REIDENTIFICATION OF BACTERIAL STRAINS FROM PROBIOTIC

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, 17. srpnja 2015. Martina Marijanović

586/MB

REIDENTIFIKACIJA

BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ

PROBIOTIČKIH

NUTRACEUTIČKIH PROIZVODA

Rad je izrađen u Laboratoriju za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura, na

Zavodu za biokemijsko inženjerstvo, Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu, pod mentorstvom dr. sc. Jasne Novak, izv. prof.

Posebno se zahvaljujem svojoj mentorici, dr. sc. Jasni Novak, izv. prof. na stručnom vodstvu,

velikoj motivaciji, susretljivosti, korisnim savjetima i nesebičnoj pomoći pri izradi

eksperimentalnog dijela i pisanju diplomskog rada.

Zahvaljujem se dr. sc. Jagodi Šušković, red. prof. i dr. sc. Blaženki Kos, red. prof. na divnom

odnosu prema studentima i trudu koji su uložile da nam zanimljivim prezentacijama i seminarima

približe nastavne sadržaje.

Zahvaljujem se i dr. sc. Andreji Leboš Pavunc, višoj asistentici, na ugodnoj atmosferi i pomoći

prilikom izrade eksperimentalnog rada.

Veliko hvala dr. sc. Kseniji Uroić, višoj asistentici, na svim savjetima, motivaciji, velikoj pomoći i

divnoj atmosferi prilikom izrade eksperimentalnog rada.

Zahvaljujem svojoj obitelji i Miroslavu na bezuvjetnoj ljubavi i podršci tijekom studiranja.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICADiplomski rad

Sveučilište u ZagrebuPrehrambeno – biotehnološki fakultetZavod za biokemijsko inženjerstvoLaboratorij za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura

Znanstveno područje: Biotehničke znanostiZnanstveno polje: Biotehnologija

REIDENTIFIKACIJA BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH, NUTRACEUTIČKIH PROIZVODA

Martina Marijanović, 586/MB

Sažetak: Na tržištu su značajno prisutni probiotički nutraceutički proizvodi, koji se primjenjuju za terapiju poremećaja gastrointestinalnog trakta (GIT) odraslih, djece i novorođenčadi. Stoga je neophodna precizna identifikacija te definiranje funkcionalnih učinaka prisutnih bakterijskih sojeva. Cilj ovog rada je reidentifikacija bakterijskih kultura iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda, te karakterizacija funkcionalnih svojstava važnih za iskazivanje probiotičkog djelovanja u GIT-u. Izolirani sojevi su gram-pozitivne, nesporogene i katalaza-negativne bakterije, koje uspješno rastu pri 37ºC u anaerobim uvjetima te tijekom uzgoja u selektivnim tekućim podlogama: MRS za laktobacile, TOS-propionat za bifidobakterije, a značajno snižavaju pH vrijednost podloge uslijed sinteze visokih koncentracije mliječne kiseline. Pomoću API 50 CHL testa identificirani su sojevi Lactobacillus vrste, a BBL CRYSTAL™ GP sustavom za identifikaciju sojevi Bifidobacterium vrste. Na temelju proteinskih profila dobivenih SDS-PAGE analizom ukupnih staničnih i površinskih proteína, bakterijski sojevi su svrstani izradom dendrograma pomoću Gel Compare II programskog paketa u dva roda Lactobacillus i Bifidobacterium. Ispitana je i otpornost pojedinih sojeva in vitro na uvjete GIT određivanjem preživljavanja u simuliranom želučanom soku i simuliranom soku tankog crijeva, te u prisutnosti 0,3% i 0,6% žučnih soli. Smrtnost probiotičkih sojeva nakon 6 sati je iznosila od 0,94-3,16 log (CFU/ml), što ukazuje na uspješno preživljavanje u simuliranim uvjetima GIT-a. Probiotičke bakterije su različito otporne na testirane koncentracije žučnih soli. Nakon preživljavanja nepovoljnih uvjeta u GIT-u, iskazivanju funkcionalnih učinaka probiotičkih sojeva može doprinjeti adhezija na intestinalnu sluznicu, stoga je ispitana i njihova sposobnost adhezije na mucin in vitro. Pojedini sojevi, primjerice Lactobacillus reuteri DSM 17938, iskazuju mogućnost vezanja na mucin. Na temelju dobivenih rezultata može se zaključiti da ispitane probiotičke bakterije uspješno preživljavaju nepovoljne uvjete GIT-a domaćina, što je jedan od glavnih kriterija za izbor probiotika kao bioterapeutika.

Ključne riječi: Bifidobacterium, Lactobacillus, funkcionalnost, probiotici, reidentifikacija

Rad sadrži: 45 stranica, 9 slika, 6 tablica, 45 literaturnih navoda

Jezik izvornika: hrvatski

Rad je u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjižnici Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb

Mentor: dr.sc. Jasna Novak, izv. profPomoć pri izradi: dr. sc. Ksenija Uroić, viši asistent

Stručno povjerenstvo za ocjenu i obranu:1. Dr. sc. Jagoda Šušković, red. prof.2. Dr. sc. Jasna Novak, izv. prof.3. Dr. sc. Jasna Mrvčić, izv. prof.4. Dr. sc. Jadranka Frece, izv. prof.

Datum obrane: 17. srpnja 2015.

BASIC DOCUMENTATION CARDGraduate Thesis

University of ZagrebFaculty of Food Technology and BiotechnologyDepartment of Biochemical EngineeringLaboratory of Antibiotic, Enzyme, Probioticand Starter Culture Technologies

Scientific area: Biotechnical SciencesScientific field: Biotechnology

REIDENTIFICATION OF BACTERIAL STRAINS FROM PROBIOTIC NUTRACEUTICAL PRODUCTS

Martina Marijanović, 586/MB

Abstract: Probiotic nutraceutical products, which are used in the treatment of gastrointestinal tract (GIT) disorders in adults, children and infants, are substantially present on the market. Therefore, precise identification and defining of functional effects of bacterial strains is essential. The aim of this thesis is reidentification of bacterial cultures from probiotic nutraceutical products, and characterization of functional properties important for expression of probiotic activity in the GIT. The isolated strains are gram-positive, non-sporogenous and catalase-negative bacteria, which grow successfully at 37˚C in anaerobic conditions in selective nutrient media: MRS for lactobacilli, TOS propionate for bifidobacteria, and significantly lower pH due to the synthesis of high concentrations of lactic acid. Strains of Lactobacillus species have been identified using the API 50 CHL test and strains of Bifidobacterium species using BBL CRYSTALTM GP identification system. Based on whole cell and surface protein profiles obtained by SDS-PAGE analysis, bacterial strains are classified in two genera by creating dendrograms using Gel Compare II software. In vitro resistance to GIT conditions of individual strains has also been tested by assessment of survival in simulated gastric and simulated intestinal juices and by tolerance to 0,3% and 0,6% bile salts. Mortality of probiotic strains after 6 hour incubation ranged between 0,94-3,16 log (CFU/ml), indicating successful survival in simulated GIT conditions. Probiotic bacteria are differently resistant to the tested concentrations of bile salts. Besides survival of stress conditions in GIT, adhesion to intestinal mucosa may contribute to the expression of the functional effects of probiotic strains, and thus ability of strains to adhere to mucin in vitro has also been tested. Based on the results, it can be concluded that tested probiotic bacteria successfully survive adverse conditions of the host's GIT, which is one of the main criteria for the selection of probiotics as biotherapeutics.

Keywords: Bifidobacterium, Lactobacillus, functionality, probiotics, reidentification

Thesis contains: 45 pages, 9 figures, 6 tables, 45 references

Original in: Croatian

Graduate Thesis in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb

Mentor: PhD. Jasna Beganović, Associate ProfessorTechnical support and assistance: PhD. Ksenija Uroić, Senior Assistant

Reviewers: 1. PhD. Jagoda Šušković, Full professor2. PhD. Jasna Novak, Associate professor3. PhD. Jasna Mrvčić, Associate professor4. PhD. Jadranka Frece, Associate professor

Thesis defended: 17 July 2015

SADRŽAJ

1. UVOD...........................................................................................................................................1

2. TEORIJSKI DIO...........................................................................................................................2

2.1. RAZVOJ PROBIOTIČKOG KONCEPTA................................................................................2

2.2. SUVREMENA PRIMJENA PROBIOTIČKIH BAKTERIJA...................................................4

2.3. MEHANIZMI PROBIOTIČKOG DJELOVANJA....................................................................5

2.3.1. Karakterizacija probiotičkih mehanizama primjenom genomskih alata...............................5

2.3.2. Preživljavanje i adhezija na GIT...........................................................................................6

2.3.3. Kompetitivna ekskluzija i antimikrobna aktivnost................................................................8

2.3.4. Modulacija imunoodgovora probiotičkim djelovanjem........................................................9

3. EKSPERIMENTALNI DIO.......................................................................................................12

3.1. MATERIJALI...........................................................................................................................12

3.1.1. Radni mikroorganizmi.........................................................................................................12

3.1.2. Hranjive podloge.................................................................................................................12

3.1.3. Kemikalije...........................................................................................................................13

3.1.4. Aparatura i pribor................................................................................................................14

3.2. METODE RADA......................................................................................................................15

3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama..............................................................................15

3.2.2. Određivanje pH vrijednosti, stupnja kiselosti i postotka proizvedene mliječne kiseline....15

3.2.3. KOH metoda........................................................................................................................15

3.2.4. Katalaza test.........................................................................................................................16

3.2.5. Određivanje sporogenosti....................................................................................................16

3.2.6. API test za određivanje fermentacijskih profila šećera.......................................................16

3.2.7. Fenotipska identifikacija bakterijskih sojeva pomoću BBL CRYSTAL™ GP testa..........17

3.2.8. SDS-PAGE analiza..............................................................................................................18

3.2.8.1. SDS-PAGE analiza ukupnih staničnih proteina.........................................................18

3.2.8.2. SDS-PAGE površinskih proteina bakterijskih stanica................................................18

3.2.9. Određivanje tolerancije probiotičkih sojeva na žučne soli..................................................19

3.2.10. Preživljavanje probiotičkih bakterija u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta.19

3.2.10.1. Priprava simuliranoga želučanog soka i simuliranoga soka tankog crijeva..............19

3.2.10.2. Učinak simuliranog želučanog soka i soka tankoga crijeva na preživljavanje

probiotičkih bakterija...............................................................................................19

3.2.11. In vitro adhezija na protein mucin....................................................................................20

4. REZULTATI...............................................................................................................................21

4.1. KARAKTERIZACIJA BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH

NUTRACEUTIČKIH PROIZVODA........................................................................................21

4.2. EVALUACIJA OTPORNOSTI BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH

NUTRACEUTIČKIH PROIZVODA NA SIMULIRANE UVJETE

GASTROINTESTINALNOG TRAKTA..................................................................................27

5. RASPRAVA...............................................................................................................................34

5.1. KARAKTERIZACIJA BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ NUTRACEUTIČKIH

PROBIOTIČKIH PRIPRAVAKA.............................................................................................34

5.2. OTPORNOSTI BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH NUTRACEUTIČKIH

PROIZVODA NA SIMULIRANE UVJETE GASTROINTESTINALNOG TRAKTA..........36

6. ZAKLJUČCI...............................................................................................................................40

7. LITERATURA............................................................................................................................41

1. UVOD

Brojni mikroorganizmi prisutni u fermentiranoj hrani su okarakterizirani kao probiotičke

bakterije, koje različitim mehanizmima doprinose zdravlju domaćina. Unatoč tome, molekularni

mehanizmi koji su temelj probiotičkog djelovanja još se uvijek istražuju, te najnovije spoznaje

proizlaze iz rezultata istraživanja koja primjenjuju suvremene pristupe genomike utemeljene na

dostupnim sekvencama cijelog genoma mikroorganizma. Mnoštvo autohtonih (prirodno prisutnih)

komensalnih bakterijskih vrsta su dio mikrobiote gastrointestinalnog trakta (GIT), kao i nosa, usta i

vagine.

Već je dugo poznato da unošenje alohtonih (prolaznih) korisnih bakterija, prisutnih u

prehrambenim proizvodima ili različitim nutraceutičkim pripravcima, ima pozitivan utjecaj na

zdravlje i dobrobit domaćina zbog uspostavljanja komensalnih interakcija s imunološkim sustavom

domaćina i autohtonom mikrobiotom. Ti korisni mikroorganizmi nazivaju se se probioticima, a

prema definiciji Svjetske zdravstvene organizacije opisuju se kao “živi mikroorganizmi, koji

primijenjeni u adekvatnoj količini imaju povoljan učinak na zdravlje domaćina” (FAO/WHO,

2002). Upravo zbog pozitivnih učinaka na zdravlje čovjeka, liofilizirani probiotički pripravci koji

sadrže probiotičke bakterije su sve brojniji na tržištu te je zbog izbjegavanja komercijalizacije

neophodna precizna identifikacija i ispravno označavanje prisutnih bakterijskih sojeva.

Kako je najveći broj okarakteriziranih probiotičkih sojeva iz bakterijskih rodova

Lactobacillus i Bifidobacterium, većina probiotičkih bakterija prema deklaraciji sadrži sojeve ovih

vrsta. Stoga je cilj ovog diplomskog rada primjeniti fenotipske metode s ciljem reidentifikacije

prisutnih bakterijskih sojeva u probiotičkim nutraceutičkim proizvodima, kako bi se odabrao

učinkovit rutinski pristup za provjeru velikog broja bakterijskih sojeva. Bakterijski sojevi odabrani

za ova istraživanja pripadaju bakterijama iz roda Lactobacillus i Bifidobacterium te su prema

deklaraciji prisutni u probiotičkim nutraceutičkim proizvodima, koji su namijenjeni za profilaksu ili

terapiju različitih intestinalnih poremećaja kod odraslih ljudi, djece ili dojenčadi. Nadalje, cilj je bio

ispitati in vitro pojedina važna funkcionalna svojstva izoliranih bakterijskih sojeva, poput otpornosti

na uvjete GIT-a, adaptaciju na različite koncentracije žučne soli i adheziju na glikoprotein mucin,

što može utjecati na iskazivanje funkcionalnih učinaka u GIT-u domaćina.

1

2. TEORIJSKI DIO

2.1. RAZVOJ PROBIOTIČKOG KONCEPTA

Tijekom posljednja četiri desetljeća, provode se značajna istraživanja na području

probiotika, a posebno se istražuju mehanizmi probiotičkog djelovanja unutar domaćina (Johnson i

Klaenhammer, 2014). Ljudi tisućama godina unose mikroorganizme putem fermentirane hrane,

koji spriječavaju kvarenje namirnica te doprinose poboljšanju senzorskih karakteristika hrane.

Pretpostavlja se da su prve fermentacije hrane rezultat slučajnih kontaminacija u povoljnim

uvjetima koje su rezultirale nastajanjem proizvoda kiselog mlijeka poput kefira, lebena, kumisa,

jogurta i kiselog vrhnja, koji se i danas konzumiraju širom svijeta.

Kontinuiranim kiseljenjem mlijeka i korištenjem dijela fermentiranog proizvoda iz

prethodne šarže kao inokuluma u novoj fermentaciji, ljudi su tijekom vremena nenamjerno

pridonijeli domestikaciji određenih mikroorganizama u različitim hranidbenim okolišima (Douglas i

Klaenhammer, 2010). Fermentirani mliječni proizvodi su bili ne samo sigurni za korištenje, već su

korišteni i u terapijske svrhe (Shortt, 1999).

Krajem devetnaestog stoljeća, francuski biokemičar Louis Pasteur, došao je do značajnih

otkrića koja su dovela do većeg znanstvenog razumijevanja fermentacije (Slika 1). Proučavajući

fermentacije vina i piva, Pasteur je dokazao da reakcije fermentacije provode mikroorganizmi.

Osim toga, opovrgnuo je znanstvenu i kulturološku tezu da se mikroorganizmi pojavljuju spontano,

zaključujući da je riječ o biogenezi.

Slika 1. Otkrića koja su pridonijela funkcionalnoj karakterizaciji probiotičkih bakterija mliječne

kiseline (BMK) (preuzeto od Johnson i Klaenhammer, 2014).

2

Na temelju Pasteurovog istraživanja, ruski nobelovac E’lie Metchnikoff je na prijelazu u

dvadeseto stoljeće popularizirao probiotike. U svojoj knjizi “Produljenje života: Optimistične

studije” iz 1907., Metchnikoff je pretpostavio da je truljenje u crijevima povezano s kraćim

životnim vijekom. Dugoročnim proučavanjem mliječno-kisele fermentacije i unošenja

mikroorganizama putem hrane kod ljudi i životinja, Metchnikoff je postavio hipotezu prema kojoj

bi mikroorganizmi koji proizvode mliječnu kiselinu mogli sprječavati truljenje u GIT-u. To je

pretpostavio transformacijom “divlje populacije crijeva u kultiviranu populaciju… Patološki

simptomi bi mogli biti uklonjeni u starijoj dobi i… Po svoj vjerojatnosti, duljina života čovjeka bi

se mogla značajno povećati” (Metchnikoff, 1907). Njegovoj teoriji je doprinjela visoka učestalost

stogodišnjaka u bugarskoj regiji koja je poznata po konzumiranju kiselog mlijeka.

Istraživanja na L. bulgaricus su značajno utjecala na zdravstvenu zajednicu Europe u 20-om

stoljeću i uskoro je Pasteurov institut u Parizu počeo prodavati Lactobacillus pod nazivom “Le

Ferment” (Shortt, 1999). Unatoč obećavajućim zapažanjima Metchnikoffa i njegovih kolega na

samom začetku probiotičkog koncepta, nije bilo dovoljno znanstvenih dokaza za primjenu sigurnog

probiotičkog soja, a osobito o navodnim mehanizmima djelovanja. Leo Rettger i suradnici na

sveučilištu Yale, ustanovili su da L. bulgaricus ne može preživjeti prolazak kroz želudac koji je

nužan kako bi došlo do kolonizacije u tankom crijevu (Rettger i Cheplin, 1921). Ova studija je

dovela u pitanje sojeve koji su bili korišteni u originalnim istraživanjima koje je proveo Cohedy i

koji su i prodavani pod imenom “Le ferment”.

Lactobacillus acidophilus se uskoro pokazao boljim kandidatom za terapeutske primjene

zbog sposobnosti preživljavanja prolaska kroz želudac i učinka na promjene sastava crijevne

mikroflore u uvjetima suplementacije laktozom i dekstrinom (Rettger i Cheplin, 1921). To su prva

istraživanja na temelju kojih je započela terapeutska primjena L. acidophilus, ali koja su bila

značajno limitirana metodama i tehnologijama svog vremena. Sve do 1970-ih, kada su se provela

istraživanja enzima Lactobacillus laktat dehidrogenaze pomoću hibridizacije i DNA elektroforeze,

nije se moglo razlikovati L. acidophilus od ostalih komensalnih laktobacila poput Lactobacillus

gasseri. Stoga, još uvijek nije poznato jesu li u ovim istraživanjima bile primijenjene mješovite

kulture L. acidophilus, L. gasseri i drugih laktobacila, ili čista kultura L. acidophilus.

Nakon što je analizirao eksperimentalne dokaze o probiotičkim bakterijama, japanski

liječnik Minoru Shirota, proveo je izolaciju Lactobacillus soja za terapeutsku primjenu. Shirota je

1930. godine odabrao Lactobacillus vrste (sada poznate kao Lactobacillus casei Shirota) iz

ljudskog fecesa koje bi mogle preživjeti prolaz kroz GIT (Shrott, 1999). Iz te bakterijske kulture,

Shirota je komercijalizirao jedan od prvih fermentiranih mliječnih proizvoda, Yakult (Shorrt, 1999),

što je predstavljalo značajan napredak za industriju mliječnih proizvoda, te je i jedan od prvih

3

proizvoda koji je sadržavao točno određeni, kultivirani bakterijski soj. Yakult je i danas prisutan na

japanskom, korejskom, australskom i europskom tržištu.

Od tada, došlo je do masovne ekspanzije tržišta funkcionalne hrane, posebice fermentiranih

mliječnih proizvoda koji sadrže probiotičke bakterije. Nedavna analiza tržišta probiotika, pokazala

je godišnji rast od 7% tijekom 2012., a predviđanje zarade unutar idućih 5 godina iznosi 48 milijardi

dolara. Štoviše, primjena probiotika osim na tržištu funkcionalne hrane, sve je značajnije prisutna

na farmaceutskom tržištu. To povećanje tržišta proizlazi iz znanstvenih spoznaja i regulatornih

aspekata probiotičkih mehanizama, čiji se temeljni molekularni mehanizmi trebaju još detaljno

okarakterizirati.

2.2. SUVREMENA PRIMJENA PROBIOTIČKIH BAKTERIJA

Unatoč dugoj povijesti otkrića probiotika i njihove terapeutske primjene, tek je nedavno

došlo do kulminacije velikih kliničkih i eksperimentalnih dokaza o korištenju probiotičkih bakterija.

Značajan primjer je korištenje probiotika za liječenje funkcionalnih gastrointestinalnih poremećaja

(engl. FGID-functional gastrointestinal disorders). Za puno FGID, poput sindroma iritabilnog

crijeva (engl. IBS-irritable bowel syndrome), postoji samo nekoliko terapija zbog niske

učinkovitosti i ozbiljnih nuspojava. IBS je prilično učestali poremećaj GIT-a i smatra se da ga

uzrokuju promjene u gastrointestinalnom mikrobiomu (Porter i sur., 2011). Nedavno je napravljen

sistematičan pregled kliničkih intervencija kojima se različiti FGID mogu liječiti korištenjem

probiotika (Hungin i sur., 2013). Tom sistematičnom analizom ustanovljeno je da je djelovanje

probiotika specifično za svaki bakterijski soj.

Znanstveni dokazi jasno upućuju na učinkovitost liječenja probioticima, ali i na važnost

razumijevanja mehanizma djelovanja svakog pojedinog soja za bioterapijsku primjenu. Među

najčešće istraživanim vrstama probiotičkih bakterija su one iz rodova Lactobacillus i

Bifidobacterium.

Rod Lactobacillus čine različite vrste gram-pozitivnih, anaerobnih/mikroaerofilnih,

nesporulirajućih bakterija mliječne kiseline (BMK) niskog G+C sadržaja, koje pripadaju koljenu

Firmicutes (Šušković i sur., 2010). Ove bakterije fermentiraju šećer do mliječne kiseline, ili

mliječne kiseline s manjim količinama ugljičnog dioksida i etanola/octene kiseline. Laktobacili su

prisutni u različitim ekološkim nišama poput GIT-a ljudi i životinja, kao i u biljnom i mliječnom

hranidbenom okolišu. Iako Lactobacillus vrste nisu dominantni članovi mikrobiote debelog crijeva,

4

većinu te mikrobiote čine probiotičke bakterije zbog njihove sposobnosti preživljavanja u manje

raznolikim uvjetima tankog crijeva.

Bakterije iz roda Bifidobacterium, koji pripada koljenu Actinobacteria, su gram-pozitivne,

nepokretne, anaerobne bakterije, male genomske i filogenetičke raznolikosti (Ventura i sur., 2006).

Prvobitno su izolirane iz fecesa dojenčadi hranjenih majčinim mlijekom i od tada je klasificirano

približno 50 vrsta izoliranih iz GIT-a ljudi, životinja i ineskata (Velez i sur., 2007). Bifidobakterije

su među najpoznatijim komensalnim bakterijama u debelom crijevu ljudi i dominiraju u

mikrobiomu dojenčadi hranjenih majčinim mlijekom (Favier i sur., 2002).

Nakon sekvencioniranja prvog bakterijskog genoma Haemophilus influenzae,

eksponencijalan napredak u metodama sekvencioniranja i razvoj bioinformatičkih tehnologija

rezultirali su s više od tisuću javno dostupnih genoma mikroorganizama. Štoviše, sekvencionirani

su i brojni genomi BMK koji se koriste kao probiotici ili starter kulture za fermentacije hrane.

Pristup genomskim sekvencama kao temelju za funkcionalnu genomiku, transkriptomiku,

proteomiku i sekretomiku, doprinosi definiranju interakcija između probiotika i GIT-a domaćina.

2.3. MEHANIZMI PROBIOTIČKOG DJELOVANJA

2.3.1. Karakterizacija probiotičkih mehanizama primjenom genomskih alata

Sekvencioniranje genoma probiotičkih bakterija i integracija funkcionalnih genomskih

tehnika, usmjerene su na razjašnjavanje mehanizama djelovanja i interakcija probiotika s GIT-om

domaćina. Pri tome su najznačajnija tri mehanizma djelovanja probiotika: 1) preživljavanje tijekom

prolaska kroz GIT i adhezija na crijevni epitel, 2) kompetitivno isključenje patogena i antimikrobno

djelovanje, i 3) modulacija imunološkog sustava domaćina (Slika 2).

5

Slika 2. A) Probiotički sojevi moraju preživjeti uvjete prisutne u GIT-u, uključujući nisku pH

vrijednost želučanih sokova (pH~2) i visoke koncentracije žuči u tankom crijevu. B) Probiotički

sojevi se u visokoj koncentraciji stanica adheziraju na crijevni epitel što može doprinjeti

kompetitivnoj ekskluziji patogena. Selektivno poticanje rasta određenih probiotičkih sojeva može

biti potaknuto prisutnošću složenih prebiotičkih oligosaharida. Pojedini probiotici proizvode

bakteriocine i druge antimikrobne spojeve, koji mogu antagonizirati patogene u lumenu. C)

Probiotici vezani u mukusne i epitelne slojeve su blizu dendritičkim stanicama mukoznog

imunosnog sustava, što dovodi do imunomodulacije (preuzeto od Johnson i Klaenhammer, 2014).

2.3.2. Preživljavanje i adhezija na GIT

Jedna od najbitnijih osobina probiotičkog mikroorganizma je sposobnost preživljavanja u

različitim regijama GIT-a (Slika 2A). Probiotički soj mora preživjeti nepovoljne uvjete GIT-a. Kao

i kod mnogih bakterija koje su acidotolerantne, lipidne membrane laktobacila izložene kiselini i

žuči se promijene kako bi se povećalo preživljavanje. U lipidnoj membrani Lactobacillus casei, kao

odgovor na zakiseljenje okoliša, dolazi do značajnog povišenja udjela mononezasićenih masnih

kiselina (Fozo i sur., 2004). Slično tome, u lipidnoj membrani Lactobacillus reuteri izloženoj

žučnim solima i kolesterolu, povećao se udio mononezasićenih masnih kiselina u odnosu na

zasićene masne kiseline (Taranto i sur., 2003). Nedavno je provedeno istraživanje na probiotičkom

soju Lactobacillus rhamnosus GG, kojim je ustanovljeno da je egzogeni izvor oleinske kiseline

[C18:1 (cis-9)], značajno povećao preživljavanje ovog soja u uvjetima niskih pH vrijednosti,

ugrađivanjem u membranu oleinske kiseline koja se reducira u stearinsku kiselinu (C18:0)

(Corcoran i sur., 2007).

6

Bron i sur. (2006) primjenili su DNA-mikročip analizu za identifikaciju gena koji se

eksprimiraju nakon izlaganja bakterijskih stanica Lactobacillus plantarum svinjskoj žuči te su

identificirani geni koji kodiraju za proteine stresa, proteine stranične ovojnice i F0F1 ATP-aze.

Komparativna proteomička analiza sojeva L. plantarum otpornih i osjetljivih na žuč, potvrdila je

rezultate transkriptomičkih analiza, te su ustanovljeni potencijalni biomarkeri za selekciju

probiotičkih sojeva otpornih na žuč.

Vjerojatno je prilikom tolerancije probiotika na žuč važna i uloga proteinskih kompleksa

transportera za lijekove (engl. MDR-multi-drug resistance) i efluks pumpi. Funkcionalne

genomičke analize MDR transportera u probiotičkim sojevima L. reuterii i L. acidophilus, pokazale

su ulogu tih transportera u toleranciji na žuč (Pfeiler i Klaenhammer, 2009). Nadalje, betA (engl.

bile efflux transporter) MDR transporter gen bakterije Bifidobacterium longum, nedavno je

identificiran i funkcionalno okarakteriziran in silico analizom genoma (Gueimonde i sur., 2009).

Heterologna ekspresija betA u E. coli, rezultirala je aktivnim izlučivanjem žučnih soli, što je

omogućilo poboljšanje tolerancije mutantnog soja na žuč.

Preživljavanje i poboljšanje korisnih mikroorganizama u GIT-u, može biti postignuto

snabdijevanjem selektivno iskoristivim ugljikohidratima, koji se nazivaju prebiotici (Andersen i

sur., 2013). Ti ugljikohidrati, uključujući b-galaktooligosaharide (GOS), laktulozu,

fruktooligosaharide i inulin, otporni su na nisku pH vrijednost u želudcu, hidrolizu i apsorpciju u

GIT-u. Prebiotičke ugljikohidrate kao hranjive supstrate selektivno metaboliziraju korisne bakterije.

Nedavno su različite transkriptomičke i funkcionalne genomičke analize pokazale sposobnosti

probiotičkih bakterija L. acidophilus NCFM (Andersen i sur., 2012) i Bifidobacterium lactis B1-04

(Andersen i sur., 2013) da iskorištavaju prebiotičke oligosaharide. Ove spoznaje temelj su za

proizvodnju novih sinbiotičkih pripravaka odgovarajućih prebiotika za L. acidophilus i B. lactis,

kako bi se poboljšalo njihovo preživljavanje i probiotička učinkovitost u tankom i debelom crijevu

domaćina.

Postoje znanstveni dokazi prema kojima metabolizam glikogena može biti značajan

čimbenik kolonizacije probiotičkih BMK. Glikogen je topljivi, razgranati polimer velike

molekularne mase, u kojem su monomerne jedinice glukoze povezane α-1,4-glikozidnim vezama u

glavni lanac, te α-1,6-glikozidnim vezama u bočne lance što dovodi do grananja. Ima mnogostruke

fiziološke funkcije u različitim bakterijama i smatra se izvorom ugljika za regulaciju energetskog

fluksa (Belanger i Hatfull, 1999). Prema Goh i Klaenhammer (2013), dokazana je funkcionalnost

operona za metabolizam glikogena koji se anotira u sekvenci genoma. Nizom kromosomskih

delecija i analiza fenotipa, ustanovilo se da metabolizam glikogena regulira održavanje rasta,

7

toleranciju na žuč i iskorištenje kompleksnih ugljikohidrata kod L. acidophilus (Goh i

Klaenhammer, 2013).

Nakon preživljavanja prolaska kroz GIT, iduća važna karakteristika za probiotičku aktivnost

je adhezija na crijevni epitel GIT-a. Preliminarna in vitro istraživanja u kojima su se koristile Caco-

2 stanice epitela crijeva, pokazala su da brojni probiotički laktobacili imaju sposobnost adhezije

(Tuomola i Salminen, 1998). Objavljeni su i radovi u kojima je dokazana adhezija Bifidobacterium

spp. na mukus crijeva čovjeka (He i sur., 2001).

Javno dostupne sekvence genoma, zajedno s integriranim genomskim tehnikama, također su

doprinjele identifikaciji medijatora adhezije probiotika. Većina tih proteina ili drugih

makromolekula stanice se izlučuju ili vežu na staničnu stijenku pomoću enzima sortaza, kako bi se

povezali s intestinalnim epitelom (Lebeer i sur., 2008). Istraživanja provedena na soju L. plantarum

WCFS1, pokazala su da se prilikom primjene soja u GIT-u miša kod bakterije induciraju dva takva

sortaza-ovisna proteina (engl. SDP-sortase-dependent proteins) (Bron i sur., 2004). In silico

analizom genoma L. acidophilus NCFM, ustanovljeno je pet proteina za koje se pretpostavlja da se

adheziraju na površinu stanice, uključujući fibronektin-vezujući protein (engl. FbpA-Fibronectin

binding protein A), S-layer protein (SlpA), mucin-vezujući protein (engl. Mub-mucin-binding

protein), i dva R28 homologa uključena u adheziju streptokoka (Buck i sur., 2005). Analizom

mutacija se pokazalo da FbpA, Mub i SlpA pridonose adheziji na Caco-2 epitelne stanične linije.

Kasnijim istraživanjima pokazana je i uloga stres proteina i faktora promicanja adhezije

(engl. aggregation-promoting factor), koji su oba površinski proteini, u adheziji na Caco-2 stanice

(Goh i Klaenhammer, 2010). S-layer protein CbsA u Lactobacillus crispatus JCM5810, sadrži

domene koje se vežu na laminin i kolagen (Antikainen i sur., 2002). Pretraživanje genoma i analiza

sekretoma Lactobacillus salivarius UCC118 doveli su do identifikacije tri SDP proteina s

domenama koje se vežu na mukus. Genetičkim transformacijama dobiven je mutantni soj koji ne

eksprimira sortazu, te je dokazana značajno slabija adhezija mutiranih bakterijskih stanica na Caco-

2 i HT-29 stanične linije in vitro (van Pijkeren i sur., 2006). Genomska analiza dva soja L.

rhamnosus, otkrila je prisutnost genomskih otoka u L. rhamnosus GG koji sadrže tri izlučene,

sortaza-ovisne pile kodirane sa spaCBA (Kankainen i sur., 2009).

2.3.3. Kompetitivna ekskluzija i antimikrobna aktivnost

Još jedan važan mehanizam djelovanja probiotičkih bakterija koji doprinosi korisnim

zdravstvenim učincima na domaćina je prevencija infekcije patogenima (Slika 2B). Nakon oralne

primjene, probiotički laktobacili privremeno oblažu mukozni sloj i epitel tankog crijeva, što stvara

8

fizičku i kemijsku barijeru protiv štetnih bakterija (Servin, 2004). Inicijalna istraživanja su pokazala

da laktobacili inhibiraju adheziju gram-negativnih uropatogena. Nadalje, in vivo modeli na

miševima su pokazali da L. casei GR1 može spriječiti infekcije urinarnog trakta koje izazivaju E.

coli, Klebsiella pneumoniae i Psudomonas aeruginosa. Pretpostavlja se da je mehanizam patogenog

antagonizma rezultat adhezije stanica laktobacila na urogenitalni epitel, čime se sprječava infekcija

kompetitivnom ekskluzijom patogena. Brojna istraživanja su dokazala in vitro inhibiciju brojnih

gastrointestinalnih patogena kompetitivnom ekskluzijom pomoću probiotičkih laktobacila i

bifidobakterija (Servin, 2004).

Pored kompetitivne ekskluzije patogena, probiotičke bakterije proizvode brojne

antimikrobne spojeve koji mogu spriječiti infekciju patogenima: vodikov peroksid, mliječnu

kiselinu, biosurfaktante, imunomodulatorne produkte i bakteriocine (Šušković i sur., 2010).

Bakteriocini su bakterijski antimikrobni peptidi koji su djelotvorni protiv drugih bakterija, a

na koje je bakterija koja ih proizvodi imuna (Cotter i sur, 2005). BMK proizvode različite

bakteriocine širokog spektra djelovanja, koji se mogu podijeliti u tri glavne skupine:

1) bakteriocini skupine I (lantibiotici): mali peptidi koji sadrže lantionin (Šušković i sur.,

2010);

2) bakteriocini skupine II: termostabilni, ne sadrže lantotion;

3) bakteriolizini: velike, termolabilne mureinske hidrolaze (Cotter i sur., 2005).

Znanstvenici osobito istražuju bakteriocine koje proizvode BMK zbog moguće primjene kao

biokonzervansa u industriji fermentiranih mliječnih proizvoda. Jedan od industrijski najvažnijih

bakteriocina je nizin, lantibiotik kojeg proizvodi Lactococcus lactis (Cotter i sur., 2005; Šušković i

sur., 2010).

2.3.4. Modulacija imunoodgovora probiotičkim djelovanjem

Uz navedene mehanizme djelovanja, sposobnost modulacije mukoznog imunosnog sustava

smatra se također vrlo značajnom funkcionalnom karakteristikom probiotičkih bakterija (Slika 2C).

Interakcije između probiotičkog soja i stalno prisutne mikrobiote epitela GIT i stanica

imunosustava, prilično su kompleksne i iscrpno se istražuju (Selle i Klaenhammer, 2013).

Probiotički sojevi moduliraju mukoznu imunost interakcijom makromolekula bakterijske

stanice (engl. MAMPs-microorganism-associated recognition receptors) koji specifično prepoznaju

receptore domaćina (engl. PRRs-pattern recognition receptors) na antigen prezentirajućim

stanicama (engl. APCs-antigen-presenting cells) poput dendritičkih stanica i makrofaga. Nakon

9

izlaganja MAMPs, PRR receptori (receptori slični NOD-u, receptori slične Tollu i C-tip lektinski

receptori) aktiviraju (NF)-κB i signalne kaskadne reakcije mitogenom-aktivirane protein kinaze,

koji moduliraju ekspresiju citokinskih i kemokinskih gena. Najčešći MAMPs u probiotičkim

bakterijama su lipoteihoična kiselina (LTA), peptidoglikan i S-layer proteini (Beganović i sur.,

2011; Bron i sur., 2012). Poput mnogih probiotičkih efektora, većina MAMPs se nalaze na površini

stanica gram-pozitivnih mikroorganizama.

Provedena je bioinformatička analiza genoma i proteoma različitih laktobacila, kako bi se

stvorila baza podataka sekretoma, u kojoj su katalogizirani različiti ekstracelularni proteini BMK

(Zhou i sur., 2010). Korištenjem in silico analize genoma i rezultata analize sekretoma BMK,

odabrani MAMP identificiran in silico se može potvrditi mutagenezom (Bron i sur., 2012). Johnson

i sur., (2013) su analizirali proteom L. acidophilus, kako bi identificirali proteine vezane na S-layer

sloj, tzv. SLAP (engl. S-layer associated proteins) proteine in situ. Nakon ekstrakcije, SLAP

proteini su identificirani masenom spektrometrijom. Analiza soja s mutacijom jednog SLAP

proteina (Iba1029), otkrila je imunomodulatorni fenotip korištenjem in vitro testa koinkubacije

bakterijskih i dendritičkih stanica, što ukazuje na potencijal mnogih nepoznatih MAMPs povezanih

s S-layerom L. acidophilus NCFM.

Kompleksne interakcije između mikroorganizama i domaćina se neprestano istražuju,

primjerice profiliranjem cijelog transkriptoma crijevnog epitela čovjeka nakon primjene probiotika.

Provedeno je istraživanje transkriptoma mukoznih regija tankog crijeva zdravih volontera koji su

konzumirali probiotičke sojeve L. acidophilus, L. casei i L. rhamnosus (van Baarlen i sur., 2011).

Transkripcijski profili inducirani primjenom svakim od tih probiotičkih sojeva, bili su specifični za

svaki soj i usporedivi s profilima dobivenim primjenom bioaktivnih spojeva i lijekova. In vitro

profiliranje transkriptoma Caco-2 epitelnih staničnih linija crijeva koje su inkubirane s L.

acidophilus NCFM, potvrdilo je te podatke (O'Flaherty i Klaenhammer, 2012). Analiza

transkriptoma Bifidobacterium bifidum PRL2010 inkubiranih in vitro na humanim staničnim

linijama i in vivo na miševima, pokazala je sposobnost soja PRL2010 da modulira urođenu imunost

domaćina (Turroni i sur., 2014).

Genomička istraživanja probiotičkih BMK, otkrila su važne aspekte probiotičkih

mehanizama, ali i kompleksnost interakcija sa autohtono prisutnom mikrobiotom i mukoznim

imunosnim sustavom. Otvorene su i brojne mogućnosti, npr. probiotičke bakterije su se počele

istraživati kao prikladni vektori za unošenje cjepiva i lijekova zbog njihovog imunomodulacijskog

djelovanja na domaćina.

10

Nedavna istraživanja upućuju na značaj probiotičkih bakterija i autohtone mikrobiote GIT-a

s mnogih drugih aspekata osim na gastrointestinalno zdravlje. Istraživanja interakcije mikrobiote

GIT-a i mozga upućuju i na neurokemijsku važnost homeostaze intestinalne mikrobiote (Bercik i

sur., 2012). Zajedno s tim spoznajama, nužno je provoditi daljna klinička istraživanja što će

omogućiti daljne spoznaje na području istraživanja probiotika i mikrobioma GIT-a.

11

3. EKSPERIMENTALNI DIO

3.1. MATERIJALI

3.1.1. Radni mikroorganizmi

Svi mikroorganizmi korišteni u ovom radu u in vitro eksperimentima, navedeni su u Tablici

1. Radi se o probiotičkim bakterijama iz rodova Lactobacillus ili Bifidobacterium koje su prisutne

u obliku liofiliziranih probiotičkih pripravaka na tržištu. Navedeni sojevi pohranjeni su u Zbirci

mikroorganizama Laboratorija za tehnologiju antibiotika, enzima, probiotika i starter kultura

Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu. Sojevi se čuvaju pri -80 °C u MRS

tekućoj hranjivoj podlozi uz dodatak 15% (v/v) glicerola.

Tablica 1. Bakterijski sojevi izolirani iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda korišteni u ovom

diplomskom radu

Bakterijski sojevi Oznaka soja

Hranjive podloge i uvjeti rasta

Lactobacillus rhamnosus LGG -1 1 MRS, 370C, aerobnoLactobacillus sp. 2A 2A MRS, 370C, aerobnoBifidobacterium sp. 2B 2B TOS, 37 0C, anaerobnoBifidobacterium longum 3 3 TOS, 37 0C, anaerobnoLactobacillus reuteri DSM 17938 -4 4 MRS, 37 0C, anaerobnoLactobacillus sp. 5/1 5/1 MRS, 37 0C, anaerobnoBifidobacterium sp. 6B 6B TOS, MRS, 37 0C, anaerobnoLactobacillus sp. 8/1 8/1 MRS, 37 0C, anaerobnoBifidobacterium sp. 8/2 8/2 TOS, 37 0C, anaerobnoL. reuteri Protectis (DSM 17938) -9 9 MRS, 37 0C, anaerobnoLactobacillus rhamnosus GR1 GR1 MRS, 37 0C, anerobnoLactobacillus reuteri RC14 RC14 MRS, 37 0C, anerobnoBifidobacterium bifidum BB12 BB12 TOS, 37 0C, anerobno

3.1.2. Hranjive podloge

U radu su korištene optimalne hranjive podloge za održavanje, čuvanje i uzgoj bakterija

mliječne kiseline iz roda Lactobacillus i bakterija iz roda Bifidobacterium:

MRS (Man-Rogosa-Sharpe) kruta hranjiva podloga sastava: pepton 15,0 g/l; mesni ekstrakt

3,0 g/L; kvaščev ekstrakt 5,0 g/L; glukoza 20,0 g/L; Tween 80 1,0 g/L; MgSO4·7 H2O 0,05

g/L; MnSO4·7 H2O 0,05 g/L; natrijev-acetat 5,0 g/L; agar 20,0 g/L, u destiliranoj vodi. pH

vrijednost podloge je 6,5; sterilizacija se provodi pri 121°C/15 min.

12

MRS (Man-Rogosa-Sharpe) tekuća hranjiva podloga istog je sastava kao MRS-agar, samo

bez dodanog agara.

TOS-propionat agar: pepton iz kazeina 10 g/L; kvaščev ekstrakt 1,0 g/L; kalijev dihidrogen

fosfat 3,0 g/L; kalijev hidrogen fosfat 4,8 g/L; amonijev sulfat 3,0 g/L; MgSO4·7H2O 0,2

g/L; L-cistein monoklorid 0,5 g/L; natrijev propionat 15,0 g/L; galaktooligosaharidi (TOS)

10,0 g/L; agar 15,0 g/L; u destiliranoj vodi. pH vrijednost podloge iznosi 6,7; sterilizacija se

provodi pri 115°C/15 min.

3.1.3. Kemikalije

Prilikom izvođenja eksperimentalnog rada korištene su slijedeće kemikalije:

pepton, „Biolife“, Malazija,

mesni ekstrakt, „Biolife“, Malazija,

kvaščev ekstrakt, „Difco“, SAD,

glukoza,

Tween 80, „Sigma“, SAD,

magnezijev sulfat, „Alkaloid“, Makedonija,

manganov sulfat, „Merck“, Njemačka,

natrijev acetat,

agar,

pepton iz kazeina,

kalijev dihidrogen fosfat,

kalijev hidrogen fosfat,

amonijev sulfat,

L-cistein monoklorid,

natrijev propionat,

galaktooligosaharid,

15%-tna otopina glicerola,

0,3% -tna i 0,6%-tna otopina natrijeve soli konjugirane iz žučne soli,

13

pepsin,

0,5 %-tna otopina natrijeva klorida,

koncetrirana klorovodična kiselina,

pankreatin,

žučna sol,

natrijeva lužina,

goveđa žuč,

mucin, „Sigma“, SAD,

karbonantni i bikarbonantni pufer,

fosfatni pufer pH 7.4,

Tween 20,

kristal violet,

citratni pufer,

fiziološka otopina,

0,9 %-tna otopina natrijeva klorida.

3.1.4. Aparatura i pribor

U ovom radu korištene su slijedeće aparature i pribor:

pH-metar, “Metrohm”, Švicarska,

pinceta,

Petrijeve zdjelice,

autoklav, „Sutjeska“, Jugoslavija,

termostat, „Instrumentarija“, Hrvatska,

vodena kupelj, „Sutjeska“, Jugoslavija,

vibro-mješač EV-100, „Kartell“, Italija,

vaga, „Tehtnica“, Slovenija,

centrifuga CENTAUR 2, „Sanyo“, Engleska,

14

centrifuga Centric, „Tehtnica“, Slovenija,

mikroskop OPTON III, „Zeiss“, Njemačka,

čitač mikrotitarskih pločica LKB 5060-006, „GDV“, Italija,

mikrotitarske pločice s 96 jažica,

denzimat, „BioMerieux“, Francuska,

automatske pipete, „Eppendorf“, SAD.

3.2. METODE RADA

3.2.1. Održavanje i čuvanje mikroorganizama

Probiotički sojevi su čuvani pri -80°C u MRS tekućoj hranjivoj podlozi uz dodatak 15%

(v/v) glicerola. Dan prije eksperimenta probiotički sojevi su inokulirani u svježu optimalnu hranjivu

podlogu te inkubirani pri optimalnoj temperaturi rasta prema uvjetima navedenim u Tablici 1.

3.2.2. Određivanje pH vrijednosti, stupnja kiselosti i postotka proizvedene mliječne kiseline

Supernatantu kulture, dobivenom centrifugiranjem prekonoćnih kultura bakterija iz roda

Lactobacillus ili Bifidobacterium pri 4000 g/10 min, se odredi pH vrijednost, te se 1 ml

supernatanta razrijedi s 19 ml destilirane vode u Erlenmeyerovoj tikvici od 100 ml. Razrijeđeni

uzorak se titrira s 0,1 M NaOH uz fenolftalein kao indikator, do pojave blijedo ružičaste boje. Broj

mililitara 0,1 M NaOH utrošenih za neutralizaciju, pomnožen s dva predstavlja kiselost u

stupnjevima Soxhlet-Henkela (°SH).

° SH =a ∙20 ∙ f NaOH ∙2

% mlije č ne kiseline=° SH ∙ 0,0225

a = ml 0,1 M NaOH

(1°SH~0,0225 g mliječne kiseline (%))

3.2.3. KOH metoda

Ova metoda se koristi za određivanje gram-pozitivnih odnosno gram-negativnih bakterija.

Na predmetno stakalce se kapne 10 μl 3% kalijevog hidroksida (KOH) te se sterilno prenese

15

mikrobiološkom ušicom vidljiva količina bakterijskih stanica u kapljicu KOH. Smjesa se promiješa,

proširivajući mjesto do promjera od 1,5 cm. Ako suspenzija postane viskozna ili gelasta unutar 5-60

s, ispitivana bakterija je gram-negativna, a u protivnom je gram-pozitivna.

3.2.4. Katalaza test

Ovaj test se provodi kako bi se utvrdilo da li istraživani mikroorganizam proizvodi enzim

katalazu. Mikrobiološkom ušicom se prenese dio ispitivane kulture na predmetno stakalce, a zatim

se doda 1-2 kapi svježeg 3%-tnog vodikovog peroksida. Prisutnost katalaze je vidljiva pojavom

mjehurića zbog oslobađanja kisika.

3.2.5. Određivanje sporogenosti

Inokulum prekonoćne kulture ispitivanih bakterija mliječne kiseline se nacijepi u svježu

hranjivu podlogu koja se kuha 10 minuta u vodenoj kupelji pri 80°C. Nakon toga se kulture

inkubiraju pri 37°C tijekom 48 sata. Ako nije došlo do rasta kulture, to znači da je ispitivana

bakterija nesporogena jer spore preživljavaju temperaturu od 80°C.

3.2.6. API test za određivanje fermentacijskih profila šećera

Ispitivana bakterijska kultura se uzgoji na MRS agaru u obliku kolonija anaerobno kroz 24 h

pri 37°C. U ampulu, koja sadrži API 50 CHL medij za rod Lactobacillus, se pomoću mikrobiološke

ušice doda nekoliko identičnih kolonija s MRS agara. Gustoća inokuluma, koja se mjeri u dezimatu,

mora biti 2 McF. Pripremljena suspenzija se nakapava u cjevčice API 50 CHL stripa koji sadrži 49

različitih ugljikohidrata. U sve cjevčice se nakapa mineralno ulje kako bi se osigurali anaerobni

uvjeti. Tako priređen API strip, stavlja se u termostat na inkubaciju pri optimalnoj temperaturi rasta

mikroorganizma. Rezultati se očitavaju nakon 24 h, odnosno 48 h inkubacije, te se unose u program

APIWEB®. Pozitivnim se smatraju oni testovi kod kojih je uslijed acidifikacije i prisutnosti

bromkrezol purpurnog indikatora došlo do promjene boje u žuto. Biokemijski profil se očita, a

bakterijske kulture identificiraju pomoću programskog paketa s bazom podataka V 5.0 (prema

uputama proizvođača).

16

3.2.7. Fenotipska identifikacija bakterijskih sojeva pomoću BBL CRYSTAL™ GP testa

The BBL Crystal™Anaerobe (ANR) Identification (ID) System je komercijalno dostupan

test koji se primjenjuje za identifikaciju učestalih izolata anaerobnih bakterija na temelju

metaboličke aktivnosti uobičajenih, fluorogenih i kromogenih supstrata. Test sadrži poklopac unutar

kojeg je 29 različitih dehidratiranih supstrata, jednu kontrolu fluorescencije te bazu s 30 udubljenja

za odvijanje reakcije. Suspenzija bakterijskih stanica priprema se u mediju dostupnom unutar testa.

Baza s udubljenima za odvijanje reakcije se inokulira s priređenom suspenzijom bakterijskih

stanica, te se preklopi s poklopcem koji sadrži supstrate, što uzrokuje njihovu rehidrataciju i početak

biokemijskih reakcija (Slika 3).

Nakon perioda inkubacije tako priređenog testa, na određenim temperaturama u termostatu,

provjerava se promjena boje te prisutnost flurescencije u svakoj pojedinoj jažici, što je rezultat

metaboličke aktivnosti ispitivanog mikroorganizma. Dobiveni profil 29 različitih reakcija se

interpretira pomoću deseteroznamenkastog broja koji je temelj za identifikaciju.

Konačna identifikacija sojeva se provodi očitavanjem rezultata analize pomoću

programskog paketa BD BBL™ Crystal™ MIND (Slika 3). Mogući biokemijski i enzimski profili

29 supstrata koje mogu metabolizirati različiti mikroorganizmi pohranjeni su u bazi podataka.

Identifikacija se provodi usporedbom biokemijskih i enzimskih profila ispitivanog bakterijskog

izolata s reakcijskim profilom identificiranih mikroorganizama u bazi podataka.

Slika 3. Aparatura za identifikaciju bakterijskih sojeva pomoću biokemijskog BBL CRYSTAL™

GP testa

17

3.2.8. SDS-PAGE analiza

3.2.8.1. SDS-PAGE analiza ukupnih staničnih proteina

Bakterijske kulture inokulirane su u 10 ml MRS tekuće hranjive podloge i inkubirane pri

37ºC preko noći. Prekonoćne kulture bakterijskih stanica u stacionarnoj fazi centrifugirane su pri 9

000 g tijekom 15 min, a zatim su stanice isprane dva puta sa 0,9%-tnom sterilnom otopinom

natrijeva klorida. Bakterijske stanice su nakon toga mehanički razbijene tako što je u mikroepruvete

s bakterijskim stanicama dodan 1 g staklenih kuglica, (r=2 mm, VidraFOC), a zatim je suspenzija

miješana na vibromješaču tijekom 4 min i to naizmjenično 30 s uz miješanje, 30 s hlađenjem u ledu,

pri maksimalnoj brzini. Određena je koncentracija proteina u supernatantima. U suspenziju je

dodano 1 mL otopine SDS-a (0,0625M Tris-HCL, pH 6,8; 2% (w/v) SDS; 10% (v/v) glicerol).

Uzorci su prokuhani 10 min, a potom ohlađeni u ledu i centrifugirani na 9 000 g, 15 min, te je

provedena SDS-poliakrilamid gel elektroforeza.

Ekstrakti ukupnih staničnih proteina razdvojeni su pomoću SDS-PAGE prema metodi

opisanoj po Laemmli (1970). U 15 μL svakog od priređenih uzoraka dodano je 5 μL reducirajućeg

reagensa te su prokuhani 2-3 min. Nakon kuhanja ukupni volumen uzorka je nanešen na

poliakrilamidni gel. SDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (4% gel za sabijanje i 12% gel za

razdvajanje) se provodi u kadici za elektroforezu pri konstantnom naponu od 200 V kroz 45 min.

Nakon završene elektroforeze, gel se boji u 0,1%-tnom metilenskom modrilu R-250 s 50%

metanola i 7% octene kiseline kroz najmanje 3 sata. Nakon bojanja, gel je odbojavan u 7%-tnoj

octenoj kiselini. SDS-PAGE proteinski gel je skeniran (Scanjet 3800; Hewlett Packard, CA, SAD)

te je slika spremljena u TIFF formatu. Priređen je dendrogram bakterijskih sojeva na temelju profila

topljivih proteina pojedinog izolata BMK pomoću UPGMA metode (engl. Unweighted Pair Group

Method Using Average Linkage), te pomoću Gel-Compare II programskog paketa (Applied Maths,

St-Materns-Latem, Belgija).

3.2.8.2. SDS-PAGE površinskih proteina bakterijskih stanica

Prekonoćne kulture probiotičkih bakterija (3 ml) se centrifugiraju pri 9 000 okr/min tijekom

5 minuta. Talog bakterijskih stanica se ispere dva puta s 1 ml sterilne destilirane vode, a zatim se

resuspendira u 50 μl 2%-tne otopine SDS-a. Uzorke je potrebno prokuhati 10 minuta, a zatim

centrifugirati 5 minuta pri 9 000 okr/min.

Proteini prisutni u dobivenim supernatantima kultura se zatim razdvajaju pomoću SDS-

poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE) prema slijedećem postupku. Koncentracija proteina u

18

priređenom uzorku se očita na spektrofotometru BioSpec-nano, te se preračuna potreban volumen

uzorka za analizu pomoću SDS-PAGE. U 15 μl svakog od priređenih uzoraka se doda 5 μl

reducirajućeg reagensa i prokuha 2-3 min. SDS-poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) se

provodi kao što je opisano u 3.2.8.1. SDS-PAGE ukupnih staničnih proteina.

3.2.9. Određivanje tolerancije probiotičkih sojeva na žučne soli

Tolerancija probiotičkih sojeva na žučne soli je ispitana na dva načina.

Prvom metodom se prekonoćno uzgojeni bakterijski sojevi inokuliraju u mikrotitarske

pločice s 96 jažica koje sadrže 200 L MRS+0,3% ili MRS+0,6% konjugiranih žučnih soli natrija u

tri paralele. Rast inokuliranih sojeva se prati kroz 7 sati mjerenjem optičke gustoće pri 620 nm

(OD620). Rast probiotičkih sojeva u MRS hranjivoj podlozi je kontrola rasta.

Drugom metodom se prati rast probiotičkih sojeva u 5 mL tri prethodno navedena tekuća

medija. Svakih sat vremena se mjeri OD620 te određuje broj poraslih bakterijskih kolonija (CFU/ml)

na MRS agaru u anaerobnim uvjetima pri 37°C nakon 48 sati inkubacije.

3.2.10. Preživljavanje probiotičkih bakterija u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog trakta

3.2.10.1. Priprava simuliranoga želučanog soka i simuliranoga soka tankog crijeva

Simulirani želučani sok je pripravljen suspendiranjem pepsina (3 g/L) u 0,5% otopini

natrijevog klorida, kojoj je pH podešen na 2,0 s koncentriranom klorovodičnom kiselinom.

Simulirani sok tankoga crijeva je pripravljen suspendiranjem pankreatina (1 g/L), samog ili/i žučnih

soli (3,0 mg/mL goveđe žuči) u 0,5% otopini natrijeva klorida, kojoj je pH podešen na 8,0 s

natrijevom lužinom (Kos, 2001).

3.2.10.2. Učinak simuliranog želučanog soka i soka tankoga crijeva na preživljavanje probiotičkih

bakterija

Suspenzije stanica odabranih bakterijskih kultura su izložene djelovanju želučanog soka

(pH=2) 2 sata, a zatim su centrifugirane pri 3500 o/min i resuspendirane u simuliranom soku

tankoga crijeva (3 mg/mL goveđe žuči) tijekom 3 sata (Kos, 2001). Broj poraslih živih stanica

određivan je indirektnom metodom.

19

3.2.11. In vitro adhezija na protein mucin

Vezanje probiotičkih sojeva na mucin je provedeno na mikrotitarskim pločicama s 96 jažica,

koje su inokulirane bakterijskim stanicama poraslim do eksponencijalne faze rasta. U jažice

mikrotitarskih pločica se prethodno, prije dodatka suspenzija bakterijskih stanica, dodaje

glikoprotein mucin u koncentraciji od 50 µg/mL u karbonantnom/bikarbonantnom puferu (50

mmol/L, pH 9,6) te se inkubira preko noći pri 4˚C. Potom se jažice isperu tri puta s fosfatnim

puferom, te se mucin imobilizira tijekom sat vremena dodatkom 1% Tween 20 u fosfatnom puferu.

100 µl suspenzije svakog soja, kojoj je podešena OD620 na 1 u fosfatnom puferu, se doda u svaku

jažicu mikrotitarske pločice koje se zatim inkubiraju preko noći pri 37˚C. Nakon uklanjanja

neadsorbiranih odnosno nevezanih stanica (tri uzastopna ispiranja s 200 µl 0.05% Tween 20 u

fosfatnom puferu) mikrotitarske pločice se suše pri sobnoj temperaturi i vezane (adhezirane) stanice

se detektiraju bojanjem kristal violetom. Potom se mikrotitarske pločice isperu s 100 l citratnog

pufera (50 mmol/L, pH 4,0) i određuje se adsorbancija na čitaču mikrotitarskih pločica LKB 5060-

006, „GDV“ pri 620 nm.

Također je ispitana i in vitro adhezija probiotičkih sojeva na mikrotitarskim pločicama s 96

jažica koje ne sadrže vezani mucin kao kontrola u svim eksperimentima. Eksperimenti su

ponovljeni tri puta kako bi se izračunala srednja vrijednost i standardna devijacija.

20

4. REZULTATI

4.1. KARAKTERIZACIJA BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH

NUTRACEUTIČKIH PROIZVODA

U ovom diplomskom radu korištene su konvencionalne mikrobiološke metode i fenotipska

identifikacija primjenom testova za fermentaciju različitih metabolita, te SDS-PAGE analiza

ukupnih topljivih i površinskih proteina bakterijskih stanica s ciljem reidentifikacije bakterijskih

sojeva koji su prisutni u odabranim probiotičkim nutraceutičkim proizvodima na hrvatskom tržištu.

Proizvodi su katalogizirani prema vrstama probiotičkih bakterija koje prema deklaraciji sadrže,

obliku pripravaka i njihovoj namjeni. Radi se o pripravcima namijenjenim za profilaksu ili terapiju

odraslih osoba, djece ili dojenčadi, u obliku tableta, pastila, vrećica odgovarajućih doza ili kapi, koji

sadrže pojedinačne ili mješovite bakterijske kulture iz rodova Lactobacillus ili Bifidobacterium.

Prilikom izolacije pojedinih probiotičkih sojeva iz nutraceutičkih proizvoda, korištene su

selektivne hranjive podloge za rast ovisno o deklaraciji navedenoj na samom proizvodu i to MRS

hranjivi agar za Lactobacillus sojeve, a TOS-propionat hranjivi agar za Bifidobacterum sojeve.

Određivanjem broja poraslih kolonija (CFU/ml), ustanovljeno je da je postignut visok broj

bakterijskih kolonija koji je iznosio najmanje 106 CFU/ml, što je u skladu s deklaracijom

navedenom na proizvodu, a i sa zahtjevima postavljenim za iskazivanje probiotičkih učinaka u

domaćinu.

Izolirani bakterijski sojevi su inokulirani u MRS tekuću hranjivu podlogu i zatim inkubirani

anerobno pri različitim temperaturama kako bi se definirali optimalni uvjeti za rast. Izolirani sojevi

su bojani po gramu, zatim mikroskopirani, te su provedeni katalaza test, KOH metoda i test

sporogenosti (Tablica 2). Na temelju navedenih konvencionalnih mikrobioloških metoda

ustanovljeno je da su svi izolirani sojevi gram-pozitivne, nesporogene i katalaza-negativne

bakterije, oblika kratkih ili dužih štapića, koje uspješno rastu pri 37ºC u anaerobim uvjetima.

Nakon prekonoćnog uzgoja pri optimalnim uvjetima rasta (optimalna podloga za rast; 37ºC;

anaerobno) određeni su pH vrijednost, stupanj kiselosti i postotak nastale mliječne kiseline u

supernatantu svake pojedine bakterijske kulture (Tablica 3). pH vrijednosti određene u supernatantu

kulture pojedinog soja su u rasponu od 3,74 do 4,38, i u skladu su s postotkom proizvedene

mliječne kiseline, osim za soj 3 za koji pH vrijednost supernatanta iznosila 5,05. Niske pH

vrijednosti određene u supernatantu kulture pojedinih sojeva su rezultat sinteze mliječne kiseline,

primarnog metabolita, što može upućivati na to da se radi o bakterijskim vrstama koje pripadaju

skupini BMK. Bakterije iz roda Bifidobacterium tkđ. proizvode mliječnu kiselinu kao jedan od

glavnih proizvoda metabolizma ugljikohidrata, ali su filogenetski različite od rodova BMK.

21

Fenotipska identifikacija je provedena pomoću API 50 CHL testa za Lactobacillus sojeve, te

sustavom za identifikaciju BBL CRYSTAL™ GP za Bifidobacterium sojeve, pri čemu su rezultati

identifikacije prikazani u tablicama 4 i 5. S obzirom na dobivene rezultate fermentacijskih profila

različitih supstrata, ustanovljeno je da se radi o bakterijama iz roda Lactobacillus, što je u skladu s

navedenom deklaracijom na samom probiotičkom nutraceutičkom proizvodu, gdje su za većinu

sojeva očitani postoci identifikacije (%ID) iznosili iznad 90%, što znači da se radi o dobroj ili vrlo

dobroj identifikaciji. Za soj 3, koji prema deklaraciji pripada rodu Bifidobacterium, ustanovljeno je

na temelju rezultata sustava za identifikaciju BBL CRYSTAL™ GP da se radi o bakteriji iz roda

Bifidobacterium (rezultati nisu prikazani).

Provedena je i SDS-PAGE analiza ukupnih staničnih, te površinskih proteína, te su na

temelju dobivenih proteinskih profila sojevi grupirani izradom dendrograma pomoću Gel Compare

II programskog paketa (Slika 4 i Slika 5). Dobiveni podaci su obrađeni primjenom Pearsonovog

koeficijenta koleracije (r), dok su dendrogrami izrađeni primjenom UPGMA metode (engl.

unweighted pair-group method with arithmetic averages).

Također su ekstrahirani i ukupni stanični i površinski proteini tri referentna soja

Lactobacillus acidophilus ATCC 4365, Lactobacillus rhamnosus LGG i Bifidobacterium animalis

subsp. lactis BB-12, koji predstavljaju referentne bakterijske sojeve za grupiranje ispitivanih sojeva

u rod Lactobacillus odnosno Bifidobacterium.

22

Tablica 2. Karakterizacija izoliranih bakterijskih sojeva iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda

pomoću osnovnih mikrobioloških metoda.

Oznaka bakterijskog

soja

KOH metoda

Bojanje po Gramu

Katalaza test

Test sporogenosti

1 G + G + negativna nesporogena2A G + G + negativna nesporogena2B G + G + negativna nesporogena3 G + G + negativna nesporogena4 G + G + negativna nesporogena5 G + G + negativna nesporogena6 G + G + negativna nesporogena

7A G + G + negativna nesporogena8/1 G + G + negativna nesporogena8/2 G + G + negativna nesporogena9 G + G + negativna nesporogena

GR-1 G + G + negativna nesporogenaRC-14 G + G + negativna nesporogena

Tablica 3. Stupanj kiselosti, postotak proizvedene mliječne kiseline i pH vrijednost, određena u

supernatantima pojedine bakterijske kulture, nakon prekonoćnog uzgoja probiotičkih sojeva u MRS

tekućoj podlozi. Rezultati tri različita eksperimenta izraženi su kao aritmetička sredina ± standardna

devijacija.

Oznaka soja SH Mliječna kiselina (%) pH

1 124,00±30,2 2,79±0,68 3,80±0,032A 108,00±28,8 2,43±0,65 3,81±0,132B 110,67±16,17 2,49±0,36 3,74±0,653 56,00±10,58 1,26±0,24 5,05±0,394 109,30±12,2 2,46±0,27 4,38±0,10

5/1 108,00±14,4 3,43±1,84 4,28±0,026B 96+100 2,16±0,51 3,85±0,257A 102,7±20,1 2,31±0,45 3,77±0,098/1 96± 2,205±0,06 3,85±0,398/2 100± 2,25+1,80 3,82; 4,269 72,0±16,0 1,62±0,36 4,30±0,03

23

Tablica 4. Fermentacijski profil bakterijskog soja RC-14, odnosno GR-1 temeljem analize

provedene biokemijskim testom API 50 CHL, koji je pomoću programskog paketa uspoređen s

fermentacijskih profilima bakterijskih sojeva prisutnim u bazi podataka V 5.0. te je bakterijski

izolat identificiran kao a) Lactobacillus reuteri b) Lactobacillus rhamnosus.

Ugljikohidrati RC-14 GR-1 Ugljikohidrati RC-14 GR-1

Kontrola / Control - - Arbutin / Arbutin - +Glicerol / Glycerol - - Eskulin / Esculin ± +Eritriol / Erythriol - - Salicin / Salicine - +

D-arabinoza / D-arabinose - - Celobioza / Cellobiose - +L-arabinoza / L-arabinose - - Maltoza / Maltose + ±

Riboza / Ribose ± + Laktoza / Lactose + +D-ksiloza / D-xylose - - Melibioza / Melibiose + -L-ksiloza / L-xylose - - Saharoza/ Saccharose ± -Adonitol / Adonitol - - Trehaloza/ Trehalose - +

β-metil-ksilozid / β-methyl-xyloside - - Inulin / Inulin - -

Galaktoza / Galactose + + Melezitoza/ Melezitose - +D-glukoza / D-glucose + + D-rafinoza/ D-raffinose + -D-fruktoza / D-fructose - + Amidon / Amidon - -D-manoza / D-mannose - + Glikogen / Glycogen - -L-sorboza / L-sorbose - + Ksilitol / Xylitol - -Ramnoza / Rhamnose - ± β-gentobioza/β-gentobiose - +

Dulcitol / Dulcitol - - D-turanoz/ D-turanose - +Inozitol / Inositol - ± D-liksoza / D-lyxose - -

Manitol / Mannitol - + D-tagatoza/ D-tagatose - +Sorbitol / Sorbitol - ± D-fukoza / D-fucose - -

α-metil-D-manozid /α-methyl-D-mannoside - - L-fukoza / L-fucose - -

α-metil-D-glukozid /α-methyl-D-glucoside - + D-arabitol / D-arabitol - -

N-acetil glukozamin /N-acetylglucosamine - + L-arabitol / L-arabitol - -

Amigdalin / Amygdalin - + Glukonat /Gluconate ± ±

2-keto-glukonat / 2-keto-gluconate - - 5-keto-glukonat /5-keto-gluconate - -

-, negativna reakcija, nije došlo do promjene boje;

+, pozitivna reakcija, promjena boje u žutu u 48 sati;

±, promjena boje između zelene i žute.

24

Tablica 5. Identifikacija bakterijskih sojeva iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda, poraslih na

MRS agar podlogama, pomoću biokemijskih profila određenih API 50 CHL stripom. Vrijednost

postotka, % ID, dokazuje sličnost testiranih sojeva sa sojevima iz API baze podataka.

Oznaka soja Identifikacija % ID

1 Lactobacillus paracasei neprihvatljiv profil2A Lactobacillus paracasei neprihvatljiv profil2B Bifidobacterium BBL test3 Bifidobacterium BBL test

4 Lactobacillus plantarum (rhamnosus) neprihvatljiv profil

5/1 Lactobacillus fermentum Dobra identifikacija6B Lactobacillus paracasei Dobra identifikacija8/1 Lactobacillus plantarum Vrlo dobra identifikacija8/2 Lactobacillus plantarum Dobra identifikacija (92,1%)9 Lactobacillus reuteri neprihvatljiv profil

RC-14 Lactobacillus fermentum Vrlo dobra identifikacija (99,7%)GR-1 Lactobacillus rhamnosus Vrlo dobra identifikacija (91,8%)

25

Slika 4. Dendrogram priređen na temelju analize ukupnih staničnih proteina Lacobacillus i

Bifidiobacterium sojeva SDS-PAGE metodom (oznake, 1-16: probiotički sojevi prisutni u

probiotičkim nutraceutičkim proizvodima i tri referentna soja). Obrada podataka je priređena

primjenom Pearsonovog koeficijenta koleracije (r), a dendrogrami su izrađeni primjenom UPGMA

metode.

Slika 5. Dendrogram priređen na temelju analize provršinskih proteina Lacobacillus i

Bifidiobacterium sojeva SDS-PAGE metodom (oznake, 1-16: probiotički sojevi prisutni u

probiotičkim nutraceutičkim proizvodima i tri referentna soja). Obrada podataka je priređena

primjenom Pearsonovog koeficijenta koleracije (r), a dendrogrami su izrađeni primjenom UPGMA

metode.

26

4.2. EVALUACIJA OTPORNOSTI BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH


GASTROINTESTINALNOG TRAKTA

Narušavanje ravnoteže sastava intestinalne mikrobiote može uzrokovati različite poremećaje

GIT-a. Mnogi sojevi iz rodova Lactobacillus i Bifidobacterium su okarakterizirani kao probiotici

zbog dokazanih klinčkih učinaka na zdravlje domaćina, te se primjenjuju za ponovno uspostavljanje

te ravnoteže. Upravo zato, mnoga znanstvena istrživanja su usmjerena na karakterizaciju različitih

bakterijskih sojeva iz roda Lactobacillus ili Bifidobacterium kao probiotika s bioterapijskim

učincima (Šušković i sur., 2009). Mnogi od tih bakterijskih sojeva su već dostupni na tržištu u

obliku probiotičkih pripravaka, no da bi iskazali svoje funkcionalne učinke, moraju preživjeti

nepovoljne uvjete u GIT-u. Zato je cilj ovoga rada ispitati otpornost probiotičkih sojeva iz rodova

Lactobacillus i Bifidobacterium na uvjete GIT-a in vitro.

U GIT-u, koji je ciljno mjesto djelovanja ovih sojeva, prisutni su nepovoljni uvjeti u

usporedbi s uvjetima optimalnim za rast pojedinih bakterijskih sojeva, poput niskog pH, brzog

protoka i toksičnih žučnih soli. Preživljavanje nepovoljnih uvjeta u GIT-u, neophodna je

karakteristika probiotičkih sojeva. Glavnu prepreku njihovom preživljavanju osim kisele pH

vrijednosti u želucu, čine i probavni enzimi poput pepsina ili pankreatina (Kos i sur., 2003).

Stoga je kao bitno funkcionalno svojstvo u ovom radu, ispitana sposobnost preživljavanja

bakterijskih sojeva iz rodova Lactobacillus i Bifidobacterium u simuliranim uvjetima GIT-a.

Određeno je njihovo preživljavanje u simuliranom želučanom soku pri pH vrijednosti 2,0, te u

simuliranom soku tankog crijeva gdje se izlučuje sok gušterače i žuč. Ovisno o bakterijskom soju,

smrtnost bakterijskih stanica, izražena kao CFU/ml, izračunata kao razlika početnog broja

bakterijskih stanica i broja bakterijskih stanica koji je određen nakon njihovog izlaganja

nepovoljnim uvjetima GIT, se razlikovala (Tablica 6). Smrtnost probiotičkih sojeva tijekom 6 sati

izlaganja bakterijskih stanica simuliranim uvjetima GIT je u rasponu vrijednosti od 0,94 – 3,16 log

CFU/ml. Pri tome je smrtnost bakterijskih stanica za soj Bifidobacterium longum 3 u usporedbi s

preostalim sojevima bila najveća, a za soj Lactobacillus 2A najmanja. No, važno je naglasiti da

eksperimentalno određene vrijednosti smrtnosti bakterijskih sojeva u ovom diplomskom radu se

mogu okarakterizirati kao uspješno preživljavanje sojeva, jer je broj postignut nakon 6 sati

inkubacije u nepovoljnim uvjetima GIT-a za većinu bakterijskih sojeva iznosio iznad 106 CFU/ml,

što je u skladu sa zahtjevima za probiotičke sojeve.

27

Osim niskog pH i probavnih enzima, prepreku preživljavanju u GIT-u mogu činiti i visoke

koncentracije žučnih soli. Tolerancija na visoke koncentracije žuči jedan je od najvažnijih svojstava

probiotičkih bakterija, budući da ima učinak na preživljavanje u tankom crijevu, a time i na

iskazivanje funkcionalnih svojstava u GIT-u (Taranto i sur., 2003). Stoga je ispitana otpornost

bakterijskih sojeva iz rodova Lactobacillus i Bifidobacterium na žučne soli, nacjepljivanjem sojeva

na optimalne čvrste i tekuće MRS podloge s 0.3% ili 0.6% žučnih soli te je uspoređen njihov rast s

brojem poraslih bakterijskih kolonija na kontrolnim MRS podlogama pri optimalnim uvjetima

(Slike 6-8). Prema rezultatima, što je i za očekivati, dodatak određene koncentracije žučnih soli u

MRS hranjivu podlogu utjecao je na smanjenje prirasta biomase u usporedbi s kontrolom, odnosno

rasta bakterijskog soja u MRS hranjivoj podlozi (Slika 6). Između ispitivanih sojeva odabrana su tri

probiotička soja koja najuspješnije podnose dodane koncentracije žučnih soli u MRS tekućoj

hranjivoj podlozi tijekom 7 sati inkubacije pri 37°C, i radi se o Lactobacillus rhamnosus LGG,

Bifidobacterium longum 3 i Lactobacillus rhamnosus GR-1 (Slika 7). Tim sojevima je određeno i

preživljavanje, osim praćenjem apsorbancije uslijed zamućenja podloge za rast, nacjepljivanjem

alikvota stanica tijekom 7 sati (svakih sat vremena) na MRS kruti hranjivi agar (Slika 8). Dobiveni

rezultati bili su u skladu s rezultatima eksperimenata dobivenim turbidimetrijskom metodom

praćenjem apsorbancije.

Pri izboru sojeva za probiotičku upotrebu, jedan od važnih kriterija je mogućnost adhezije za

crijevni epitel (Kos i sur., 2003; Šušković i sur., 2009). Pri tome bakterijska stanica specifično

prepoznaje različite makromolekule intestinalnih epitelnih stanica kao moguće receptore. Stoga je

ispitana in vitro adhezija na glikoprotein mucin probiotičkih sojeva iz rodova Lactobacillus i

Bifidobacterium (Slika 9). Isti eksperiment je proveden na mikrotitarskim pločicama s 96 jažica

koje ne sadrže imobiliziran glikoprotein mucin, kao kontrolni test. Mucini su glikoproteini sluznice

i dio su dinamičnog, interaktivnog obrambenog sustava sluznice, te su prisutni na površini sluznice

GIT-a gdje predstavljaju mukozalnu barijeru između lumena i intestinalnih epitelnih stanica. Kao

takvi, mogu biti dio receptora intestinalnog tkiva domaćina kojeg prepoznaju različite

makromolekule na površini bakterijske stanice probiotičkih sojeva. Na temelju dobivenih rezultata,

u usporedbi s kontrolnim testom, ističu se probiotički sojevi Bifidobacterium sp. 8/2,

Bifidobacterium sp. 6B, Lactobacillus reuteri DSM 17938-4 i Bifidobacterium sp. 2B koji iskazuju

mogućnost interakcije s ovim glikoproteinom. Preostali ispitani bakterijski sojevi nisu iskazali

značajnu sposobnost vezanja in vitro na glikoprotein mucin (Slika 9).

28

Tablica 6. Broj poraslih bakterijskih kolonija (CFU/ml) na MRS krutoj hranjivoj podlozi i

izračunata smrtnost bakterijskih stanica ( log CFU/mL) nakon izlaganja stanica simuliranim

uvjetima GIT (direktan prijelaz iz simuliranog želučanog soka u simulirani sok tankog crijeva).

Bakterijski sojevi

Prijelaz iz želučanog soka u sok tankog crijeva (CFU/mL)

Želučani sok

(t=0 h)

Želučani sok

(t=2 h)Sok tankog

crijeva (t=4 h)Smrtnost stanica

log CFU/mL (0-6h)

Lactobacillus sp. 1 3,41x108 1,64x108 2,63x107 1,11Lactobacillus sp. 2A 3,53x108 8,14x107 2,96x107 1,08Lactobacillus sp. 2B 2,12x108 5,21x106 9,78x105 2,34Bifidobacterium sp. 3 2,52x108 7,496x107 1,75x105 3,16

Lactobacillus sp. 4 1,43x108 3,83x107 1,45x106 2,00Lactobacillus sp. 5/1 3,89x108 3,41x107 1,04x106 2,57Lactobacillus sp. 6B 1,94x108 5,84x106 4,25x105 2,6Lactobacillus sp. 7A 3,65x108 1,03x108 4,13x107 0,94Lactobacillus sp. 8/1 4,38x108 8,48x107 7,48x106 1,77Lactobacillus sp. 8/2 2,71x108 1,04x108 3,41x106 1,9Lactobacillus sp. 9 1,84x108 6,13x107 2,15x106 1,93

29

Slika 6. Usporedba rasta bakterijskih sojeva u optimalnoj MRS tekućoj podlozi i u istoj tekućoj podlozi uz dodatak 0,3% ili 0,6% žučnih soli. Sivo su

označeni bakterijski sojevi koji uspješnije preživljavaju dodatak žučnih soli u usporedbi s preostalim ispitivanim probiotičkim bakterijama.

30

Slika 7. Rast probiotičkih sojeva a) Lb. rhamnosus LGG i b) B. longum 3 c) Lb. rhamnosus

GR-1 u MRS tekućoj podlozi, te u MRS tekućoj podlozi uz dodatak 0,3% ili 0,6% žučnih

soli, praćen tijekom 7 sati inkubacije bakterijskih sojeva pri 37ºC.

31

Slika 8. Preživljavanje bakterijskih kolonija a) Lb. rhamnosus LGG b) Lb. rhamnosus GR-1 i

c) B. longum 3, poraslih na MRS krutoj hranjivoj podlozi nakon inokulacije u MRS tekuću

podlogu, te u MRS tekuću podlogu s 0,3% ili 0,6% žučnih soli, određeno tijekom 7 sati

inkubacije bakterijskih sojeva pri 37ºC.

32

a)

1 2A 2B

34

5/1 6B

8/1 8/2

9 GR1

RC14E. coli ATCC

0 0.2 0.4 0.6 0.8

kontrola

OD 620 nm

b)

1 2A 2B

34

5/1 6B

8/1 8/2

9 GR1

RC14E. coli ATCC

0 0.2 0.4 0.6 0.8

OD 620 nm

Slika 9. In vitro adhezija probiotičkih sojeva ispitana na mikrotitarskim pločicama s 96 jažica

a) kontrola; prazne jažice b) mucin; jažice sadrže imobilizirani mucin.

33

5. RASPRAVA

5.1. KARAKTERIZACIJA BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ NUTRACEUTIČKIH

PROBIOTIČKIH PRIPRAVAKA

Probiotik je jedna ili više kultura živih mikroorganizama koji, primjenjeni u ljudi i

životinja, djeluju korisno na domaćina poboljšavajući svojstva autohtone mikroflore

probavnog sustava domaćina (Šušković, 1996). Probiotički nutraceutički proizvodi koji

sadrže pojedinačne ili nekoliko različitih sojeva probiotičkih bakterija, značajno su prisutni

na tržištu, a kako se radi o proizvodima koji se primjenjuju za profilaksu ili terapiju različitih

zdravstvenih poremećaja i to ne samo kod odraslih, već i kod djece i dojenčadi, neophodna je

ispravna taksonomska identifikacija na razini soja i označavanje prisutnih bakterijskih sojeva,

te određivanje broja poraslih kolonija (CFU/ml) iz određene količine probiotičkih pripravaka,

što sve, prema legislativi, treba biti navedeno na deklaraciji proizvoda (Šušković i sur., 2009).

Zbog velike komercijalizacije probiotičkih pripravaka, Europska agencija za sigurnost

hrane (engl. EFSA-European Food Safety Authority) je izdala upute za znanstvenu provjeru

zdravstvenih tvrdnji koje se navode na deklaraciji proizvoda. U velikom broju ispitivanih

probiotičkih proizvoda pojavljuju se nepodudaranja između dobivenih rezultata i

deklariranog sadržaja probiotičkih sojeva. Stoga je u Europi pokrenuta inicijativa

reidentifikacije bakterijskih sojeva koji se koriste kao probiotici da bi se osnovala banka

probiotičkih sojeva kao temelj za daljnja istraživanja. Budući da postoje mnoga znanstvena

istraživanja koja upućuju na čestu pojavu nepravilnog označavanja probiotičkih sojeva u

komercijalnim proizvodima, cilj ovog diplomskog rada je bio sakupiti nekoliko komercijalno

dostupnih probiotičkih pripravaka na hrvatskom tržištu, kako bi se provela reidentifikacija

bakterijskih sojeva koji su prisutni, prema deklaraciji, u tim proizvodima. No, prije

definiranja funkcionalnih učinaka, najvažniji opći kriterij za odabir probiotičkih sojeva je

ispravna taksonomska identifikacija. Stoga je jedan od ciljeva ovog rada identifikacija

bakterijskih sojeva izoliranih iz probiotičkih nutraceutičkih proizvoda primjenom fenotipskih

metoda kao brzih, učinkovitih i ekonomičnih pristupa za rutinsku analizu velikog broja

bakterijskih sojeva. Pri tome su korištene konvencionalne mikrobiološke metode i fenotipske

metode, poput API 50 CHL i BBL CRYSTAL GP testova za određivanje fementacijskih

profila različitih metabolita, te SDS PAGE analiza ukupnih staničnih i površinskih proteina.

Naime, na deklaracijama sakupljenih probiotičkih nutraceutičkih proizvoda, navedeno

je da sadrže jedan ili više bakterijskih sojeva koji pripadaju rodu Lactobacillus, odnosno

Bifidobacterium, zbog čega su prilikom izolacije pojedinačnih kolonija korištene MRS

34

hranjiva podloga selektivna za rast Lactobacillus vrsta, te TOS-propionat podloga koja se

koristi kao selektivna podloga za rast Bifidobacterium vrsta. Izolacija čistih probiotičkih

sojeva je provedena odabirom optimalnih temperatura i količini kisika prema bakterijskim

sojevima navedenim na liofiliziranim pripravcima. Radi se o 37ºC i anerobnim uvjetima.

Nakon izolacije, odabrani su izolirani bakterijski sojevi za reidentifikaciju i fenotipsku

karakterizaciju s oznakama: 1-LGG, 2A, 2B, 3, 4, 5, 6B, 7A, 8/1, 8/2, 9, RC-14 i GR-1.

Sojevi 2A i 2B, te 8/1 i 8/2, su izolirani iz istih proizvoda, ali s različitih hranjivih podloga

zbog čega se pretpostavljalo da pripadaju različitim rodovima.

Tijekom rasta i fermentacije bakterije mliječne kiseline, a i pripadnici roda

Bifidobacterium proizvode značajne količine organskih kiselina, osobito mliječne kiseline.

Upravo zato za navedene bakterije su određeni postotak proizvedene mliječne kiseline,

stupanj kiselosti i pH vrijednosti nakon prekonoćnog uzgoja probiotičkih sojeva u MRS

tekućoj podlozi. Mliječna kiselina je primarni metabolit koji se sintetizira u eksponencijalnoj

fazi rasta BMK (Kos i sur., 2003). Sinteza mliječne kiseline, osim što može upućivati na

pripadnost jednom od rodova BMK, ili rodu Bifidobacterium, tkđ. doprinosi važnom

funkcionalnom učinku probiotičkih bakterija, a to je antimikrobno djelovanje. Naime,

lipofilna kiselina kao što je mliječna u nedisociranom obliku, može prodrijeti u stanicu

mikroorganizma i interferirati s osnovnim staničnim metabolizmom, te sniziti intracelularni

pH u stanici patogenog soja (Šušković i sur., 2010). Iz priloženih rezultata (Tablica 3) se

jasno vidi da su svi bakterijski sojevi, osim soja 3, proizveli visoku koncentraciju mliječne

kiseline te u skladu s tim snizili pH vrijednost odnosno povećali stupanj kiselosti hranjive

podloge. pH vrijednosti određene u supernatantu kulture pojedinog soja se kreću u rasponu

od 3,74 do 4,38. Izolirani probiotički sojevi su klasičnim mikrobiološkim metodama

okarakterizirani kao nesporogene i katalaza-negativne bakterije (Tablica 2), što odgovara

općim karakteristikama BMK, ali i bakterijama iz roda Bifidobacterium. Osim toga

mikroskopiranjem je ustanovljeno da su to gram pozitivne bakterije koje imaju morfološki

oblik kratkih ili dužih štapića.

Daljnja fenotipska karakterizacija izoliranih sojeva je provedena ispitivanjem

učinkovitosti fermentacije različitih izvora ugljika i to primjenom API 50 CHL testa koji

služi za identifikaciju Lactobacillus vrsta. Korišteni su svi sojevi osim soja 2B, 3 i 7 za koje

se pretpostavljalo da pripadaju rodu Bifidobacterium, prilikom čega je soj 3 identificiran kao

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, što je ujedno navedeno na deklaraciji

probiotičkog nutraceutičkog proizvoda. Na temelju eksperimentalno dobivenih profila

35

fermentacije ugljikohidrata i postojeće baze podataka API sustava, provedena je identifikacija

ispitivanih probiotičkih sojeva. Sojevi 5 i RC-14 su identificirani kao Lactobacillus

fermentum, a GR-1 kao Lactobacillus rhamnosus, što odgovara deklaraciji proizvoda. Na

temelju API sustava sojevi 8/1 i 8/2 su identificirani kao Lactobacillus plantarum, dok je soj

6 identificiran kao Lactobacillus paracasei. Prema deklaraciji za sojeve 8/1 i 8/2 navedeno je

da su unutar probiotičkog pripravka prisutni Lactobacillus acidophilus LA-5 i

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, dok je s druge strane navedeno da se unutar

pripravka sa sojem 6 nalazi nekoliko Lactobacillus vrsta. Za sojeve 1-LGG te 2A je

potvrđeno da se radi o istom soju iz roda Lactobacillus, no primjenom API 50 CHL testa

identifikacija je okarakterizirana kao neprihvatljiv profil za Lactobacillus paracasei vrstu te

stoga možemo zaključiti da se radi o vrsti Lactobacillus rhamnosus, što je ujedno navedeno

na deklaraciji probiotičkog pripravka. Prilikom identifikacije sojeva 4 i 9 primjenom API

sustava ustanovljen je neprihvatljiv profil, no možemo tvrditi da pripadaju vrsti Lactobacillus

reuteri budući da u bazi podataka API sustava ne postoji fermentacijski profil za

Lactobacillus reuteri vrstu, a na temelju eksperimentalno dobivenih podataka (Tablica 5)

možemo definitivno potvrditi da se radi o bakterijskim sojevima iz roda Lactobacillus.

Nakon pripreme ekstrakata ukupnih staničnih i površinskih proteina, provedena je

SDS-PAGE metoda te su sukladno dobivenim proteinskim profilima (Slika 4 i Slika 5),

izrađeni dendrogrami primjenom UPGMA metode. Slika 4. prikazuje tri grupacije unutar

dendrograma koje ukazuju na međusobnu sličnost proteinskih profila između ispitivanih

probiotičkih sojeva. Slika 5. prikazuje tri grupacije unutar kojih se postiže 90%-tna sličnost

proteinskih profila između ispitivanih probiotičkih sojeva. Koeficijenti korelacije između

pojedinih grupacija probiotičkih sojeva na dendrogramu su iznad 85%, te su sojevi u

konačnici svrstani u dva roda Lactobacillus i Bifidobacterium.

5.2. OTPORNOSTI BAKTERIJSKIH SOJEVA IZ PROBIOTIČKIH


GASTROINTESTINALNOG TRAKTA

Mikrobiota GIT-a čovjeka nužna je za pravilno funkcioniranje organizma zbog niza

važnih učinaka ove kompleksne mikrobne zajednice na zdravlje čovjeka (Šušković i sur.,

2009). Međutim, kada nastupi narušavanje ravnoteže sastava mikrobiote GIT-a zbog

prisutnosti patogenih mikroorganizama i dugotrajne primjerice terapije antibioticima, može

36

doći do neželjenih učinaka na ljudski organizam, što može uzrokovati različite intestinalne

poremećaje. Upravo zato da bi se uspostavila ponovna ravnoteža intestinalne mikrobiote GIT-

a, primjenjuju se probiotički sojevi. Većinom su probiotički sojevi okarakterizirani iz rodova

BMK, a isto tako vrlo često iz roda Bifidiobacterium (Šušković i sur., 2009). Bakterije iz roda

Lactobacillus i Bifidobacterium, osim što su važni industrijski mikroorganizmi koji imaju

mogućnost biotehnološke proizvodnje specifičnih metabolita, prepoznate su i kao važne

probiotičke kulture, koje iskazuju poželjne funkcionalne učinke na organizam domaćina, što

otvara mogućnost njihove primjene kao bioterapeutika (Šušković i sur., 2010).

Prilikom primjene ovih sojeva kod domaćina, prvu prepreku za iskazivanje

funkcionalnih učinaka predstavlja preživljavanje nepovoljnih uvjeta GIT-a. Uvjeti niskih pH

vrijednosti, odnosno preživljavanje u uvjetima kiselog mikrookoliša je vrlo često izazov za

BMK. Osim toga, poboljšanje otpornosti probiotičkih sojeva na visoke koncentracije kiseline

ključno je u primjeni BMK kao bioterapeutika (Kos i sur., 2003; Šušković i sur., 2009). Javno

dostupni, potpuno sekvencionirani genomi BMK doprinose razjašnjavanju molekularne

biologije BMK, a razvoj i primjena post-genomičkih pristupa ubrzali su identifikaciju gena i

proteina koji su ključni za odgovor i adaptaciju bakterijskih stanica na različite nepovoljne,

stresne uvjete. Ove spoznaje doprinose razvoju stategija koje će omogućiti povećanu

otpornost BMK u nepoželjnim uvjetima, što je osobito značajno prilikom iskazivanja

funkcionalnosti probiotičkih sojeva u GIT-u čovjeka. Navedeni sistemski biološki pristup uz

primjenu mikrobioloških i molekularnih tehnika omogućuju razvoj BMK s povećanom

otpornošću na nepovoljne uvjete s ciljem osiguravanja funkcionalnosti probiotičkih sojeva s

bioterapijskim učincima.

Zato je preživljavanje u nepovoljnim uvjetima prisutnim u GIT-u je jedan od prvih

izbornih kriterija prilikom odabira pojedinog bakterijskog soja da bi se mogao definirati kao

probiotički (Serrazanetti i sur., 2009, Šušković i sur., 2010). Zato je u ovom diplomskom radu

ispitano preživljavanje izoliranih probiotičkih sojeva iz rodova Lactobacillus i

Bifidobacterium u in vitro simuliranom želučanom soku i simuliranom soku tankog crijeva, te

tolerancija na žučne soli. Adhezija na površinu epitelnih stanica bitan je preduvjet za

kolonizaciju probiotiotičkih sojeva u GIT i omogućava djelovanje probiotika na crijevnu

mikrofloru i imunološki sustav domaćina (Kos i sur., 2003). Zato je ispitana mogućnost in

vitro adhezije na glikoprotein mucin. Mucin je prisutan kao jedna od strukturnih

komponenata na površini sluznice GIT-a, gdje čini dio intestinalne barijere, te postoji

mogućnost da ova molekula ima ulogu receptora za adhezine probiotičke bakterije.

37

Primjenom eksperimentalnih metoda u ovom radu se ustanovilo da su ispitane

probiotičke bakterije otporne na žučne soli i sposobne za rast u njihovoj prisutnosti (Slike 6

do 8). Između ispitanih sojeva, Lactobacillus rhamnosus LGG, Bifidobacterium longum i

Lactobacillus rhamnosus GR-1 pokazuju najbolju toleranciju na žučne soli. Žuč igra važnu

ulogu u fiziologiji crijevnih bakterija i utječe na njihovu funkcionalnost. To je posebno važno

za probiotičke bakterije jer njihovi pozitivni učinci ne smiju biti ometani u prisustvu ove

fiziološke tekućine. Prisutnost žučnih soli utječe na aktivnosti intestnalnih laktobacila i

bifidobakterija te su čak neke od tih aktivnosti, kao što je asimilacija kolesterola, izravno

povezane s metabolizmom žučne soli kod tih bakterija. Razumijevanje mehanizama zbog

kojih probiotičke bakterije mogu preživjeti stres uzrokovan žučnim solima još uvijek se

istražuju (Taranto i sur., 2003).

Svi ispitani sojevi preživljavaju u želučanom soku i soku tankog crijeva, što znači da

ujedno dobro podnose niske pH vrijednosti prisutne u tim uvjetima. Treba naglasiti da sojevi

Lactobacillus rhamnosus LGG-1, Lactobacillus sp. 2A i Lactobacillus sp. 8 iskazuju

najmanju smrtnost (log CFU/ml), odnosno najotporniji su na simulirane uvjete GIT-a, dok su

bakterije Bifidobacterium longum, Lactobacillus sp. 5/1 i Bifidobacterium sp. 6B nešto

osjetljivijije na prisutne uvjete. Ispitani sojevi većinom nemaju značajnu sposobnost vezanja

in vitro na glikoprotein mucin. Ipak, probiotički sojevi Bifidobacterium sp. 8/2,

Bifidobacterium sp. 6B, Lactobacillus reuteri DSM 17938-4 i Bifidobacterium sp. 2B

iskazuju mogućnost interakcije s ovim glikoproteinom. Adhezija na površinu intestinalne

sluznice interakcijom bakterijskih stanica s mucinom ili proteinima ekstracelularnog matriksa

može biti važan preduvjet za kolonizaciju probiotičkih sojeva u intestinalnom lumenu, koji

može omogućiti ovim bakterijama i kompetitivnu prednost pred drugim mikroorganizmima u

takvom ekosustavu (Šušković i sur., 2010)

Prema rezultatima, ispitane bakterije iz roda Lactobacillus i Bifidobacterium,

zadovoljavaju važan uvjet prilikom selekcije probiotičkih sojeva jer preživljavaju u

nepovoljnim uvjetima GIT-a domaćina (niski pH, visoke koncetracije žučne soli, prisutnost

probavnih enzima) i pri tome pojedini sojevi iskazuju mogućnost adhezije na mucin in vitro;

što je jedan od glavnih kriterija za izbor probiotika u svrhu prirodnog uspostavljanja i

održavanja ravnoteže crijevne mikrobiote.

Analiza otpornosti na uvjete GIT-a sojeva iz roda Lactobacillus i Bifidobacterium

pokazuje da su svi sojevi tolerantni na ekstremne uvjete GIT-a, odnosno preživljavaju u

kiseloj sredini, pri visokim koncetracijama žučne soli i u prisutnosti probavnih enzima. Može

38

se zaključiti da ispitani sojevi zadovoljavaju važan selektivni kriterij za odabir probiotičkih

sojeva te se mogu primijeniti kao probiotički nutraceutički proizvodi koji se odlikuju

uspješnim preživljavanjem u simuliranim uvjetima GIT-a.

39

6. ZAKLJUČCI

1. Probiotički sojevi izolirani iz nutraceutičkih proizvoda, nakon rasta na selektivnim

krutim hranjivim podlogama, porasli su u visokom broju (najmanje 106 CFU/ml), što

je u skladu s deklaracijom navedenom na proizvodu. Provedbom konvencionalnih

mikrobioloških metoda, ustanovljeno je da su svi sojevi gram-pozitivne bakterije

morfologije kraćih ili dužih štapića, koje su nesporogene, katalaza-negativne i koje

uspješno rastu pri 37˚C u anaerobnim uvjetima.

2. Svi ispitivani sojevi, osim soja Bifidobacterium 3, proizvode visoke koncentracije

mliječne kiseline i snižavaju pH vrijednost podloge.

3. Uspješno je provedena fenotipska identifikacija sojeva Lactobacillus vrsta pomoću

API 50 CHL testa te sojeva iz roda Bifidobacterium pomoću BBL CRYSTALTM GP,

što je potvrđeno i analizom proteinskih profila dobivenih SDS PAGE elektroforezom

ukupnih staničnih i površinskih proteina, jer su sojevi grupirani izradom dendrograma

pomoću Gel Compare II programskog sustava u rodove Lactobacillus i

Bifidobacterium.

4. Ispitivani sojevi uspješno preživljavaju u simuliranom želučanom soku i simuliranom

soku tankog crijeva. Inkubacijom sojeva u MRS tekućoj podlozi s 0,3% ili 0,6%

žučnih soli, ustanovljeno je dodatak žučnih soli u MRS podlogu utječe na smanjenje

prirasta biomase u usporedbi s kontrolom. Dodatak žučnih soli najbolje podnose

Lactobacillus rhamnosus LGG, Bifidobacterium longum 3 i Lactobacillus rhamnosus

GR-1.

5. Među ispitanim sojevima, Bifidobacterium sp. 8/2, Bifidobacterium sp. 6B,

Lactobacillus reuteri DSM 17938-4 i Bifidobacterium sp. 2B pokazuju mogućnost

interakcije s glikoproteinom mucinom in vitro.

40

7. LITERATURA

Andersen, J. M., Barrangou, R., Hachem, M. A, Lahtinen, S. J., Goh, Y. J., Svensson, B.,

Klaenhammer, T. R. (2012) Transcriptional analysis of prebiotic uptake and catabolism by

Lactobacillus acidophilus NCFM. PLoS ONE. 7(9)

Andersen, J. M., Barrangou, R., Abou-Hachem, M., Lahtinen, S. J., Goh, Y. J., Svensson, B.,

Klaenhammer, T. R. (2013) Transcriptional analysis of oligosaccharide utilization by

Bifidobacterium lactis Bl-04. BMC Genom. 14, 312.

Antikainen, J., Anton, L., Sillanpaa, J., Korhonen, T. K. (2002) Domains in the S-layer

protein CbsA of Lactobacillus crispatus involved in adherence to collagens, laminin and

lipoteichoic acids and in self-assembly. Mol. Microbiol. 46 (2), 381-394.

Beganović, J., Frece, J., Kos, B., Leboš Pavunc, A., Habjanič, K., Šušković, J. (2011)

Functionality of the S-layer protein from the probiotic strain Lactobacillus helveticus M92.

Antonie van Leeuwenhoek, Intern. J. General Mol. Microbiol. 100(1), 43-53.

Belanger, A. E., Hatfull, G. F. (1999) Exponential-phase glycogen recycling is essential for

growth of Mycobacterium smegmatis. J. Bacteriol. 181(21), 6670-6678.

Bercik, P., Collins, S. M., Verdu, E. F. (2012) Microbes and the gut-brain axis.

Neurogastroenterol. Motil. 24(5), 405-413.

Bron, P. A., Grangette, C., Mercenier, A., de Vos, W. M., Kleerebezem, M. (2004)

Identification of Lactobacillus plantarum genes that are induced in the gastrointestinal tract

of mice. J. Bacteriol. 186(17), 5721-5729.

Bron, P. A., Molenaar, D., de Vos, W. M., Kleerezebem, M. (2006) DNA micro-array-based

identification of bile-responsive genes in Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol.

100(4), 728-738.

Bron, P. A., van Baarlen, P., Kleerebezem, M. (2012) Emerging molecular insights into the

interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nat. Rev. Microbiol. 10(1): 66-

78.

Buck, B. L., Altermann, E., Svingerud, T., Klaenhammer, T. R. (2005) Functional analysis of

putative adhesion factors in Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ. Microbiol.

71(12), 8344–8351.

41

Corcoran, B. M., Stanton, C., Fitzgerald, G. F., Ross, R. P. (2007) Growth of probiotic

lactobacilli in the presence of oleic acid enhances subsequent survival in gastric juice.

Microbiology 153(1), 291-299.

Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. (2005) Bacteriocins: developing innate immunity for food.

Nat. Rev. Microbiol. 3(10), 777-788.

Douglas, G. L., Klaenhammer, T. R. (2010) Genomic evolution of domesticated

microorganisms. Annu. Rev. Food. Sci. Technol. 1, 397-414.

FAO/WHO (2002) Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. FAO/WHO,

London/Ontario.

Favier, C. F., Vaughan, E. E., De Vos, W. M., Akkermans, A. D. (2002) Molecular

monitoring of succession of bacterial communities in human neonates. Appl. Environ.

Microbiol. 68(1), 219-226.

Fozo, E. M, Kajfasz, J. K., Quivey, R. G. (2004) Low pH-induced membrane fatty acid

alterations in oral bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 238, 291-295.

Goh, Y. J., Klaenhammer, T. R. (2010) Functional roles of aggregation-promoting-like factor

in stress tolerance and adherence of Lactobacillus acidophilus NCFM. Appl. Environ.

Microbiol. 76(15), 5005-5012.

Goh, Y. J., Klaenhammer, T. R. (2013) A functional glycogen biosynthesis pathway in

Lactobacillus acidophilus: expression and analysis of the glg operon. Mol. Microbiol. 89(6),

1187-1200.

Gueimonde, M., Garrigues, C., van Sinderen, D., de los Reyes-Gavilan, C. G., Margolles, A.

(2009) Bile-inducible efflux transporter from Bifidobacterium longum NCC2705, conferring

bile resistance. J. Bacteriol. 75(10), 3153-3160.

He, F., Ouwehan, A. C., Hashimoto, H., Isolauri, E., Benno, Y., Salminen, S. (2001)

Adhesion of Bifidobacterium spp. to human intestinal mucus. Microbiol. Immunol. 45(3),

259-262.

Hungin, A. P., Mulligan, C., Pot, B., Whorwell, P., Agreus, L., Fracasso, P, Lionis, C.,

Mendive, J., de Philippart Foy, J. M., Rubin, G., Winchester, C., Wit, N., European Society

for Primary Care, G. (2013) Systematic review: probiotics in the management of lower

42

gastrointestinal symptoms in clinical practice-an evidence-based international guide. Aliment.

Pharmacol. Ther. 38(8), 864-886.

Johnson, B. R., Klaenhammer, T. R. (2014) Impact of genomics on the field of probiotic

research: historical perspectives to modern paradigms. Antonie van Leeuwenhoek 106, 141-

156.

Kankainen, M., Paulin, L., Tynkkynen, S., von Ossowski, I., Reunanen, J., Partanen, P.,

Satokari, R., Vesterlund, S., Hendrickx, A. P., Lebeer, S., De Keersmaecker, S. C.,

Vanderleyden, J., Hamalainen, T., Laukkanen, S., Salovuori, N., Ritari, J., Alatalo, E.,

Korpela, R., Mattila-Sandholm, T., Lassig, A., Hatakka, K., Kinnunen, K. T., Karjalainen, H.,

Saxelin, M., Laakso, K., Surakka, A., Palva, A., Salusjarvi, T., Auvinen, P., de Vos, W. M.

(2009) Comparative genomic analysis of Lactobacillus rhamnosus GG reveals pili containing

a human-mucus binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106(40), 17193-17198.

Kos, B. (2001): Probiotic concept: in vitro investigation with selected lactic acid bacteria.

PhD Thesis, Faculty of Food Technology and Biotechnology, University of Zagreb.

Kos, B., Šušković, J., Vuković, S., Šimpraga, M., Frece, J., Matošić, S. (2003) Adhesion and

aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J. Appl. Microbiol. 94,

981-987.

Lebeer, S.,Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S. C. (2008) Genes and molecules of

lactobacilli supporting probiotic action. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72(4), 728-764.

Metchnikoff, E. (1907) The prolongation of life: optimistic studies, William Heinemann,

London.

O’Flaherty, S., Klaenhammer, T. R. (2012) Influence of exposure time on gene expression by

human intestinal epithelial cells exposed to Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ.

Microbiol. 78(14), 5028-5032.

Pfeiler, E. A., Klaenhammer, T. R. (2009) Role of transporter proteins in bile tolerance of

Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 75(18), 6013-6016.

Porter, C. K., Gormley, R., Tribble, D. R., Cash, B. D., Riddle, M. S. (2011) The Incidence

and gastrointestinal infectious risk of functional gastrointestinal disorders in a healthy US

adult population. Am. J. Gastroenterol. 106(1), 130-138.

43

Rettger LF, Cheplin HA (1921) A treatise on the transformation of the intestinal flora, with

special reference to implantation of Bacillus acidophilus, Yale University Press, New Haven.

Selle, K., Klaenhammer, T. R. (2013) Genomic and phenotypic evidence for probiotic

influences of Lactobacillus gasseri on human health. FEMS Microbiol. Rev. 37(6), 915-935.

Servin, A. L. (2004) Antagonistic activities of Lactobacilli and Bifidobacteria against

microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28(4), 405-440.

Shortt, C. (1999) The probiotic century: historical and current perspectives. Trends Food Sci.

Technol. 10, 411-417.

Šušković, J. (1996): The growth and probiotic effect of chosen lactic acid bacteria, PhD

Thesis, Faculty of Food Technology and Biotechnology, University of Zagreb.

Šušković, J., Kos, B., Frece, J., Beganović, J., Leboš Pavunc, A. (2009) Probiotički koncept-

probiotici kao dodaci hrani i probiotici kao bioterapeutici. Hrvatski časopis za prehrambenu

tehnologiju, biotehnologiju i nutricionizam. 4, 3-4; 77-84.

Šušković, J., Kos, B., Beganović, J., Leboš Pavunc, B., Habjanič, K., Matošić, S. (2010)

Antimicrobial Activity-The Most Important Property of Probiotic and Starter Lactic Acid

Bacteria, Food. Technol. Biotechnol. 48(3), 296-307.

Taranto, M. P., Fernandez Murga, M. L, Lorca, G., de Valdez, G. F. (2003) Bile salts and

cholesterol induce changes in the lipid cell membrane of Lactobacillus reuteri. J. Appl.

Microbiol. 95(1), 86-91.

Tuomola, E. M., Salminen, S. J. (1998) Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus

strains to Caco-2 cell cultures. Int. J. Food. Microbiol. 41(1), 45-51.

Turroni, F., Taverniti, V., Ruas-Madiedo, P., Duranti, S., Guglielmetti, S., Lugli, G. A.,

Gioiosa, L., Palanza, P., Margolles, A., van Sinderen, D., Ventura, M. (2014)

Bifidobacterium bifidum PRL2010 modulates the host innate immune response. Appl.

Environ. Microbiol. 80(2), 730-740.

van Baarlen, P., Troost, F., van der Meer, C., Hooiveld, G., Boekschoten, M., Brummer, R.

J., Kleerebezem, M. (2011) Human mucosal in vivo transcriptome responses to three

Lactobacilli indicate how probiotics may modulate human cellular pathways. Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 108, 4562-4569.

44

van Pijkeren, J. P., Canchaya, C., Ryan, K. A., Li, Y., Claesson, M. J., Sheil, B., Steidler, L.,

O’Mahony, L., Fitzgerald, G. F., van Sinderen, D., O’Toole, P. W. (2006) Comparative and

functional analysis of sortase-dependent proteins in the predicted secretome of Lactobacillus

salivarius UCC118. Appl. Environ. Microbiol. 72(6), 4143-4153.

Velez, M. P., De Keersmaecker, S. C., Vanderleyden, J. (2007) Adherence factors of

Lactobacillus in the human gastrointestinal tract. FEMS Microbiol. Lett. 276(2), 140-148.

Ventura, M., Canchaya, C., Del Casale, A., Dellaglio, F., Neviani, E., Fitzgerald, G. F., van

Sinderen, D. (2006) Analysis of bifidobacterial evolution using a multilocus approach. Int. J.

Syst. Evol. Microbiol. 56, 2783-2792.

Zhou, M., Theunissen, D., Wels, M., Siezen, R. J. (2010) LAB-Secretome: a genome-scale

comparative analysis of the predicted extracellular and surface-associated proteins of lactic

acid bacteria. BMC Genom 11, 651.

45

Documents

REIDENTIFICATION OF BACTERIAL STRAINS FROM PROBIOTIC