Rekombinantna Dna Tehnologija (Antibiotici, Vektori)

REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA ((Biomedicinski inžinjeringBiomedicinski inžinjering ) )

– Obuhvata proučavanjaObuhvata proučavanja molekularnih mehanizama molekularnih mehanizama u u živživojoj ćelij ćeliji; i;

– Zavaljujući tiim istraživanjima čovjek je ovladao Zavaljujući tiim istraživanjima čovjek je ovladao metodama genske tehnologije; metodama genske tehnologije;

– Ove Ove metode metode nazivamonazivamo zajedni zajedničkčkim imenom - im imenom - GGenetienetičkički ininžžinjering iliinjering ili Rekombinantna DNK tehnologija; Rekombinantna DNK tehnologija;

– DNK tehnologiju čovjek DNK tehnologiju čovjek primjenjujprimjenjujee za za dobijadobijanjenje;; korisnkorisnihih produk produkaattaa kao kao što sušto su:: bakteriostatici, vakcine, bakteriostatici, vakcine,

proteini, proteini, amino kiseline, amino kiseline, nezasinezasićene masne kiseline, ćene masne kiseline, vitaminivitamini, minerala i td, minerala i td..;;

zatim zatim za dijagnosticiranje i liječenje genskih bolesti, kao za dijagnosticiranje i liječenje genskih bolesti, kao što je genska terapijašto je genska terapija

– Ovim metodama modificiraju se Ovim metodama modificiraju se virusi, bakterije, virusi, bakterije, biljne, animalne, humane biljne, animalne, humane ćelije (ćelijski inžinjering), ćelije (ćelijski inžinjering), tkiva (tkivni inžinjering) ili cijeli organizam (GMO).tkiva (tkivni inžinjering) ili cijeli organizam (GMO).

•Ogromni istraživački potencijal fiziologije i patofiziologijeOgromni istraživački potencijal fiziologije i patofiziologije čovjekačovjeka•Velike mogućnost diVelike mogućnost dijajagnosticiranja gnosticiranja ii tretm tretmaanana bolesti bolesti•Mogućnost planiranja zdrave porodiceMogućnost planiranja zdrave porodice•ProiProizvodnjazvodnja lijekova, lijekova, enzenziimmaa, , hrane,hrane, aditiv aditivaa,, kozmetičkihkozmetičkih preparata, popreparata, polilimermeraa, hemi, hemikkalalijaija, energenata , energenata itditd..•Pobolj Pobolj ššanje anje genetgenetskihskih atribut atributa organizamaa organizama•Uticaj na prinos, otpornost, stres i bolesti biljaka i Uticaj na prinos, otpornost, stres i bolesti biljaka i životinjaživotinja•EliminaEliminacciijaja polutan polutanaattaa i opasnih i opasnih materimaterijjalalaa iz prirode iz prirode

DDoprinosi oprinosi rekombinantne DNK rekombinantne DNK tehnologjetehnologje

•Mogući organizmi opasni za druge organizme ili sredinu!•Genetički inžinjering ljudi?•Redukcija prirodnog - genetickog diverziteta?•Skupa tehnologija i primjenjuju je samo bogate nacije?•Moguućnost ućnost tajnogtajnog g genetičkog rada?•Eliminira tradicionalnu agrikulturnu praksu?

SociSocijjalalne ne posljedice rekombinantne DNK posljedice rekombinantne DNK tehnologjetehnologje

1.DNA, plasmid extraction2.Enzime restriction3.Gene insertion 4.Ligature5.Introducing DNA vector6.Amplification of the target DNA7. Identification of clone containing gene of interest

ProProizvodnjaizvodnja Antibioti Antibiotikaka 12 000 antibiotik12 000 antibiotika je a je identifiidentificiranocirano

– VeVeććinu proizvode inu proizvode Gram-poGram-pozzitive baitive bakkteriterije je koje se nalaze u tlu -koje se nalaze u tlu - Streptomycetae Streptomycetae

– Neke Neke antibiotike antibiotike sintetiziraju sintetiziraju gljivegljive,, a a ostale ostale Gram-poGram-pozzitiveitive ili ili Gram-negativGram-negativnene ba bakkteriterijeje

100 000 ton100 000 tonaa antibioti antibiotika ka proizvodeproizvode s see godigodiššnjenje

200-300 n200-300 novih lijekova godiovih lijekova godiššnjenje FlemingFlemingova proizvodnja je ova proizvodnja je imalaimala 2 U/ml, 2 U/ml,

zahvaljujuzahvaljujućći i DNK DNK tehnologiji to danas tehnologiji to danas iznosiiznosi 70 000 U/ml70 000 U/ml

Najpoznatiji mkrobioloNajpoznatiji mkrobiološškiki sintetizirani sintetizirani antibioticiantibiotici

AntibioticAntibioticii pprodrodoizvedenioizvedeni Strptomyces Strptomyces sojem sojem ttransformransformiranim sairanim sa pplalazzmidmidomom Pij2303 Pij2303 ii Pij2315 Pij2315

KKloniloniranje ranje gena za gena za

aantibiotintibiotikeke MutMutirani soj za irani soj za

produkciju antibiotika produkciju antibiotika UUnnos plazmda iz os plazmda iz

gengenske biblioteke u ske biblioteke u divlji sojdivlji soj

PratPratii se kolonije sa se kolonije sa DNK insertom iz DNK insertom iz bibliotekebiblioteke

Cjelokupan put Cjelokupan put obuhvata obuhvata vi vi šše od e od 20-30 20-30 korakakoraka……

Selektivne karakteristike najSelektivne karakteristike najččeešćšćih ih aantibiotintibiotikaka

TherapeutskTherapeutskii agensi agensiPostoji preko 200 proteina koji se proizvode genskom tehnologijom i sa velikom Postoji preko 200 proteina koji se proizvode genskom tehnologijom i sa velikom tendencijom goditendencijom godišnjegšnjeg rasta. “Stare bolesti” zahtjevaju nove pristupe zbog rastu rasta. “Stare bolesti” zahtjevaju nove pristupe zbog rastuće će rezistencijerezistencije na lijekove na lijekove, , a a “Nove bolesti” ili stanja mogu da se tretiraju“Nove bolesti” ili stanja mogu da se tretiraju zahvaljuju zahvaljujućći novim i novim saznanjima i proizvodimasaznanjima i proizvodima

Terapeutska monoklonalna antitijela

Industrijska - komercijalna upotreba enzima

KKomerciomercijjalalnnaa upotreba upotreba

aamino mino kiselinakiselina

– Target DNK organisma donora mora se izolovati- Target DNK organisma donora mora se izolovati- ekstrakcija, isjeci sa restrikcionim endonukleazama ekstrakcija, isjeci sa restrikcionim endonukleazama i ligirati-povezati sa vektorom za kloniranje.i ligirati-povezati sa vektorom za kloniranje.

– Izrezivanje DNK domacina i vektora mora se obaviti Izrezivanje DNK domacina i vektora mora se obaviti istom restriktivnom endonukleazomistom restriktivnom endonukleazom

– Rekombinantni konstrukt mora se transferirati u Rekombinantni konstrukt mora se transferirati u celiju domacina, prokariotsku ili eukariotsku celiju domacina, prokariotsku ili eukariotsku

– Celije koje ne prihvate rekonstruisani plazmid Celije koje ne prihvate rekonstruisani plazmid eliminiraju se selektivnim protokolomeliminiraju se selektivnim protokolom

– Celije koje su prihvatile plazmid sa ciljnom-stranom Celije koje su prihvatile plazmid sa ciljnom-stranom DNK dalje se cuvaju, analiziraju, u svakom slucaju DNK dalje se cuvaju, analiziraju, u svakom slucaju uzgajaju, zavisno od toga sta zelimo. uzgajaju, zavisno od toga sta zelimo.

Uobicajena strategija kloniranaUobicajena strategija klonirana

1.DNA, plasmid extraction2.Enzime restriction3.Gene insertion 4.Ligature5.Introducing DNA vector6.Amplification of the target DNA7. Identification of clone containing gene of interest

Restrikcijski enzimiRestrikcijski enzimi

To su enzimi koji modificiraju To su enzimi koji modificiraju DNKDNK

NajNajčešće su to enzimi koji sjeku češće su to enzimi koji sjeku DNK DNK

Postoji viPostoji više od še od 100 razlicitih 100 razlicitih restrikcijskih enzima… neki restrikcijskih enzima… neki prepoznaju samo specificne DNK prepoznaju samo specificne DNK sekvence, neki prepoznaju vise sekvence, neki prepoznaju vise razlicitih DNK sekvenci, a neki razlicitih DNK sekvenci, a neki prepoznaju fizicku strukturu DNK prepoznaju fizicku strukturu DNK tj., DNK motivtj., DNK motiv

Restrikcijske endonukleazeRestrikcijske endonukleaze

Restrikcijske endonukleaze Restrikcijske endonukleaze posebno su značajna sredstva u posebno su značajna sredstva u biotehnologiji.biotehnologiji.

Omogućavaju naučnicima precizan, Omogućavaju naučnicima precizan, predvidiv i ponovljiv način rezanja predvidiv i ponovljiv način rezanja DNA molekule.DNA molekule.

Rane 1950, Salvador Luria i Rane 1950, Salvador Luria i Giuseppe Bertani sa Univ. Illinois i Giuseppe Bertani sa Univ. Illinois i Jean Weigle sa California Institute Jean Weigle sa California Institute of Technology uočili su of Technology uočili su primitivniprimitivni imuni sistem kod bakterija. imuni sistem kod bakterija.

Zapazili su da neki sojevi bakterije Zapazili su da neki sojevi bakterije Escherichia coliEscherichia coli su rezistentni na su rezistentni na infekciju raznih bakteriofaga. infekciju raznih bakteriofaga.

Ovaj fenomen je karakteristika Ovaj fenomen je karakteristika bakteriske ćelije koja je sposobna bakteriske ćelije koja je sposobna da ograniči rast i replikaciju nekih da ograniči rast i replikaciju nekih faga.faga.


1962, Werner Arber, sa Univ. of Geneva, prvi je 1962, Werner Arber, sa Univ. of Geneva, prvi je došao do spoznaje da bakterije imaju jedan došao do spoznaje da bakterije imaju jedan sistem sistem enzimenzima koji a koji selektivno prepoznaju i selektivno prepoznaju i liziraju stranu DNAliziraju stranu DNA. Oni istovremeno . Oni istovremeno modificiraju svoju hromozomalnu DNA da ne bi modificiraju svoju hromozomalnu DNA da ne bi doveli do njene samo-hidrolize. doveli do njene samo-hidrolize.

Nekoliko godina kasnije Arber i njegovi Nekoliko godina kasnije Arber i njegovi saradnici sa Harvard University, izolirali su saradnici sa Harvard University, izolirali su E. E. colicoli ekstrakte koji efikasno cijepaju DNA faga tj. ekstrakte koji efikasno cijepaju DNA faga tj. bakterijskih virusa.bakterijskih virusa.


Ekstrakti su sadržavali prve poznate Ekstrakti su sadržavali prve poznate restrikcijske endonukleaze, enzime koji restrikcijske endonukleaze, enzime koji prepoznaju i sjeku specifičnu sekvencu na prepoznaju i sjeku specifičnu sekvencu na DNA molekuli.DNA molekuli.

Restrikcijske endonukleaze su široke grupe Restrikcijske endonukleaze su široke grupe enzima nazvanih nukleaze, koje generalno enzima nazvanih nukleaze, koje generalno hidroliziraju fosfodiestarske veze koje hidroliziraju fosfodiestarske veze koje povezuju susjedne nukleotide u DNA heliksu. povezuju susjedne nukleotide u DNA heliksu.

Endonukleaze sjeku DNA na unutarnjim Endonukleaze sjeku DNA na unutarnjim pozicijama, dok egzonukleaze progresivno pozicijama, dok egzonukleaze progresivno digestiraju DNA molekule od njihovog kraja.digestiraju DNA molekule od njihovog kraja.


Endonukleaze ćelije domaćina su modificirane Endonukleaze ćelije domaćina su modificirane i znaju da zaštitile svoju ali ne i stranu DNA. i znaju da zaštitile svoju ali ne i stranu DNA.

Kasnije se saznalo da enzim štiti bakterijsku Kasnije se saznalo da enzim štiti bakterijsku (svoju) DNA od digestije. Naime, dodaju metil (svoju) DNA od digestije. Naime, dodaju metil grupe na nukleotide unutar skvence koju one grupe na nukleotide unutar skvence koju one prepoznaju i sjeku. Time je DNA domaćina prepoznaju i sjeku. Time je DNA domaćina zaštićena u odnosu na stranu DNA zaštićena u odnosu na stranu DNA bakteriofaga. bakteriofaga.

Obično oba lanca DNA domaćina su metilirana. Obično oba lanca DNA domaćina su metilirana. Mada, DNA domaćina bila bi zaštićena od Mada, DNA domaćina bila bi zaštićena od digestije ako je metiliran samo jedan lanac.digestije ako je metiliran samo jedan lanac.


Metilacija DNAMetilacija DNA

Ovi enzimi prepoznaju specifične Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence unutar DNA nukleotidne sekvence unutar DNA molecule i sjeku ih, ma gdje one bile. molecule i sjeku ih, ma gdje one bile.

Mogu biti hiljadama baza međusobno Mogu biti hiljadama baza međusobno udaljene. udaljene.

Sve ovo omogućava da ovi enzimu Sve ovo omogućava da ovi enzimu budu odlična sredstva za manipulaciju budu odlična sredstva za manipulaciju sa DNA molekulom.sa DNA molekulom.


Ovaj fenomen restrikcijske modifikacije bio je u Ovaj fenomen restrikcijske modifikacije bio je u slaboj upotrebi sve do 1970. Tada su Hamilton slaboj upotrebi sve do 1970. Tada su Hamilton Smith i njegov student Kent Wilcox sa Johns Smith i njegov student Kent Wilcox sa Johns Hopkins University izolirali novu restrikcijsku Hopkins University izolirali novu restrikcijsku endonukleazu iz endonukleazu iz Haemophilus influenzae. Haemophilus influenzae.

Restriktivna aktivnost ovog enzima nazvana je Restriktivna aktivnost ovog enzima nazvana je HindII. Razlikuje se od predhodno otkrivene HindII. Razlikuje se od predhodno otkrivene endonukleaze u 2 važne stvari. endonukleaze u 2 važne stvari. – enzim pokazuje restriktivne aktivnosti ali nema mogućnost enzim pokazuje restriktivne aktivnosti ali nema mogućnost

modifikacijemodifikacije– HindII sječe DNA po unaprijed poznatoj sekvenci na jednoj HindII sječe DNA po unaprijed poznatoj sekvenci na jednoj

preciznoj poziciji, a ne i na ostalim mjestima.preciznoj poziciji, a ne i na ostalim mjestima.


Postoje 3 glavne klase restrikcionih Postoje 3 glavne klase restrikcionih endonukleaza : Tip I, II i III.endonukleaza : Tip I, II i III.

Tip I i III enzima imaju restrikcijsku i Tip I i III enzima imaju restrikcijsku i aktivnost modifikacije. Sjeku DNA na svim aktivnost modifikacije. Sjeku DNA na svim mjestima gdje postoji specifična sekvenca mjestima gdje postoji specifična sekvenca koju prepoznaju. koju prepoznaju. – Koriste ATP kao energiju za svoje aktivnostiKoriste ATP kao energiju za svoje aktivnosti

Gube predvidivost u sječenju. Ovo i upotreba Gube predvidivost u sječenju. Ovo i upotreba ATP učinila je ove enzime manje ATP učinila je ove enzime manje upotrebljivim u praksi.upotrebljivim u praksi.


Restrikcione endonukleaze Tip II idealne su Restrikcione endonukleaze Tip II idealne su kao sredstva za manipulaciju sa DNA kao sredstva za manipulaciju sa DNA molekulom iz više razloga:molekulom iz više razloga:– Sve imaju restrikcionu aktivnost ali ne i Sve imaju restrikcionu aktivnost ali ne i

aktivnost modifikacijeaktivnost modifikacije– Sjeku DNK na predvidivo mjesto, na isti način Sjeku DNK na predvidivo mjesto, na isti način

unutar ili do sekvence koju prepoznaje unutar ili do sekvence koju prepoznaje – Tip II enzim zahtjeva samo jone (MgTip II enzim zahtjeva samo jone (Mg++++) kao ) kao

kofaktor; ATP je nepotrebankofaktor; ATP je nepotreban..


Ime restrikcione Ime restrikcione endonukleaze reflektuje endonukleaze reflektuje njeno porijeklo:njeno porijeklo:

EcoRI EcoRI – E = genus (rod) E = genus (rod) Escherichia Escherichia – co= species (vrsta) coli co= species (vrsta) coli – R = strain (soj) RY13 npr.R = strain (soj) RY13 npr.– I = prva nađena I = prva nađena

endonukleazaendonukleaza


Tip Tip II restrikcionih endonukleaza prepoznaje II restrikcionih endonukleaza prepoznaje sekvence koje su generalno duge 4 ili 8 baznih sekvence koje su generalno duge 4 ili 8 baznih parova parova

To su obično palindromske sekvence. To su obično palindromske sekvence. ČČitaju se isto u itaju se isto u suprotnim pravcima, kao riječ “RATAR” npr. suprotnim pravcima, kao riječ “RATAR” npr. – Sekvenca prepoznavanja za npr. BamHI je: Sekvenca prepoznavanja za npr. BamHI je: 5'GGATCC3' 5'G GATCC3' 5'GGATCC3' 5'G GATCC3' 3'CCTAGG5' 3'CCTAG G5'3'CCTAGG5' 3'CCTAG G5'


Čitanje palindromske Čitanje palindromske sekvenccesekvencce


Specifičnosti nekih od tipičnih endonukleazaSpecifičnosti nekih od tipičnih endonukleaza

Sekvence koje se prepoznaju od strane endonukleaze su napisane u 5’-3’ pravcu. Sekvence koje se prepoznaju od strane endonukleaze su napisane u 5’-3’ pravcu. Prikazan je samo jedan lanac. Strelice pokazuju mjesta sječenja. Pu (purin) znači da će Prikazan je samo jedan lanac. Strelice pokazuju mjesta sječenja. Pu (purin) znači da će A ili G biti prepoznat. Py (pirimidin) znači da će C ili T biti prepoznat. Zvjezdica A ili G biti prepoznat. Py (pirimidin) znači da će C ili T biti prepoznat. Zvjezdica predstavlja poziciju gdje baze mogu biti metilirane.predstavlja poziciju gdje baze mogu biti metilirane.


Odabrane restrikcione endonukleaze i njihova specifična sekvenca prepoznavanja

Restrikciono mapiranje DNK feagmenta endonukleazama

Velicine DNA fragmenata (u kilobaznim Velicine DNA fragmenata (u kilobaznim parovima), jednog plazmida, nastale parovima), jednog plazmida, nastale digestijom jedne ili dvije restriktivne digestijom jedne ili dvije restriktivne

endonukleazeendonukleaze

1kb=1000 baznih parova1kb=1000 baznih parova

Mapa restrikcionih endonukleazaMapa restrikcionih endonukleaza Kreirana sa jednim ili viKreirana sa jednim ili višše e

digestivnih enzima digestivnih enzima Ovo su korisni markeri Ovo su korisni markeri

genskih lokacija koji se genskih lokacija koji se koriste i u kloniranju genakoriste i u kloniranju gena

Enzimi koji se najcesce koriste u rekombinantnoj DNA tehnologijiEnzimi koji se najcesce koriste u rekombinantnoj DNA tehnologiji

cDNA ScDNA Siintentezaza Oligo(dT) prOligo(dT) prajajmermer ReverReverznazna

transtranskkriptariptazaza Klenow/DNAP IKlenow/DNAP I RNaRNazaza H H

DegradDegradiraira RNA RNA iziz DNA:RNA hDNA:RNA hiibridbridaa

S1 nucleaS1 nucleazaza DegradDegradiraira ss ss

nucleinucleinskenske kiseline kiseline ii nesparene petljenesparene petlje

DNA rezanje restriktivnom endonukleazom DNA rezanje restriktivnom endonukleazom (1)(1)

DNA rezanje restriktivnom endonukleazom DNA rezanje restriktivnom endonukleazom (2)(2)

Spajanje komplementarih “Ljepljivih” krajeva

AAkktitivvnonostst T4 DNA Liga T4 DNA Ligazzee

Vectori:Vectori:Karakteristike vektora za kloniranje: Karakteristike vektora za kloniranje: Svi vektori imaju odgovarajuće bazne karaktristike (npr. mjesto Svi vektori imaju odgovarajuće bazne karaktristike (npr. mjesto

replikacije, mjesto za ugradnju strane DNA. Obično nose jedan ili replikacije, mjesto za ugradnju strane DNA. Obično nose jedan ili nekoliko gena ). nekoliko gena ).

Danas se vektori dizajniraju za specifične svrhe, tako da neki Danas se vektori dizajniraju za specifične svrhe, tako da neki imaju dodatne - jedinstvene karakteristike.imaju dodatne - jedinstvene karakteristike.

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Osnovne karakteristikeOsnovne karakteristike

– Posjeduju selektivne markere Posjeduju selektivne markere – Posjeduju mjesto replikacijePosjeduju mjesto replikacije– Posjeduju mjesto za kloniranje Posjeduju mjesto za kloniranje

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Specijalne karakteistikeSpecijalne karakteistike

– Mogućnost za praćenje inserta (npr. aktivacija insercijom)Mogućnost za praćenje inserta (npr. aktivacija insercijom)– Mogućnost selekcije po veliMogućnost selekcije po veličč inserta (npr. selekcija po količini inserta (npr. selekcija po količini

nebitne sekvence koju mozemo zamjeniti sa nanebitne sekvence koju mozemo zamjeniti sa našom ciljanom šom ciljanom sekvencomsekvencom))

– Da posjeduje promotorsku sekvencu za transkripciju inserta. Da posjeduje promotorsku sekvencu za transkripciju inserta. Jako su interesantni neki promotori iz bakteriofaga (zbog Jako su interesantni neki promotori iz bakteriofaga (zbog visoke mogućnosti transkripcije gena-inserta)visoke mogućnosti transkripcije gena-inserta)

– Ekspresija vektora zbog dobijanja Ekspresija vektora zbog dobijanja što većeg broja kopija što većeg broja kopija kloniranog genakloniranog gena

PlasmidiPlasmidi su vanhromozomski genetski materijal bakterija. Oni su vanhromozomski genetski materijal bakterija. Oni su cirkularne DNA molekule koje egzistiraju nezavisno od su cirkularne DNA molekule koje egzistiraju nezavisno od bakterijskog hromozoma. Na njima se nalaze geni koji bakterijskog hromozoma. Na njima se nalaze geni koji omoguomogućavaju bakteriji preživljavanje u nepovoljnim uslovima. ćavaju bakteriji preživljavanje u nepovoljnim uslovima. Naprimjer, ako se bakterija nađe na podlozi sa ampicilinomNaprimjer, ako se bakterija nađe na podlozi sa ampicilinom,, ona aktivira ekspresiju plazmidnog gena ona aktivira ekspresiju plazmidnog gena ččiji proteinski iji proteinski produkt cijepa-hidrolizira ampicilin. To joj omogućava produkt cijepa-hidrolizira ampicilin. To joj omogućava preživljavanje na toj podlozi.preživljavanje na toj podlozi.

Najjednostavniji vektori za kloniranje su plazmidi bakterija. Najjednostavniji vektori za kloniranje su plazmidi bakterija. Veličina im je od 1,000 do 200,000 baznih pairova. Molekularni Veličina im je od 1,000 do 200,000 baznih pairova. Molekularni biolozi mogu promjeniti plazmide tj. mogu ugraditi u njih biolozi mogu promjeniti plazmide tj. mogu ugraditi u njih specifične genske sekvence. specifične genske sekvence.

Plazmidi se mogu koristiti za umnožavanje i većih fragmenata Plazmidi se mogu koristiti za umnožavanje i većih fragmenata neke DNA sekvence od uobineke DNA sekvence od uobičajenih čajenih 2- 5 kb 2- 5 kb. Upotrebljavaju se . Upotrebljavaju se za ekspresiju strane DNA u bakteriji ili drugoj ćeliji domaćinu. za ekspresiju strane DNA u bakteriji ili drugoj ćeliji domaćinu.

Plazmidi se repliciraju koristeći se mašinerijom bakterija. Plazmidi se repliciraju koristeći se mašinerijom bakterija. Može se replicirati kao i bakterijski hromozom-jednom, a u Može se replicirati kao i bakterijski hromozom-jednom, a u pravilu repliciraju se u više od pravilu repliciraju se u više od 50 kopija50 kopija. To je dobro jer se . To je dobro jer se tako i ugrađeni gen za neki enzim-protein ekspresira u visokoj tako i ugrađeni gen za neki enzim-protein ekspresira u visokoj mjeri.mjeri.

Vectori:Vectori:

Pocetni vektori kod kloniranja Pocetni vektori kod kloniranja genagena

pBR322pBR322 PlasmidPlasmid

Mali nezavisni replikon Mali nezavisni replikon sa selektivnim sa selektivnim markerima i korisnim markerima i korisnim mjestima za kloniranjemjestima za kloniranje

Vektori: Vektori: PlazmidiPlazmidi

Kloniranje sa plazmidnim vektorom: Kloniranje sa plazmidnim vektorom: blabla = beta-laktamaza = beta-laktamaza selektivni marker (rezistencija na penicilin); selektivni marker (rezistencija na penicilin); oryory = mjesto = mjesto početka replikacijepočetka replikacije

Osim plazmida za kloniranje gena koriste se i virusiOsim plazmida za kloniranje gena koriste se i virusi– Virusi su kategorizirani po: Virusi su kategorizirani po:

domaćinu – teže da budu specifični za domaćinu – teže da budu specifični za domaćina domaćina bakterije, biljke ili animalije bakterije, biljke ili animalije postoji I specifičan tip unutar grupe– npr. postoji I specifičan tip unutar grupe– npr.

bakteriofag T2 napada samo bakteriofag T2 napada samo E. coliE. coli neki animalni virusi imaju više domaćina neki animalni virusi imaju više domaćina

(humani virus influenze) – osim čovjeka (humani virus influenze) – osim čovjeka inficira patke, svinje itd. inficira patke, svinje itd.

tipu nukleinske kiselinetipu nukleinske kiseline DNA ili RNA DNA ili RNA dvolančana ili jednolančana n.k. dvolančana ili jednolančana n.k. linearna ili cirkularna linearna ili cirkularna

configuraciji kapsideconfiguraciji kapside prisustvu ili odsustvu membrane iz predhodne prisustvu ili odsustvu membrane iz predhodne

ćelije domaćinaćelije domaćina

Bakteriski virusi – bakteriofagiBakteriski virusi – bakteriofagi– Virusi su Virusi su prvo otkriveni infektivni agensi koji mogu prvo otkriveni infektivni agensi koji mogu

preći kroz filter, kroz koji ne mogu proći bakteijepreći kroz filter, kroz koji ne mogu proći bakteije– Filtrat sa virusima ne može rasti samostalno na Filtrat sa virusima ne može rasti samostalno na

hranljivom medijuhranljivom mediju– Vezuju se svojim specifičnim proteinima za Vezuju se svojim specifičnim proteinima za

specifične receptore domaćina koji se nalaze na specifične receptore domaćina koji se nalaze na ćelijskom zidu bakterije ćelijskom zidu bakterije

– Injekciraju DNA u ćeliju domaćinaInjekciraju DNA u ćeliju domaćina– IImaju svoja 2 životna ciklusa; Liticki i lizogenimaju svoja 2 životna ciklusa; Liticki i lizogeni

Litički ciklus bakteriovirusaLitički ciklus bakteriovirusa •Koriste sintetički aparat ćelije domaćina za Koriste sintetički aparat ćelije domaćina za produkciju svojih specifičnih enzima i drugih produkciju svojih specifičnih enzima i drugih proteina proteina •DNA faga se replicira u ćeliji domaćinaDNA faga se replicira u ćeliji domaćina•Novo sintetizirani proteini faga združuju se u Novo sintetizirani proteini faga združuju se u nove virusne partikule bakteriofaga nove virusne partikule bakteriofaga •Obično sintetiziraju jedan Obično sintetiziraju jedan endolizinendolizin koji lizira koji lizira bakteriski ćelijski zid i oslobađaju se novi bakteriski ćelijski zid i oslobađaju se novi bakterijski virusi u spoljašnju sredinu bakterijski virusi u spoljašnju sredinu •Degradiraju DNA domaćina tako da se proteini Degradiraju DNA domaćina tako da se proteini domaćina više ne sintetiziraju. Za pola sata domaćina više ne sintetiziraju. Za pola sata producira se producira se 100 do 400100 do 400 novih partikla faga novih partikla faga

lizogeni ciklus bakteriovirusalizogeni ciklus bakteriovirusa •Ovisno od zdravstvenog stanja ćelije domaćinaOvisno od zdravstvenog stanja ćelije domaćina,, virusi virusi se razvijaju putemse razvijaju putem litičk litičkogog ili lizogen ili lizogenogog ciklus ciklusaa •U slučaju lizogenog ciklusa, produciraju enzime za U slučaju lizogenog ciklusa, produciraju enzime za inserciju DNA faga u bakterisku DNA inserciju DNA faga u bakterisku DNA •Produciraju regulatorne proteine koji ne Produciraju regulatorne proteine koji ne dozvoljavaju transkripciju gena virusa dozvoljavaju transkripciju gena virusa •Kada imunitet (kontrola) domaćina opadne Kada imunitet (kontrola) domaćina opadne isključuju se regulatorni proteini, počinje isključuju se regulatorni proteini, počinje transkripcija virusne DNAtranskripcija virusne DNA•Izrezuje se virusna DNA iz DNA domaćina i dalji Izrezuje se virusna DNA iz DNA domaćina i dalji život virusa ide u litičkom pravcu život virusa ide u litičkom pravcu •Bakterije se brane od virusa svojim restrikcijskim Bakterije se brane od virusa svojim restrikcijskim egzo i endonukleazamaegzo i endonukleazama

Karakteristike Lambda Karakteristike Lambda vektoravektora

Plazmidni vektori su najboljiPlazmidni vektori su najbolji,, ako kloniramo ako kloniramo male fragmente DNA.male fragmente DNA.

– Postoji određeni limit u veličini ugrađene DNAPostoji određeni limit u veličini ugrađene DNA– Rekombinantni plazmid sa velikim DNA insertom Rekombinantni plazmid sa velikim DNA insertom

manje je stabilan. Efikasnost transformacije takvog manje je stabilan. Efikasnost transformacije takvog inserta se reducira. Plazmid će dati mnogo manji inserta se reducira. Plazmid će dati mnogo manji

broj kopija ako se klonira u broj kopija ako se klonira u E coliE coli.. Vektori bazirani na bakteriophagu lambda Vektori bazirani na bakteriophagu lambda

dozvoljavaju efikasnije kloniranje većih dozvoljavaju efikasnije kloniranje većih fragmenata koji su važni pri konstrukciji fragmenata koji su važni pri konstrukciji

genske bibliotekegenske biblioteke. . Insert veći od 20 kb slabije se kloniraInsert veći od 20 kb slabije se klonira i u b.fagu i u b.fagu

Bakteriofag lambdaBakteriofag lambda– inficira E. coliinficira E. coli

Zaštitini proteinski omotač formira rep i glavu. Zaštitini proteinski omotač formira rep i glavu. Linearna DNA je locirana u središtu glave fagaLinearna DNA je locirana u središtu glave faga DNA molekula sadrži 48.502 baznih-pairovaDNA molekula sadrži 48.502 baznih-pairova

– Koji kodiraju priližno 50 različitih proteinaKoji kodiraju priližno 50 različitih proteina Cijela sekvenca lambda genoma je poznataCijela sekvenca lambda genoma je poznata IIdentificirane su dentificirane su ssekvence kontrolnih regiona ekvence kontrolnih regiona

za transkripciju i replikacijuza transkripciju i replikaciju Lambda bakteriofag postao je uobičajeni Lambda bakteriofag postao je uobičajeni

vektor za kloniranjevektor za kloniranje


Postupci pri kloniranju u lamda faga

Rekombinantna viralna partikula

In vitro pakovanje,koje se odvija u bakteriji

Insercija strane (ciljne) DNA i ligacija

Restrikciona digestija tj. otklanjanje centralne genske regije

Lambda fag

Centralna genska regija

Lambda kraj

Lambda kraj

Lambda DNA molecula ima jedanu neuobičajenu strukturu. Lambda DNA molecula ima jedanu neuobičajenu strukturu. – Jedno-lančani segmenti DNA sadrže po12 nukleotida na oba Jedno-lančani segmenti DNA sadrže po12 nukleotida na oba

kraja DNA molekulekraja DNA molekule Bazna sekvenca terminalnih regiona poznatih kao kohezivni ili Bazna sekvenca terminalnih regiona poznatih kao kohezivni ili

ljepljivi krajevi komplementareni su jedan drugom ljepljivi krajevi komplementareni su jedan drugom Kada se povežu ljepljivi krajevi linearna molekula bakteriofaga Kada se povežu ljepljivi krajevi linearna molekula bakteriofaga

lambda dobija cerkulatorni oblik. lambda dobija cerkulatorni oblik. Ako se lambda DNA inkubira na 37°C Ako se lambda DNA inkubira na 37°C

– Kohezivni krajevi se sparuju po principu komplementarnosti i Kohezivni krajevi se sparuju po principu komplementarnosti i formira se cirkulatorna molekula. formira se cirkulatorna molekula.

Zagrijavanjem cirkularne molekule Zagrijavanjem cirkularne molekule DNA na 75°C, ljepljivi krajevi se DNA na 75°C, ljepljivi krajevi se razdvajaju i DNA molekula se razdvajaju i DNA molekula se konvertuje u linearnu konvertuje u linearnu formu (denaturacija).formu (denaturacija).


Stvaranje cirkularne lambda DNA molekule odvija Stvaranje cirkularne lambda DNA molekule odvija se u inficiranoj bakteriskoj ćeliji se u inficiranoj bakteriskoj ćeliji

Kada lambda inficira Kada lambda inficira E. coliE. coli , tj. kad DNA faga uđe u , tj. kad DNA faga uđe u bakteriju, ljepljivi krajevi se spajaju formirajući bakteriju, ljepljivi krajevi se spajaju formirajući cirkularnu molekulucirkularnu molekulu

Transkripcija i replikacija DNA faga odvija se u Transkripcija i replikacija DNA faga odvija se u bakterijskoj ćeliji. Novo-nastale DNA molekule bakterijskoj ćeliji. Novo-nastale DNA molekule pakuju se u novo-nastale partikule faga pakuju se u novo-nastale partikule faga

Oko 100-400 partikla lambde oslobađa se u medij, Oko 100-400 partikla lambde oslobađa se u medij, liziom bakterijske ćelijeliziom bakterijske ćelije


Cirkularna DNA molekula faga rijetko se integrira Cirkularna DNA molekula faga rijetko se integrira u DNA E. coli u DNA E. coli

U tom slučaju bakterijska ćelija se ponaša U tom slučaju bakterijska ćelija se ponaša normalno, a lambda DNA se replicira kao dio normalno, a lambda DNA se replicira kao dio bakterijskog hromozoma (Lizogeni ciklus)bakterijskog hromozoma (Lizogeni ciklus)

Kada se bakterijska ćelija nađe u nekoj stresnoj Kada se bakterijska ćelija nađe u nekoj stresnoj situaciji (npr. izložena UV svjetlu), lambda DNA se situaciji (npr. izložena UV svjetlu), lambda DNA se izrezuje iz hromozoma domaćina i počinje normalni izrezuje iz hromozoma domaćina i počinje normalni ciklus viralne replikacjeciklus viralne replikacje


Litički i lizogeni ciklus lambda bakteriofaga

Liza bakterije

Replikacija faga

Litički ciklus

Infekcija

Rast i diobalizogene ćelije

Lizogeni fag

Lizogeni ciklus

Prekid represije

tj. kontrole replikacije

DNA bakteriofaga

Pakovanje Pakovanje hromozomahromozoma Putem kružne cikliPutem kružne ciklične replikacije čne replikacije formira se prirodni formira se prirodni

DNA konkatemer sa cos mjestima odvojenim sa oko DNA konkatemer sa cos mjestima odvojenim sa oko 50 kb. 50 kb.

DNA se sječe na DNA se sječe na coscos mjestima i unosi se u kapsidu. mjestima i unosi se u kapsidu.

ZreliZreli fag fag

DNA spakovana u DNA spakovana u proteinski omotaproteinski omotačč

Kozmidni vektoriKozmidni vektori - - COS sekvenceCOS sekvence su su acelularni i intracelularni paraziti acelularni i intracelularni paraziti – U strukturnom smislu oni su proteinska U strukturnom smislu oni su proteinska

kapsula ili kapsida koja sadrži neku kapsula ili kapsida koja sadrži neku nukleinsku kiaelinunukleinsku kiaelinu

– mogu primiti insert od 30-45 kb.mogu primiti insert od 30-45 kb. – mogu se upakovati u viralne partikule mogu se upakovati u viralne partikule

omogućavajući visoko efikasnu omogućavajući visoko efikasnu transformaciju.transformaciju.

– To je zapravo modificirani bakteriofaga To je zapravo modificirani bakteriofaga

Kozmidni vektori - COSKozmidni vektori - COS

Fage Fage vektor vektor Unutarnji segment se Unutarnji segment se

uklanja (oko 20 kb)uklanja (oko 20 kb) OstajuOstaju intaktna intaktna cos cos

mjestamjesta Ciljna DNA se Ciljna DNA se

ugrađuje između dvije ugrađuje između dvije “ruke” DNA se “ruke” DNA se pakuje in vitropakuje in vitro

Rekombinantnim Rekombinantnim fagom inficiramo fagom inficiramo ćelije ćelije E. coliE. coli

AnimalAnimalnini virus virusii– Virusi imaju jednog ili više domaćina Virusi imaju jednog ili više domaćina – Imaju različite tipove nukleinskih kiselinaImaju različite tipove nukleinskih kiselina– Životni ciklus animalnih virusa:Životni ciklus animalnih virusa:

Vezuju se za ćelijsku membranu domaćinaVezuju se za ćelijsku membranu domaćina preko proteina plazma membrane, koji preko proteina plazma membrane, koji

bivaju prepoznati od virusa kao njegovi bivaju prepoznati od virusa kao njegovi receptori receptori

ako membrana nema ovakve proteine ako membrana nema ovakve proteine jednostavno fuziraju sa ćelijskom jednostavno fuziraju sa ćelijskom membranom membranom

Kada uđu u ćeliju kapsida se uklanja ćelijskim Kada uđu u ćeliju kapsida se uklanja ćelijskim proteazama proteazama

Zavisno od tipa nukleinske kiseline repliciraju Zavisno od tipa nukleinske kiseline repliciraju se svojim enzimima (reverzna transkriptaza – se svojim enzimima (reverzna transkriptaza – RNA virusi) ili enzimima koju sue nalaze u ćeliji RNA virusi) ili enzimima koju sue nalaze u ćeliji domaćinadomaćina

AnimalAnimalnini virus virusii–

Produciraju viralno specifične proteine Produciraju viralno specifične proteine unključujući i enzime za replikacijuunključujući i enzime za replikaciju

Koriste sintetičku mašineriju domaćina što Koriste sintetičku mašineriju domaćina što otežava dejstvo antibiotika otežava dejstvo antibiotika

Produciraju – sklapaju svoje partikule u ćeliji Produciraju – sklapaju svoje partikule u ćeliji domaćinudomaćinu

Oslobađaju se razaranjem ili liziranjem plazma Oslobađaju se razaranjem ili liziranjem plazma membranemembrane

– Sadže minimum virusnih gena za: Sadže minimum virusnih gena za: Polimerazu ili reverznu transkriptazu Polimerazu ili reverznu transkriptazu Proteine kapsideProteine kapside Proteazu za finalnu obradu proteina kapsideProteazu za finalnu obradu proteina kapside Anti-viralna strategija mora imati za cilj specifične Anti-viralna strategija mora imati za cilj specifične

funkcije virusafunkcije virusa

Reverzna Reverzna transkriptazatranskriptaza

Reverzna transkriptazaReverzna transkriptaza je uobičajeno ime za je uobičajeno ime za enzim koji funkcioniše enzim koji funkcioniše kao polimeraza RNA-kao polimeraza RNA-ovisna od DNA. ovisna od DNA.

Kodirana je genom Kodirana je genom retrovirusa, ona kopira retrovirusa, ona kopira viralni RNA genom u viralni RNA genom u DNA prije njene DNA prije njene integracije u genom integracije u genom (DNA) domaćina.(DNA) domaćina.

Reverzna transkriptaza ima dvije aktivnosti:Reverzna transkriptaza ima dvije aktivnosti:

1.1. DNA polimeraznu aktivnost: DNA polimeraznu aktivnost: u životu retrovirusa reverzna transkriptaza u životu retrovirusa reverzna transkriptaza

kopira samo RNA, ali ako je koristimo u kopira samo RNA, ali ako je koristimo u laboratoriji ona će prepisivati jednolančanu RNA laboratoriji ona će prepisivati jednolančanu RNA kao i jednolančanu DNA sa istom efikasnošću. kao i jednolančanu DNA sa istom efikasnošću. Naravno, potrebni su joj RNA ili DNA prijmeri za Naravno, potrebni su joj RNA ili DNA prijmeri za započinjanje sinteze.započinjanje sinteze.

2. 2. Aktivnost RNaze H : RNaza H je ribonukleaza Aktivnost RNaze H : RNaza H je ribonukleaza koja degradira RNA kod RNA-DNA hibrida koji koja degradira RNA kod RNA-DNA hibrida koji nastane tokom reverzne transkripcije RNA nastane tokom reverzne transkripcije RNA lanca. Ovaj enzim funkcioniše kao endonukleaza lanca. Ovaj enzim funkcioniše kao endonukleaza i egzonukleaza, a supstrat joj je RNA-DNA i egzonukleaza, a supstrat joj je RNA-DNA hibrid.hibrid.

Reverzna transkriptaza Reverzna transkriptaza se koristi za kopiranje se koristi za kopiranje RNA u DNA.RNA u DNA. – Ovo je sastavni dio kloniranja Ovo je sastavni dio kloniranja

komplementarnih DNA (cDNAs), komplementarnih DNA (cDNAs), koje su kopije zrelih mesindžer koje su kopije zrelih mesindžer RNA molekula.RNA molekula.

DNA kopije mRNA prepisa DNA kopije mRNA prepisa pomazu u otkrivanju pomazu u otkrivanju gena koji kodira datu gena koji kodira datu mRNA – mRNA – RTPCRRTPCR (Reverse (Reverse transcription polymerase transcription polymerase chain reaction).chain reaction).

Reverzna Reverzna transkriptazatranskriptaza

•RetrovirusiRetrovirusi•RNA virusi koji se ugrađuju u genomRNA virusi koji se ugrađuju u genom

domaćina putem DNA oblikadomaćina putem DNA oblika•HIV, mišji virus leukemijeHIV, mišji virus leukemije (MoMuLV), (MoMuLV),

RSV RSV (Respiratory syncytial virus) (Respiratory syncytial virus) •AdenovirusiAdenovirusi

•DNA virusi koji uzrokuju respiratorne,DNA virusi koji uzrokuju respiratorne, intestinalne i infekcije oka u ljudiintestinalne i infekcije oka u ljudi

•Virus obične prehladeVirus obične prehlade•Adeno-asocirani virusiAdeno-asocirani virusi

•DNA virusi koji se mogu ugraditi naDNA virusi koji se mogu ugraditi na specifično mjesto unutar kromosoma 19specifično mjesto unutar kromosoma 19

•Herpes simplex virusi DNA virusi koji Herpes simplex virusi DNA virusi koji napadaju specifične tipove stanica, neuronenapadaju specifične tipove stanica, neurone

Virusni vektori za gensku terapijuVirusni vektori za gensku terapiju

1.1. Ulazak retrovirusa u ciljnu stanicu2.Ulazak retrovirusa u ciljnu stanicu2.2.2. Ugradnja retrovirusnog genoma u Ugradnja retrovirusnog genoma u hhromoromozzomom

•Retrovirusni genom ne može proći krozRetrovirusni genom ne može proći kroz jezgrinu membranu ako je ona cjelovita jezgrinu membranu ako je ona cjelovita kaokao kod stanica koje se ne dijele kod stanica koje se ne dijele •KKod stanica koje se dijele dolazi do kidanjaod stanica koje se dijele dolazi do kidanja jezgrine membrane pa virusni genom možejezgrine membrane pa virusni genom može doprijeti do kromosoma i ugraditi se doprijeti do kromosoma i ugraditi se – – prikladno za gensku terapiju rakaprikladno za gensku terapiju raka•RRetrovirusi su uprkos ovom ograničenju etrovirusi su uprkos ovom ograničenju najčešći virusni vektori za gensku terapiju najčešći virusni vektori za gensku terapiju – – modifikacije modifikacije •Lentivirusi nemaju ova ograničenja (HIV), Lentivirusi nemaju ova ograničenja (HIV), ali postoji bojazan od izazivanja bolestiali postoji bojazan od izazivanja bolesti

Ugradnja retrovirusnog Ugradnja retrovirusnog genoma u genoma u hhromoromozzomom

•Virusi bez ovojnice sVirusi bez ovojnice s dl DNA dl DNA genomomgenomom•Poznato 40 serotipPoznato 40 serotipovovaa•Većina uzrokuje respiratorne Većina uzrokuje respiratorne infekcije kod ljudiinfekcije kod ljudi•Kao vektori najčešće se Kao vektori najčešće se koristekoriste adenovirusi adenovirusi podskupine C, podskupine C, serotipa 2 ili 5serotipa 2 ili 5•12 niti poput antena za 12 niti poput antena za prihvaprihvattanje virusaanje virusa•Mogu inficirati stanice u Mogu inficirati stanice u diobi i u mirovanjudiobi i u mirovanju•VVeliki broj kopija –eliki broj kopija – 10121012 čestica/mlčestica/ml

Adenovirusi kao vektori za Adenovirusi kao vektori za gensku terapijugensku terapiju

Prihvaćanje putem proteina CAR, Prihvaćanje putem proteina CAR, internalizacija putem integrinainternalizacija putem integrina

Two proteins have been proposed to be the receptor for the fibre of subgroup C adenoviruses, the coxsackie and adenovirus receptor (CAR) and MHC class I heavy chain.Coxsackie (virus) is a cytolytic virus of the Picornaviridae family, an enterovirus(a group containing the polioviruses, coxsackie viruses, and echoviruses)

Kvaščev umjetni hromozomi (YACs), bakterijski umjetni Kvaščev umjetni hromozomi (YACs), bakterijski umjetni hromozomi (BACs) i humani umjetni hromozom mogu se hromozomi (BACs) i humani umjetni hromozom mogu se koristiti za kloniranje stotina i hiljada baznih parova..koristiti za kloniranje stotina i hiljada baznih parova..

Umjetni vektori

BACs and YACs

Molekularni biolozi mogu izbjeci probleme Molekularni biolozi mogu izbjeci probleme nepodudarnosti, koristeci eukariotske celije nepodudarnosti, koristeci eukariotske celije kao domacine za ekspresiju eukariotskih kao domacine za ekspresiju eukariotskih gena.gena.

ĆĆelije kvasca, jednocelijske gljive jednostavne elije kvasca, jednocelijske gljive jednostavne su za uzgoj kao i bakterijske celije. Imaju su za uzgoj kao i bakterijske celije. Imaju plazmide, plazmide, ššto je rijetkost za eukariote.to je rijetkost za eukariote.

Naucnici su konstruisali kvaNaucnici su konstruisali kvaščščev umjetni ev umjetni hromozom (yeast artificial chromosomes -hromozom (yeast artificial chromosomes -YACs) – sa jednim njestom za replikaciju, YACs) – sa jednim njestom za replikaciju, centromerom i dvije telomeraze sa stranom centromerom i dvije telomeraze sa stranom DNA.DNA.

Ovi hromozomi se ponasaju normalno u mitozi Ovi hromozomi se ponasaju normalno u mitozi i mogu nositi mnogo vise DNK od plazmida i i mogu nositi mnogo vise DNK od plazmida i virusa. virusa.

Kapacitet bakterijskih Kapacitet bakterijskih vektorskih sistemavektorskih sistema

100-300kb ciljne sekvence100-300kb ciljne sekvence P1 bakterijski sistemP1 bakterijski sistem F plazmidni sistemF plazmidni sistem BACs (bacterial artificial BACs (bacterial artificial

chromosomes)chromosomes) Plazmidi (10000 nukleotid baznih Plazmidi (10000 nukleotid baznih

parova ili 10kb)parova ili 10kb) Cozmidi (do 30 kb)Cozmidi (do 30 kb) Bakterijski umjetni hromozomi (BACs) Bakterijski umjetni hromozomi (BACs)

(do 350 kb )(do 350 kb ) KvaKvaščev ščev umjetni hromozomi (YACs) (up umjetni hromozomi (YACs) (up

to 1000 kb)to 1000 kb) Plant Artificial Chromosomes (PACs)Plant Artificial Chromosomes (PACs)

•Nastaju spontanom agregacijom lipidnih molekulaNastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula uu vodenom okruženjuvodenom okruženju•Katjonski lipozomi vežu negativno nabijenu DNA Katjonski lipozomi vežu negativno nabijenu DNA •Tako omotana DNA zaštićena je od razgradnjeTako omotana DNA zaštićena je od razgradnje•Lipofektin, lipofektamin – služe i za transfekciju Lipofektin, lipofektamin – služe i za transfekciju stanica u kulturi. Ima pozitivno nabijene lipidnestanica u kulturi. Ima pozitivno nabijene lipidne glaveglave

Liposomi kao vektoriLiposomi kao vektori

•Nedostatak jednostavnih liposoma -vrlo brzo seNedostatak jednostavnih liposoma -vrlo brzo se uklanjaju iz cirkulacije putem makrofaga iz jetreuklanjaju iz cirkulacije putem makrofaga iz jetre•Dodatak površinskih liganada smanjuje degradacijuDodatak površinskih liganada smanjuje degradaciju liposoma:liposoma:

•MonosijalogangliozidiMonosijalogangliozidi•PolioksietileniPolioksietileni•HolesterolHolesterol•Glukuronska kiselinaGlukuronska kiselina

•Produženi polu-život liposoma zbog reduciraneProduženi polu-život liposoma zbog reducirane opsonizacije (omatanja proteinima iz plazmeopsonizacije (omatanja proteinima iz plazme ))

Liposomi kao vektoriLiposomi kao vektori

•Dugotrajna i jednostavna pohrana – barem godinuDugotrajna i jednostavna pohrana – barem godinu dana kao liofilizirani prah na sobnoj temperaturidana kao liofilizirani prah na sobnoj temperaturi•Trajne vezikule – preživljavaju višestruke fuzije sTrajne vezikule – preživljavaju višestruke fuzije s membranommembranom•Preživljavanje u gastro-intestinalnom traktu –Preživljavanje u gastro-intestinalnom traktu – prikladni za oralnu primjenuprikladni za oralnu primjenu

Kokleati – višeslojni liposomiKokleati – višeslojni liposomi

•Za aktivno usmjeravanje DNAZa aktivno usmjeravanje DNA•Na površini nose specifična protutijelaNa površini nose specifična protutijela•Protutijela na unutarstanični miozin usmjeravajuProtutijela na unutarstanični miozin usmjeravaju imunoliposome na područja srčanog mišićaimunoliposome na područja srčanog mišića zahvaćenog infarktomzahvaćenog infarktom•Protutijela na molekule specifične za tumoreProtutijela na molekule specifične za tumore usmjeravaju imunoliposome na stanice tumorausmjeravaju imunoliposome na stanice tumora

ImunoliposomiImunoliposomi

Transformacija Transformacija bakterijabakterija

Proces unošenja slobodne DNA u Proces unošenja slobodne DNA u ććeliju domaeliju domaćinaćina ( (čestočesto E. E. colicoli soj K12, DH5 soj K12, DH5) nazivamo transformacija ćelije domaćina) nazivamo transformacija ćelije domaćina– CaClCaCl22- toplotna transformacija- toplotna transformacija

Bakterijska Bakterijska ććelija tretira se na ledu sa ohlađenim CaClelija tretira se na ledu sa ohlađenim CaCl2,.2,. Odmah potom izložimo je dejstvu temperature od 42°C Odmah potom izložimo je dejstvu temperature od 42°C utoku 90 secondi. Tačan mehanizam djelovanja CaClutoku 90 secondi. Tačan mehanizam djelovanja CaCl22 na na toplotnu transformaciju još je nepoznat. toplotnu transformaciju još je nepoznat.

– ElektroporacionElektroporacion Umjesto hemijske indukcije, u jakom pulsirajucem Umjesto hemijske indukcije, u jakom pulsirajucem

električnom polju može se ćelijski zid domaćina učiniti električnom polju može se ćelijski zid domaćina učiniti permeabilnim za stranu DNA koristeći aparat permeabilnim za stranu DNA koristeći aparat “elektroporator”. “elektroporator”.

– KonjugacijaKonjugacija Prirodni proces u kome bakteija bakteriji donira genetički Prirodni proces u kome bakteija bakteriji donira genetički

materijal (cell-to-cell genetic transfer) kroz predhodno materijal (cell-to-cell genetic transfer) kroz predhodno uspostavljeni proteinski most.uspostavljeni proteinski most.

ElektroporacijElektroporacijaa

Transformacija Transformacija bakterijabakterija

ElektroporacijaElektroporacija

Celije se suspendiraju u DNK Celije se suspendiraju u DNK soluciji koja je u kiveti izmedju soluciji koja je u kiveti izmedju 2 elektrode2 elektrode

Uspostavi se pulsirajuce visoko Uspostavi se pulsirajuce visoko voltazno elektricno polje (high voltazno elektricno polje (high voltage electric field-HVEF)voltage electric field-HVEF)

DNK migrira kroz HVEF poljem DNK migrira kroz HVEF poljem inducirane otvore celijeinducirane otvore celije

Uspjesna je primjena kod Uspjesna je primjena kod bakteriskih, kvascevih i bakteriskih, kvascevih i animalnih celijanimalnih celij

Prednosti bakterijskih sistema•Brz rast, za 8 sati imamo proizveden protein•Visoki prinosi, 50-500mg/L•Mala cijena kostanja, zbog jednostavnih hranljivih medija•Niska cijena fermentora

Nedostaci bakterijskih sistema•Teska je ekspresija velikih i kompleksnih proteina (<50kD)•Nema glikolizacije ili odstranjivanja signalne sekvence•Eukariotski proteini si ponekad toksicni za bakteriju•Bakterije nemogu posredovati u kod proteina bogatim S-S mostovima

Transformacija bakterijaTransformacija bakterija

F - cellF + cell F+ cell F+ cell

F F ++ cell cell F F -- cell cell

• Sex pilus je tuba kroz koju prolazi DNA • Otkriveni od strane Lederberg i Tatum (1946) Biološka važnost Biološka važnost

bakterijskog genskog bakterijskog genskog transfera: transfera: •Raste genetička raznovrsnost. Raste genetička raznovrsnost. Npr. Npr. Escheria coliEscheria coli sadrži 17% sadrži 17% strane DNAstrane DNA• Povećava se virulentnost.Povećava se virulentnost.• “ “Pathogeni geni” se lako Pathogeni geni” se lako prenose između bakterijaprenose između bakterija• Nastaje resistance na Nastaje resistance na antibiotike. Oralni antibiotike. Oralni streptococcistreptococci genetički su rezervoar i genetički su rezervoar i prenose-doniraju rezistanciju prenose-doniraju rezistanciju na antibiotike drugimna antibiotike drugim patogenim bakterijamapatogenim bakterijama..

Selektvni markeriSelektvni markeri Potrebni su markeri uspješne ligacije i Potrebni su markeri uspješne ligacije i

bakteriske transformacije. bakteriske transformacije. Čak i sa efikasnim sistemom transformacije Čak i sa efikasnim sistemom transformacije

koji je danas raspoloživ za koji je danas raspoloživ za E. coli, E. coli, samo 1% samo 1% bakterijskih ćelija biva transformisan - bakterijskih ćelija biva transformisan - primi stranuprimi stranu DNA. DNA.

Ako koristimo drugi organizam (ćeliju) za Ako koristimo drugi organizam (ćeliju) za transformaciju uspjeh je još manji. transformaciju uspjeh je još manji.

Da bi otkrili transformirane ćelije, važno je Da bi otkrili transformirane ćelije, važno je spriječiti rast ne transformisanim spriječiti rast ne transformisanim ććelijama. elijama. To su one ćelije koje nisu preuzele plazmid.To su one ćelije koje nisu preuzele plazmid.

Geneticka transformacija Geneticka transformacija prokariotaprokariota

Hemijska transformacijaHemijska transformacija CaClCaCl22 i temperaturni sok i temperaturni sok Frekfencija transformacija je oko 1/1000Frekfencija transformacija je oko 1/1000

• ElektroporacijaElektroporacija• Elektricno polje posreduje u Elektricno polje posreduje u

permeabilizaciji membranepermeabilizaciji membrane• 10-100 puta efikasnija od hemijske 10-100 puta efikasnija od hemijske

transformacijetransformacije• Mnogo je bolja za velike plazmide (Mnogo je bolja za velike plazmide (<<100 kb)100 kb)

KonjugacijaKonjugacija Prirodni sistem prenosa plazmida iz Prirodni sistem prenosa plazmida iz

jedne celije/soja u drugujedne celije/soja u drugu Zahtjeva specificne DNA sekvence na Zahtjeva specificne DNA sekvence na

plazmidu i odgovarajuce proteine za plazmidu i odgovarajuce proteine za transporttransport

Plasmidi Plasmidi <<101066bp ne mogu se prenijeti bp ne mogu se prenijeti na taj nacinna taj nacin

Obicno je to interspecijski prenosObicno je to interspecijski prenos Tripartitno parenje i multipla selekcijaTripartitno parenje i multipla selekcija

Konjugacija Konjugacija Odredjene bakterije (F+), mogu da Odredjene bakterije (F+), mogu da

sadrže gene koje nazivamo sadrže gene koje nazivamo faktorom plodnosti (fertility factor-F faktorom plodnosti (fertility factor-F ili plazmid)ili plazmid)

F faktor uvijek se prenosi bakteriji F faktor uvijek se prenosi bakteriji koja ga nema, tj. F- celiji.koja ga nema, tj. F- celiji.

Nakon toga F- celija se transformise Nakon toga F- celija se transformise u F+ celijuu F+ celiju

Prirodno je da bakterija ima plazmidPrirodno je da bakterija ima plazmid

Konjugacija Konjugacija Bakterija prenosi DNK kroz specijalizovanu Bakterija prenosi DNK kroz specijalizovanu

tubu, tzv. sex pilus – polna tubatubu, tzv. sex pilus – polna tuba

E. coli cells

Kako se odvija konjugacija?Kako se odvija konjugacija?

Transformacija bakterija Transformacija bakterija transdukcijomtransdukcijom

Transformacija je Transformacija je – je prelazak slobodnih – je prelazak slobodnih DNA fragmenata - plazmidaDNA fragmenata - plazmida

TransdukcijaTransdukcija – Prenos DNK – Prenos DNK putem virusaputem virusa Za unos strane DNA koriasti se bakteija ili Za unos strane DNA koriasti se bakteija ili

bilo koja bilo koja ćelija domaćinaćelija domaćina..

Conjugacija – BakterijaConjugacija – Bakterija Ovo omoguOvo omogućava ogromnu adaptibilnost za ćava ogromnu adaptibilnost za

bakterijebakterije Ako bakterija razvije neku korisnu Ako bakterija razvije neku korisnu

mutaciju, konjugacija je brz nacin prenosa mutaciju, konjugacija je brz nacin prenosa ove osobine- informacije drugoj bakteriji. ove osobine- informacije drugoj bakteriji.

Konjugacija bakterijama osigurava Konjugacija bakterijama osigurava prezivljnjeprezivljnje

Selekcija bakterija sa kloniranim genom

Selektivni markeri: Selektivni markeri: AntibioticiAntibiotici

Rezistancija na antibiotik Rezistancija na antibiotik Plazmidni vektor posjeduje Plazmidni vektor posjeduje gen za hidrolizu antibiotika. gen za hidrolizu antibiotika.

Ako zasijemo miks (u kome Ako zasijemo miks (u kome smo vršili transformaciju), smo vršili transformaciju), na agarnu ploču sa na agarnu ploču sa antibiotikom izrasti će samo antibiotikom izrasti će samo transformisane ćelijetransformisane ćelije

Selektivni markeri: Selektivni markeri: LacZLacZ Petri posuda sadržiPetri posuda sadrži antibiotik,antibiotik,

šećeršećer X-galactozu (Xgal) iX-galactozu (Xgal) i IPTGIPTG. . LacZLacZ gena u plazmidnom gena u plazmidnom vektoru vektoru

kodira kodira beta-galaktozidazu beta-galaktozidazu koja koja metabolizirametabolizira XgalXgal ii nastajenastaje plaviplavi produkt.produkt.

Samo bakterijske kolonje koje Samo bakterijske kolonje koje sadrže plazmid (genom za sadrže plazmid (genom za rezistenciju) mogu rasti.rezistenciju) mogu rasti.

Kolonije koje imaju Kolonije koje imaju intactni intactni polilinker (plazmid u koji se nije polilinker (plazmid u koji se nije ugradio strani gen) proizvodit će ugradio strani gen) proizvodit će plavi boju, kolonije će biti plave.plavi boju, kolonije će biti plave.

Kolonije sa sa Kolonije sa sa disruptiranim disruptiranim polilinkerompolilinkerom (u plazmid se ugradio(u plazmid se ugradio gen)gen) ne mogune mogu metaboliziratimetabolizirati XgalXgal zato izrastajuzato izrastaju bijele bijele kolonije.kolonije.

BijeleBijele kolonje sadrže rekombinantne kolonje sadrže rekombinantne plazmide koji sadrže naš ciljni gen.plazmide koji sadrže naš ciljni gen.

Produkt Produkt lacZlacZ gena gena ((ββ-galaktozidaza)-galaktozidaza)može da inducira može da inducira stvaranje plave boje u stvaranje plave boje u prisustvu prisustvu IPTG IPTG (isopropyl-(isopropyl-thiogalactoside).thiogalactoside).

Selektivni markeri: LacZSelektivni markeri: LacZ

Genetička mapa plazmidnog vektora pUC18. Mali je i može služiti Genetička mapa plazmidnog vektora pUC18. Mali je i može služiti za kloniranje većih fragmenata DNA. Ima veliki broj restrikciskih za kloniranje većih fragmenata DNA. Ima veliki broj restrikciskih mjesta unutar polilinkera koji je lociran u mjesta unutar polilinkera koji je lociran u lacZlacZ genu genu

Plavo/bijela selekcija poslije ligacije. X-gal i IPTG su dodati LB (Luria-Bertani) podlozi sa ampicilinom prije zasijavanja transformisanih TOP10 E. coli ćelija. U ovom slućaju plazmid je bio pCR2.1, a PCR produkt je bio dio IDH1 gena (cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase).

Selektivni markeri: Selektivni markeri: LacZLacZ

Izolacija Izolacija klonirane DNAklonirane DNA

Documents

Rekombinantna Dna Tehnologija (Antibiotici, Vektori)