Escuela Superior Politécnica del Litoral

Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la ProducciónCarrera de Ingeniería en Alimentos

Materia: Bioingeniería Alimentaria

Tema: Estudio Cinético del enzima Amilasa

Alumno: Danny Tagle Freire

Profesora:Ing. Mirella Bermeo Garay

I Término 2012 - 2013

ESTUDIO CINÉTICO DE LA ENZIMA AMILASA

OBJETIVOEstudiar la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren.

INTRODUCCIÓN La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren.

La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:

Por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo Por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo

En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato (S) y de la enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética del alfa-amilasa. Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reacción de color que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).

Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:

Amilosa Amilopectina + Amilasa : AMILODEXTRINAS +IODO = Color azul violetaERITRODEXTRINAS + IODO = Color rojo pardoMaltosa + Glucosa – DEXTRINAS LIMITES +Iodo No dan coloración Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. La influencia de la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacción de la forma ya descrita pero utilizando diferentes c(E), manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(s). En el caso del estudio de la influencia del pH y la temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes valores de ambos con la reacción del Lugol.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los carbohidratos también llamados azucares, osas o sacáridos, son polihidroxialdehidos o polihidrozicetonas o compuestos poliméricos que por hidrólisis producen polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas. Según el número de unidades de azucares sencillos que poseen se clasifican en:

MONOSACARIDOS o azucares sencillos, que a su vez pueden ser ALDOSAS cuando contienen el grupo aldehído o CETOSAS cuando contienen el grupo cetona. Los monosacáridos naturales pertenecen a la serie D de los azucares y pueden tener entre tres y hasta siete átomos de carbono.

DISACARIDOS que están formados por dos monosacáridos unidos entre sí por enlaces glucosidicos.OLIGOSACARIDOS que tiene entre tres y diez monosacáridos unidos también por enlaces glucosidicos.POLISACARIDOS que son polímeros naturales con varios miles de unidades de azúcar sencillo ligadas entre sí.

De acuerdo con lo anterior, además de reconocer si un compuesto pertenece a la familia de los carbohidratos, es necesario diferenciar si se trata de un monosacáridos tipo aldosa o cetosa, si es fácilmente oxidable o no, es decir si es un Azúcar Reductor o no lo es, si es de cinco.

CAMBIOS EN LA COMPOSCION DE UN PLATANOCOLOR CARACTERISTICO ALMIDON AZUCAR

1 Verde 21-19,5% 0,1-2%3 Verde, pero ya

madurando18-14,5% 3,5-7%

6 Totalmente maduro, color amarillo

4-1% 16,5-19,5%

Producto Amilosa (%) Amilopectina (%)Tapioca 18 82Trigo 24 76Arroz 17 83Papa 22 78

PROCEDIMIENTO Realice los ensayos que se describen a continuación, en tubos de ensayo limpios y secos, con las soluciones patrón de los carbohidratos que se indican en cada caso y la muestra problema.

Ensayo de Molisch: Soluciones patrón de carbohidratos: ARABINOSA, GLUCOSA, FRUCTOSA, SACAROSA, Y

ALMIDON. Coloque un tubo de ensayo de 2 ml de la solución del carbohidrato y agregue 0,2 ml de α-

naftol al 10% Mezcle bien y luego adicione cuidadosamente por las paredes del tubo, 1ml de acido sulfúrico

concentrado, la formación de un anillo violeta en la interface es prueba positiva para carbohidratos.

Ensayo de Lugol:

Soluciones patrón de carbohidrato: ALMIDON Y GLICOGENO

Coloque en un tubo de ensayo 2 ml de la solución del carbohidrato y agregue 0,2 ml de lugol, mezcle y observe la formación de los colores rojo para glicógeno, azul-violeta para almidón como pruebas positivas.

Ensayo de Molish: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con acido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con alfa-naftol formando un color purpura violeta.

Ensayo con Lugol: El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja.

En la práctica realizada el día martes 5 de Junio del 2012 se realizaron pruebas con papa cruda, papa expuesta al calor, arroz de cebada crudo, arroz de cebada expuesto al calor, verde pintón, verde pintón expuesto al calor, verde verde, verde verde expuesto al calor, zanahoria cruda y zanahoria cruda, zanahoria expuesta al calor. Se siguió el siguiente procedimiento:

1. Cada muestra cruda se ralló y se colocó en cajas petri en una cantidad aproximada de dos gramos, luego se les añadió lugol para ver la reacción.

2. Otros 10 gramos de la muestra cruda fueron tomados y puestos en un vaso de precipitación junto con 100 ml de agua, esta mezcla se la llevó a calentamiento; posteriormente se la dejo enfriar.

3. La muestra expuesta al calor se toma y se le aplica dos gotas de lugol y se compara con la muestra cruda.

4. Se toma parte del sobrenadante y se lo coloca en un tubo de precipitación. Luego se agrega ácido clorhídrico o sulfúrico para lograr el efecto señalado anteriormente y se adiciona el reactivo de Molisch (alfa naftol).

5. Procedemos a observar y realizar el análisis.

EQUIPOS Y MATERIALES

Pipetas Baño termostático Pinzas Tubos de ensayo Vasos de precipitación Agitadores Calentador

RESULTADOS

Lugol: Color azul violeta oscuro denota la presencia de almidón y por supuesto es una reacción positiva (+)Molisch: Anillo violeta denota la presencia de carbohidratos simples no compuestos; esto es una reacción positiva para carbohidratos en general (+)

Se usará (+) para denotar la presencia de color y (-) para indicar el no cambio de color

Materia Prima

Ensayo Lugol (crudo)

Ensayo lugol (sobrenadante después de cocción)

Observaciones Fotos

Papa + +

Mayor intensidad de color en

muestra expuesta al calor

Zanahoria - - El color del lugol no cambió

Arroz de Cebada

- +

En la muestra cruda no hubo

reacción alguna, no cambió el color. En la expuesta a

cocción si hubo cambio de color dando positivo

Verde + +

Mayor intensidad de color en

muestra expuesta al calor

Verde pintón

+ +

Mayor intensidad de color en

muestra expuesta al calor

Materia Prima Ensayo de Molish (sobrenadante)

Observaciones Fotos

Papa +

Formación de un halo de color purpura violeta

Zanahoria -No hubo formación del halo purpura violeta

Arroz de Cebada

+

Formación de halo color purpura violeta

Verde +

Verde pintón +

CONCLUSIONES

Las pruebas realizadas en laboratorio son pruebas cualitativas, es decir nos dicen si existe o no la presencia de carbohidratos, pero no nos detallan la cantidad de ellos. En la prueba de lugol se determina la presencia de almidones; para que una muestra de positiva esta debe teñirse con un color azul violeta oscuro. El cambio de color se debe a que las moléculas de iodo se insertan en los huecos de la moléculas espiralada del almidón (amilosa específicamente). Las moléculas absorben más luz visible excepto el azul. Si el almidón se rompe en maltosa y glucosa, no se desarrolla ningún color debido a que desaparece la espiral y no quedan huecos para que entre el iodo, es decir la ausencia de color puede está asociada a la hidrólisis del almidón o a su ausencia inicial en la muestra.

De las pruebas realizadas todas resultaron positivas con el lugol a excepción de la zanahoria ya sea cruda o expuesta al calor y el arroz de cebada crudo. En el primer caso la explicación es más que obvia, no existe almidón en ella por lo tanto no puede darse ninguna reacción. En el segundo caso, el de arroz de cebada crudo, este posee una estructura granular grande con una forma definida y impenetrable para el iodo si se lo añade directamente sin tratar la muestra; esto no significa que no tenga almidón ya que en la muestra expuesta al calor si existió un resultado positivo, lo cual afirma nuestro argumento.

En la prueba de Molisch todas las muestras resultaron positivas menos la zanahoria, lo cual es lógico ya que esta no posee almidón. En las muestras que resultaron positivas se puede decir que el sobrenadante poseía almidón y este fue hidrolizado en moléculas menores como monosacáridos cuando se le adicionó el ácido correspondiente, estos a su vez resultan deshidratados formando fufural y sus derivados; y es precisamente este furfural el que reacciona con el alfa naftol del reactivo, dando como resultado un halo color violeta.

RECOMENDACIONES

Cuando se realiza la prueba de Molisch es importante recomendar que el reactivo de molisch (alfa naftol) debe agregarse primero a la muestra en el tubo de ensayo. Luego inclinado en 30 grados se coloca por las paredes el ácido para así poder ver bien el halo formado entre las dos fases; se puede agitar la solución al inicio cuando tenemos solamente la muestra con el reactivo, pero en la segunda parte donde adicionamos el ácido no se debe agitar ni mezclar nada.

INVESTIGACIÓN

ALFA y BETA-AMILASA

El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.

Origen de alfa-amilasa: Fúngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del páncreas.

Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote.

La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda más en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal.

Acciones: Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6.

La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa.

Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados.

La beta-amilasase la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la

cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la molécula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38).La beta-amilasano necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivándose a 70°C por 15 min. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4,5.

Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido carbónico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estén presentes en la masa, y cuya formación depende, a su vez, de la acción sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adición de extracto de malta usado también para este objeto. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adición.

La alfa-amilasa de origen fúngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitación y una aereación intensas), aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservándose así la maltosa, esencial para la fermentación. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentación de la masa, tiene las siguientes ventajas:

- mayor contenido de azúcares fermentescibles en la masa;- aceleración de la fermentación;- desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido;- aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más uniforme y más coloreada.

La alfa-amilasa de origen bacteriano es más estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adición debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproducción de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38, 40). Por otra parte, una actividad residual de alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservación, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradación de su almidón, causante del envejecimiento. Al sustituir la adición, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteolítica, cuyas desventajas se han señalado anteriormente.

REACCION DE MOLISCH

Es una prueba general para cualquier carbohidrato sin importar su complejidad; el H2SO4 hidroliza los carbohidratos complejos y deshidrata a los monosacáridos resultantes formando furfural y derivados de estos, finalmente, producen compuestos color púrpura por reacción de furfural con el alfa naftol.

PREGUNTAS SUGERENCIAS

1. ¿Cuáles son las características estructurales del almidón?

Lo que llamamos almidón no es realmente un polisacárido, sino la mezcla de dos, la amilosa y la amilopectina. Ambos están formados por unidades de glucosa, en el caso de la amilosa unidas entre ellas por enlaces α 1-4 lo que da lugar a una cadena lineal. En el caso de la amilopectina, aparecen ramificaciones debidas a enlaces α 1-6.

La amilosa es una cadena teóricamente lineal, pero en la práctica existen algunas sustituciones iguales a las de la amilopectina, una cada varios centenares de moléculas, que no modifican sus propiedades. El peso molecular de las cadenas de amilosa es del orden de un millón.

En la amilopectina, las ramificaciones aparecen cada 20 o 30 glucosas. Las cadenas de las ramificaciones se ramifican a su vez, y aunque la estructura no está totalmente aclarada, parece probable que se encuentren no ramificadas al azar, sino formando una estructura que podríamos llamar "fractal", alrededor de una cadena central, que es la única que tiene un extermo reductor. El resultado son moléculas enormes de un peso molecular entre 10 millones y 500 millones. En algunos almidones, como el de patata, la amilopectina tiene también algunos ésteres de fosfato.

En los cereales y tubérculos que lo contienen, el almidón se encuentra en las células formando estructuras discretas, los gránulos de almidón. Estos gránulos tienen un tamaño entre 2 y 100 micras, dependiendo del vegetal, aunque en un mismo vegetal aparece una cierta heterogeneidad de tamaño Los gránulos de almidón de arroz están entre los más pequeños, y los del almidón de patata, entre los más grandes, en los extremos del rango de tamaños indicado. La forma suele ser redondeada, pero también aparecen gránulos de forma alargada o más o menos irregular. En los gránulos de almidón, que no están rodeados por ninguna envoltura, las moléculas de amilosa y de amilopectina se disponen en forma radial, formando una serie de capas concéntricas. En estas capas existen zonas cristalinas, en las que las cadenas están asociadas en forma de hélices.

2. ¿Qué tipo de enzima es el Alfa-Amilasa?

Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6.

La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados.

3. ¿Cuáles son los productos que origina la acción de esta enzima sobre el almidón?

Forma una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa.

4. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración de la enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.

Concentración de la Enzima: La gran eficacia de la acción enzimática se manifiesta en la elevada velocidad de reacción que se consigue incluso a concentraciones enzimáticas bajas, ello es debido a que tras la fijación enzima sustrato las cadenas laterales de los aminoácidos del centro activo crean las condiciones fisicoquímicas necesarias para la transformación del sustrato en producto.

Concentración de sustrato: Al principio un aumento de la concentración de substrato produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue aumentando la concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a disminuir.

La temperatura: Todas las enzimas muestran cierta termolabilidad, aunque para muchas de ellas el aumento de la temperatura, hasta cierto límite, acelera la velocidad de la reacción. Sin embargo, por que la mayoría de éstas son estructuras proteicas, pueden ser desnaturalizadas a medida que se aumenta la temperatura y así perder su actividad biológica. La temperatura a la cual se observa la máxima actividad enzimática se denomina Temperatura Óptima.

El pH: Por su característica proteica, muchas enzimas por el pH de donde se encuentran pueden cambiar desde un estado ionizado (Con carga) a uno no ionizado (sin carga), afectando así la actividad biológica de las mismas. Cada enzima posee un pH característico donde puede realizar su función (pH óptimo), cualquier variación del mismo puede afectar la acción enzimática y así afectar la velocidad de las reacciones químicas.

BIBLIOGRAFIA

Guarnizo, Anderson. Experimentos de Química Orgánica. Elizcom. Armenia, Colombia. pp 137-138.

Estructura almidón. http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/azucares/almidon.html. 08/06/2012.

Amilasas. http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_ farmaceuticas/schmidth02/parte07/01.html. 08/06/2012

Olivas, Evangelina. Manual de Prácticas de Microbiología y Microbiología de Alimentos. Universidad Autónoma de la ciudad de Juárez. Juárez, México. pp 36