RENDGENSKA KRISTALOGRAFIJA

Rendgenska kristalografija omogućuje određivanje trodimenzijskog rasporeda većine atoma u

molekuli proteina.

Za provođenje kristalografije potrebni su: 1. izvor x-zraka

2. kristalizirani protein

3. detektor

Element Kα valna duljina (λ) Å

Mo 0.7107

Cu 1.5418

Co 1.7902

Fe 1.9373

Cr 2.2909

Metode kristalizacije:A ˝Hanging drop˝;B : ˝Sitting drop˝;C: Mikrodijaliza

Kapljica sadrži pročišćeni protein u visokojkoncentraciji (2-50 mg/ml), pufer i sredstvo zataloženje dok se u rezervoaru nalazi otopinapufera i sredstva za taloženje u većojkoncentraciji.

Phoenix robot za ispitivanje uvjeta kristalizacije

Molekule proteina nemaju pravilne oblike pa se relativno teško pakiraju ukristale. Osim toga, proteinski kristali su u odnosu na kristale soli vrlo krhki,mekani i osjetljivi na vanjske uvjete. Molekule su povezane slabim ionskim,vodikovim i hidrofobnim interakcijama u kristalu. To je s druge strane povoljnojer omogućuje unošenje otopina u kristale (supstrati, inhibitori, metalni ioni).

Proteinski kristali često zadržavaju aktivnost, tj. proteini kristaliziraju ubiološki aktivnoj konformaciji.

Kako bi se spriječilo oštećivanje kristala prilikom ozračivanja kristali se prijesnimanja hlade u pari tekućeg dušika ili u tekućem dušiku. Da ne bi došlo dostvaranja kristala leda tijekom hlañenja u otopinu za kristalizaciju se dodajukrioprotektivne tekućine (etilen glikol, glicerol, PEG, koncentrirane otopine soliili saharoze).

x-zrake valne duljine 1,54 A (Cu) prolazi kroz kristal – dio prolazi kroz kristal, a diose otklanja u različitim smjerovima. Rasap zraka se bilježi na filmu ili pomoćudetektora. Uzorak koji se dobije daje informaciju o strukturi proteina.

Osnovni fizikalni principi:

1. Elektroni skreću x-zrake. Amplituda vala raspršenog na atomu je proporcionalnabroju elektrona u atomu (C atom otklanja 6 puta jače nego H).

2. Raspršene zrake interferiraju. Svaki atom doprinosi raspršivanju x-zraka.Raspršeni valovi se pojačavaju ako su u fazi ili poništavaju ako su izvan faze.

3. Interferencija otklonjenih valova ovisi o rasporedu atoma.

Rotiranjem kristala dobije se rendgenska fotografija na kojoj se nalazi niz točaka.Svakoj točki se zati odredi položaj i intenzitet – to daje osnovne podatke za analizukoji se zatim obrañuju Furierovim transformacijama. Pomoću Furierovihtransformacija dobije se mapa elektronske gustoće i odredi položaj atoma. Zadobivanje 3D slike kristal se rotira i za svaki kut rotacije se dobijudvodimenzionalne mape elektronske gustoće čijom se onda kombinacijomkompjuterski generira 3D struktura.

(a) rendgenska fotografija (b) izračunata 3D mapa elektronske gustoće (c) područja najveće

gustoće pokazuju položaj jezgri

(a) (c)(b)