ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1

Rekayasa Genetika Pseudomonas putida KT2442 untuk Biotransformation of Senyawa Aromatik menjadi Chiral Cis-Diols

1. Tujuan Rekayasa Genetika Tujuan dari rekayasa genetika yang dilakukan adalah memasukkan gen yang dapat meningkatkan konsumsi Oksigen Pseudomonas putida sehingga dapat digunakan untuk biotransformasi senyawa aromatik menjadi produk berupa senyawa cis-diol melalui proses cis-dihidroksilasi dengan yield yang besar. 2. Latar Belakang Senyawa aromatik (benzena dan turunannya) merupa senyawa yang toksik bagi mikroorganisme. Meskipun demikian, benzena dapat dengan mudah dihidroksilasi oleh bakteri yang memiliki enzim TDO (Toluen dioksigenase) sehingga kontaminasi karena senyawa aromatik dapat dihindari. Reaksi yang diharapkan berlangsung untuk menghasilkan senyawa benzena cis- diol ditunjukkan oleh gambar 1. Jika benzena ditambahkan dalam jumlah yang kecil, maka senyawa benzena cis diols yang dihasilkan juga sedikit. Senyawa benzena cis-diols memiliki nama IUPAC cis-cyclohexa-3,5-diene-1,2-diol, berguna sebagai ligan pada enzim. Dalam reaksi ini, oksigen merupakan faktor kunci yang mempengaruhi reaksi dihidroksilasi.

Gambar 1 Reaksi biotransformasi senyawa aromatik benzena menjadi senyawa cis-diol

(Ouyang dkk., 2007)

3. Mikroorganisme Target Mikroorganisme yang akan direkayasa adalah Pseudomonas putida. Gambar 2 menunjukkan bentuk batang dari P.putida yang juga merupakan bakteri gram negatif.

Gambar 2 Pseudomonas putida

(Sumber : http://enfo.agt.bme.hu/)

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1Taksonomi untuk P.putida KT2442, Domain: Bacteria Filum: Proteobacteria Kelas: Gamma proteobacteria Ordo: Pseudomonadales Famili: Pseudomonadaceae Genus: Pseudomonas Spesies: Pseudomonas putida 4. Sumber Gen Tambahan Gen yang ditambahkan disebut Vitreoscilla hemoglobin (VHb). Gen ini ditambahkan untuk meningkatkan penggunaan oksigen yang akan meningkatkan kecepatan reaksi dihidroksilasi substrat.

Gambar 3 Vitreoscilla

(Sumber : http://www.sciencephoto.com/) Taksonomi Vitreoscilla adalah, Kingdom: Bacteria Filum: Proteobacteria Kelas: Betaproteobacteria Ordo: Neisseriales Famili: Neisseriaceae atau Vitreoscillaceae Genus: Vitreoscilla 5. Susunan gen yang Ditambahkan Tabel 1 menunjukkan plasmid yang digunakan dalam rekayasa genetik ini. Dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR), fragmen DNA dari P. putida KT2442 diamplifikasi dengan menggunakan dua primer, yaitu 5 primer AGA AAGCTT ACCGGCAGCAAGGAC dan 3 primer GAG GCTAGC ATCCAGTCAGCAGCTC. Gambar 4 menunjukkan plasmid pUC18 yang diambil bagian lacZ mob site sacB sehingga menjadi pK18mobsacB.

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1

Tabel 1 Plasmid yang Digunakan Dalam Rekayasa Genetika Plasmid Karakteristik Referensi pSPM01 Kmr, tac promoter dan todC1C2BA genes Ouyang dkk., 2006 pK18mobsacB Turunan Kmr pUC18 lacZ mob site sacB Schafer dkk., 1994 pSPK01 Turunan dari pK18mobsacB, pha operon

parsial P. p KT2442 dimasukkan Ouyang dkk., 2007

pSPK02 Turunan dari pK18mobsacB, pha operon parsial P. p KT2442 dimasukkan

Ouyang dkk., 2007

pSPK03 vgb operon dari pBR322-vgb dikloning dan dimasukkan ke pSPK02 pvuI

Ouyang dkk., 2007

pBBR322-vgb Vgb operon, Ampr Ouyang dkk., 2005

Gambar 4 Susunan DNA pada plasmid pUC18 (Sumber : http://www.thermoscientificbio.com/)

Plasmid yang telah dikonstruksi dimasukkan ke Escherichia coli S17-1 yang digunakan sebagai strain pendonor dalam transformasi konjugasi.

6. Metode yang Digunakan untuk Rekayasa Genetika Metode knockout mutan digunakan dalam rekayasa genetika ini. Metode ini membuat gen yang dimutasi menjadi tidak berfungsi. P. putida KT2442 yang menjadi sasaran rekayasa genetika

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1plasmidnya dikonstruksi pada bagian operon pha sehingga menjadi P.putida KTOY01, kemudian kemudian mengalami pemotongan yang kedua sehingga terbentuk mutan P. putida KTOY02. Gambar 5 menunjukkan tahapan pemotongan operon pha yang dilakukan pada plasmid P.putida KT2442.

Gambar 5 (A) Operon pha pada P.putida KT2442 (B) Operon pha pada P.putida KTOY01 (C)

Operon pha pada P.putida KTOY02 (Sumber : Ouyang dkk., 2007)

7. Cara klarifikasi Klarifikasi dilakukan dengan menambahkan senyawa turunan benzene ke dalam medium dalam jumlah yang divariasikan. Biotransformasi dibiarkan terjadi selama 12 jam. Setelah itu, kultur disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dan dilarutkan dalam H2O/MeOH (50/50, v/v) kemudian dilakukan analisa dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan laju 0,6 ml/menit. Senyawa cis-diols terdeteksi pada 254 nm Pustaka Ouyang, S.P., dkk. 2005. Genetic Engineering of Pseudomonas putida KT2442 for Biotransformation of Aromatic Compounds to Chiral Cis-Diols . Journal of Biotechnology 132 (2007) 246250.

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1

Metode Rekayasa Genetika Metode rekayasa dibagi menjadi tiga, metode plasmid, metode pembawa (vector), dan metode biolistik (biolistic/bioballistic). 1. Metode Plasmid Metode plasmid banyak digunakan untuk merekayasa genetika pada mikroorganisme. Metode ini memanfaatkan plasmid sebagai rangkaian DNA berbentuk lingkaran yang dapat dimodifikasi. Metode ini menggunakan enzim restriksi untuk memotong gen pada bagian yang diinginkan. Enzim yang digunakan untuk menyambun gen disebut enzim ligase. Untuk memperbanyak gen yang diinginkan dapat digunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction), pemisahannya dapat dilakukan dengan elektroforesis. Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam metode ini adalah - Pemotongan susunan DNA yang diinginkan dari plasmid menggunakan enzim restriksi. - Susunan DNA yang telah dipotong diinduksikan ke sel yang akan direkayasa sehingga ujung-

ujung susunan DNA akan melekat (sticky ends) dan berfusi ke plasmid sel. Penambagab enzim ligase diperlukan dalam tahap ini untuk menyambungkan DNA yang terpotong kepada plasmid sel. Ujung awal dan akhir dari DNA yang dipotong biasanya ditandai sebagai promoter dan terminator.

- Plasmid baru yang telah terbentuk dikulturkan dan dibiarkan bereplikasi. - Bakteri yang telah dimodifikasi dikulturkan. Metode ini dilakukan secara in vitro. Gambar 1 menjelaskan tahapan-tahapan metode plasmid.

Gambar 1 Tahapan metode plasmid (Sumber : www.bio.davidson.edu)

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM12. Metode Pembawa (vector) Rekayasa genetika yang paling umum dilakukan adalah dengan memasukkan material genetik ke dalam pembawa secara acak. Teknik ini menggunakan vektor viral yang dapat berupa virus pembawa. Contoh virus pembawa yang banyak digunakan adalah bacteriophage. Tahap awal dari metode ini sama dengan metode plasmid, yaitu memotong DNA yang diinginkan dan DNA yang telah dipotong dibiarkan berfusi ke plasmid sel. Selain virus, bakteri juga dapat digunakan sebagai vektor. Sebanyak 1% bakteri secara alami dapat mengambil DNA asing yang diinduksikan oleh bakteri lain. Membuat bakteri mengalami tekanan seperti panas atau listrik yang mengubah kepermeabelan membran dari sel sehingga gen yang diinginkan dapat dimasukkan. 3. Metode biolistic Metode biolistic dikenal juga sebagai metode bioballistic. Metode ini menggunakan logam yang sangat kecil yang telah dilapisi dengan gen yang ingin dimasukkan ke mikroorganisme lain. Potongan logam yang sangat kecil (biasanya tungsten) akan ditembakkan ke sel hingga gen yang dibawa logam masuk dan direplikasi. Gambar 2 menunjukkan skema alat yang digunakan untuk metode biolistic.

Gambar 2 Metode biolistic

(www.tau.ac.il) Pengujian yang dilakukan untuk mengetahui suatu organisme mengandung gen yang telah direkayasa adalah dengan PCR, Southern hybridization, dan DNA sequencing. Ketiga metode ini mengandalkan elektroforesis DNA pada gel untuk verifikasi gen yang termodifikasi. Gambar 3 menunjukkan prinsip metode PCR dan contoh elektroforesis pada agarose.

ArtiMurnandari/13010036 TUGASRPM1

Gambar 3 Prinsip PCR (kiri) dan Elektroforesis (kanan) (Sumber : users.ugent.be)

Tidak semua sel yang dikenalkan dengan material genetik yang baru dapat mengalami rekayasa genetika. Dalam banyak kasus, digunakan penanda (marker) untuk membedakan sel yang terdiferensiasi dengan yang tidak.

Untuk mengetahui suatu bakteri mengalami mutasi genetik dapat juga dilakukan pengujian dengan menumbuhkan sel pada kultur yang mengandung antibiotik atau senyawa kimia yang hanya dapat diekspresikan oleh sel yang telah termodifikasi. Metode lainnya dengan menggunakan DNA probe, yaitu senyawa yang hanya dapat menempel pada gen yang dimasukkan, biasanya berupa single stranded DNA.

Daftar Pustaka

- James, Clive.2008."Global Status of Commercilized Biotech/GM Crops:2008". ISSA Brief No. 39.

- users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html (tanggal akses : 12 September 2013)