enzimáticos en el control de hongos fitopatogénicos

Una de las consecuencias principales de las infecciones fúngicas en cultivos vege-

tales es la notable pérdida económica en la producción agrícola mundial. Los métodos

de control tradicionales actúan fundamentalmente sobre el patógeno mediante la utili-

zación de fungicidas. Sin embargo su acción, rara vez selectiva, produce alteraciones en

el equilibrio del ecosistema, además de una serie de trastornos asociados, tales como el

desarrollo de cepas resistentes a estos productos. Por otro lado, el encarecimiento de los

fungicidas y las cada vez más rígidas y lógicas restricciones reguladoras de su uso,

hacen necesaria la búsqueda de nuevos métodos de control. Una alternativa a los méto-

dos químicos se basa en la posibilidad de utilización de organismos vivos como agen-

tes de control biológico. Los microorganismos antagonistas son posibles agentes de con-

trol biológico debido a su potencial para ejercer acciones directas o indirectas sobre los

patógenos, reduciendo de esta manera la expresión de la enfermedad. El uso de hongos

como micoparásitos, aplicados en control biológico, ha sido ampliamente desarrollado,

fundamentalmente en los casos de hiperparasitismo sobre hongos fitopatógenos,

habiéndose descrito una gran variedad de ellos. Sin embargo, el uso de los complejos

enzimáticos de hongos, aplicados directamente al suelo o inmovilizados de forma con-

veniente, no ha sido investigado como método importante de lisis de hongos patóge-

nos. Las enzimas líticas presentes en el suelo y procedentes de microorganismos, pue-

den controlar, bajo condiciones favorables, el crecimiento de los hongos sensibles a

ellas.

Research Summary

Biohydrometallurgy: ecology, molecular biology and biotechnology of

acidophylic microorganisms

An important part of our research is focused on the microbiology of biohydro-

metallurgical processes, not only in basic aspects related to the isolation and characte-

rization of microorganisms from acidic environments, but also to the applied aspects,

exploring their potential industrial applications. The areas of research in this field are

the following: i) microbial ecology of extreme acidophilic environments, ii) develop-

248

ment of tools for microbial ecology studies of acidophilic habitas, iii) development of

methodologies for identification of microorganisms based on the obtention of prockar-

yotic macrorestricion patterns, algae karyotypes and ITS sequences from acidophilic

fungi, iv) obtention of physical and genetic maps of chromosomes and extrachromoso-

mal elements from chemolithotrophic reference microorganisms, v) differential genetic

expression studies to facilitate the identification of genes involved in chemolithotrophy,

vi) identification of microorganisms with biotechnological potential in bioleaching, spe-

cific metal sequestering (recovery and decontamination) and coal desulfurization.

Microbial ecology of extreme environments as models of life of astro-

biological interest

The recent development of astrobiology, the search for life beyond the Blue

Planet, requires the establishment of terrestrial reference model systems, which due to

their properties, could develop in the conditions reported for extraterrestrial environ-

ments. Microorganisms capable of growing in extreme conditions of temperature, ionic

strength, pH, radiation, pressure, etc. are interesting candidates for this type of study.

In our lab we are evaluating the possibility of extremophilic chemolithoautotrophic aci-

dophilic bacteria and haloarchaea to develop in scenarios of astrobiological interest:

Mars and Europa. Specifically, we are studying the potential interest of the biodiversity

observed in the Tinto River ( pH between 2 and 2.5 and high concentration of iron and

heavy metals) as a model of Martian life.

Methanogenesis: anaerobic treatment of contaminated waters

The anaerobic treatment of contaminated waters has important advantages over

conventional aerobic systems. In spite of its importance there is limited information on

the toxicity of many compounds produced by different industrial activities on the pro-

cess. In this line of research we are evaluating the inhibition of methanogenesis produ-

ced by different compounds present in contaminated industrial waters: i.e. heavy

metals, antibiotics, aliphatic organochloride derivatives, etc. An important aspect of the

work is related to the identification of sensitive microorganisms to different inhibitors,

the degree of toxicity produced, the adaptation and/or recovery capacity of the micro-

bial communities at different inhibitory conditions, in order to know the limits of tole-

249

rance of the system and to facilitate the design of processes for the tretament of waters

with high levels of toxicants.

Functiotype: the study of the functional evolution of ribosomes

Our laboratory has extensive experience in the functional characterization of ribo-

somes from different domains (archaea, bacteria and eukarya) using protein synthesis

inhibitors as functional markers. The inhibition curves generated for the different ribo-

some-antibiotic pairs have shown interesting homologies between phylogenetically

related systems, which made it possible to use these information to study the functio-

nal evolution of ribosomes (functiotype). The phenograms obtained using functional

data are similar to those obtained using the conventional method of comparing SSU

rRNA sequences, which proves the phylogenetic value of functional analysis. We are

currently working on amplifying the inhibition databank and on the development of

analytical tools with which to study the intersection of the sequence space (genotype)

and the functional space (functiotype)

Change in the global expression of toxin production genes of dinoflage-

llates under environmental stress

Dinoflagellates constitute a vaste group of protists, generally represented by

planktonic algae, which can be found in many different aquatic habitats. Occasionally

they produce important blooms originating the so call �red tides�. There are red tides

which are innocuous, but in some cases the dinoflagellates can produce very powerful

toxins which concentrate in bivalves and can produce severe harm to those who eat it.

We have recently opened a new line of research devoted to the study of the curious

genomic organization of dinoflagellates related to red tides and the regulation of gene

expression in conditions of environmental stress related to toxin production.

Enzymatic systems for the control of phytopathogenic fungi

One of the main consequences of fungal infections in plants is the high economi-

cal losses produced in agriculture. The traditional control systems are based on the use

of chemical fungicides against the pathogens. Nevertheless, their inhibitory action,

rarely selective, produces important modifications of the ecological equilibria of the

ecosystems, in addition to important problems related to the selection of resistant spe-

cies to these products. In addition, the increasing prices for the fungicides and the intro-

duction of restrictive legislation regulating their use, requires the search for new met-

hods of control. An alternative to the chemical methods is based on the utilization of

microorganisms as biological control agents. The antagonistic microorganisms are

putative biological control agents due to their potential to act directly or indirectly on

the pathogens, reducing the level of expression of the correspondent diseases. The use

of fungi as mycoparasites applied to biological control has been developed mainly for

the control of hyperparasitism over phytopathogenic fungi, existing an important num-

ber of described species. Nevertheless, the use of fungal enzymatic complexes applied

directly to the soil or immovilized in a convenient form, has not been investigated as a

method for the production of the lysis of pathogenic fungi. The lytic enzymes present

in the soil produced by microorganisms could be used, under adequate conditions, to

control the development of sensitive fungi.


� Moreira, D. and Amils, R. Phylogeny of Thiobacillus cuprinus and other mixotrop-

hic thiobacilli: proposal for Thiomonas gen. nov. Internat. J. System. Bacteriol. 47,

522-528 (1997).

� Gómez, E., Ballester, A., Marín, I., Blázquez, M.L., González, F. Bioleaching of

metallic sulphides using a new moderate thermophilic microorganism with spe-

cificity for copper sulphides. En �IBS-Biomine 97�, A.I.M. Ritchie (ed), Australian

Mineral Foundation, Glenside, pp. 187-196 (1997).

� Marín, I., Amils, R. and Abad, J.P. Genomic organization of the metal-mobilizingbacterium Thiobacillus cuprinus. Gene 187, 99-105.8 (1997).

� Gómez, F., Amils, R., Marín, I. Microbial ecology studies for the desulfurizationof Spanish coals. Fuel Process. Technol. 52, 183-189 (1997).

� Gómez, F., Amils, R. and Marín, I. Comparative coal desulfurization using isola-ted endogenous and exogenous bacteria. En �IBS-Biomine 97�, A.I.M. Ritchie(ed), Australian Mineral Foundation, Glenside, pp. 701-702 (1997).

250

251

� Sanz, J.L., Rodriguez, N. and Amils, R. Effect of chlorinated aliphatic hydrocar-

bons on the acetoclastic methanogenic activity of granular sludge. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 47, 324-328 (1997).

� Durán, C., Marín, I. and Amils, R. Specific metal sequestering fungi from an aci-

dic river. En �IBS-Biomine 97�, A.I.M. Ritchie (ed), Australian Mineral

Foundation, Glenside, pp. 425-432 (1997).

� Irazabal, N., Marín, I. and Amils, R. Genomic organization of the acidophilic che-

molithotrophic bacterium Thiobacillus ferrooxidans ATCC 21834. J. Bacteriol. 179,

1946-1950 (1997).

� Amils, R., López-Archilla, A.I., Marín, I. Modelos de vida en condiciones límite como

base para la exobiología. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fis. Nat. (Esp) 91, 87-99 (1997).

� García-Lepe, R., Nuero, O.M., Reyes, F. and Santamaría, F. Lipases in autolysed

cultures of filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 25, 127-130 (1997).

� Irazabal, N., Abad, J.P., Amils, R. and Marín, I. Genomic organization of acidop-

hilic chemolithotrophic bacteria, En �IBS-Biomine 97�, A.I.M. Ritchie (ed),

Australian Mineral Foundation, Glenside, pp. 567-568 (1997).

� Briones, C., Koroutchev, K. and Amils, R. Functional phylogeny: the use of the

sensitivity of ribosomes to protein synthesis inhibitors as a tool to study the evo-

lution of ribosomes. Orig. Life Evol. Biosp. 28, 571-582 (1998).

� Amils, R., Irazabal, N., Moreira, D., Abad, J.P. and Marín, I. Genomic organization

analysis of acidophilic chemolithotrophic bacteria using pulsed field gel electro-

phoretic techniques. Biochim. 80, 911-922 (1998).

� Navarrete, M., Rodriguez, N., Amils, R. and Sanz, J.L. Effect of 1,1,2,2-tetrachlo-

roethane on the performance of UASB reactors. Wastewater Anaerobic

Treatment, vol 1, pp 1- 7 (1998).

� Buckwold, V.E. and Amils, R. How big breweries failed the taste test. Nature 393,

407 (1998).

� Rodriguez, N. and Sanz, J.L. Response of an anaerobic granular sludge to chlori-

nated aliphatic hydrocarbons in different conditions. J. Ferment. Bioeng. 86, 226-

232 (1998).

� Ramírez-Arcos, S., Fernández-Herrero, L.A., Marín, I. and Berenguer, J.

Anaerobic growth, a property horizontally transferred by an Hfr-like mechanism

among extreme thermophiles. J. Bacteriol. 180, 3137-3143 (1998).

� Briones, C. and Amils, R. The evolution of function: a new method to assess the

phylogenetic value of ribosomal sensitivity to antibiotics. Intenat. Microbiol. 1, 301-

306 (1998).


Consuelo Duran: �Caracterización de hongos de interés biotecnológico�. Universidad


Felipe Gómez: �Caracterización de las poblaciones microbianas presentes en carbones

y su utilización en procesos de biodesulfuración�. Universidad Autónoma de Madrid.

1998. Calificación: Apto cum laude.

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with the Industry

Biomar: �screening� de actividades farmacológicas en microorganismos procedentes

de ambientes extremos. Merck Sharp and Dohme: caracterización de hongos de interés

farmacológico procedentes de ambientes extremos. Cadagua: desarrollo de tecnología

de tratamiento de aguas contaminadas. Petresa: Toxicidad en procesos de digestión

anaerobia de compuestos de interés industrial.

252

253

Organización de Reuniones Científicas / Organization of ScientificMeetings

Ricardo Amils:

� Co-Chairman del International Biohydrometallurgy Symposium IBS-99. 1999 /

Co-Chaiman of the International Biohydrometallurgy Symposium IBS-95. 1999.

� Co-Chairman del International Symposium �Origins of species and evolutionary

changes� 1998. / Co-Chairman of the International Symposium on �Origins of

species and evolutionary changes�. 1998.

Irma Marín:

� Miembro de la Comisión Organizadora del International Biohydrometallurgy

Symposium IBS-99. 1999 / Member of the Organizing Committee of the

International Biohydrometallurgy Symposium IBS-99.

254

MANTENIMIENTO Y VARIABILIDAD DEL GENOMA:ENZIMOLOGÍA DE LA REPARACIÓN DEL DNA GENOME MAINTENANCE AND VARIABILITY: ENZYMOLOGYOF DNA REPAIR

Jefe de Línea / Group Leader: Luis BlancoPersonal Científico Scientific Personnel : Orlando DomínguezBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: María Luisa Saníger Becario Predoctoral Graduate Student: José Ruiz Pérez


El interés de nuestra línea de investigación, iniciada en 1998, se centra en la iden-

tificación de nuevas DNA polimerasas de reparación de DNA en mamíferos, cuyo

papel podría ser muy relevante tanto para el mantenimiento de la estabilidad genómi-

ca, como para proporcionar un cierto grado de variabilidad, necesario en determinados

genes como en el caso de los receptores de antígeno, pero indeseable en su contribución

a incrementar el fenotipo mutador que se haya asociado a una gran mayoría de proce-

sos tumorales.

(i) Caracterización de la enzimología de reparación de daño oxidativo en

mitocondria.

A priori, teniendo en cuenta el tipo de daño más frecuente producido por radica-

les de oxígeno en el DNA (modificaciones de las bases nitrogenadas), es posible apos-

tar por la necesidad de un sistema de reparación del tipo �base excission repair� (BER)

operando en el interior de la mitocondria. Uno de nuestros objetivos es la identificación

de la DNA polimerasa implicada en la reparación del daño oxidativo que tiene lugar en


255

las mitocondrias de células de mamífero, tanto en condiciones fisiológicas, como en

otras condiciones de estrés metabólico producido mediante reactivos específicos o

inducido por la infección viral.

(ii) Identificación de nuevas polimerasas de mamíferos implicadas en

reparación de DNA

Hemos identificado los homólogos murino y humano de un gen que codifica una

nueva DNA polimerasa eucariótica, que hemos denominado Pol theta (θ). Su elevada

expresión en testículo en ambas especies, sugiere su participación en fenómenos de

reparación asociados a meiosis. Su presencia basal en la mayoría de los tejidos podría

apuntar también a un papel más general en reparación asociada a recombinación.

Actualmente estamos analizando alteraciones de expresión, pérdida de heterocigosis y

polimorfismo asociados a este gen en líneas celulares y muestras de tumores seleccio-

nados en base a presentar un fenotipo mutador. Ya disponemos de un clon genómico

de más de 8 kilobases, que contiene los nueve exones del gen murino de la Pol θ, lo que

nos ha permitido comenzar el proceso para la obtención de un modelo murino �knock-

out� en este gen. Este trabajo se está llevando a cabo en colaboración con el Dr. A.

Bernad, del Centro Nacional de Biotecnología.

De forma paralela, estamos caracterizando las versiones murina y humana de otra

nueva DNA polimerasa, que hemos denominado Pol iota (ι). Ya disponemos del cDNA

completo correspondiente al gen humano, que ha sido obtenido a partir de placenta.

Esta nueva DNA polimerasa presenta una elevada similitud de secuencia con la trans-

ferasa terminal (TdT), enzima que juega un papel fundamental en la generación de

variabilidad de los receptores de antígeno, debido a su capacidad de incorporar nucléó-

tidos �no complementarios�. Este carácter �creativo�, que se contrapone a la fidelidad

de la mayoría de las �replicasas�, podría estar presente también en el nuevo enzima que

hemos identificado, sugiriendo su papel en procesos fisiológicos y/o patológicos que

impliquen variabilidad (hipermutación somática). De acuerdo con esta hipótesis, resul-

tados muy recientes indican que esta DNA polimerasa se encuentra a nivel basal en la

mayoría de los tejidos, pero en niveles elevados en tejidos linfoides secundarios.

Research Summary

The main objective of our group, constituted in 1998, is the identification of new

mammalian DNA polymerases involved in DNA repair, that could have a significant

role in the maintenance of genome stability and , alternatively, in the generation of

variability, required for particular genes as those coding for antigen receptors, but

undesirable if contributing to increase the mutator phenotype associated to a variety of

oncogenic transformations.

(i) Repair of mitochondrial DNA damage

Considering the most frequent damage produced by reactive oxygen species to

DNA (base modifications), an adequate mechanism to repair such a damage, i.e. base-

excision-repair (BER), should be operative also inside mitochondria. We are interested

in identifying the DNA polymerase activity involved in repairing the oxidative dama-

ge occurring on the DNA of mammalian mitochondria, and its regulation upon induc-

tion of metabolic stress and/or viral infection.

(ii) Identification of new mammalian DNA polymerases involved in

DNA repair

We have identified the human and mouse homologues of a novel gene, poten-

tially coding for a new DNA polymerase (Pol θ). Its high level of expression in testis

from both species suggests a potential role in DNA repair associated to meiosis.

Moreover, its basal expression in most tissues could be related with a more general role

in the DNA repair processes occurring during DNA recombination. Alteration of

expression, loss of heterozygosis, and polymorphisms in Pol θ are being analyzed,

using as models both cell lines and tumour samples that display a mutator phenotype.

A genomic clone spanning more than 8 Kb, and containing nine exons of murine Pol θ,

has been obtained, allowing to begin the obtention of a knock-out mouse model for this

gene. This work is being carried out in collaboration with Dr. A. Bernad, at the Centro

Nacional de Biotecnología (Madrid).

In parallel, we are characterising the murine and human homologues of a new

DNA polymerase, that we named Pol iota (ι). The human cDNA for this gene has been

obtained from placenta. This new DNA polymerase has a remarkable similarity with

256

257

terminal transferase (TdT), an enzyme involved in generation of diversity of antigen

receptor genes, based on its capacity to incorporate non-templated nucleotides. This

�creative� synthesis, that contrasts with the fidelity of most DNA polymerases, could

be present also in Pol ι, suggesting its participation in both natural and pathological

processes that imply variability, i.e. somatic hypermutation. In agreement with such a

hypothesis, recent results demonstrated basal levels of this enzyme in most tissues, but

an elevated presence in secondary lymphoid organs.

258

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DEL RIBOSOMA STRUCTURE AND FUNCTION OF THE RIBOSOME

Jefe de Línea / Group Leader: Juan Pedro García BallestaPersonal Científico Scientific Personnel: Miguel RemachaBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Vassiliki Lalioti, Miguel Angel Rodriguez-GabrielBecarios Predoctorales Graduate Students: Maria Elisa Briones, Patricia González Santamaria,

Esther Guarinos, Antonio Jiménez Díaz, Pilar Parada, Jorge Pérez Fernández, Gretel Nusspaumer,Sonia Zúñiga

Técnico de Investigación Technical Assistance: Mª Carmen Fernández MoyanoEstudiantes Undergraduate Students: Veronique Bergeron, Javier López Ríos, Pablo Rivera Científicos Visitantes Visiting Scientists: M.Teresa Tellez-Iñon (INGEBI, Conicet. Argentina),

Elisabeth Gagou (Universidad de Atenas. Grecia), A.van den Broek (Univ. Utrecht. Holanda), David Jameson (Univ. de Hawaii. USA), Michael Helms (Univ. de Hawaii. UDSA). Reina Zambrano, (Univ. de Carabobo. Venezuela), Enrico Gratton (Univ. Illinois. USA), Jose Eduardo González Pastor (Hospital Ramón y Cajal. Madrid).


Estructura y función del tallo ribosómico de S. cerevisiae

El trabajo se enfoca a esclarecer el papel que le tallo ribosómico juega como regu-

lador de la actividad del ribosoma y de todo el proceso de traducción en eucariontes.

A) Estructura de los componentes.

Se está llevando a cabo un análisis de la estructura de las proteínas P1α y P2β,

mediante diferentes técnicas físicas (ultracentrifugación, DC, espectroscopia de fluores-


cencia, NMR) en colaboración con los Drs. J.M. Sanz (C.I.B., Madrid) y M. Rico (Inst.

Estructura de la Materia, Madrid). Se ha comprobado la existencia de un bajo nivel de

estructura terciaria y una conformación equivalente a un �glóbulo fundido�. Estos

resultados permiten postular la existencia de proteínas del tipo de las chaperonas que

la protejan en la citoplasma de la degradación y les confieran la conformación activa

requerida. La estructura de estas proteínas se diferencia notablemente de las equiva-

lentes bacterianas a pesar de llevar a cabo un papel funcional análogo, careciendo del

domino carboxilo altamente estructurado que estas poseen.

Actualmente se continúa el análisis estructural intentando determinar in vivo las

interacciones entre los diferentes componentes del tallo mediante la técnica de dos

híbridos. Igualmente, en colaboración con el D. Jameson (Univ. de Hawaii), se esta

poniendo a punto la aplicación de transferencia de energía fluorescente para determi-

nar in vitro distancias e interacciones dentro el tallo y de este con otros efectores del sis-

tema de traducción (factores solubles, antibióticos).

B) Análisis de papel de la proteína L12.

Esta proteína, aunque no forma parte del tallo ribosómico, se une al Centro

GTPasa en el 26S RNA, solapando con el sitio de unión de la proteína P0. Se ha llevado

a cabo la inactivación de los dos genes que la codifican, comprobándose que las células

son viables en ausencia de L12 aunque crecen muy lentamente. Los ribosomas con-

tienen un tallo defectuoso al que le faltan las proteínas P1α y P2β. Esta cepa se esta

usando para aislar mutaciones en la proteína L12 que induzcan resistencia a inhibidores

del Centro GTPasa.

C) Papel de la fosforilación.

Se ha llevado a cabo un análisis mutacional de los sitios de fosforilación de las

proteínas constituyentes del tallo ribosómico (P1, P2 y P0) comprobándose que la susti-

tución de la serina fosforilable por un residuo no modificable no afecta la integración

de la proteína en el tallo ni su función en condiciones de crecimiento estándar. Las cepas

mutantes sí muestran, sin embargo, un fenotipo relacionado con la osmosensibilidad a

37ºC. Estos resultados han llevado a proponer que los cambios en la estructura del tallo

ribosómico, bien por falta de alguno de sus componentes o por alteración de su nivel de

259

fosforilación afectan la expresion de proteínas especificas que están directa o indirecta-

mente relacionadas con la sensibilidad osmótica de la célula.

Análisis del genoma de S. cerevisiae

Se ha continuado la participación en el Programa europeo para le secuenciación y

análisis del genoma de la levadura y como parte del mismo se han secuenciado 50 Kbp

de DNA de los cromosomas IV y XIV. Se ha llevando a cabo el análisis funcional de 20

ORFs dentro del programa Eurofan I.

Research Summary

Structure and Function of the S. cerevisiae ribosomal stalk

The work is focused to the understanding of the role played by the ribosomal

stalk as a regulator of the ribosomal activity and of the whole translation process.

A) Stalk components structure

An analysis of the P1α and P2β protein structure is being carried out using dif-

ferent physical techniques (ultracentrifugation, CD, fluorescence spectroscopy, NMR)

in collaboration with Drs. J.M Sanz (C.I.B., Madrid) y M. Rico (Inst. Estructura de la

Materia, Madrid). It has been shown that the proteins have a low tertiary structure con-

tent showing a conformation that resembles a molten globule. These results allow to

propose the existence of chaperon like proteins which protect the stalk components

from degradation in the cytoplasm, and at the same time confer to them the appropri-

ate stable conformation. The structure of these proteins differs notably from the equiv-

alent bacterial components in spite of playing similar functional role, lacking the high-

ly structured carboxyl domain present in the prokaryotic polypeptides.

Presently, the structural analysis is carried on further trying to characterize in

vivo the interactions among the different stalk components using the two-hybrids

approach. Similarly, in collaboration with Dr. D. Jameson (Univ. of Hawaii), a fluores-

cence energy transfer technique is being set up to determine in vivo distance and inter-

actions inside the stalk as well as between the stalk and other effectors of the translation

machinery (supernatant factors, antibiotics).

260

261

B) Analysis of the role of protein L12.

This protein, although is not part of the ribosomal stalk, binds to the GTPase cen-

ter in the 26S rRNA, overlapping with the binding site of protein P0. The disruption of

both genes encoding protein L12 has been performed, finding that the cells are viable

in the absence of this protein but grow very slowly. The ribosomes have a defective

stalk lacking proteins P1α and P2β. This strain is being used to obtain L12 mutations

that induce resistance to GTPase inhibitors.

C) Role of phosphorylation.

A mutational analysis of the phosphorylation sites has been performed in the pro-

teins that form the ribosomal stalk (P0, P1 and P2). It has been shown that mutation of

the serine to a non-phosphorylatable residue does not affect either the integration of the

mutated protein in the stalk or its activity in standard growing conditions. The mutant

strains do show, however, a phenotype related to osmosensibility at 37ºC. These results

led to the proposal that changes in the stalk structure, either due to the absence of any

of the components or by changes in the level of phosphorylation affect the expression

of specific proteins which are directly or indirectly involved with the osmotic sensibili-

ty of the cell.

Analysis of the S. cerevisiae genome

The participation on the European program for the sequencing and analysis of the

S. cerevisiae genome has continued. About 50 kbp DNA from chromosomes IV and

XIV have been sequenced. Presently, the functional analyses of 20 ORFs is being carried

out as part of the Eurofan I program.


� C. Jacq y 160 autores más en orden alfabético incluyendo a Ballesta, J.P.G.,

Remacha, M., Soler-Mira, A. The nucleotide sequence of chromosome IV from

Saccharomyces cerevisiae. Nature 387 (suppl.) 75-78 (1997).

262

� P. Philipssen y 87 autores más en orden alfabético incluyendo a Ballesta, J.P.G.,

Remacha, M., Soler-Mira, A. The complete sequence of the 784 kb chromosome

XIV of S. cerevisiae reveals an active evolutionary history highlighted by one

recent and six ancient gene cluster duplications of 12 to 120 kb. Nature 387

(suppl.) 93-98 (1997).

� Zurdo, J., Sanz, J.M., González, C., Rico, M. and Ballesta, J.P.G. The exchangeable

yeast ribosomal acidic protein YP2ß shows characteristics of a partialy folded

state under physiological conditions. Biochemistry 36, 9625-9635 (1997).

� Lalioti, V.S., Ballesta, J.P.G. and Fragoulis, E. G. Purification and characterization

of novel poly(U), poly(C) ribonuclease from Saccharomyces cerevisiae. Biochim.

Biophys. Acta 342, 62-72 (1997).

� Zambrano, R., Briones, E., Remacha, M. and Ballesta, J.P.G. Phosphorylation of

the acidic ribosomal P proteins in Saccharomyces cerevisiae. A reappraisal.

Biochemistry 36, 14439-14446 (1997).

� Mager, W.H., Planta, R.J., Ballesta, J.P.G., Lee, J.C., Mizuta, K., Suzuki, K., Warner,

J.R. and Woolford, J. A new nomenclature for cytoplasmic ribosomal proteins of

Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acid Res. 25, 4872-4875 (1997).

� Briones, E., Briones, C., Remacha M. and Ballesta, J.P.G. The GTPase center pro-

tein L12 is required for correct ribosomal stalk assembly but not for

Saccharomyces cerevisiae viability. J. Biol. Chem. 273, 31956-31961 (1998).

� Rodriguez-Gabriel, M.A., Remacha, M. and Ballesta, J.P.G. Phosphorylation of

ribosomal protein P0 is not essential for ribosome function but affects translation

Biochemistry 37, 16620-16626 (1998).

263


Germán Bou Arévalo: �Caracterización de proteínas quinasas específicas de las proteí-

nas P de Saccharomyces cerevisiae�. Universidad Autónoma de Madrid.1997.

Calificación: Apto cum laude.

Miguel Angel Rodríguez Gabriel: �La Proteína ribosómica P0 de Saccharomyces cere-visiae. Aspectos funcionales y estructurales�. Universidad Autónoma de Madrid.1997.

Calificación: Apto cum laude.

Maria Elisa Briones Rosales: �Caracterización funcional de la proteína L12 de

Saccharomyces cerevisiae� mediante disrupción génica Universidad Autónoma de

Madrid.1998. Calificación: Apto cum laude.

Antonio Jiménez Díaz: �Utilización de un extracto de traducción in vitro de

Saccharomyces cerevisiae para el estudio de la función de las proteínas P1 y P2 del ribo-

soma�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Director: M. Remacha.

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with IndustryContrato de colaboración con Glaxo-Wellcome, S.A.

264

SÍNTESIS DE PROTEÍNAS Y SU REGULACIÓN EN EUCARIONTESPROTEIN SYNTHESIS AND ITS REGULATION IN EUKARYOTES

Jefe de Línea / Group Leader: César de Haro, José M. SierraBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Juan José Berlanga, Javier SantoyoBecarios Predoctorales Graduate Students: Mª del Mar Castellano, Greco Hernández, Saturnino

Herrero, Natalia PomarTécnico de Investigación Technical Assistance: José Alcalde


Control de la traducción por las eIF-2αα quinasas

La fosforilación de la subunidad α del eIF-2 representa uno de los mecanismos de

regulación de la síntesis de proteínas mejor caracterizado en células de mamífero, en

respuesta a varias condiciones de estrés celular. Hasta hace unos meses, se conocían tres

eIF-2α quinasas diferentes, que actúan como reguladores de la traducción en células

eucarióticas, fosforilando el eIF2α en el residuo Ser-51. Dos eIF-2α quinasas de células

de mamífero, el inhibidor regulado por hemina (HRI) y la proteína quinasa dependien-

te de RNA de doble cadena (PKR) y el GCN2 de levaduras. Mientras que tanto HRI

como PKR inhiben globalmente la síntesis de proteínas, la activación de GCN2 estimu-

la específicamente la traducción del factor de transcripción GCN4 de levaduras.

Recientemente, se ha identificado una cuarta eIF-2α quinasa, llamada PERK, que se

localiza en el retículo endoplásmico.

Durante estos dos últimos años hemos estado interesados en caracterizar nuevos

miembros de esta familia de proteína quinasas, para mostrar su presencia en todos los

eucariotes, desde las levaduras hasta los mamíferos, e intentar implicarlas en algún

mecanismo molecular común, responsable de modular la función del eIF2 en las célu-

las eucarióticas.


265

Hemos clonado y caracterizado una eIF-2α quinasa de Drosophila (DGCN2)

homóloga a la proteína quinasa GCN2 de levaduras. Anticuerpos específicos anti-

DGCN2, purificados por afinidad, inmunoprecipitan una actividad eIF-2α quinasa y

reconocen una fosfoproteína de 175 kDa en Western blots de extractos de embriones de

Drosophila . La expresión del DGCN2 está regulada durante el desarrollo y en estadíos

tardíos, esta expresión se restringe a unas pocas células del sistema nervioso central.

También, hemos clonado un cDNA de hígado de ratón que es el primer homólogo del

GCN2 caracterizado en células de mamífero (mGCN2). Un análisis por Northern blot

demuestra que el RNA mensajero del mGCN2 se expresa en un amplio rango de tejidos

de ratón, siendo más abundante en hígado y cerebro.

Hemos purificado una actividad eIF-2α quinasa sensible a hemina, a partir de

extractos de hepatocitos de ratón y de células NIH 3T3. Además, hemos clonado y

expresado esta eIF-2α quinasa (mHRI) de hígado de ratón. Tanto el enzima purificado

como la proteína recombinante presentan dos actividades, autoquinasa y eIF-2α quina-

sa, y ambas actividades se inhiben por hemina in vitro. Además, el mHRI tipo salvaje,

pero no el mutante inactivo mHRI-K196R, se autofosforila in vivo, cuando se expresa

en células 293. El RNA mensajero de mHRI se expresa en todos los tejidos de ratón exa-

minados, lo cual sugiere que el mHRI es una eIF-2α quinasa presente en todas las célu-

las de mamíferos.

Los mecanismos moleculares que regulan la función de las eIF-2α quinasas son en

gran parte desconocidos. Además, aún no se sabe si en las células de mamíferos se

induce la expresión de productos génicos específicos a nivel de la traducción, tras un

aumento en la fosforilación del eIF2α; ni si en las células superiores opera un mecanis-

mo del tipo del GCN4 de levaduras. Estudios recientes atribuyen un papel a la fosfori-

lación del eIF2α en el control del crecimiento y diferenciación celular. Nuestros objeti-

vos actuales se centran en determinar cuales son las funciones de las eIF-2α quinasas,

tanto en el control global de la traducción, como en la traducción de RNAs mensajeros

que codifican proteínas reguladoras del crecimento en células eucarióticas. Será de gran

interés determinar si el DGCN2 está implicado en el control del ciclo celular y la dife-

renciación en Drosophila.

266

Estudio de la estructura y expresión de los genes de los factores de ini-

ciación eIF4E y eIF4G de Drosophila y su papel en el desarrollo embrionario

y crecimiento celular

La unión del mRNA al ribosoma está catalizada por el factor de iniciación euca-

riótico- (eIF-) 4E, que es una proteína que interacciona con la estructura m7G �cap� de

los mRNAs de células eucarióticas. El eIF4E se une tambien al eIF4G, que además con-

tiene los sitios de unión a los factores eIF4A, eIF3 y, al menos en levaduras, a la proteí-

na de unión al poly(A), facilitando de esta forma el ensamblaje del complejo proteico

implicado en la iniciación de la traducción, el mRNA y el ribosoma. Resultados recien-

tes sugieren que, al menos, el eIF4E juega un papel central en el control del crecimien-

to celular en mamíferos e induce diferenciación celular en embriones de Xenopus.

El trabajo previo de nuestro laboratorio permitió el aislamiento y caracterización

del eIF4E y eIF4G de embriones de Drosophila, así como la clonación de los cDNAs y

de los genes correspondientes, sus localizaciones cromosómicas y la caracterización de

sus estructuras genómicas, habiendose iniciado el estudio de su expresión durante el

desarrollo (Maroto, F.G. & Sierra, J.M., 1989, Mol. Cell. Biol. 9, 2181-2190; Zapata, J.M.

et al., 1994 J. Biol. Chem. 269, 18047-18052; Hernández, G. & Sierra, J.M., 1995, Biochim.

Biophys. Acta, 1261, 427-431; Hernández, G. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 253, 624-633;

Hernández, G. et al., Eur. J. Biochem. 253, 27-35). Nuestros objetivos inmediatos consis-

ten en estudiar el posible papel de las proteínas eIF4E y eIF4G en la expresión, a nivel

de la traducción, de genes implicados en el desarrollo de Drosophila, usando mutantes

carentes de estas proteínas y animales transgénicos que las sobreexpresan ectópica-

mente en diferentes condiciones. Tambien estamos interesados en la identificación de

mRNAs cuya traducción se activa preferentemente en células en cultivo sobreexpre-

sando eIF4E o eIF4G. Basándonos en estos abordajes experimentales, esperamos identi-

ficar genes importantes en la regulación del crecimiento celular y/o desarrollo embrio-

nario regulados a nivel traduccional.

267

Research Summary

Translational control by eIF-2αα kinases

Phosphorylation of the α subunit of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF-2α) is

one of the best-characterized mechanisms for down-regulating protein synthesis in

mammalian cells in response to a variety of different cellular stresses. Until recently,

three distinct eIF2α kinases were known as translational regulators in eukaryotic cells

by phosphorylating eIF2α at Serine-51. They were two mammalian eIF2α kinases, the

heme-regulated inhibitor (HRI) and the double-stranded RNA-dependent kinase

(PKR), and the yeast GCN2. In contrast to PKR and HRI, which inhibit global protein

synthesis in response to stress signals, the activation of GCN2 leads to increased trans-

lation of one mRNA species, GCN4 mRNA. A fourth eIF2α kinase, termed PERK, has

recently been identified as an endoplasmic reticulum kinase.

We have been studying new members of this family of kinases in order to provi-

de evidence that the eIF2α kinases are present in all eukaryotes, from yeast to mam-

mals, trying to implicate them in some common mechanisms that modulate eIF2 func-

tion in eukaryotic cells.

We have reported the molecular cloning and characterization of DGCN2, a

Drosophila eIF2α kinase related to yeast GCN2 kinase. Specific affinity-purified

DGCN2 antibodies immunoprecipitated an eIF2α kinase activity and recognized a 175

kDa phosphoprotein in Western blots of Drosophila embryo extracts. Expression of

DGCN2 is developmentally regulated and at later stages becomes restricted to a few

cells of the central nervous system. We have also cloned a cDNA from mouse liver that

represents the first mammalian GCN2 homolog (mGCN2). Northern blot analysis

demonstrated that mGCN2 mRNA is expressed in a wide range of different tissues,

with highest levels in liver and brain.

We have purified a heme-sensitive eIF2α kinase activity from both mouse liver

and NIH 3T3 cell extracts. Furthermore, we have cloned and expressed this mouse liver

eIF2α kinase (mHRI). Both the purified enzyme and the recombinant mHRI exhibited

an autokinase and an eIF2α kinase activity, and both activities were inhibited in vitro

by hemin. In addition, wild-type mHRI, but not the inactive mHRI-K196R mutant was

autophosphorylated in vivo when they were expressed in 293 cells. The mHRI mRNA

is expressed in all mouse tissues examined, suggesting that mHRI is an ubiquitous

eIF2α kinase of mammalian cells .

The molecular mechanisms which regulate the function of the eIF2α kinases are

largely unknown. Moreover, it is not yet known whether mammalian cells induce the

expression of specific gene products at the translational level under conditions where

eIF2α phosphorylation is increased and whether a GCN4-type mechanism can operate

in higher cells. Several recent studies suggest a role for eIF2α phosphorylation in the

control of cell growth and differentiation. We are interested in determining which are

the functions of the eIF2α kinases in general translational control as well as in transla-

tion of mRNAs that encode key growth regulatory proteins in eukaryotic cells. It will

be of great interest to determine whether DGCN2 is involved in cell-cycle control and

cellular differentiation in Drosophila.

Study of the structure and expression of the genes for translation initia-

tion factors eIF4E and eIF4G from Drosophila and their role on the embryonic

development and cell growth

The binding of the mRNA to the ribosome is promoted by eukaryotic initiation

factor- (eIF-) 4E, a protein that binds to the m7G �cap� structure of mRNAs of eukaryo-

tic cells. eIF4E also binds eIF4G, which in addition has binding sites for eIF4A, eIF3 and,

at least in yeasts, the poly(A)-binding protein. In this way, eIF4G provides the assembly

of the protein complex involved in translation initiation, the mRNA and the ribosome.

Recent results suggest that at least eIF4E plays a central role in the control of cell growth

in mammals and induces cell differentiation in Xenopus embryos.

Previous work from our laboratory led to the isolation and characterization of

eIF4E and eIF4G from Drosophila embryos, as well as the cloning of the cDNAs and the

corresponding genes, their chromosomal localization and the characterization of their

genomic structures, beginning the study of their expression during development

(Maroto, F.G. & Sierra, J.M., 1989, Mol. Cell. Biol. 9, 2181-2190; Zapata, J.M. et al., 1994

J. Biol. Chem. 269, 18047-18052; Hernández, G. & Sierra, J.M., 1995, Biochim. Biophys.

Acta, 1261, 427-431; Hernández, G. et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 253, 624-633;

268

269

Hernández, G. et al., Eur. J. Biochem. 253, 27-35). Our next aims are to study the possi-

ble role of eIF4E and eIF4G proteins on the expression, at the translational level, of

genes involved in the development of Drosophila, using mutants lacking these proteins

and transgenic animals overexpressing them ectopically at different conditions. Also,

we are interested in the identification of mRNAs whose translation is preferentially

activated in culture cells overexpressing eIF4E or eIF4G. Based on these experimental

approaches we hope to identify important genes in cell growth regulation and/or

embryonic development regulated at the translational level.


� Santoyo, J., Alcalde, J., Méndez, R., Pulido, D. and de Haro, C. Cloning and cha-

racterization of a cDNA encoding a protein synthesis initiation factor-2α (eIF2α)

kinase from Drosophila melanogaster. Homology to yeast GCN2 protein kinase. J.Biol. Chem. 272, 12544-12550 (1997).

� Hernández, G., Diez del Corral, R., Santoyo, J., Campuzano, S. and Sierra, J. M.

Localization, structure and expression of the gene for translation initiation factor

eIF4E from Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 253, 624-633 (1997).

� Hernández, G., Castellano, M.M., Agudo, M. and Sierra, J.M. Isolation and cha-

racterization of the cDNA and the gene for eukaryotic translation initiation factor

4G from Drosophila melanogaster. Eur. J. Biochem. 253, 27-35 (1998).

� Berlanga, J.J., Herrero, S., and de Haro, C. Characterization of the hemin-sensiti-

ve eukaryotic initiation factor 2α kinase from mouse nonerythroid cells. J. Biol.Chem. 273, 32340-32346 (1998).


Javier Santoyo: �Clonaje y Caracterización de una eIF2α Quinasa de Drosophila mela-nogaster�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

270

EXPRESIÓN GÉNICA EN Streptomyces Y LEVADURAS GENE EXPRESSION IN Streptomyces AND YEASTS

Jefe de Línea / Group Leader: Antonio JiménezPersonal Científico Scientific Personnel: María Fernández-LobatoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Juan Carlos Espinosa, Natalia Martínez Romero,

Lourdes Osaba Ortiz-Mendibil, Eloísa Sanz Martínez, José Antonio Tercero

Becarios Predoctorales Graduate Students: Juan Alva Rabanal, Jasminka Boskovic, Teresa A.

Carmona, Dolores Marín Alberdi, Jessica Martínez Arenas, Miguel Angel Rubio Olmos, Alicia Ruiz Mahillo, Irene Saugar Gómez, Mercedes Tiemblo

Técnico de Investigación Technical Assistance: Asunción Martín RedondoCientífico Visitante Visiting Scientist: María Josefa Elena Fernández-Fernández


Dentro del cluster pur, determinante de la ruta de biosíntesis de puromicina en

Streptomyces alboniger, se han estudiado los primeros pasos enzimáticos iniciales catali-

zados por los productos de los genes pur7 y pur10. El enzima Pur10 se ha demostrado

que es una deshidrogenasa de ATP que depende de NAD. Aunque no se pudo aislar el

producto derivado de ATP por su extremada inestabilidad, toda la evidencia sugiere

que sería el primer producto de la ruta: 3�-amino-3�-ceto-3�-deoxiATP. En relación a

Pur7 se ha establecido que es una nucleotidil-pirofosfohidrolasa (enzima �Nudix�) que

convierte 3�-amino-3�-desoxiATP en 3�-amino-3�-desoxiAMP. Además se ha estudiado

en el organismo heterólogo Streptomyces lividans la dependencia de la expresión de pur

a nivel de traducción del gen bldA. Este gen determina un tRNALeu que está codificado

por el codon UUA, rarísimo en Streptomyces. En la secuencia determinante de los genes


pur6 y pur10 existe un codon TTA, cuya expresión podría depender de bldA. De hecho,

se ha demostrado que en un mutante de bldA- de S. lividans no existe expresión de pur.

Este defecto se revierte, con la consiguiente biosíntesis de puromicina mediante la

inclusión de bldA en el transformante S. lividans bldA-(pur). En relación al cluster de

biosíntesis del nucleósido A201A, relacionado químicamente con puromicina, de

Streptomyces capreolus se ha caracterizado un nuevo gen determinante de autorresisten-

cia denominado ard2. Codifica por una fosfotransferasa que inactiva A201A por fosfo-

rilación en el C2 de la porción hexofuranosa insaturada. Además se han secuenciando

unas 30 kb del posible cluster génico a201A. Se encontró que los genes de los clusters pur

y a 201A, implicados en labiosíntesis de la región común (N6,N6-3�-amino-3�-desoxiade-

nosina) de puromicina y A201A son muy semejantes y tienen la misma organización.

En relación a levaduras se ha continuado con los proyectos EUROFAN I y II, estu-

diándose la funcionalidad de una variedad de ORFs de función desconocida. Además

se ha continuado la preparación de levaduras industriales con capacidad amilolítica.

Inicialmente se investigó la influencia del grado de glicosilación, por mutagénesis diri-

gida, en las propiedades cinéticas y bioquímicas de la amilasa SWA2 de Schwanniomyces

occidentalis. El gen determinante, dotado del promotor ADH1 se ha introducido en una

levadura panadera. Por último se ha detectado actividad α-amilasa y glucoamilasa en

la levadura Phaffia rhodozyma.

Research summary

The products from the pur7 and pur10 genes, which catalyze the initial steps of the

puromycin biosynthetic pathway, of the pur cluster from Streptomyces alboniger were

studied. Pur10 catalizes the NAD-dependent conversion of ATP into 3�-keto-3�-dATP.

Pur7 is a Nudix enzyme which converts 3�-amino-3�-dATP into 3�-amino-3�-dAMP and

pyrophosphate. In addition, the bldA-dependence, at the translational level, of pur

expression in the heterologous host Streptomyces lividans was studied. bldA determines

a tRNALeu whose cognate codon (UUA) is extremely rare in Streptomyces. The coding

sequence of both pur6 and pur10 includes a TTA codon, which suggested that their

expression could depend on bldA. Indeed, this was shown to be the case because: i) a S.

lividans bldA- mutant does not express pur, and ii) this phenotype is reversed by trans-

271

formation with the bldA gene. Concerning the biosynthetic gene cluster for the puromy-

cin related nucleoside antibiotic A201A from Streptomyces capreolus, a novel gene (ard2)

encoding a phosphotransferase was characterized. This enzyme inactivates A201A by

phosphorylation of C2 at the insaturated hexofuranose moiety. On the whole 30 kb of

the possible gene cluster were sequenced. It was found that the genes implicated in the

biosynthesis of the common moiety (N6,N6-3�-dimethyl-3�-amino-3�-desoxyadenosine)

of puromycin and A201 A are highly similar and share an identical organization.

Concerning yeasts, the group maintained a collaboration within the EUROFANI

and II projects of the EU. The functionality of a variety of ORFs of unknown function

was studied. Furthermore, the preparation of industrial yeasts with amylolytic function

was pursued. Initially, the effects of the glycosylation rate on the kinetic and biochemi-

cal properties of the SWA2 amylase from Schwanniomyces occidentalis was studied by

means of site-directed mutagenesis. Its encoding gene, governed by the strong ADH1

promoter was introduced in a bakery yeast. Finally, both α-and gluco-amylases were

detected in the yeast Phaffia rhodozyme.


� Barrasa, M.I., Tercero, J.A. and Jiménez, A. Characterization of a novel resistance

determinant encoding a phosphotransferase activity, which inactivates the ami-

nonucleoside antibiotic A201A, from Streptomyces capreolus, the producing orga-

nism. Eur. J. Biochem. 245, 54-63 (1997).

� Cifuentes, V., Hermosilla, G., Martínez, C., León, R., Pincheira, G. and Jiménez, A.

Genetics and electrophoretic karyotyping of wild-type and astaxanthin mutant

strains of Phaffia rhodozyma. Anton. Leeuw. 72, 111-117 (1997).

� Jacq, C., ..., Boskôvic, J., Gacía-Cantalejo, J. M., Jiménez, A., ... et al. The nucleoti-

de sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IV. Nature 387, 75-78 (1997).

� Philippsen, P., ..., Boskôvic, J., Gacía-Cantalejo, J. M., Jiménez, A., ..., et al. Thenucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIV and its evolutio-nary implications. Nature 387, 93-98 (1997).

272

� Yáñez, E., Carmona, T. A., Tiemblo, M., Jiménez, A. and Fernández-Lobato, M.

Expression of Schwanniomyces occidentalis SWA2 amylase in Saccharomyces cerevi-

siae: role of N-glycosylation on activity, stability and secretion. Biochem. J. 329, 65-

71 (1998).

� Tercero, J. A., Espinosa, J. C. and Jiménez, A. Expression of the Streptomyces albo-

niger pur cluster in Streptomyces lividans is dependent on the bldA-encoded

tRNALeu. FEBS Letters 421, 221-223 (1998).

� Tercero, J. A., Espinosa, J. C. and Jiménez, A. StgR, a new Streptomyces alboniger

member of the LysR family of transcriptional regulators. Mol. Gen. Genet. 259, 475-

483 (1998).

� Rubio, M. A., Espinosa, J. C., Tercero, J. A. and Jiménez, A. The Pur10 protein

encoded in the gene cluster for puromycin biosynthesis of Streptomyces alboniger

is a NAD-dependent ATP dehydrogenase. FEBS Letters 437, 197-200 (1998).


Juan Carlos Espinosa Martín: �Caracterización molecular del cluster pur de

Streptomyces alboniger y estudio de la biosíntesis de puromicina�. Universidad


Jasminka Boskovic: �Secuenciación y análisis funcional de nuevas fases de lectura

abierta de los cromosomas IV, XI y XIV de Saccharomyces cerevisiae�. Universidad


Jessica Isabel Martínez Arenas: �Transformación y deleción génica en Streptomyces

alboniger: Estudio sobre la función de los genes napH y pur8 del cluster pur�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.

Miguel Ángel Rubio Olmos: �Estudio sobre los genes implicados en los pasos inicia-

les de la ruta de biosíntesis de puromicina en Streptomyces alboniger�. Universidad

Autónoma de Madrid. 1998. Calficación: Apto cum laude.

273

274

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD GENÉTICA POR HORMONAS HORMONAL REGULATION OF GENE EXPRESSION

Jefe de Línea / Group Leader: Antonio NietoPersonal Científico Scientific Personnel: J. Predestinación García-RuizBecarios Predoctorales Graduate Students: K. Díaz González, R. Gutiérrez-Sagal, J. Muñoz, S.

Ogueta, I. OlazabalTécnico de Investigación Technical Assistance: Carlos GarcíaCientífico Visitante Visiting Scientist: Marta Riffo (Universidad de Chile)


Regulación hormonal y función de genes expresados en el tracto genital

Los esteroides ováricos regulan numerosos genes en el tracto genital que es una

típica diana para estas hormonas. Entre estos genes, el de uteroglobina (UG/CC10) es

de particular interés puesto que es regulado por diferentes hormonas esteroides de una

manera específica de tejido y de especie. En epitelio del endometrio, la transcripción de

ug es inducida por progesterona y esta inducción se correlaciona con el aumento (o

nueva aparición) de factores nucleares detectados por su unión in vitro a regiones

específicas del promotor. Así, dos proteínas nucleares inducidas por progesterona se

unen a una E-box (CACCTG) muy próxima a la TATA box del gen. Determinaciones de

la Mr del complejo de unión, así como mapeo con exonuclease III sugieren que estas dos

proteínas HLH se unen como dímeros a la E-box. Al menos una de estas dos proteínas

parece específica de endometrio. Por otra parte, experimentos de expresión transitoria

en células transfectadas con una construcción conteniendo una mutación en esa E-box

también sugieren que este elemento es importante en la expresión específica de tejido

del gen ug. Otros elementos cis del promotor y sus correspondientes factores trans están


siendo considerados con técnicas similares. El clonaje y secuenciación del gen de otras

dos especies también han permitido un estudio comparativo de la regulación hormonal

y específica de tejido del gen.

Respecto a la posible función de genes expresados en el tracto genital, hemos

estudiado la implicación del enzima fosfolipasa A2 del espermatozoide en el reconoci-

miento de los gametos durante la fecundación. Los resultados sugieren que, tras la

reacción acrosomal, los lisofosfolípidos liberados inducen modificaciones físico-quími-

cas y estructurales en la zona pelucida y la adhesión a ésta del espermatozoide. Este

puede ser un mecanismo fisiológico en la interacción de los dos gametos.

Señalización intracelular mediada por el receptor de prolactina (PRLR)

Hemos estudiado los mecanismos mediante los cuales la hormona Prolactina

(PRL) dispara en células derivadas de glándula mamaria (BMGE) señales celulares de

crecimiento y diferenciación. Con este objetivo hemos cotransfectado células BMGE con

vectores que expresan las distintas formas del receptor de prolactina y sus formas muta-

das en el dominio intracelular con vectores de expresión de LUC bajo el control del pro-

motor del gen de colagenasa, que contiene un sitio AP-1, o el promotor β-caseína. La

PRL estimula la señalización a PRL-β-caseína cuando las células son ayunadas en

medio con Insulina y Dexametasona, mientras que el efecto proliferativo de la PRL y la

señalización a AP-1 es máximo en ausencia de Dexametasona. La señal proliferativa del

PRLR necesita la integridad en el box-1 y la tirosina distal del dominio intracelular del

receptor. La intervención de la proteína quinasa pp60c-src, abundantemente expresada en

las células BMGE, en señalización celular del PRLR ha sido estudiada. La expresión de

mutantes, SH2 y SH3 de pp60c-src disminuye el efecto de la PRL, tanto el proliferativo

como el de inducción de β-caseína.

Research Summary

Hormonal regulation and function of genes expressed in the genital tract

Ovarian steroids regulate numerous genes in the genital tract, a typical target for

these hormones. The uteroglobin (UG/CC10) gene is of special interest since it is regu-

lated by different steroid hormones in both tissue and species-specific ways. ug trans-

275

cription is induce by progesterone in endometrial epithelium and this induction is

correlated with an increase (or de novo appearence) of nuclear factor as detected by in

vitro binding to specific regions of the promoter. Thus, two progesterone-induced

nuclear proteins bind to an E-box (CACCTG) close to the TATA box of ug.

Determinations of the Mr of the binding complex as well as exonuclease III mapping

suggest than these two HLH proteins bind to the E-box as dimers. At least one of these

proteins seems to be specific of the endometrium. On the other hand, transient expres-

sion experiments in cells transfected with a construct bearing a mutated version of this

E-box also suggest that this element is important for the tissue-specific expression of ug.

Other cis elements of the ug promoter and their corresponding trans factors are being

analyzed with similar techniques. The cloning and sequencing of the gen from two dif-

ferent animal species have also allowed a comparative study of the hormonal and tis-

sue-specific regulation of ug.

Regarding to the possible function of genes expressed in the genital tract, we have

studied the involvement of the sperm enzyme phospholipase A2 in the interaction of

the gametes at fertilization. The results suggest that following acrosome reaction the

released lysophospholipids induce physicochemical and structural modifications of the

zona pellucida and the subsequent secondary binding of the spermatozoon. This may

be a physiological mechanism in the interaction of the two gametes.

Prolactin receptor (PRLPR)-mediated intracellular signalling

We have studied the mechanisms of whereby prolactin triggers cellular signals of

growth and differentiation in cells derived from mammary gland (BMGE). With this

aims in mind we have co-transfected BMGE cells with vectors expressing either diffe-

rent forms of the PRLR or versions mutated in the intracellular domain and with vec-

tors expressing the luciferase gene driven either by the promoter of the collagenase gen,

which contains an AP-1 site, or by the promoter of the β-casein gene. PRL estimulates

the signaling to the β-casein promoter when cells were incubated in medium containing

insulin and dexamethasone whereas the proliferative effect of PRL and the signaling to

AP-1 is maximal in the absence of dexamethasone. The proliferative signal of PRLR

needs the integrity of the box-1 and the distal tyrosin of the intracellular domain of the

receptor. The involvement of the protein kinase pp60c-src, strongly expressed in BMGE

276

277

cells, in the cellular signaling of PRLR has also been studied. The expression of SH2 and

SH3 mutants of pp60c-src decreases both the proliferative and the β-casein induction

effects of PRL.

Publicaciones/Publications

� Nieto, A., Gutierrez Sagal, R. and Pérez Martínez, M. Isolation and characteriza-

tion of a rabbit epididymal secretory glycoprotein that associates to the sperma-

tozoon surface. Mol. Reprod. Dev. 46, 337-343 (1997).

� Berlanga, J.J., García Ruiz, J.P., Perrot-Applanat, M., Kelly, P. and Edery, M. The

short form of the prolactin (PRL) receptor silences PRL induction of the β-casein

gene promoter. Mol. Endocrinol. 11, 1449-1457 (1997).

� Gutiérrez Sagal, R. and Nieto, A. Molecular cloning of the cDNA and the promo-

ter of the hamster uteroglobin/clara cell 10-kDa gene (ug/cc10): tissue-specific and

hormonal regulation. Arch. Biochem. Biophys. 350, 214-222 (1998).

� Gutiérrez Sagal, R. and Nieto, A. Cloning and sequencing of the cDNA coding for

pig pre-uteroglobin/clara cell 10 kDa protein. Biochem. Mol. Biol. Int. 45, 205-213

(1998).

� García, C. and Nieto, A. Two progesterone-dependent endometrial nuclear fac-

tors bind to an E-box in the rabbit uteroglobin gene promoter: involvement in tis-

sue-specific transcription. Arch. Biochem. Biophys. 362, 301-308 (1998).

� Riffo, M. and Nieto, A. Lysophosphatidylcholine induces changes in physicoche-

mical, morphological, and functional properties of mouse zona pellucida: a pos-

sible role of phospholipase A2 in sperm-zona pellucida interaction. Mol. Reprod.

Dev. 53, 68-76 (1998).

278


R. Gutiérrez Sagal: �Clonaje molecular del cDNA y de la región promotora, expresión

específica de tejido y regulación hormonal del gen de la uteroglobina de hamster�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calficación: Apto cum laude.

K. Díaz González: �Interacción con membranas y acción mitogénica de la uteroglobi-

na�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calficación: Apto cum laude.

279

ESTRUCTURA CROMATÍNICA Y TRANSCRIPCIÓN CHROMATIN STRUCTURE AND TRANSCRIPTION

Jefe de Línea / Group Leader: Enrique PalaciánPersonal Científico Scientific Personnel: Francisco HernándezBecario Predoctoral Graduate Student: Mayel ChirinosTécnico de Investigación Technical Assistance: Santiago Arenas


El objetivo del grupo es el esclarecimiento de las relaciones entre estructura cro-

matínica y función transcripcional, distinguiendo entre iniciación y elongación, y utili-

zando para ello moldes oligonucleosómicos definidos, ensamblados sobre DNA con

secuencias posicionantes de nucleosomas regularmente espaciadas, y un sistema senci-

llo y eficiente de transcripción con RNA polimerasa T7. Además de cambios en la uni-

dad nucleosómica, como son la ausencia de dímeros H2A·H2B, la acetilación o la

ausencia de los dominios histónicos terminales, y la presencia de histonas H1/H5 o de

proteínas HMG 14/17, se pretende averiguar la contribución a los efectos sobre la trans-

cripción del grado de compactación de las cadenas oligonucleosómicas. Para conseguir

este último objetivo, se determinan paralelamente el grado de compactación y la efi-

ciencia transcripcional de los distintos moldes en condiciones salinas apropiadas para

obtener diferentes niveles de plegamiento.

En los dos últimos años, se han investigado las relaciones estructura-función en

estructuras oligonucleosómicas carentes de histonas H2A y H2B y en otras desprovis-

tas de los dominios terminales de las histonas. Se observa una notable facilitación de la

elongación transcripcional en ausencia de dímeros H2A·H2B o de las colas histónicas.

Con oligonucleosomas que contienen sólo tetrámeros (H3·H4)2, la elongación tiene

lugar con la misma facilidad que en moldes totalmente desprovistos de histonas. La


unión de los dímeros H2A·H2B a los tetrámeros (H3·H4)2 ensamblados sobre el DNA

va acompañada de inhibición de la elongación de las cadenas de RNA. Para que se pro-

duzca este efecto represor de los octámeros de histona es necesaria la presencia de los

dominios histónicos terminales. Los incrementos en la eficiencia transcripcional obser-

vados con los moldes modificados se deben, al menos en una parte significativa, a cam-

bios estructurales producidos a nivel de nucleosomas individuales.

En el futuro inmediato, pensamos investigar la relación entre los cambios estruc-

turales y los efectos sobre la transcripción de la incorporación a los moldes oligonu-

cleosómicos de la histona H1. Esperamos averiguar si el admitido efecto de la histona

H1 reprimiendo la transcripción se debe a la estabilización de estructuras condensadas

de la cromatina o a un efecto directo sobre la estructura de cada elemento nucleosómi-

co, y en el caso de que ambos cambios estructurales participen en la represión, cual sea

la contribución de cada uno.

En los últimos años ha aumentado significativamente el conocimiento de la

estructura cromatínica y cómo se afecta ésta por la presencia de diferentes cationes, por

modificaciones del octámero de histonas y por la presencia de la histona H1. Por otra

parte, es espectacular la acumulación de información relativa al papel de la cromatina

en transcripción. Sin embargo, se sabe poco acerca de las relaciones básicas entre estruc-

tura y función transcripcional y los mecanismos que permiten la transcripción del DNA

nucleosómico. El propósito de nuestro trabajo es precisamente esclarecer las relaciones

básicas entre estructura cromatínica y función transcripcional, como un primer paso

para entender el proceso de transcripción en sistemás biológicos más complejos.

Research Summary

The purpose of our research efforts is to contribute to the elucidation of the rela-

tionships between chromatin structure and transcriptional function, studying both ini-

tiation and elongation. We plan to use defined oligonucleosome templates, assembled

on DNA containing regularly spaced nucleosome positioning sequences, and a simple

and efficient transcription system with T7 RNA polymerase. In addition to changes in

the nucleosome element, such as absence of H2A·H2B dimers, acetylation or absence of

280

histone tail domains, and presence of histone H1/H5 or that of proteins HMG 14/17,

we try to evaluate the contribution of the degree of folding of the oligonucleosome

chains to the observed transcriptional effects. With this goal in mind, the extent of com-

paction and the transcriptional efficiency of the different templates, under salt condi-

tions inducing different levels of folding, will be determined in a parallel way.

During the last two years, our group has investigated structure-function rela-

tionships in oligonucleosomes lacking histones H2A and H2B and in those deprived of

the histone terminal domains. In the absence of either H2A·H2B dimers or histone tails,

there is a significant facilitation of RNA chain elongation. On oligonucleosomes with

only (H3·H4)2 tetramers, elongation takes place as easily as on naked DNA. The binding

of H2A·H2B dimers to (H3·H4)2 tetramers assembled on DNA is accompanied by inhi-

bition of RNA chain elongation, the presence of the histone tails being required to achie-

ve this inhibitory effect of core histone octamers. The increased transcription efficiency

observed in the modifed templates is caused, at least in a substantial part, by structural

changes at the nucleosome level.

In the near future, we plan to investigate the relations between structural changes

and transcription effects induced by the binding of histone H1 to oligonucleosome tem-

plates. We hope to find out whether the accepted repressive effect of H1 on transcrip-

tion is caused by stabilization of compacted chromatin structures or by a direct effect on

the individual nucleosome elements. If both structural changes participate in repres-

sion, we would like to evaluate their relative contributions.

During the last years, the knowledge of chomatin structure and the way in which

it is affected by different cations, by modification of the histone octamer, and by the pre-

sence of H1 has increased significantly. Moreover, information concerning the role of

chromatin in transcription has accumulated in a surprising way. However, little is

known about the basic relations between chromatin structure and transcription capa-

city, and the mechanisms allowing transcription of nucleosomal DNA. The purpose of

our work is precisely the elucidation of the basic relationships between chromatin struc-

ture and transcriptional function, as a first step toward understanding transcription in

more complex biological systems.

281

282


� Chirinos, M., Hernández, F., and Palacián, E. Repressive effect on oligonucleoso-

me transcription of the core histone tail domains. Biochemistry 37, 7251-7259

(1998).

� Hernández, F., López-Alarcón, L., Puerta, C., and Palacián, E. Transcriptional

inhibitory role of the tail domains of histone (H3·H4)2 tetramers. Arch. Biochem.

Biophys. 358, 98-103 (1998).

Tesis Doctoral / Doctoral Theses

Mayel Chirinos: �Iniciación y elongación transcripcionales de oligonucleosomas des-

provistos de los dímeros H2A·H2B o de los dominios histónicos terminales�

Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.

283

ENVOLTURAS CELULARES CELL ENVELOPES

Jefe de Línea / Group Leader: Miguel A. de PedroPersonal Científico Scientific Personnel: Ana Dopazo, Francisco García-del Portillo,

María Graciela PucciarelliBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Sylvia Gutierrez, Becario Predoctoral Graduate Student: Katyssulla Costa, Marina Martínez-MoyaTécnicos de Investigación Technical Assistance: Nuria Gómez, Juliana de la Rosa


Nuestro objetivo es la investigación de los mecanismos que regulan la proli-

feración y persistencia de las bacterias patógenas intracelulares en el ambiente

intracelular. La proliferación intracelular y consiguiente colonización de células veci-

nas, es clave en la patogénesis de bacterias intracelulares. Así mismo, la capacidad de

persistencia intracelular, entendida como mantenimiento de la viabilidad sin proli-

feración masiva, es relevante en el establecimiento de los estados de portador asin-

tomático. La investigación de los procesos indicados debe facilitar la lucha contra este

tipo de patógenos bacterianos, con un gran impacto actual en la salud mundial.

En este contexto nos interesa particularmente el papel que juega la envoltura celu-

lar bacteriana, como elemento morfogenético primario de la bacteria, como elemento a

través del cual ocurre el intercambio de señales (cross-talk) entre patógeno y

hospedador, y como elemento capaz de liberar moléculas de elevada actividad bioló-

gica, y por tanto con capacidad de señalización. Una segunda area de interés para

nosotros es la investigación de aspectos estructurales y metabólicos de la pared celular

bacteriana, en particular de bacterias que como las bacterias termófilas y algunas bac-


terias patógenas (Helicobacter pylori), colonizan habitats extremos. La mayor parte del

trabajo experimental se realiza en Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes,

Helicobacter pilory, Escherichia coli y Thermus spp. Para el trabajo con patógenos se

han puesto a punto sistemas de infección in vitro y se recurre, cuando es preciso, a sis-

temas animales modelo.

Los aspectos concretos sujeto de nuestra investigación son los siguientes:

1) Caracterización de factores bacterianos implicados en la regulación del proce-

so de proliferación intracelular y en el establecimiento del estado de persistencia.

Hemos desarrollado un modelo in vitro de persistencia de S. typhimurium en el inte-

rior de células eucarióticas no fagocíticas. La caracterización genética de los aislados

bacterianos rescatados tras este tiempo demuestra la aparición de mutaciones en el gen

lpd, que codifica la dihidro-lipoamida deshidrogenasa. Estos mutantes pierden la

capacidad de producir infección sistémica en ratón BALB/c. Estamos investigando las

bases de este fenotipo. 2) Estudio de los mecanismos de señalización bacteria-célula

eucariótica. Estudios de la señalización entre bacteria y célula NRK han indicado la pro-

ducción significativa de óxido nítrico (NO), mecanismo por el cual la célula eucariótica

pudiera atenuar la proliferación intracelular de S. typhimurium. 3) Análisis de mutantes

de S. typhimurium en sistemas reguladores de factores de virulencia. Este trabajo ha per-

mitido identificar el sistema de dos componentes denominado PhoP-PhoQ como el con-

trolador de la proliferación intracelular de S. typhimurium. 4) Dentro del marco de un

proyecto europeo, se colabora en la secuenciación completa del genoma de L. monocy-

togenes. Una vez concluida esta primera fase, se iniciará el análisis funcional de genes

que codifican para proteínas de superficie unidas covalentemente a peptidoglicano. Por

ensayos inmunológicos y bioquímicos hemos encontrado evidencia de la existencia de

proteínas con capacidad de unión a peptidoglicano, y con un posible papel en la inte-

racción con la célula eucariota. 5) Análisis de las modificaciones inducidas en la pared

celular en el ambiente intracelular, tanto en situaciones de proliferación activa como de

persistencia, y de su relevancia en la evolución de la infección. 6) Estudio de la impli-

cación de la pared bacteriana en las fases tempranas de la infección, y de los requeri-

mientos estructurales necesarios para la invasión y proliferación del patógeno. 7)

Estudio del posible papel de fragmentos de la pared celular como moléculas seña-

284

lizadoras en el ambiente intracelular. 8) Análisis de la estructura y metabolismo de la

pared celular de H. pylori. 9) Investigación de la topografía (localización de sitios específicos)

del sáculo bacteriano por medio de nuevas técnicas en desarrollo en nuestro laboratorio.

Research Summary

The main interest of our group is the investigation of the mechanisms controlling

proliferation and persistance of intracellular pathogenic bacteria in the intracellular

environment. Intracellular proliferation and the subsequent colonization of neighbor-

ing cells are key events in the pathogenesis of intracellular bacterial pathogens.

Likewise, the ability of some bacterial pathogens to colonize host cells for prolonged

periods of time without active proliferation but keeping viability (persistance) might be

instrumental for the establishment of asymptomatic carriers, who which a critical role

in infection spreading. Therefore, research on the above indicated topics should be of

help for the therapy and prevention of world-wide spread diseases caused by intracel-

lular pathogens.

In this context, we are particularly interested on the role played by the bacterial

cell envelope. Indeed the cell envelope is the primary morphogenetic element of the

bacterial cell, is an essential element in host-parasite cross-talk, and is able to release

substantial amounts of molecules with high biological activity, and therefore with a

potential as intracellular signaling effectors. A second area of interest for us is the inves-

tigation of the structural and metabolic aspects of the bacterial cell wall, in particular for

bacteria of extreme habitats (thermophiles) and pathogens as Helicobacter pylori.

Research on this particular point is expected to help unraveling the mechanisms of bac-

terial division and adaptation to specific ecological niches. Most of our research is done

on Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Escherichia

coli and Thermus spp. In vitro infection systems are set up for intracellular pathogens,

and animal model systems are also available when required. The precise objectives of

our research are:

1) Characterization of bacterial factors involved in the regulation of intracellular

proliferation and in the development of bacterial persistance. An in vitro model system

285

286

for persistance studies as been set up using non-phagocytic cells. Genetic analysis of

bacterial cells recovered after a prolonged persistance period revealed the selection of

lpd (dihydro-lipoamide dehydrogenase) mutants in the intracellular environment. The

mutants loose the ability to produce systemic infection in BALB/c mice. The biochem-

ical basis for this phenotype is under study at present. 2) Investigation of the host-

pathogen cross-talk mechanisms. Studies with NRK cells infected with S. typhimurium

indicate that the host cell could attenuate bacterial proliferation by means of an stimu-

lation of NO production. 3) Analysis of S. typhimurium mutants affected in virulence

regulatory genes. Our studies indicate that the two component PhoP/PhoQ system is

involved in the regulation of intracellular proliferation of S. typhimurium. 4) We are

member of an European consortium for the complete sequencing of L. monocytogenes

genome. Once the sequence is finished we will proceed to the functional analysis of

genes coding for cell surface proteins covalently interacting with the cell wall.

Immunological and biochemical studies indicate the existence of peptidoglycan-bind-

ing proteins involved in the interaction with the host cell. 5) Analysis of cell wall mo-

difications associated to bacterial proliferation and persistance in the intracellular envi-

ronment, and of their significance for the outcome of infection. 6) Investigation of the

implications of the bacterial cell wall on the early steps of infection, and of the structural

requirements necessary for the successful colonization of the host. 7) Analysis of the

potential role of cell envelope derived fragments as intracellular signaling effectors. 8)

Analysis of the structure and metabolism of H. pylori cell wall. 8) Analysis of the bac-

terial cell wall topography (location of specific surface features) by means of specific

labeling techniques under development in our laboratory.


� García-del Portillo, F., Stein, M. and Finlay, B.B. Release of lipopolysaccharide

from intracellular compartments containing Salmonella typhimurium to vesicles

of the host epithelial cell. Infection and Immunity 65, 24-34 (1997).

� de Pedro, M.A., Quintela, J.C., Höltje, J.V. and Schwarz, H. Murein segregation in

Escherichia coli. J. Bacteriol. 179, 2823-2834 (1997).

287

� Quintela, J.C., de Pedro, M.A., Zollner, P., Allmaier, G. and García del Portillo, F.

Peptidoglycan structure of Salmonella typhimurium growing within cultured

mammalian cells. Mol. Microbiol. 23, 693-704 (1997).

� Martínez-Moya, M., de Pedro, M.A., Schwarz, H. and García del Portillo, F.

Inhibition of Salmonella intracellular proliferation by non-phagocytic eucaryotic

cells. Research Microbiology 149, 309-318 (1998).

� Cano D.A., Mouslim, C., Ayala, J.A., García-del Portillo, F. and Casadesús, J.

Overproduction of Salmonella typhimurium imidazole-glycerol-phosphate synt-

hase (HisHF) inhibits septum formation. J. Bacteriol. 180, 5231-5234 (1998).

288

BASES MOLECULARES DE LAS ENFERMEDADESMETABÓLICAS MOLECULAR BASIS OF METABOLIC DISEASES

Jefe de Línea / Group Leader: Magdalena UgartePersonal Científico Scientific Staff: Mª José García Muñoz, Begoña Merinero, Belén

Pérez, Celia Pérez-Cerdá, Pilar Rodríguez-Pombo, Lourdes Ruiz Desviat

Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Janet Hoenicka, Pedro Ruiz SalaBecarios Predoctorales Graduate Students: Margarita Castro, Marisel DeLucca, Alejandra

Gámez, Jon A. Gangoiti, Fernando García, Silvia Muro, Eva Richard

Técnicos de Investigación Technical Assistance: Mar Infante, Rocío Martín, Ascensión Sánchez,

Paloma SanzSecretaria / Secretary: Mª José Cano, Julia Gutiérrez, Isabel ReinaCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Carola Grosso, Fermina López Grondona, Paola E.

Leone, José Mª Satizabal


Caracterización de defectos metabólicos

El estudio selectivo de aminoacidopatías y acidemias orgánicas se viene realizan-

do sistemáticamente desde 1974 por parte de nuestro grupo de investigación en el

Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (ver memorias anteriores).

Durante el período 1997-98 se han identificado 59 nuevos casos. El mayor núme-

ro de pacientes identificados en este período corresponde en primer lugar a fenilceto-

nuria y deficiencia en OTC, seguidos por aciduria glutárica, defectos en el metabolismo

de cobalaminas, acidosis láctica congénita y a los defectos en β-oxidación mitocondrial


de ácidos grasos. Se han recibido 106 líneas celulares de pacientes, de las cuales 16 son

de Suiza, USA, Brasil, Colombia y Chile para llevar a cabo estudios enzimáticos y en su

caso genéticos.

Así mismo, se han realizado 12 diagnósticos prenatales en embarazos de alto ries-

go para defectos en el metabolismo de las cobalaminas, acidemia propiónica, jarabe de

arce, tirosinemia y deficiencia en dihidropterina reductasa (DHPR).

Genética molecular de la fenilcetonuria

La fenilcetonuria (PKU) es una enfermedad genética humana debida a un defec-

to en la proteína fenilalanina hidroxilasa (PAH) que cataliza la hidroxilación de fenila-

lanina a tirosina [MIM 261600] (OMIN, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omin). En este

período se ha continuado el estudio de la diversidad genética de la PKU en España y

Latinoamérica. Se han analizado mas de 200 pacientes mediante el sistema combinado

de DGGE y secuenciación cíclica directa de los fragmentos seleccionados. En este estu-

dio se han detectado 70 mutaciones, 19 de las cuales se han descrito por primera vez. El

estudio de polimorfismos intragénicos asociados ha servido de base para conocer la epi-

demiología genética de la enfermedad, identificando el origen de cada mutación. La

importancia clínica de esta heterogeneidad se ha podido reflejar claramente en el estu-

dio de la relación fenotipo-genotipo realizada en los pacientes estudiados que repre-

sentan 137 genotipos diferentes. De esta forma, teniendo en cuenta el fenotipo bioquí-

mico de los pacientes homocigotos para una mutación, los hemicigotos, la naturaleza de

las mutaciones así como la expresión in vitro de algunas de ellas hemos podido definir

la severidad de 58 de las mutaciones detectadas, lo que permite predecir el fenotipo bio-

químico de los pacientes PKU en base al genotipo.

Nuestro objetivo actual es estudiar el efecto de diferentes mutaciones sobre la

estructura y/o función de la proteína. Así, mediante la expresión de la mutación S349L

in vitro, tanto en sistemas procariotas como eucariotas y la coexpresión con chaperoni-

nas se ha podido saber que esta mutación afecta al ensamblaje y a la actividad hidroxi-

lante del enzima. Por otra parte, estudios in vivo mediante el sistema de doble híbrido

en células de mamífero han demostrado que esta mutación también afecta a la oligo-

merización de los monómeros de PAH.

289

Bases moleculares de la acidemia propiónica.

La acidemia propiónica [MIM 232000, MIM 232050] (OMIM, http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim) es una enfermedad metabólica, autosómica recesiva,

causada por una deficiencia en la enzima propionil-CoA-carboxilasa (PCC). La proteí-

na nativa es un heteropolímero constituido por dos tipos de subunidades: α y β codifi-

cadas por los genes PCCA (cromosoma 13) y PCCB (cromosoma 3) respectivamente.

Mutaciones en cualquiera de los dos genes pueden causar acidemia propiónica.

Se han estudiado un total de 57 pacientes procedentes de España, Austria, Chile,

Brasil y Ecuador, de los cuales se han seleccionado 15 como PCCA y 42 PCCB.

Análisis molecular del gen PCCA

En los pacientes deficientes en la subunidad α-PCC se han detectado un total de

10 mutaciones diferentes, ninguna de ellas prevalente, y 8 de ellas no detectadas en

otras poblaciones. El espectro mutacional corresponde a 5 mutaciones de cambio de

sentido, 2 mutaciones sin sentido y tres defectos de �splicing�, consistentes en cambios

en la región donadora y aceptora de �splicing� de un exón de 54pb que, como conse-

cuencia, resulta excluido del cDNA. También se ha detectado un polimorfismo presen-

te en la población general que aparece con frecuencia elevada en los pacientes PCCA,

por lo que no se puede descartar su implicación en la enfermedad. Se ha realizado la

expresión in vitro de la proteína PCCA mediante un sistema de transcripción-traduc-

ción acopladas, permitiendo el posterior transporte y procesamiento intramitocondrial,

y se ha demostrado que el efecto de la mutación puntual M348K es una desestabiliza-

ción de la proteína madura en el interior de la mitocondria, siendo degradada más rápi-

damente que la proteína normal.

Análisis molecular del gen PCCB

Se ha caracterizado la estructura del gen PCCB utilizando la técnica de PCR larga.

El gen consta de 15 exones diferentes con tamaños comprendidos entre 57 y 183 pb.

El conocimiento de las secuencias intrónicas que flanquean los exones ha permi-

tido la amplificación directa de los exones a partir de DNA genómico. De esta forma se

han podido definir un total de 71/73 de los alelos independientes en estudio, detectán-

290

291

dose un total de 20 mutaciones diferentes. El espectro mutacional incluye 13 mutacio-

nes puntuales (R44P, S106R, G131R, R165W, E168K, G198D, V205D, R410W, M442T,

A497V, R512C, L519P, W531X), 4 inserciones y/o deleciones (ins/del, c1170insT, 790-

791insG, 1298-1299insA) y tres mutaciones que afectan al procesamiento (IVS1+3G→C,

IVS 10-11del6, IVS11-2A→G).

La caracterización del efecto de las mutaciones PCCA y PCCB sobre la funciona-

lidad de la proteína PCC se está realizando a varios niveles: 1. Efecto de varias de estas

mutaciones sobre la importación y estabilidad intramitocondrial. 2. Localización de los

dominios de interacción homomérica y heteromérica e implicación de las mutaciones en

la interacción, utilizando la técnica del doble híbrido, y 3. Expresión de las distintas

mutaciones en células eucariotas.

Research Summary

Characterization of metabolic defects

Since 1974 selective screening of amino acid and organic acid disorders is being carried

out by the Centro de Diagnóstico de Enfermedades Moleculares (see previous reports).

During the period 1997-98, 59 new cases have been identified. The largest num-

ber of identified patients are hyperphenylalaninemia and OTC deficiency, followed by

glutaric aciduria, lactic acidosis and defects of fatty acid β-oxidation. Skin fibroblasts

lines from 106 patients have been received for enzyme and genetic studies, from them

16 lines are from Switzerland, USA, Chile, Colombia and Brazil. Twelve prenatal diag-

noses have been carried out in high risk pregnancies for methylmalonic acidemia with

homocystinuria, maple syrup urine disease, propionic acidemia, tyrosinemia, and defi-

ciency of dihydropterin reductase.

Molecular genetics of phenylketonuria

Phenylketonuria (PKU) is a human genetic disorder caused by a defect of the

phenylalanine hydroxylase (PAH) enzyme, which catalyzes the hydroxylation of pheny-

lalanine to tyrosine [MIM 261600](OMIM, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim). In

this period we have continued the study of the genetic heterogeneity of PKU in Spain

292

and Latinoamerica. More than 200 patients have been analyzed using a combined

approach of DGGE and direct cycle sequencing of the selected fragments. In this study,

70 mutations, 19 novel ones, have been identified and the analysis of associated intra-

genic polymorphisms has provided the basis for the study of the genetic epidemiology

identifying the origin of each mutation. The clinical relevance of this heterogeneity,

which involves 137 different genotypes, is clear from the analysis of the genotype-phe-

notype correlations. The severity of 58 mutations has been predicted taking into

account the biochemical phenotype of homozygous and hemizygous patients, as well

as the nature of the mutations and the in vitro expression data. This allows the predic-

tion of the phenotype based on the genotype of the patient.

Our present aim is the analysis of the effect of the different mutations on the struc-

ture and/or function of the protein. In this way, mutation S349L has been expressed in

vitro in eukaryotic and prokaryotic systems, also with the coexpression of chaperonins,

showing that it affects the assembly and enzymatic activity of the protein. In vivo stu-

dies using two-hybrid assays in mammalian cells have also demonstrated that this

mutation affects the oligomerization of PAH subunits.

Molecular basis of propionic acidemia

Propionic acidemia [MIM 232000, MIM 232050] (OMIM, http://

www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim) is an autosomal recessive metabolic disease caused by

a deficiency of the propionyl-CoA carboxylase (PCC). The native protein is an hetero-

polymer of two types of subunits: α and β encoded by the PCCA (chromosome 13) and

PCCB (chromosome 3) genes, respectively. Mutations in either genes can cause propio-

nic acidemia.

Overall, 57 patients from Spain, Austria, Chile, Brazil and Ecuador have been stu-

died, 15 from them classified as PCCA and 42 as PCCB.

Molecular Analysis of the PCCA gene.

A total of 10 different mutations, none predominant, and including 8 novel ones,

have been identified in patients with α-subunit defects. The mutational spectrum inclu-

des 5 missense mutations, 2 nonsense and three splicing defects, consisting in the dis-

ruption of the splicing acceptor and donor sites of a 54bp exon, which is consenquently

deleted in the cDNA. We have also detected a polymorphism with an elevated fre-

quency in PCCA patients which could be involved in the expression of the disease. We

have carried out in vitro expression of the PCCA protein using a coupled transcription-

translation assay and analyzed the mitochondrial import and processing of the protein.

Using this approach, we have demonstrated that mutation M348K results in a protein

with a reduced intramitochondrial stability which is degraded more rapidly than the

wild-type protein.

Molecular analysis of the PCCB gene

We have characterized the structure of the PCCB gene using extra-long PCR. The

gene consists of 15 exons ranging in size from 57 to 183 bp.

The identification of the flanking intronic sequences of each exon has allowed

their amplification and analysis from genomic DNA. In this way, we have characteri-

zed 71/73 independent alleles under study, detecting 20 different mutations. The muta-

tional spectrum includes 13 point mutations (R44P, S106R, G131R, R165W, E168K,

G198D, V205D, R410W, M442T, A497V, R512C, L519P, W531X), 4 insertions and/or

deletions (ins/del, c1170insT, 790-791insG, 1298-1299insA) and three mutations affec-

ting splicing (IVS1+3G→C, IVS 10-11del6, IVS11-2A→G).

The characterization of the effect of the PCCA and PCCB mutations on the struc-

ture-function of the PCC protein is being studied at different levels: 1. Effect of the

mutations on the mitochondrial import and stability. 2. Identification of the domains

involved in the homomeric and heteromeric interactions, and mutations involved, using

two-hybrid approach. 3. In vitro expression in eukaryotic cells of the different mutations.


� Pérez, B., Desviat, L.R. and Ugarte, M. Analysis of the Phenylalanine Hydroxylase

Gene in the Spanish Population: Mutation Profile and Association with Intragenic

Polymorphic Markers. Am. J. Hum. Genet. 60, 95-102 (1997).

� Desviat, L.R., Pérez, B. and Ugarte, M. Phenylketonuria in Spanish gypsies:

Prevalence of the IVS10nt546 mutation on non-haplotype 34. Hum. Mutat. 9, 66-

68 (1997).

293

294

� Song, X.-Q., Fukao, T., Mitchell, G.A., Kassovska-Bratinova, S., Ugarte, M.,

Wanders, R.J.A., Hirayama, K., Shintaku, H., Churchill, P., Watanabe, H., Orii, T.

and Kondo, N. Succinyl-CoA:3 ketoacid coenzyme A (SCOT): development of an

antibody to human SCOT and diagnosis use in hereditary SCOT deficiency.

Biochim. Biophys. Acta 1360, 151-156 (1997).

� Castiñeiras, D.E., Couce, M.L., Alonso Fernández, J.R., Castro, M., Pérez-Cerdá,

C. and Ugarte, M. Two cases of biotinidase deficiency within a 9 day period after

8 years of neonatal screening involving the analysis of 175.000 newborn children.

Proceedings III International Society for Neonatal Screening. Editors H. L. Levy,

R. J. Hermos, G. F. Grady. 190-191 (1997).

� Cali, F., Piazza, A., Dianzani, I., Desviat, L.R., Pérez, B., Ugarte, M. Ozguc, M.,

Shiloh, Y., Giannattasio, S., Carducci, C. and Romano, V. The STR 252-

IVS10nt546-VNTR7 phenylalanine hydroxylase minhaplotype in five

Mediterranean samples. Hum. Genet. 100, 350-355 (1997).

� Desviat, L.R., Pérez, B., García, M.J., Martinez Pardo, M., Baldellou, A., Arena, J.,

Sanjurjo, P., Campistol, J., Couce, M.L., Fernández, A., Cardesa, J. and Ugarte, M.

Relationship between mutation genotype and biochemical phenotype in a hete-

rogeneus Spanish PKU population. Eur. J Hum. Genet. 5, 196-202 (1997).

� Richard, E., Desviat, L.R., Pérez, B., Pérez-Cerdá, C. and Ugarte, M. Three novel

splice mutations in the PCCA gene causing identical exon skipping in propionic

acidemia patients. Hum. Genet. 101, 93-96 (1997).

� Hoenicka, J., Rodríguez-Pombo, P., Pérez Cerdá, C., Muro, S., Richard, E. and

Ugarte, M. A new frequent mutation in the PCCB gene in Spanish propionic aci-

demia patients. Hum. Mutat. Suppl. 1, 234-236 (1998).

� Ugarte, M., Desviat, L.R. and Pérez, B. Perspectivas en el diagnóstico Molecular

de los errores congénitos del metabolismo por análisis del DNA. Acta Nutricional

24, 43-46 (1998).

� Merinero, B., Pérez-Cerdá, C., García, M.J., Chadefaux-Vekemans, B., Kamoun, P.,

Tonetti, C., Zittoun, J. and Ugarte, M. Reliability of biochemical parameters used

in prenatal diagnosis of combined methylmalonic aciduria and homocystinuria.

Prenatal Diagnosis 18, 947-952 (1998).

� Pérez-Cerdá, C., Merinero, B., Martí, M., Cabrera, J.C., Peña, L., García, M.J.,

Gangoiti, J., Sanz, P., Rodríguez-Pombo, P., Hoenicka, J., Richard, E., Muro, S. and

Ugarte, M. An unusual late onset case of propionic acidemia: Biochemical inves-

tigations, neuroradiological findings and mutation analysis. Eur. J. Pediat. 157,

50-52 (1998).

� DeLucca, M., Pérez, B., Desviat, L.R. and Ugarte, M. Molecular basis of phenyl-

ketonuria in Venezuela: Presence of two novel �null� mutations. Hum. Mutat.

11(5), 345-353 (1998).

� Casale, C.H., Casals, J., Pie, J., Zapater, N., Pérez-Cerda, C., Merinero, B.,

Martínez-Pardo, M., García-Peñas, J.J., García-González, J.M., Lama, R., Poll-The,

B.-T., Smeitink, J.A.M., Wanders, R.J.A., Ugarte, M. and Hedgardt, F.G. A non-

sense mutation in the exon2 of the 3hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a lyase

(HL) gene producing three nature mRNAs is the main cause of 3-hydroxy-3-

metylglutaric aciduria in european mediterranean patients. Arch. Biochem.Biophys. 349(1), 129-137 (1998).

� Rodríguez-Pombo, P., Hoenicka, J., Muro, S., Pérez, B., Pérez-Cerdá, C., Richard,E., Desviat, L.R. and Ugarte, M. Human Propionyl-CoA Carboxylase ß SubunitGene: Exon-Intron Definition and Mutational Spectrum in Spanish and LatinAmerican Propionic Acidemia Patients. Am. J. Hum. Genet. 63, 360-369 (1998).

� Merinero, B., Pérez-Cerdá, C., García, M.J., Pérez, B., Desviat, L.R. and Ugarte, M.Experiencia en el diagnóstico prenatal de 45 casos de aminoacidopatías y acide-mias orgánicas. Progresos en Diagnóstico Prenatal 10(8), 464-468 (1998).

� Richard, E., Desviat, L.R., Pérez, B., Pérez-Cerdá, C. and Ugarte, M. Genetic hete-rogeneity in propionic acidemia patients with α-subunit defects. Identification offive novel mutations, one of them causing instability of the protein. Biochim.Biophys. Acta 1998 1453, 351-358 (1999).

295

296


Marisel de Lucca: �Bases moleculares de la fenilcetonuria en Latinoamérica�. Facultad

de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.

Eva Mª Richard Rodríguez: �Bases Moleculares de la Acidemia Propiónica: caracteri-

zación de la deficiencia en el gen PCCA� Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma

de Madrid. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions

Magdalena Ugarte, Mª José García, Mercedes Martínez-Pardo, Lourdes Ruiz Desviat,

Belén Pérez:

� Premio de Investigación de la Real Academia de Farmacia 1998.

297

DIVISIÓN CELULAR BACTERIANA Y RESISTENCIA AANTIBIÓTICOS BACTERIAL CELL DIVISION AND ANTIBIOTICS RESISTANCE

Jefe de Línea / Group Leader: Juan Alfonso Ayala SerranoBecarios Predoctorales Graduate Students: Julián Alberto Ferreras, Beatriz Lara Arnaud,

Bibiana Martín Talavera, Silvina Sara Dongarrá, Gustavo Varela Pensado

Técnico de Investigación Technical Assistance: Juliana de la RosaCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Dr. Sergei Borksenious (Academia Rusa de Ciencias.

Rusia), D. Guillermo Cobas Pupo (Universidad de Oriente. Cuba), Dª. Clara Hink (Universidad de Viena. Austria), D. Dietmar Knoll (Universidad de Leipzig. Alemania), Dra. Martine Nguyen-Disteche (Universidad de Lieja. Bélgica), D. Mohamed Terrak(Universidad de Lieja. Bélgica)


El interés de nuestro grupo es el análisis molecular de tres importantes procesos

celulares en bacterias, como son la septación durante la división celular, la recuperación

de productos del metabolismo del peptidoglicano (reciclaje) y la inducción de la expre-

sión de β-lactamasas. Estos tres procesos han mostrado estar interconectados y regula-

dos por los productos intermedios en la ruta de biosíntesis y remodelación del pepti-

doglicano. Una gran parte de los enzimas implicados en estos procesos se encuentran

agrupados en un cluster denominado dcw (division and cell wall), donde se incluyen,

entre otros, los genes mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3) y ftsW. Una parte de nuestro tra-

bajo se ha centrado en el estudio de la regulación de la expresión de estos genes del clus-

ter y en la determinación funcional de MraW. La previsión de futuro es la extensión de

estos estudios en estirpes patógenas en humanos y de interés medioambiental, tales


298

como Aeromonas, Shigella, Pseudomonas y Mycoplasma, con vistas a ser utilizados

como dianas para la búsqueda y desarrollo de nuevos antimicrobianos

El peptidoglicano septal se sintetiza por la proteína PBP3, que aporta la actividad

transpeptidasa (crosslinking) asociada a otra proteína, posiblemente PBP1B, que apor-

ta la actividad transglicosilasa (elongación de cadena). Se requiere para ello el aporte

del substrato específico (lípidoII-tripéptido) anclado a la membrana, que es transporta-

do por la proteína de membrana interna FtsW. Nuestro grupo ha trabajado en los últi-

mos diez años en esta caracterización molecular y funcional de las dos primeras proteí-

nas (PBP3 y PBP1B) y en los últimos dos años en FtsW.

La estructura formada en el periplasma está en continua remodelación, produ-

ciendo, por la acción de DD-endopeptidasas, amidasas, transglicosilasas líticas y DD-

carboxipeptidasas, productos (muropéptidos) que se reciclan hasta el interior celular y

son reutilizados como precursores de nueva síntesis. La alteración del equilibrio entre

síntesis y recuperación puede producirse por causas variadas, entre las que se incluye

la inhibición de los enzimas responsables del mantenimiento del mismo por los anti-

bióticos β-lactámicos, y conduce a cambios cuantitativos en la composición de

muropéptidos. Este proceso de reciclaje ha sido utilizado por la célula como transmisor

de señal para indicar el estado celular del peptidoglicano y servir como inductor de la

expresión de β-lactamasas (los enzimas que degradan los antibióticos β-lactámicos).

Nuestro grupo ha estudiado la implicación de algunos genes del cluster dcw (ftsA, ftsQ

y ftsZ) en el proceso de inducción. Además hemos caracterizado nuevas β-lactamasas

cromosómicas.

Los logros esenciales en los dos últimos años han sido: 1.- Definición precisa de los

genes del cluster por comparación de secuencias con H. influenzae, B. subtilis y M. genitalium.

2.- Caracterización de la regiones promotoras en la región 5� del cluster dcw. 3.- Identificación

de secuencias reguladoras e implicación del promotor Pmra en la expresión de todo el clus-

ter. 3.- Demostración de mraW y mraR como genes esenciales en E. coli. 4.-Caracterización

del substrato metilado por la actividad metiltransferasa de MraW. 5.- Topología de FtsW.

Research Summary

Our main interest is the analysis at molecular level of three important cellular

processes in bacteria, i.e. septation during cell division, recycling of products from the

peptidoglycan metabolism and the induction of the expression of β-lactamases. These

three processes have been shown to be interconnected and regulated by the interme-

diate products (the precursors) of the biosynthetic pathway and the muropeptides of

the maturation of peptidoglycan. Most of the gene coding for the enzymes involved on

these processes are grouped in a so called dcw cluster (division and cell wall), that

include, among others, the genes mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3) y ftsW. A big part of

our recent work has been focused in the study of the regulation of the expression of

these genes and the functional characterization of MraW. Our future aim is to extend

these type of studies to pathogenic and environmental strains, as Aeromonas, Shigella,

Pseudomonas y Mycoplasma. These studies must allow the search and development of

new antimicrobial agents based on those target proteins.

Septal peptidoglycan is synthesized by the penicillin-binding protein PBP3. This

protein holds the transpeptidase activity (crosslinking) in the C-terminal domain, and

associates with another protein, probably PBP1B, that supplies the transglycosylase

activity (chain elongation). The specific substrate, used as acceptor for the former reac-

tion (lipidII-tripeptide), anchored to the inner membrane is supplied by the membrane

protein FtsW. Our group has been working during the last ten years on the functional

and molecular characterization of the two first proteins (PBP3 and PBP1B), and in the

last two years on FtsW.

The structure that forms the saculus in the periplasm is continuously remodeling,

and the action of the hydrolytic enzymes, DD-endopeptidases, amidases, lytic-trangly-

cosylases and DD-carboxypeptidases, produces a number of products (muropeptides),

that are recycled into the cytoplasm and reused as precursor of the biosynthetic path-

way. The alteration of the equilibrium between synthesis and recycling can be produ-

ced by different causes; among them the inhibition, by the β-lactam antibiotics, of the

enzymes involved in the maintenance of this equilibrium , and produce quantitative

changes in the muropeptide composition. The recycling process has been used by the

cell as a signal transducer that shows the actual state of the peptidoglycan and induces

299

300

the expression of β-lactamases (the enzymes that degrade β-lactam antibiotics). Our

group has been studying the role of some genes of the dcw cluster (ftsA, ftsQ y ftsZ) in

the induction process. Also, we have characterized new chromosomal β-lactamases.

Our main achievements in the last two years were: 1.- The precise definition of the

boundaries of the dcw cluster by homology sequence comparison of H. influenzae, B.

subtilis y M. genitalium. 2.- Characterization of the promoter regions in the 5� end of the

dcw cluster. 3.-Identification of the regulatory sequences involved and the role of the

Pmra promoter on the expression of the whole cluster. 3.- Confirmation of the role of

mraW and mraR as essential genes in cell division in Escherichia coli. 4.-

Characterization of one of the substrate on the membrane for the methyltransferase

activity of MraW. 5.- Membrane topology of FtsW.


� Vicente, M., Gómez, M.J. and Ayala, J.A. Regulation of transcription of cell divi-

sion genes in the Escherichia coli dcw cluster. Cellular and Molecular Life

Sciences 54(4), 299-382 (1998).

� Mengin-Lecreulx, D., Ayala, J.A., Bouhss, M., van Heijenoort, J., Parquet, C. and

Hara, H. Contribution of the Pmra promoter to the expression of genes in the

Escherichia coli mra cluster of cell envelope biosynthesis and cell division genes.

J. Bacteriol. 180(17), 4406-4412 (1998).

� Cano, D.A., Mouslin, C., Ayala, J.A., Garcia-del Portillo, F. and Casadesús, J. Cell

division inhibition in Salmonella typhimurium histidine-constitutive strains: an

ftsI-like defect in the presence of wild-type penicillin-binding protein 3 levels. J.

Bacteriol. 180(19), 5231-5234 (1998).

301

BIOTECNOLOGÍA Y GENÉTICA DE BACTERIAS TERMOFILAS EXTREMAS BIOTECHNOLOGY AND GENETICS OF EXTREME THERMOPHILIC BACTERIA

Jefe de Línea / Group Leader: José BerenguerBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Myriam de Grado, Alicia HurtadoBecarios Predoctorales Graduate Students: Ana Arraztio, Pablo Castán, Renata Moreno, Sandra

Ramírez, Cristina Vallés


Los principales objetivos de nuestro grupo de investigación son: 1) el estudio de

los mecanismos de regulación de la síntesis del principal componente proteico de la

envoltura celular de bacterias termófilas del género Thermus; 2) el desarrollo de herra-

mientas para la manipulación genética de estos microorganismos con vistas a su utili-

zación como factorías de síntesis de enzimas termoestables; y 3) el clonaje y caracteri-

zación de enzimas termófilas de potencial aplicación en Biotecnología.

Para abordar estos objetivos empleamos habitualmente como modelo de labora-

torio las cepas T. thermophilus HB8 y HB27, debido a su elevada velocidad de creci-

miento y rendimiento celular y al hecho de presentar competencia natural.

En referencia al objetivo 1, nuestro grupo ha identificado dos mecanismos super-

puestos de control de la expresión del gen de la capa proteica regular (capa S) que rodea

a T. thermophilus HB8, uno basado en el empleo de dos factores de transcripción deno-

minados SlrA (represor transcripcional) y SlpM (activador), y otro traduccional que

implica la interacción de la propia proteína regulada con la región líder de su mRNA.

En la actualidad estamos profundizando en estos mecanismos de regulación a través

de: 1) la purificación de los factores de transcripción; 2) la construcción de mutantes en


las regiones reguladoras del promotor de la capa S; y 3) la identificación de los domi-

nios de SlpA implicados en la interacción con su mRNA.

Con respecto al objetivo 2, hemos caracterizado orígenes de replicación autónoma

de distintos aislados de Thermus spp. empleándolos para la construcción de plásmidos

bifuncionales E. coli-Thermus. Nuestro objetivo inmediato es el desarrollo de plásmidos

para la expresión controlada de proteínas en Thermus spp, con el doble objetivo de: 1)

sobreproducir enzimas termoestables complejas que no pueden obtenerse en forma

activa en E. coli y, 2) aplicarlos a la obtención de enzimas más termoestables mediante

selección funcional a temperaturas crecientes.

En relación con el objetivo 3, nuestro grupo ha clonado y caracterizado varias

enzimas de T. thermophilus durante los últimos años. En particular, se ha caracterizado

una actividad nitrato reductasa respiratoria presente únicamente en T. thermophilus

HB8, cuyos genes codificantes se localizan en un plásmido conjugativo integrado en su

cromosoma, que, adicionalmente, le permite movilizar su contenido genético a otras

cepas. A corto plazo, pretendemos caracterizar en detalle esta actividad y sus genes

codificantes, así como sobreexpresar una forma soluble de la enzima para su aplicación

en kits de detección de nitrato. Finalmente, a partir de diferentes cepas de Thermus spp

hemos clonado enzimas de aplicación en técnicas de Biología Molecular, y pretendemos

obtener otras que, añadidas como aditivos, mejoren aspectos específicos de las reaccio-

nes de amplificación de DNA.

Research Summary

The main objectives of our group are: 1) the study of the regulatory mechanisms

that control the expression of the main proteinaceous component from the cell envelo-

pe of thermophilic bacteria belonging to the genus Thermus; 2) the development of

genetic tools for the manipulation of these bacteria in order to use them as cell factories

for the synthesis of thermophilic enzymes; and 3) the cloning and characterization of

thermophilic enzymes of potential use in Biotechnology. As laboratory models the

strains T. thermophilus HB8 and HB27 are rootinely used because of their high growth

rate, cell yield and natural competence.

302

303

In relation to objective 1, we have identified two overlapping mechanisms con-

trolling the expression of the regular protein layer (S-layer) that surrounds the cells of

T. thermophilus HB8, one of them based on the use of two transcription factors named

SlrA (repressor), and SlpM (activator), and a second one that implies the interaction of

the regulated protein SlpA with the leader region of its own mRNA. At present, we are

analyzing in deep these regulatory mechanisms through: 1) the purification of the trans-

cription factors; 2) the construction of mutants defective in the regulatory regions of the

S-layer gene promoter; and 3) the identification of the S-layer domains implicated in the

interaction with its own mRNA.

Concerning objective 2, we have characterized two autonomous replicative ori-

gins from different isolates of Thermus spp., using them for the construction of Thermus-

E.coli bifunctional plasmids. Our immediate objective is the development of new plas-

mid for the controlled expression of proteins in Thermus spp, with the double purpose

of: 1) to overproduce complex thermophilic enzymes which can not be obtained in E.

coli in an active form, and 2) To use them for the isolation of more thermostable enzy-

mes through functional selection at increasing temperatures.

With respect to objective 3, our group has cloned and characterized several enzy-

mes from T. thermophilus during the last years. In particular, we have characterized a

respiratory nitrate reductase activity which is present only in T. thermophilus HB8.

Interestingly, their encoding genes are localized within a conjugative plasmid integra-

ted in its chromosome that can mobilize also the entire chromosome to other strains. In

the near future, we want to characterize in detail this activity and its encoding genes, in

addition to overproduce a soluble form of the enzyme for its use in nitrate detection

kits. Finally, we have cloned and expressed enzymes of direct application in Molecular

Biology from different strains of Thermus spp, and we plan to obtain other proteins that,

as additives, will improve specific properties of DNA amplification reactions.

304


� Badet-Denisot, M.A., Fernández-Herrero, L.A., Berenguer, J., Ooi, T. and Badet, B.

Characterization of L-Glutamine:D-Fructose-6P Amidotransferase from the

Extreme Thermophile Thermus thermophilus HB8. Archives of Biochemistry andBiophysics 337, 129-136 (1997).

� Fernández-Herrero, L.A., Olabarría, G. and Berenguer, J. Surface proteins and a

novel transcription factor regulate the expression of the S-layer gene in Thermusthermophilus HB8. Molecular Microbiology 24, 61-72 (1997).

� Fernández-Herrero, L.A., Olabarría, G. and Berenguer, J. The S-layer of Thermusthermophilus HB8: structure and genetic regulation. In H. Bahl et al. �Molecular

Biology of S-layer. FEMS Microbiology Reviews 20, 47-98 (1997).

� Ramírez-Arcos, S., Fernández-Herrero, L.A. and Berenguer, J. A nitrate reductase

is responsible for the anaerobic growth of Thermus thermophilus HB8.

Biochimica et Biophysica Acta 1396, 215-227 (1998).

� Ramírez-Arcos, S, Fernández-Herrero, L.A., Marín, I. and Berenguer, J. Anaerobic

growth, a property horizontally transferred by an Hfr-like mechanism among

extreme thermophiles. Journal of Bacteriology 180, 3137-3143 (1998).

� De Grado, M., Lasa, I. and Berenguer, J.A minimun replicative origin for Thermusspp. FEMS Microbiol. Letters 165, 51-57 (1998).


Sandra Ramírez Arcos: �Caracterización y transferencia horizontal de una nitrato

reductasa de Thermus thermophilus HB8�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997.

Calificación: Apto cum laude por unanimidad.

Ana Arraztio García: �Estudio de la termoestabilización mediante construcción de pro-

teínas híbridas y técnicas de evolución molecular�. Universidad Autónoma de Madrid.

1998. Calificación: Apto cum laude por unanimidad.

305

Patentes / Patents

Ramírez Arcos, S., Fernández-Herrero, L.A., de Grado Sanz, M. y Berenguer, J.:

Nitrato reductasa termoestable para la detección de nitratos en alimentos. N. de paten-

te: P9701003 ( BOPI del 16/11/98).

306

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ESPECÍFICA DETEJIDO REGULATION OF TISSUE-SPECIFIC GENE EXPRESSION

Jefe de Línea / Group Leader: José Luis Castrillo DiezPersonal Científico Scientific Personnel: Victoria Vila del CastilloBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Oscar Jiménez Mateo, Miguel de la Hoya Mantecón Becarios Predoctorales Graduate Students: Olga Bassy Alvarez, Martha Y. Díaz Gallardo, Job

García Liévana, Marina Romero Prado, Angelina Rodriguez Torres

Técnico de Investigación Technical Assistance: Ana Isabel Cabornero

Resumen de Investigacion

El objetivo general de nuestra línea de investigación es el estudio a nivel mole-

cular de la expresión génica específica de tejido en organismos eucarióticos. Nuestro

sistema modelo lo constituye el gen humano HGH-N que se transcribe específicamente

en la hipófisis y que se localiza en una región de 100 Kb del cromosoma 17 dentro del

locus �HGH-HPL�. A este locus pertenecen genes que comparten una gran homología

de secuencia: HGH-V (variante placentaria de la hormona GH), HPL-3 y HPL-4 (genes

que codifican para la hormona lactógeno placentaria). En los últimos años, hemos estu-

diado cómo tiene lugar la regulación de la transcripción del gen de la hormona de cre-

cimiento humana (HGH-N) en la hipófisis y del gen de la hormona lactógeno placen-

taria (HPL-3). Frutos de esta investigación han sido la purificación y clonaje de los fac-

tores de transcripción específicos de tejido (GHF-1/PIT-1 y PLA-1), proteínas nuclea-

res con un homeodominio, y pertenecientes a la familia de factores de transcripción

denominadas �POU�. En la actualidad, se está estudiando su interacción con los diver-

sos promotores y enhancers que hemos subclonado a partir de cósmidos que engloban

más de 100Kb del locus �HGH-HPL� completo.


Los objetivos de nuestra línea de investigación son:

1) Purificación y clonaje de nuevos factores de transcripción específicos de hipó-

fisis y placenta.

2) El estudio de los mecanismos moleculares responsables de la expresión especí-

fica en tejido de los genes que constituyen el locus HGH-HPL, así como los genes del

locus HCGß-HLHß (que también presentan una estricta restricción de expresión

específica de tejido).

Las respuestas que se obtengan con esta línea de investigación nos permitirá

conocer cómo la estructura de la cromatina y los factores de transcripción asociados,

son capaces de regular la expresión de regiones génicas de 100 Kb de DNA, que con-

tiene genes que se transcriben con una estricta especificidad de tejido y al mismo tiem-

po presentan una regulación muy flexible frente a estímulos extracelulares.

Research Summary

The overall goal of this project is to study at molecular level the tissue-specific

gene expression in eukaryotic organisms. Our working model is the human growth

hormone gene (HGH-N) specifically transcribed in the anterior. It is mapped in a 100

Kb region of chromosome 17: the �HGH-HPL� locus. This is a cluster of closely related

genes specialized in the expression of related hormones in two different tissues: HGH-

V (placental variant of GH hormone gene), HPL-3 and HPL-4 (placental lactogen

genes). We have purified and cloned tissue-specific transcription factors (GHF-1/PIT-1

and PLA-1), proteins with an homeodomain, and members of transcription factors fam-

ily called �POU�. We are studying the interactions of those transcription factors with

the promoters and enhancers subcloned from cosmids of the whole �HGH-HPL� locus.

The goals of this research project are:

Molecular cloning of new specific transcription factors in pituitary and placenta.

The study of molecular mechanisms responsible of tissue-specific transcription of genes

in the HGH-HPL locus, and the HCGß-HLHß locus (with a specific tissue-specific

restriction).

307

308

The answers obtained with this research project will shows us how the chromatin

structure and transcription factors associated, will regulate the gene expression of a 100

Kb DNA region with a strict tissue-specific expression and, at the same time, with a

flexible control from extracellular stimuli.


� Martínez-Barberá, J.P., Vila, V., Valdivia, M.M. and Castrillo, J.L. Cloning of

Sparus aurata GHF-1/Pit-1 pituitary transcription factor. Gene 185(1), 87-93

(1997).

� Castrillo, J.L. and Vila, V. Regulación de la transcripción del gen de la hormona

de crecimiento. En �Fundamentos Moleculares del Sistema Endocrino�. E.

Blázquez, ed. (Madrid: Ed.Síntesis) (1997).

� Rajas, F., Delhase, M., de la Hoya, M., Verdood, P., Castrillo, J.L. and Hooghe

Peters, E.L. Nuclear factor-1 regulates the distal silencer of the human

PIT1/GHF1 gene. Biochem. J. 333(1), 77-84 (1998).

� de la Hoya, M., Vila, V., Jiménez, O. and Castrillo, J.L. The anterior pituitary deve-

lopment and Pit-1/GHF-1 transcription factor. Cell. Molec. L.S. (54), 1059-1066 (1998).

� Sánchez-Pacheco, A., Peña, P., Palomino, T., Güell, A., Castrillo, J.L. and Aranda,

A. The transcription factor GHF-1/Pit-1, but not the splice variant GHF-2, coope-

rates with thyroid hormone and retinoic acid receptors in rat growth hormone

gene expression. FEBS Lett. 422(1), 103-107 (1998).

� Castrillo, J.L. and Barrera-Saldaña, H.A. El gen hGH-N y su regulación hipofisa-

ria. Ciencia UANL 1(4), 333-338 (1998).

309


Oscar Jiménez Mateo: �Caracterización de un nuevo factor POU en placenta

humana�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Miguel de la Hoya Mantecón: �Caracterización del promotor del gen

GHF1/PIT1 humano�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:

Apto cum laude.

310

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR REGIONESNO CODIFICANTES DE mRNA EUCARIÓTICOS REGULATION OF GENE EXPRESSION IN EUKARYOTESTHROUGH mRNA NON-CODING REGIONS

Jefe de Línea / Group Leader: Encarnación Martínez-SalasPersonal Científico Scientific Staff: Ricardo RamosBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Nieves IbarrolaBecario Predoctoral Graduate Student: Sonia López de Quinto


Algunos mRNAs que son traducidos en situaciones de inhibición de la traducción

dependiente de cap, contienen en su región 5´ no traducida elementos que dirigen la

iniciación interna de la traducción (IRES). Nuestro objetivo es entender el mecanismo

de iniciación interna de la traducción en mRNAs eucarióticos. Usando como modelo

vectores bicistrónicos portadores de regiones no codificantes de RNAs de picornavirus

y flavivirus, hemos identificado motivos esenciales para la actividad IRES que poseen

la secuencia consenso GNRA, localizados en el bucle de una horquilla muy estable,

posiblemente implicados en la estructura terciaria del IRES de picornavirus. La rele-

vancia de este resultado reside en el hecho de estar filogenéticamente conservados en

todos los IRES de picornavirus y en que un bucle con el motivo GNRA determina el

replegamiento de la molécula de ribozimas. Por el contrario, la secuencia del motivo

RAAA no es crítica siempre que el tamaño del bucle y la organización de los bucles pró-

ximos no se altere. Estos resultados han sido contrastados analizando la capacidad inhi-

bidora de moléculas antisentido sobre la infectividad del RNA viral.

La eficiencia del IRES de distintos genotipos del virus de la hepatitis C (VHC) es

5 veces inferior al IRES de aftovirus, siendo el más eficiente el del genotipo 2. A pesar


de las variaciones de nucleótido entre aislados de distintos genotipos, los IRES de VHC

muestran una eficiencia que oscila 2 veces dependiendo de la línea celular transfectada

(Arch. Virol. 1999, 144, 1-15). Este resultado concuerda con la observación de que la

mayoría de las substituciones mantienen la estructura secundaria, indicando que la

estructura del IRES de VHC es un factor determinante de su actividad. En el futuro pre-

tendemos estudiar interacciones moleculares entre dominios estructurales del IRES e

identificar factores transactivadores de la actividad IRES.

Paralelamente hemos estudiado el mecanismo de selección del AUG iniciador de

la traducción dependiente de IRES, cuya relevancia se basa en el uso de IRES en vecto-

res de expresión, cada vez más frecuente. Mientras que en el RNA de aftovirus es pro-

bable que exista un segundo sitio de entrada del ribosoma (Virology 1999, 255, 324-336),

en mRNAs desprovistos de la secuencia viral presente entre los dos AUGs iniciadores,

el codon iniciador se selecciona después de un rastreo del ribosoma hasta las cercanías

del mismo. El reconocimiento de este AUG depende de la estructura del tramo de RNA

presente entre el extremo 3´ del IRES y el AUG, de la ausencia de codones de iniciación

entre ambas posiciones, y del contexto que rodea al AUG iniciador.

Research Summary

Certain eukaryotic mRNAs which are translated under cap-dependent shut-off

conditions are characterized by the presence of a long 5´ untranslated region involved

in internal initiation of translation, known as IRES. Our main objective is to understand

how these cis-acting elements promote internal initiation. Using bicistronic expression

vectors carrying the picornavirus or flavivirus 5´ untranslated region between two cis-

trons as model systems, we have shown that GNRA motifs located in conserved loops

of stable hairpins are essential for IRES activity, constituting candidates to mediate the

tertiary folding of the IRES structure. This is based on i) the phylogenetic conservation

of this motif among all picornavirus IRES secondary structures and ii) on the fact that a

GNRA motif mediates self-folding in ribozymes. In contrast, the sequence of the RAAA

conserved motif is not essential as far as the loop size and the structure of the neighbour

stem-loops is not modified. These conclusions have been tested using antisense mole-

cules to inhibit the infectious capacity of viral RNA.

311

IRES efficiency of different genotypes from hepatitis C virus (HCV) is 5-fold

lower than that of aphthovirus, that of genotype 2 being the most efficient IRES. In spite

of the nucleotide variation between genotypes, the HCV IRES efficiency varies 2-fold

depending on the transfected cell line (Arch. Virol. 1999, 144, 1-15). This is consistent

with the observation that most of the substitutions tend to maintain the secondary

structure, suggesting that the RNA structure is a determinant factor of IRES activity.

Our future objectives are the identification of molecular interaction between structural

domains of the IRES and the identification of its transacting factors.

In parallel we have studied the mechanism of selection of the initiator AUG in

IRES-dependent translation initiation, which is relevant to the increasing use of IRES

elements in expression vectors. Whereas the existance of a second entry site in the apht-

hovirus RNA is likely (Virology, 1999, 255, 324-336), mRNAs which do not contain the

viral RNA sequence present between both initiators codons seems to use a scanning

mechanism to select the initiator codon after ribosome entry. Recognition of this AUG

depends on its sequence context, the structure of the RNA stretch located between the

3´ end of the IRES and the initiator codon, and the absence of other initiator codons in

this stretch.


� López de Quinto, S. and Martínez-Salas, E. Conserved structural motifs located in

distal loops of the aphthovirus internal ribosome entry site domain 3 are required

for internal initiation of translation. J. Virol. 71, 4171-4175 (1997).

� López de Quinto, S. and Martínez-Salas, E. Parameters influencing translational

efficiency in aphthovirus IRES-based bicistronic expression vectors. Gene 217, 51-

56 (1998).

� López de Quinto, S., Ibarrola, N., López-Labrador, F-X., Sánchez-Tapias, J-M.,

Rodés, J., Martínez-Salas, E., y Sáiz, J-C. La actividad in vivo del IRES del virus de

la hepatitis C (VHC) varía entre genotipos, pero es independiente de la respuesta

al Interferon�. Gastroenterol. y Hepatol. 21, Supl. 2, p. 43 (1998).

312

313


Paloma Bigeriego: �Inhibición de la multiplicación del virus de la fiebre aftosa media-

da por ácidos nucleicos� (Tesis codirigida con F. Sobrino). Facultad de Veterinaria,

Universidad de Extremadura. 1998. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Patente / Patent

E. Martínez-Salas y S. López de Quinto: �Acidos nucleicos reguladores de la expre-

sión génica�. Nº 9701449. CSIC (1997).

Documents

Regulación de la Expresión GØnica Regulation of Gene ... · de SIDA sufren LV. LV es ahora la infección oportunista de origen parasitario mÆs comœn entre las personas VIH-positivas