Restrikcijske endonukleaze

Oruđe u molekularnoj biologiji

Nomenklatura

tri slova iz imena bakterije, oznaka soja, rimski broj

EcoRI- Escherichia coli, soj R, rimski broj

- HinDIII- Haemophilus influenzae, soj D, treći izolat

Što prepoznaje i kako cijepa EcoRI?

Sažetak

Pojavu restrikcije i modifikacije otkrio je Werner Arber, švicarski znanstvenik.

Za to je otkriće podijelio Nobelovu nagradu 1978. sa Amekikancima D. Nathansom i H. Smithom.

OTKRIĆE RESTRIKCIJSKIH ENDONUKLEAZA

Zaključak

Prvo - soj K i soj B imaju neki mehanizam za “restrikciju” infektivne sposobnosti bakteriofaga izoliranog iz onog drugog soja (suprotnog soja). Naime, infektivnost bakteriofaga se smanjuje kada se inicijalno prebaci s jednog soja na drugi.

Drugo – do “restrikcije” infektivnosti bakteriofaga dolazi replikacijom DNA bakteriofaga unutar bakterijske stanice. Evidentiran je povratak infektivnosti bakteriofaga nakon nekoliko inkubacija sa novim sojem bakterijskog domaćina.

RESTRIKCIJSKI ENZIMI

najvažniji enzimi koji se koriste u genetičkom inženjerstvu

restrikcija DNA → degradacija, "inaktivacija" DNA

modifikacija DNA → zaštita od restrikcije

Modifikacijsko-restrikcijski sustav:

modifikacija se sastoji u metilaciji adenina (N6-metiladenin) i/ili citozina (5-metilcitozin ili N4-metilcitozin), u sekvenciji kojuprepoznaje restrikcijski enzim.

do metilacije dolazi nakon replikacije, a za modifikacijsku metilazu najbolji supstrat je hemimetilirana DNA.

NH

CH

N

O

NH2

CH3

NH

CH

N

N

CH

N

NCH3H

NH

CH

N

O

CH

NCH3

H

N6-metiladenin

(6-metilaminopurin)

N4-metilcitozin

123

45

6

321

65

4

78

9

12

3 4 5

6

5-metilcitozin

Restrikcijske endonukleaze, tri skupine, različiti mehanizmi reakcije i važnost:

I. Režu nespecifično 100-1000 bp od mjesta prepoznavanja (SAM, ATP, Mg2+).Tri gena, hsdM + hsdS i hsdR, jedan kompleks (enzim) (S prepoznaje sekvenciju, M metilira, R cijepa?)

II. Režu unutar sekvencije (Mg2+ !). Dva gena, odvojene aktivnosti.

IIS. Režu na određenom mjestu pokraj sekvencije prepoznavanja.

III. Režu na udaljenosti od 25-27 bp, asimetrična sekvencija (Mg2+, ATP). Dva gena, jedan kompleks.

(IV. Mcr/Mrr - režu modificiranu DNA, zaštita od modificiranih faga!)

II. Skupina restrikcijskih endonukleaza.

- prepoznaju specifičnu, "palindromsku" sekvenciju - tetra, penta, heksa, hepta ili oktanukleotid (učestalost - 1/4n).- isti redoslijed nukleotida u oba lanca (ali u istom smjeru 5'→ 3' !)

RESTRIKCIJSKI ENZIMI – OSNOVNE KARAKTERISTIKE

1. Utjecaj metilacije DNA – često inhibira aktivnost enzima

GATC GA*TCMboI, NdeI + -Sau3A + + DpnI - +

2. Nomenklatura (e.g. EcoRV ili EcoR V).

3. Palindrom! 4. Krajevi – a) 3' hidroksil, b) 5' fosforil, c) ravni

5. Izoshizomeri (e.g. SmaI, XmaI); “striktni izoshizomeri” – nastaju isti krajevi. 6. Kompatibilni krajevi (e.g. SmaI, XhoI).

Restrikcijski enzimi - primjer