Upload
others
View
13
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Universitatea de Medicină și Farmacie
„Carol Davila” București
Facultatea de Farmacie
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
CONTRIBUȚII EXPERIMENTALE LA EVALUAREA
IN-VITRO ŞI IN-VIVO A PROPRIETĂȚILOR
BIOFARMACEUTICE ALE CLOPIDOGRELULUI ŞI
METABOLIȚILOR SĂI
Coordonator ştiinţific:
PROF. DR. CONSTANTIN MIRCIOIU
Doctorand:
SIMONA NICOLETA SAVU (căs. DUNĂ)
BUCUREŞTI
2016
CUPRINS I. INTRODUCERE………………...………………………………………….
1
II. STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII
II.1 Notiuni generale privind istoricul si rolul actual al clopidogrelului in farmacoterapie………………………………………………………… 4
II.2 Stadiul actual al cunoasterii privind farmacocinetica clopidogrelului si a metabolitilor sai…………………………………………………... 9
II.3 Stadiul actual al cunoasterii privind cinetica de cedare a clopidogrelului si premisele dezvoltarii unui model IVIVC…………..
16
III. CONTRIBUTII EXPERIMENTALE LA EVALUAREA IN-VITRO SI IN-VIVO A PROPRIETATILOR BIOFARMACEUTICE ALE CLOPIDOGRELULUI SI METABOLITILOR SAI
III.1 Teste de stabilitate ex-vivo; teste privind influenta anticoagulantului utilizat la recoltari asupra rezultatelor farmacocinetice; aplicarea intr-un studiu de biodisponibilitate realizat pe voluntari sanatosi a unor metode analitice de ultima generatie pentru determinarea in probe de farmacocinetica a clopidogrelului si metabolitilor sai………………... 26
III.2 Dezvoltarea unui model IVIVC biorelevant ce poate fi aplicat pentru predictia biodisponibilitatii formularilor generice de clopidogrel…… 53
III.3 Evaluarea cailor de metabolizare prin mecanisme de conjugare a clopidogrelului: studii farmacocinetice pe soareci si subiecti umani sanatosi ce descriu absorbtia, disponibilitatea si eliminarea clopidogrelului acil glucuronid……………………………………….. 73
III.4 Evaluarea interactiunilor medicamentoase intre clopidogrel si substraturi competitoare sau inhibitori CYP2C19 sau CYP3A4 si determinarea impactului lor asupra ratei de formare a metabolitului activ H4: studii in vitro realizate pe microzomi hepatici……………... 90
IV. CONCLUZII
IV.1 Concluzii partiale……………………………………………………... 110
IV.2 Concluzii finale...……………………………………………………... 120
V. REFERINTE BIBLIOGRAFICE……………………………….………….. 123
VI. ANEXE…………………………………………………………………….. 136
VII. ARTICOLE PUBLICATE CA PRIM AUTOR IN REVISTE COTATE ISI……………………………………………………………………………… 149
NOTA: Cuprinsul respecta numerotarea paginilor si capitolelor din teza
Pagina|1
INTRODUCERE
Clopidogrelul este un medicament din clasa tienopiridinelor, utilizat ca
antiagregant plachetar cu scopul de a inhiba formarea cheagurilor de sange in boala
coronariana, boala vasculara periferica si boala cerebrovasculara [RCP, 2013]. In
ciuda faptului ca acest medicament este utilizat in practica farmacoterapeutica de mai
bine de 18 ani (a primit aprobarea de punere pe piata in Uniunea Europeana in anul
1998) si ca, inainte de expirarea brevetului sau, acesta a fost al doilea cel mai utilizat
medicament din lume [Topol et. al., 2011], este surprinzator faptul ca informatiile
disponibile pana in prezent cu privire la soarta sa metabolica si variabilitatea inter-
individuala crescuta farmacocinetica si farmacologica sunt inca incomplete.
Clopidogrelul in sine este un promedicament; pentru a rezulta metabolitul
activ care inhiba agregarea plachetara, acesta trebuie sa fie metabolizat pe calea
izoenzimelor citocromului P450. Metabolitul activ al clopidgrelului inhiba selectiv
legarea adenozin-difosfatului (ADP) de receptorul sau plachetar P2Y12 si, prin
aceasta, activarea complexului glicoproteinei GP IIb/IIIa mediata de ADP;
consecutiv, agregarea plachetara este inhibata. Datorita legarii ireversibile,
trombocitele expuse la clopidogrel sunt afectate pentru tot restul duratei lor de viata
(aproximativ 7-10 zile), iar refacerea functiei trombocitare normale corespunde
duratei turn-over-ului trombocitar [RCP, 2013].
In vitro si in vivo, clopidogrelul este metabolizat pe doua cai metabolice
principale: una mediata de esteraze care determina hidroliza la derivatul sau
carboxilic inactiv (85% dintre metabolitii circulanti) si una mediata de izoenzimele
citocromului P450. Pe calea izoenzimelor hepatice, clopidogrelul este convertit mai
intai la metabolitul intermediar 2-oxo-clopidogrel. Metabolizarea consecutiva a
intermediarului 2-oxo-clopidogrel determina formarea metabolitului activ, un derivat
tiolic al clopidogrelului. In vitro, aceasta cale metabolica este mediata de CYP3A4,
CYP2C19, CYP1A2 si CYP2B6 [Kazui et. al., 2010].
Conform RCP “deoarece metabolitul activ se formeaza pe calea izoenzimelor
citocromului P450, dintre care o parte sunt polimorfe sau sunt inhibate de alte
medicamente, inhibarea plachetara nu este adecvata la toti pacientii”. Desi este
adevarat ca s-a demonstrat existenta unei legaturi intre polimorfismul genetic al
izoenzimei CYP2C19, formarea metabolitului activ si evenimentele adverse clinice,
corelarea dintre genotipul individual si raspunsul la tratament reuseste sa explice
Pagina|2
numai 12% din variabilitatea totala cu privire la eficacitatea tratamentului cu
clopidogrel [Krishna et. al., 2012; Nissen et. al., 2011; Shuldiner et. al., 2009].
Pana in prezent au fost in realitate formulate mai multe ipoteze cu privire la
motivele pentru care unii pacienti nu raspund sau au un raspuns diminuat la
tratamentul cu clopidogrel, insa impactul individual sau chiar si cumulat al factorilor
citati nu explica pe deplin faptul ca aproximativ 20% pana la 40% din populatia
tratata prezinta un raspuns suboptimal la regimul standard de terapie [Zhang et. al.,
2014]. Factorii cel mai adesea incriminati sunt variabilitatea intra- si inter-individuala
cu privire la formarea metabolitului activ, rezistenta generala la xenobiotice si
reactivitatea trombocitara individuala pre-tratament [Gurbel et. al., 2003; Müller et.
al., 2003].
In aceasta lucrare va fi descrisa pe larg farmacocinetica clopidogrelului
parinte, determinata prin metode HPLC-MS/MS de ultima generatie si se vor corela
informatiile obtinute cu date in vitro privind cedarea sa din forma farmaceutica,
printr-un model IVIVC biorelevant. De asemenea, pornind de la observatii privind
capacitatea unuia dintre principalii metaboliti circulanti ai clopidogrelului sa
reformeze medicamentul parinte in vitro prin trans-esterificare [Silvestro et. al.,
2010], se va studia posibila relevanta in vivo a unei reactii similare. Pentru elucidarea
acestui aspect au fost realizate teste in vivo cu administrare directa a metabolitului
clopidogrel acil glucuronid (metabolit capabil sa genereze in vitro cantitati
semnificative de clopidogrel parinte) pe cale orala si intravenoasa intr-un model
animal relevant. Scopul a fost acela de a vedea daca in vivo este posibila o reactie de
trans-esterificare sau de hidroliza a metabolitului (prin actiunea beta-glucuronidazei
sau a esterazelor plasmatice) din care sa rezulte clopidogrel parinte. Cu acelasi scop
au fost realizate si teste pe voluntari umani sanatosi, in care s-a realizat administrarea
de clopidogrel in doza unica orala fie in conditii standard, fie urmata de un regim de
dozare cu carbune medicinal activat ce avea ca scop intreruperea circuitului entero-
hepatic. In acest studiu pe subiecti umani au fost recoltate atat probe de
farmacocinetica cat si de eliminare (clopidogrelul si principalii sai metaboliti
circulanti au fost cuantificati in probe de urina si materie fecala), pentru a elucida
daca acesti metaboliti sunt implicati sau nu intr-un circuit entero-hepatic si a
determina in cazul observarii unei asemenea reactii daca fractia reabsorbita este
clopidogrelul parinte sau o alta entitate derivata. O intelegere amanuntita a tuturor
proceselor metabolice ce pot contribui la expunerea totala la clopidogrel observata in
Pagina|3
om este fundamentala pentru identificarea tuturor surselor de variabilitate ce
influenteaza farmacocinetica sa. Datele de excretie determinate in acest studiu, cu
specificitate fata de entitatea derivata eliminata, au fost si ele analizate in contextul
informatiilor non-specifice existente in literatura cu privire la recircularea si
eliminarea derivatilor de clopidogrel (obtinute in studii de bilant de masa realizate cu
clopidogrel marcat cu C14 [Lins R., 1999]).
Dupa determinarea profilului farmacocinetic si de eliminare al clopidogrelului,
urmatorul scop important a fost acela de a caracteriza expunerea la metabolitii
importanti ai acestuia (atat cei importanti cantitativ (precum clopidogrel acid
carboxilic si clopidogrel acil glucuronid) cat si cei relevanti din punct de vedere al
bioactivarii (2-oxo-clopidogrel si metabolitul tiolic activ)). Aceasta lucrare descrie o
metodologie analitica complexa pentru determinarea in plasma a metabolitilor mai sus
mentionati si trateaza pe larg posibile surse de interferenta ce pot afecta cuantificarea
lor in plasma (coversii ex-vivo cauzate de paroxonazele sau esterezale plasmatice si
reactii de trans-esterificare ce pot avea loc in momentul procesarii probelor). Un
aspect important studiat a fost cel privind posibila influenta a anticoagulantului folosit
pentru recoltarea sangelui asupra cantitatilor de metaboliti determinati in probele de
PK. Fiind cunoscut faptul ca pentru anumite prodroguri cu grupari ester, pot avea loc
reactii de metabolizare ex vivo sub influenta esterazelor plasmatice [Billecke et. al.,
2000; Lindegardh et. al., 2006; Li et. al. 2005] si tinand cont de faptul ca in momentul
realizarii studiului era in mare voga teoria conform careia paroxonaza-1 (si nu
izoenzimele citocromului P450) ar fi fost principalul determinant al formarii
metabolitului activ [teorie enuntata de Bouman et. al. in 2011], s-au realizat teste
pentru determinarea consumului de substrat si identificarea eventualilor metaboliti
rezultati in urma incubarii ex-vivo a 2-oxo-clopidogrelului in fluide biologice
relevante (sange intreg, plasma si lizat eritrocitar).
De asemenea a fost dezvoltat si un model predictiv pentru testarea in vivo,
utilizand microzomi hepatici, a potentialelor interactiuni la nivel metabolic intre
clopidogrel / oxo-clopidogrel si alte medicamente administrate in mod uzual in
practica medicala concomitent cu clopidogrelul.
Pagina|4
PARTEA DE TEORIE GENERALA
Notiuni privind stadiul actual al cunoasterii cu privire la
medicamentul studiat
Partea generala a tezei de doctorat cuprinde trei capitole care trateaza aspecte
referitoare la progresele stiintifice deja rezultate din studii clinice si experimente cu
clopidogrel (sau metaboliti derivati) si identifica domeniile unde o cercetare mai
amanuntita este inca necesara.
In subcapitolul I au fost prezentate notiuni generale privind istoricul si rolul
actual al clopidogrelului in farmacoterapie, incepand cu aprobarea acestuia si
urmarind rezultatele studiilor clinice/ghiduri care au modelat indicatiile actuale,
posologia medicamentului si stabilirea terapiei duale clopidogrel-aspirina ca standard
in preventia evenimentelor aterotrombotice:
- CAPRIE [Clopidogrel versus Aspirin in Patients at Risk of Ischaemic
Events]
- CREDO [Clopidogrel for the Reduction of Events During Observation]
- “Ghidul privind Interventiile Coronariene Percutanate”, versiunea 2005,
publicat de comitetul reunit al ACC/AHA/SCAI [American College of
Cardiology/ American Heart Association/ Society for Cardiovascular
Angiography and Interventions].
Odata cu oficializarea rolului clopidogrelului in farmacoterapia de preventie
cardiovasculara a avut loc si o crestere semnificativa a expunerii populatiei la
tratament, lucru care a facut vizibila variabilitatea inter-individuala mare cu privire la
raspunsul terapeutic. S-au discutat, printre altele, si rezultatele urmatoarelor studii
clinice randomizate care au influentat modul in care intelegem variabilitatea
farmacodinamica a clopidogrelului:
- sub- studiului GIFT (Genotype Information and Functional Testing study)
subordonat GRAVITAS (Gauging Responsiveness with A VerifyNow
assay–Impact on Thrombosis And Safety), in care s-a studiat influenta
polimorfismului uninucleotidic al CYP2C19 asupra efectului
farmacodinamic.
Pagina|5
- studiul TRITON-TIMI 38 in care s-a studiat corelarea intre polimorfismul
ABCB1 (gena responsabila pentru activitatea transportorului de eflux P-
glicoproteina (Pgp), esentiala pentru absorbtia intestinala a
clopidogrelului), polimorfismul CYP2C19 si evenimentele cardiovasculare
intampinate de pacientii tratati cu clopidogrel.
In subcapitolul II s-au prezentat notiuni privind metabolismul clopidogrelului si
progresele facute de-a lungul timpului in vederea elucidarii farmacocineticii
compusului parinte si al metabolitilor sai, accentuand si aspectele ramase inca
neelucidate ce urmeaza sa fie tratate in capitolul experimental. In linii mari, discutia
se bazeaza pe considerentele prezentate in continuare:
- Desi Plavix (clopidogrel) a inceput sa fie utilizat inca din anul 1998,
detaliile cu privire la farmacocinetica compusului parinte si a metabolitului
sau cu activitate farmacologica au ramas necunoscute pentru o lunga
perioada de timp. La momentul respectiv, erau disponibile metode
analitice numai pentru cuantificarea metabolitului inactiv principal
circulant, clopidogrel acid carboxilic, care reprezinta aproximativ 85% din
bilantul compusilor derivati din clopidogrel circulanti in plasma. Desi util
ca marker de absorbtie, a fost recunoscut faptul ca relevanta studiilor
farmacocinetice conventionale bazate pe cuantificarea metabolitului
inactiv este limitata.
- Urmatoarea etapa importanta in intelegerea farmacocineticii si
metabolismului clopidogrelului a fost dezvoltarea de metode analitice cu
sensibilitate suficient de mare pentru detectia compusului parinte. Spre
deosebire de clopidogrel acid carboxilic pentru rezultate similare au fost
obtinute prin metode analitice diferite si de catre autori diferiti, in cazul
clopidogrelului parinte intre parametrii de farmacocinetica raportati de
cercetatori diferiti pentru aceeasi doza de 75 mg administrata exista o
diferenta substantial (de 6-7 ori ca ordin de marime). Studii mai
amanuntite efectuate de Silvestro et. al. au aratat ca metabolitul
clopidogrelul acil-glucuronid este responsabil pentru aceste diferente, prin
re-conversia la clopidogrel-parinte in conditii standard de recoltare si
manipulare a probelor biologice [Silvestro et. al., 2011]. Datorita tendintei
clopidogrelului acil glucuronid de reconversie la clopidogrel in vitro, unul
Pagina|6
dintre obiectivele cercetarii in cadrul acestei teze a fost acela de a evalua
daca un proces similar este posibil si in vivo prin trans-esterificare sau sub
actiunea glucuronidazei [subiect tratat in Capitolul III.3, unde sunt
prezentate si date complete de farmacocinetica si eliminare pentru
metabolitul conjugat].
- In anul 2004, grupul Taubert et al. a publicat prima lucrare privind
determinarea de clopidogrel metabolit tiolic in plasma, fara selectivitate
insa pentru izomerul activ al acestuia (forma H4). Cercetari mai
amanuntite realizate in vivo de care Lada et. al. si Furlong et. al. au
demonstrat ca in matrice biologice numai formele izomere H3 si H4 sunt
cuatificabile [Karazniewicz-Lada et. al., 2012; Furlog et. al., 2013].
- Impreuna cu progresele analitice realizate in ultimii ani, un mare efort a
fost de asemenea depus pentru a intelege mai bine calea de metabolizare a
clopidogrelului, cu accent pe identificarea de markeri care ar putea fi
asociati cu variabilitatea farmacodinamica individuala, prin
genotipare.Studiile au demonstrat ca CYP2C19 a contribuit substantial la
ambele etape de oxidare necesare pentru formarea de clopidogrel metabolit
activ si ca CYP3A4 a contribuit semnificativ la al doilea pas oxidativ,
astfel explicand impactul pe care polimorfismul genetic al CYP2C19 si co-
administrarea de inhibitori puternici ai CYP3A4 il au asupra
comportamentului farmacocinetic si farmacodinamic al clopidogrelului
[subiect trata mai pe larg in capitolul III.4].
- In timp ce pentru majoritatea metabolitilor clopidogrelului exista date
disponibile in literatura, foarte putine sunt cunoscute despre profilul
farmacocinetic al 2-oxo-clopidogrelului, intermediar indispensabil in
procesul de formare al metabolitului activ. Abia in anul 2015 a fost
publicat primul articol privind cuantificarea metabolitului in plasma
stabilizata cu antioxidant, recoltata de la 8 voluntari sanatosi, dupa
administarea de Plavix 75 mg in conditii post-prandiale [Li et. al., 2015].
Pana in prezent nu a fost insa publicat nici un studiu in care sa se
determine simultan 2-oxo-clopidogrelul si metabolitul activ forma H4
astfel incat sa se observe in mod comparativ cinetica acestora [lucru
realizat in cadrul acestui proiect de cercetare, rezultatele fiind prezentate in
capitolul III.1].
Pagina|7
In subcapitolul III se analizeaza:
- importanta si avantajele utilizarii unor medii de cedare continand agenti
tensioactivi fiziologici care sa simuleze cat mai fidel conditiile de la
nivelul gastric si respectiv intestinal in conditii pre- si postprandiale (asa
numitele medii “biorelevante”) fata de mediile de cedare compendiale.
- o serie de situatii de non‐corelare in vitro ‐ in vivo cauzate deindepartarea conditiilor experimentale de realitatea fiziologica aprocesului de dizolvare sau de tentativa de a corela un proces fizicireversibil precum dizolvarea cu parametrii farmacocineticicaracterizati prin ciclicitate (in cazul medicamentelor implicate incircuitenterohepatic).
- principiile de baza ale obtinerii de corelatii cantitative intre cinetica de
cedare in vitro si farmacocinetica in vivo.
PARTEA ORIGINALA EXPERIMENTALA
III.1 Teste de stabilitate ex-vivo
Fiind deja cunoscut faptul ca pentru anumite entitati chimice cu grupari ester, pot
avea loc reactii de metabolizare ex vivo sub influenta esterazelor plasmatice [Billecke
S., 2000; Lindegardh N., 2006; Li B. 2005] si in urma examinarii rezultatelor
publicate de Bouman et. al. in 2011 in care se descria faptul ca cea de a doua etapa
metabolica necesara formarii derivatului tiolic activ al clopidogrelului (conversia 2-
oxo-clopidogrelului la metabolitul farmacologic activ), nu necesita implicarea
izoenzimelor citocromului CYP450 ci se produce prin scindarea hidrolitica catalizata
de esterazele PON1 si PON3 a inelului γ-tiobutirolactonic al 2-oxo-clopidogrelului, s-
a cercetat posibilitatea ca sub actiunea parxonazelor prezente in sange, 2-oxo-
clopidogrelul aflat in probele proaspat recoltate sa fie convertit la metabolitul activ
sau un izomer al acestuia in conditii de prelucrare standard. Deoarece aceasta reactie
ar avea loc inainte de separarea si congelarea probelor de plasma, rezultatele obtinute
la determinarea cantitativa a metabolitului activ ar fi supraestimate, prejudiciul fiind
unul nedetectabil prin analiza repetata (ISR – incurred sample reanalysis) impusa prin
normele actuale de validare bioanalitica. Prin urmare, pentru a evalua impactul unei
asemenea reactii, am conceput un experiment pentru determinarea cineticii de
conversie a 2-oxo-clopidogrelului in fluide biologice relevante (singe proaspat
recoltat/plasma/lizat eritrocitar, fara adaos suplimentar de PON1 sau PON3).
Pagina|8
Probe de sange intreg proaspat au fost recoltate, in tuburi continand heparina ca
anticoagulant, de la un voluntar sanatos care nu a urmat vreodata tratament cu
clopidogrel si nu a primit in ultimele trei saptamani anterioare recoltarii alte
medicamente. Sangele proaspat obtinut de la voluntar a fost utilizat ca atare sau
pentru obtinerea unor probe de plasma heparinizata sau lizatul eritrocitar. Dupa
recoltare/procesare aceste fluide biologice blank au fost incubate la 37° Celsius pentru
a reveni la o temperatura fiziologic relevant, tratate cu solutii de 2-oxo-clopidogrel in
DMSO, si lasate in continuare la incubat la 37° Celsius.
In figura de mai sunt prezentate cromatograme reprezentative obtinute prin
determinarea simultana a analitilor clopidogrel, 2-oxo-clopidogrel, clopidogrel acid
carboxilic si clopidogrel metabolit tiolic activ intr-o proba de incubare cu substrat 2-
oxo-clopidogrel (Figura III.3):
Figura III.3 Cromatograma obtinuta dupa incubarea 2-oxo-clopidogrelului (Sample 17.3)
In timp ce metabolitul activ tiolic (formula stanga) nu a fost identificat in probe, s-a
cuantificat un peak foarte apropiat, despre care credem ca reprezinta forma endo- a
metabolitului activ (formula dreapta).
Clopidogrel metabolit activ (H4) Clopidogrel „endo”-metabolit
Pagina|9
Rezultatele sugereaza ca sub actiunea paroxonezei-1, in mediu ex-vivo are loc o
conversie a 2-oxo-clopidogrelului la un metabolit cu o structura si un timp de retentie
foarte similare cu cele ale metabolitului activ. Acest lucru poate sa explice de ce unii
autori au raportat ca aceasta estereaza poate fi responsabila de formarea metabolitului
activ atat in mediu hepatic cat si in ser [Bouman H.J., 2011], rezultate care nu au fost
reproduse pana in prezent. Este posibil ca metodele analitice folosite sa nu fi fost
suficient de selective pentru a departaja cei doi analiti.
Concentratiile obtinute pentru acest endo-metabolit par sa scada pe masura ce creste
durata de incubare, sugerand ca metabolitul nu este unul foarte stabil (Figura III.4).
Figura III.4 Concentratiile de endo-metabolit cuantificate in plasma dupa incubarea a 5 concentratii
diferite de 2-oxo-clopidogrel in probe de sange intreg (proaspat recoltat) timp de 60 de minute
Acelasi lucru este valabil si pentru 2-oxo-clopidogrel, metabolit al carui concentratii
in probele de plasma obtinute dupa centrifugarea sangelui intreg incubat scad
considerabil dupa 15 minute, sugerand ca pe langa conversia la endo-metabolit mai au
loc si reactii de degradare dependente de timp (Figura III.5).
Figura III.5 Curbele de epuizare a substratului obtinute pentru 5 concentratii diferite de 2-oxo-
clopidogrel, dupa incubarea metabolitului in probe de sange intreg proaspat recoltat timp de 60 de
minute
0
100
200
300
400
500
600
700
15 30 45 60 Con
cen
trat
ie 2
-oxo
-clo
pid
ogre
l (n
g/m
L)
Timp de incubare (minute)
Recuperarea 2-oxo-clopidogrelului in plasma dupa centrifugarea probelor de sange intreg in care a fost incubat
10 000 ng/ml
5 000 ng/ml
2 000 ng/ml
1 000 ng/ml
500 ng/ml
0
100
200
300
400
500
15 30 45 60
Con
cent
rati
e en
d0-
met
abol
it (
ng/
mL
)
Timp de incubare (minute)
Concentratiile de "endo-metabolit"in plasma dupa centrifugarea probelor de sange intreg in care a fost incubat
2-oxo-clopidogrel
10 000 ng/ml
5 000 ng/ml
2 000 ng/ml
1 000 ng/ml
500 ng/ml
Pagina|10
Comparand concentratiile de 2-oxo-clopidogrel obtinute in urma analizei
concentratului eritrocitar si a plasmei provenind din aceleasi probe de sange intreg, a
fost dedus si faptul ca 2-oxo-clopidogrelul nu patrunde in eritrocite.
Degradare substantiala si dependenta de timp a 2-oxo-clopidogrelului in sange sub
actiunea PON-1 sugereaza faptul ca rezultatele obtinute in urma determinarii acestui
metabolit in probe de farmacocinetica pot sa difere in functie de anticoagulantul
utilizat la recoltarea lor (avand in vedere ca EDTA, de exemplu, este inhibitor PON1
in timp ce heparina nu este).
Avand in vedere faptul ca 2-oxo-clopidogrelul este un intermediar cheie in formarea
metabolitului tiolic activ, cuantificarea sa corecta in plasma poate ajuta la elucidarea
anumitor aspecte mecanistice cu privire la cele doua etape oxidative.
Teste privind influenta anticoagulantului utilizat la recoltari asupra rezultatelor
farmacocinetice
Avand in vedere reactiile de metabolizare/degradare suferite de 2-oxo-clopidogrel sub
actiunea paroxonazelor, a fost realizat un experiment prin care sa se determine daca
recoltarea probelor de farmacocinetica in tuburi ce contin EDTA (inhibitor PON) sau
EDTA + DTT (1,4-ditio-DL-treitol; utilizat pentru a opri oxidarea sulfului din inelul
tiolactonic al 2-oxo-clopidogrelului la sulfoxid sau sulfona), aduce beneficii in plus
din punct de vedere al stabilitatii metabolitului comparativ cu heparina. Patru
voluntari sanatosi fara istoric de tratament cu clopidogrel, au primit o doza unica de
Plavix 75 mg in conditii de repaus alimentar. Le-au fost recoltate cu ajutorul unor
seringi probe de sange la 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa administrare. Imediat dupa
recoltare, fiecare proba a fost divizata in 3 parti alicote care au fost puse in monovete
continand heparina, EDTA si respective EDTA+DTT si mentinute la temperatura
camerei timp de 15 minute (conditii standard de lucru) inainte de centrifugare. Apoi
probele au fost prelucrate la rece si analizate pentru cuantificarea 2-oxo-
clopidogrelului.
Curbele individuale de concentratie plasmatica a 2-oxo-clopidogrelului versus timp,
obtinute de la cei patru voluntari dupa divizarea acelorasi probe in trei tuburi cu
anticoagulanti diferiti, sunt prezentate in Figura III.6 de mai jos; curbele medii
obtinute pentru EDTA versus Heparina si EDTA + DTT versus Heparina sunt
prezentate in figurile III.7 si respectiv III.8.
Pagina|11
Figura III.6 Curbe farmacocinetice de 2-oxo-clopidogrel individuale, prezentate in functie de
anticoagulantul utilizat
p <0.05
p < 0.05
p < 0.05
0.00
3.00
6.00
9.00
12.00
15.00
18.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Oxo
-clo
pid
ogre
l (ng
/mL
)
Timp (ore)
Concentratii de oxo-clopidogrel determinate in probele plasate in tuburi cu EDTA sau heparina
EDTA
Heparina
Figura III.7 Curbe farmacocinetice medii de 2-oxo-clopidogrel prezentate in mod comparativ pentru
EDTA versus Heparina (prezentare lineara insotita de deviatii standard si marcarea punctelor in care
testul T a demonstrat diferente semnificative statistic)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Oxo
-clo
pid
ogre
l (n
g/m
L)
Timp (ore)
Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu Heparina
Sub 1
Sub 2
Sub 3
Sub 4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Oxo
-clo
pid
ogre
l (n
g/m
L)
Timp (ore)
Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu EDTA
Sub 1
Sub 2
Sub 3
Sub 4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Oxo
-clo
pid
ogre
l (n
g/m
L)
Timp (ore)
Concentratii oxo-clopidogrel in probele cu EDTA + DTT
Sub 1
Sub 2
Sub 3
Sub 4
Pagina|12
p < 0.05
p <0.05
p < 0.05
p < 0.05
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
16.00
18.00
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Oxo
-clo
pid
ogre
l (ng
/mL
)
Timp ore)
Concentratii de oxo-clopidogrel determinate in probele plasate in tuburi cu EDTA+DTT sau heparina
EDTA + DTT
Heparina
Figura III.8 Curbe farmacocinetice medii de 2-oxo-clopidogrel prezentate in mod comparativ pentru
EDTA+DTT versus Heparina (prezentare lineara insotita de deviatii standart si marcarea punctelor in
care testul T a demonstrat diferente semnificative statistic)
Verificarea semnificatiei statistice a diferentelor obtinute s-a realizat prin aplicarea
testului T bilateral pentru esantioane dependente. In cazul EDTA versus Heparina,
testul a demonstrat diferente semnificative (valori p < 0.05) la trei timpi de recoltare
iar pentru EDTA + DTT versus heparina la patru timpi de recoltare. Este de remarcat
faptul ca in ambele cazuri a fost observata o diferenta importanta in proba
corespunzatoare concentratiei plasmatice maxime, astfel incat se poate spune ca
parametrii farmacocinetici principali (atat Cmax cat si ASC0-t) difera semnificativ in
functie de anticoagulantul ales pentru recoltarea probelor.
Intre EDTA simplu si EDTA+DTT nu s-au obtinut rezultate semnificativ diferite.
A fost demonstrat faptul ca anticoagulantul utilizat poate avea impact asupra
stabilitatii oxo-clopidogrelului (si foarte posibil si asupra altor entitati chimice care
contin inel lactonic) prin inhibarea sau inlesnirea activitatii paroxonazelor.
Efectul observat a atins nivelul de semnificatie statistica chiar si in contextul unor
conditii rapide de procesare (timpul scurs intre recoltarea probelor de sange intreg si
inghetarea plasmei dupa centrifugare a fost mentinut sub 30 minute).
Deoarece sunt cunoscute doua tipuri polimorfe ale PON1 (Q192R si L55M) iar datele
de literatura sugereaza ca polimorfismul acesta are efect asupra eficientei hidrolitice a
enzimei [Adkins, 1993; Billecke, 2000], este de asteptat ca degradarea in probe a 2-
Pagina|13
oxo-clopidogrelului sa fie una specifica subiectului si astfel o potentiala sursa de
eroare in ipotezele formulate cu privire la variabilitatea inter-subiecti a parametrilor
farmacocinetici.
Aplicarea intr-un studiu de biodisponibilitate realizat pe voluntari sanatosi a
unor metode analitice de ultima generatie pentru determinarea in probe de
farmacocinetica a clopidogrelului si metabolitilor sai
In pofida utilizarii pe scara larga a clopidogrelului si a faptului ca s-au realizat
proiecte extensive de cercetare in vederea elucidarii anumitor aspecte particulare ce
tin de biodisponibilitatea lui si rata de formare a metabolitului sau activ, sursele
variabilitatii intra-individuale substantiale observate atat farmacocinetic cat si
farmacodinamic raman inca incomplet descrise. Lipsa unor raspunsuri care sa
convinga intreaga comunitate stiintifica se datoreaza partial faptului ca pasii critici
implicati in bioactivarea pro-medicamentului nu au putut fi descrisi integral din cauza
multiplelor provocari intampinate la cuantificarea sa si a metabolitilor sai (atat din
punct de vedere al conditiilor de procesare ale probelor cat si al metodelor analitice
folosite). Metoda analitica dezvoltata pentru determinarea clopidogrelului si a
metabolitilor inactivi este una optimizata pentru a evita procesul de reconversie
clopidogrel acil glucuronid – clopidogrel (temperatura autosamplerului pe durata de
achizitie a probelor este setata la -5ºC si se utilizeaza acetonitril ca agent de
precipitare al probelor in loc de solutii ce contin metanol) iar determinarea
metabolitului activ are loc separat (metoda 2, unde procedura optima de extractie
implica utilizarea metanolului ca agent de precipitare iar faza mobila contine la randul
ei metanol). De asemenea, conditiile de recoltare si prelucrare a probelor la centrul
clinic au fost optimizate pentru stabilizarea 2-oxo-clopidogrelului atat termic cat si
prin inhibarea paroxonazelor. Prin faptul ca se cuantifica toti metabolitii principali
(fie ca sunt sau nu legati de activitatea farmacologica a medicamentului) in probe
proveniti de la aceiasi subiecti, se faciliteaza o evaluare mai complexa a
metabolismului clopidogrelului si a stabilitatii metabolitilor sai in probele de plasma,
fiind posibila identificarea eventualelor surse de degradare si a produsilor rezultati in
urma unor asemenea reactii prin reanaliza de probe reale (ISR, incurred samples
reanalysis). Probele analizate provin dintr-un studiu pilot de bioechivalenta in care au
fost inrolati 12 voluntari sanatosi si s-au administrat comprimate de 75 mg
clopidogrel in doza unica. Cu 11 ore inainte de administrarea medicatiei, subiectii au
Pagina|14
luat o cina standardizata si apoi au postit pana la 5 ore dupa dozare. De asemenea,
consumul de lichide a fost restrictionat timp de o ora inainte si o ora dupa dozare, iar
volumul de apa plata la temperatura camerei utilizat pentru administrarea medicatiei a
fost unul standardizat (240 mL).
Probe de sange a cate 5 mL fiecare au fost recoltate in tuburi racite continand
K2EDTA ca anticoagulant + DTT (1,4-ditio-DL-treitol; utilizat pentru a opri oxidarea
sulfului din inelul tiolactonic al 2-oxo-clopidogrelului): inainte de administrare si la
0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 16.0, 24.0 si 36.0 ore
post doza. Tuburile de recoltare au fost imediat plasate pe baie de apa cu gheata si
mentinute acolo maxim 15 minute pana in momentul centrifugarii.
Centrifugarea s-a efectuat la o temperatura nominala de 4 °C si o forta de 1500-g,
timp de 10 minute. Dupa scoaterea din centrifuga, plasma rezultata a fost divizata in
doua parti alicote de aproximativ 1 mL fiecare, in tuburi de polietilena pre-racite.
Tuburile continand cele doua parti alicote au fost puse in doua congelatoare de -70 °C
pana cand au fost expediate catre laboratorul analytic. Pe durata transportului,
temperatura probelor a fost monitorizata si inregistrata cu ajutorul unui dispozitiv
electronic iar la printarea raportului de temperaturi s-a confirmat faptul ca probele nu
au fost expuse la temperaturi mai ridicate de -70 °C.
- Inainte de inceperea procesarii in laborator, probele au fost dezghetate pe baie
de apa si gheata.
- Dupa dezghetare acestea au fost vortexate timp de 3 minute pentru
omogenizare.
Extractie clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil
glucuronid:
- Esantioane de cate 0.2 mL plasma mentinuta pe baie de apa cu gheata au fost
transferate in tuburi de propilena pre-racite si tratate cu solutie-mix de
standard intern racit (0.02 mL continand d3-clopidogrel hidrogensulfat
100ng/mL, 13C6-clopidogrel acid carboxilic 800ng/mL, acil-β-D-glucuronid si
oxoclopidogrel-d3 100 ng/mL in acetonitril) - aceste probe au fost utilizate
doar pentru cuantificarea clopidogrelului si a celor trei metaboliti inactivi:
clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil glucuronid;
- S-au adaugat 0.4 mL acetonitril rece (ca agent de precipitare) in fiecare tub;
Pagina|15
- Probele au fost mixate timp de 2 minute apoi centrifugate timp de 5 minute la
o viteza de 10 000 rpm si o temperatura nominala de 4°C;
- Volume de cate 0.4 mL supernatant limpede din fiecare proba au fost
transferate in tuburi de autosampler din polipropilena pre-racite si apoi
introduse in autosamplerul prevazut cu criotermostat ce a mentinut o
temperatura de - 5 °C (+/- 1 °C) pe intreaga durata de achizitie a probelor.
Extractie metabolit activ:
- Deoarece pentru metabolitul activ procedura optima de extractie implica
utilizarea de metanol, in vederea cuantificarii sale s-au luat in lucru alte
esantione de plasma provenind din aceleasi probe farmacocinetice dezghetate,
vortexate si apoi mentinute pe baie de apa cu gheata. Volume de cate 0.2 mL
plasma au fost transferate in tuburi de propilena pre-racite si tratate cu solutie-
mix de standard intern racit (0.02 mL d3-metabolit activ 40 ng/mL in acid
formic 0.1% si apa cu metanol (40/60 v/v);
- S-au adaugat 0.35 mL solutie racita de metanol + 0.1% acid formic in fiecare
tub, ca agent de precipitare;
- Probele au fost mixate timp de 2 minute apoi centrifugate timp de 5 minute la
o viteza de 10 000 rpm si o temperatura nominala de 4°C;
- Volume de cate 0.2 mL supernatant limpede din fiecare proba au fost
transferate in tuburi de autosampler din polipropilena pre-racite si apoi
introduse in autosamplerul prevazut cu criotermostat ce a mentinut o
temperatura de - 5 °C (+/- 1 °C) pe intreaga durata de achizitie a probelor.
Metode analitice:
1. Clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, oxoclopidogrel si clopidogrel acil
glucuronid:
Sistemul LC au fost compus din pompe binare seria 1200SL produse de Agilent
(Santa Clara, CA, USA) si autosampler de tip CTC PAL HTS (Zwingen, Elvetia),
configurate cu ajutorul unui sistem Aria LX-2 (Cohesive Technologies, Thermo
Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) pentru a opera doua coloane analitice in
paralel.
Separarea s-a realizat pe coloane cromatografice in mecanism de faza inversa de tip
Ascentis RP-Amide 10 cm x 2.1mm, 2.7 µm (Supelco, Bellefonte, PA, USA).
Volumul de elutie a fost de 0.2 mL/min cu o faza mobila compusa din apa cu 0.1%
Pagina|16
acid formic (A) si acetonitril (B) in gradient. Volumul de injectie a fost de 10 µL si
probele au fost termostatate in autosampler la o temperaura de - 5 °C (+/- 1 °C)
utilizand un criotermostat extern model Lauda RM 6 (Lauda-Königshofen,
Germania). Spectrele de masa si cromatogramele au fost achizitionate cu
spectrometrul de masa de tip trapa ionica liniara model API 4000 QTRAP produs de
Applied Biosystems-Sciex (Toronto, ON, Canada). Acesta a fost operat in modul de
ionizare pozitiv, cu o interfata de tip electrospray (Applied Biosystems
Turboionspray). Ca si gaz de coliziune pentru fragmentarea ionilor moleculari si
pentru gaz-cortina a fost folosit azotul de inaltă puritate, iar pentru nebulizare si
vaporizarea eluentului in sursa a fost utilizat aer comprimat. Datele au fost obtinute si
procesate cu soft-ul producatorului, Analyst 1.4.2.
Pentru determinarea cantitativa s-a folosit modul de scanare MRM (multiple reaction
monitoring), urmarind tranzitiile:
- 322.0/184.0, clopidogrel // 327.0/189.0, d3-clopidogrel
- 308.0/95.0, clopidogrel acid carboxilic // 314.1/158.1, clopidogrel a. carboxilic 13C6
- 338.1/155.1, oxoclopidogrel // 341.1/158.0, d3-oxoclopidogrel
- 484.3/198.1, clopidogrel acil glucuronid
Particularitati: ionul molecular corespunzator la 35Cl (322.2) a fost ales ca si ion
precursor pentru clopidogrel in metoda MRM folosita pentru cuantificare, in timp ce
in cazul standardului intern d3-clopidogrel au fost preferati ionii ce contin izotopii 37Cl in pofida faptului ca sunt mai putin intensi, in sesul obtinerii unei mai bune
selectivitati; in cazul metabolitului acid a fost preferat fragmentul cu m/z 95 mai putin
intens deoarece concentratiile plasmatice mari (comparativ cu clopidogrelul) puteau
conduce la o saturare a detectorului in cazul masurarii fragmentelor principale
[cromatograme reprezentative in Figurile A I.2 – A I.4] .
Metoda analitica a fost validata in ceea ce priveste eficienta de extractie, efectul de
matrice, linearitatea, limita inferioara de cuantificare, specificitate, selectivitate,
acuratete, precizie si stabilitatea probelor. Reanalizarea sistemica a 5% din probele de
studiu a demonstrat ca peste 2/3 din probele reanalizate se incadreze in + 20 % fata de
rezultatele initiale, demonstrand astfel reproductibilitatea metodei si stabilitatea
compusilor in conditiile optimizate de procesare.
Curbe de calibrare cu 8 puncte au fost preparate in intervalele de concentratii 0.01 -
100 ng/mL pentru clopidogrel si oxoclopidogrel si 1 - 10000 ng/mL pentru
clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic. In fiecare secventa analitica
Pagina|17
a fost analizata o curba de calibrare si trei randuri de probe pentru controlul calitatii
(QC-uri preparate la patru concentratii diferite din intervalul acoperit de calibrare).
2. Metabolit activ:
Sistemul LC au fost compus din pompe binare serila 1200SL produse de Agilent
(Santa Clara, CA, USA) si autosampler de tip CTC PAL HTS (Zwingen, Elvetia),
configurate cu ajutorul unui sistem Aria LX-2 (Cohesive Technologies, Thermo
Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) pentru a opera doua coloane analitice in
paralel. Separarea s-a realizat pe coloane cromatografice in mecanism de faza inversa
de tip Ascentis RP-Amide 10 cm x 2.1mm, 2.7 µm (Supelco, Bellefonte, PA, USA).
Volumul de elutie a fost de 0.25 mL/min cu o faza mobila compusa din apa cu
metanol si 0.1% acid formic (65/35 v/v) - A si apa cu metanol si 0.1% acid formic
(90/10 v/v) – B si un program de gradient intercalat (100:0, 0:100, 0:100, 100:0,
100:0). Volumul de injectie a fost de 40 µL si probele au fost termostatate in
autosampler la o temperaura de - 5 °C (+/- 1 °C) utilizand un criotermostat extern
model Lauda RM 6 (Lauda-Königshofen, Germania). Spectrele de masa si
cromatogramele au fost achizitionate cu spectrometrul de masa de tip triplu cuadrupol
model API 4000 produs de Applied Biosystems-Sciex (Toronto, ON, Canada). Acesta
a fost operat in modul de ionizare pozitiv, cu o interfata de tip electrospray (Applied
Biosystems Turboionspray). Ca si gaz de coliziune pentru fragmentarea ionilor
moleculari si pentru gaz-cortina a fost folosit azotul de inaltă puritate, iar pentru
nebulizare si vaporizarea eluentului in sursa a fost utilizat aer comprimat. Datele au
fost obtinute si procesate cu soft-ul producatorului, Analyst 1.4.2.
Pentru determinarea cantitativa s-a folosit modul de scanare MRM (multiple reaction
monitoring), urmarind tranzitiile:
- 356.1/212.2, metabolitul activ de clopidogrel // 361.1/217.1, standard intern deuterat
Metoda analitica a fost validata in ceea ce priveste eficienta de extractie, efectul de
matrice, linearitatea, limita inferioara de cuantificare, specificitate, selectivitate,
acuratete, precizie si stabilitatea probelor. Reanalizarea sistemica a 5% din probele de
studiu a demonstrat ca peste 2/3 din probele reanalizate se incadreze in + 20 % fata de
rezultatele initiale, demonstrand astfel reproductibilitatea metodei si stabilitatea
compusului. Curbe de calibrare cu 8 puncte au fost preparate in intervalele de
concentratii 0.1 - 1000 ng/mL. In fiecare secventa analitica a fost analizata o curba de
calibrare si trei randuri de probe pentru controlul calitatii (QC-uri preparate la patru
concentratii diferite din intervalul acoperit de calibrare).
Pagina|18
A I.1 Cromatograma reprezentativa a unui punct din curba de calibrare in care sunt prezentati suprapus cei 7 analiti si timpii de retentie asociati
Pagina|19
A I.2 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de clopidogrel
Pagina|20
A I.3 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de d3-clopidogrel
Pagina|21
A I.4 Spectrul de masa obtinut prin disocierea colizionala a ionului molecular de clopidogrel acid carboxilic
Pagina|22
A I.5 Metabolitactiv(coloanastanga)sistandardintern(coloanadreapta)inCalibrare0(blank–randsuperior)siCalibrare1(LLOQ–randinferior)
Pagina|23
A I.6 Metabolitactiv(coloanastanga)sistandardintern(coloanadreapta)inCalibrare8(ULOQ–randsuperior)sioprobadinstudiu(randinferior)
Pagina|24
Metoda statistica:
Estimarea parametrior de farmacocinetica a fost realizata prin analiza non-compartimentala,
utilizand programul SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC, SUA), astfel:
- concentratia plasmatica maxima (Cmax) si timpul la care aceasta s-a produs, raportat la
momentul administrarii (Tmax) sunt parametrii obtinuti direct din profilele plasmatice
individuale, fara interpolare
- constanta de eliminare (ke) a fost calculata in baza regresiei lineare obtinuta din
concentratiile terminale ale profilului concentratie versus timp, utilizand metoda celor
mai mici patrate
- timpul de injumatatire a fost calculate dupa formula 0.693/ke
- aria de sub curba pana la ultima concentratie cuantificabila (ASC0−t) a fost calculata
utilizand metoda trapezoidala, conform formulei Σ[(Cn-1 + Cn) × (tn – tn-1)/2], unde Cn-1
si Cn reprezinta concentratiile plasmatice obtinute la timpii de recoltare consecutivi tn-1
si tn (astfel obtinand aria unui trapez); astfel, ASC0-t reprezinta suma ariilor tuturor
trapezelor ce pot fi calculate pe valori de concentratie mai mari decat 0;
In figurile de mai jos [III.9, III.10] sunt prezentate curbele medii obtinute pentru clopidogrel si
metabolitii sai (acid carboxilic, acil glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ) dupa
cuantificarea lor in aceleasi probe de plasma, provenite de la 12 voluntari sanatosi:
Figura III.9 Profilele farmacocinetice medii de clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, clopidogrel acil
glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ obtinute dupa administrarea de clopidogrel (n=12 voluntari,
doza=75 mg, conditii pre-prandiale) - prezentare lineara
Pagina|25
Figura III.10 Profilele farmacocinetice medii de clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic, clopidogrel acil
glucuronid, oxoclopidogrel si metabolit activ obtinute dupa administrarea de clopidogrel (n=12 voluntari,
doza=75 mg, conditii pre-prandiale) - prezentare ln-lineara
Pentra a facilita interpretarea rezultatelor obtinute, parametrii farmacocinetici estimati pentru
clopidogrel si metabolitii sai sunt tabelati mai jos [Figura cu tabele III.11] in functie de
procesul metabolic prin care se formeaza.
Clopidogrel
Medie Cmax
(ng/ml) Medie ASC0-t
(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)
Mediana t1/2 (h)
1.236 1.956 0.75 4
Esteraze CYP450
Clopidogrel acid carboxilic Oxoclopidgrel
Medie Cmax
(ng/ml) Medie ASC0-t
(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)
Mediana t1/2 (h)
Medie Cmax
(ng/ml) Medie ASC0-t
(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)
Mediana t1/2 (h)
3075 9892 0.5 7 18.936 34.818 0.5 9.6
UDP-glucuroniltransferaza Clopidogrel acil glucuronid Metabolit activ (H4) Medie Cmax
(ng/ml) Medie ASC0-t
(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)
Mediana t1/2 (h)
Medie Cmax
(ng/ml) Medie ASC0-t
(ng/ml *h) Mediana Tmax (h)
Mediana t1/2 (h)
459 1573 1 5 13.215 16.832 0.75 0.5
Figura cu tabele III.11 Reprezentare a parametrilor farmacocinetici medii estimati pentru clopidogrel si
metabolitii sai (N=12) in cadrul schemei de metabolizare a compusului parinte [datele din cele doua tabele unde
se prezinta contributiile individuale ale izoenzimelor CYP la cele doua etape oxidative necesare pentru formarea
metabolitului activ sunt preluate din Kazui et. al., 2010]
CYP 1A2 2B6 2C19
% contributie 35.8 19.4 44.9
CYP 2B6 2C9 2C19 3A4 CYP450
% contributie 32.9 6.76 20.6 39.8
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
0 2 4 6 8 10 12
Con
cen
trat
ie n
g/m
L t
ran
sfor
mat
a in
sca
ra ln
Timp (h)
Clopidogrel si metabolitii sai determinati in probe de plasma provenite de la 12 voluntari sanatosi, dupa administrarea de Plavix 75 mg (scara ln-lineara)
Acil glucuronid (ng/mL) Acid carboxilic (ng/mL) Clopidogrel (ng/mL)
Oxoclopidogrel (ng/mL) Metabolit activ H4 (ng/mL)
Pagina|26
Dupa cum era de asteptat deja, cele mai mici concentratii plasmatice determinate in acest
studiu au fost pentru pro-medicamentul clopidogrel parinte, puternic hidrolizat (deoarece
acesta devine disponibil pentru hidroliza mediata de carboxilesteraze de indata ce este eliberat
din forma farmaceutica la nivel gastric - CES2 iar cantitatea ce nu se pierde pre-sistemic si ar
putea fi, dupa absorbtie, metabolizata oxidativ de izoenzimele CYP450 din mediul hepatic
este din nou supusa partial hidrolizei sub actiunea carboxilesterazei hepatice - CES1) si in mai
mica masura metabolizat. Din punct de vedere al autoritatilor de reglementare a produselor
medicamentoase, in pofida lipsei unei activitati intrinseci a clopidogrelului parinte si a faptului
ca nu exisa o corelatie intre concentratiile plasmatice ale acestuia si cele ale metabolitului
activ, demonstrarea bioechivalentei intre formularile farmaceutice orale ce contin clopidogrel
trebuie sa fie bazata pe profilele farmacocinetice de medicament parinte [Ghid FDA cu prvire
la Clopidogrel bisulfat, revizuit August 2008; Ghid EMA cu privire la bioechivalenta
produselor orale cu eliberare imediata, 2010] si nu pe cele de metabolit activ. Aceasta cerinta
se bazeaza, dupa cum este explicat in ghidul EMA, pe intelegerea notiunii ca Cmax-ul
medicamentului parinte este un parametru farmacocinetic cu o sensibilitate mai mare pentru
detectia diferentelor in rata de absorbtie cauzate de formulare decat Cmax-ul unui metabolit. In
cazul clopidogrelului, aceasta observatie este intr-adevar foarte pertinenta avand in vedere
complexitatea proceselor metabolice implicate in activarea medicamentului parinte,
concentratiile de metabolit activ rezultate fiind dependente in mod principal de factori ce tin
de subiectul tratat si nu de profilul de cedare al formularii administrate. Din moment ce
suntem interesati doar de soarta moleculei cedate de ce nu am gasi deci o solutie biorelevanta
pentru testarea in vitro macar a prezumtiei de bioechivalenta? Conform cadrului legislativ
actual studiile pivotale pe oameni nu pot fi inlocuite deoarece clopidogrelul face parte din
clasa BCS (Biopharmaceutical Classification System) II, pentru care in prezent nu se admite
demonstrarea echivalentei prin conceptul de “biowaiver” (bioderogare, prin care se admite
lipsa datelor de bioechivalenta obtinute prin administrarea la subiecti umani daca se pot
demonstra caracteristici similare de cedare in vitro pentru doua formulari farmaceutice cu
eliberare nemodificata destinate pentru administrare orala). Insa ceea ce putem avea in vedere
pentru reducerea costurilor de dezvoltare a unui generic este sa inlocuim studiile pilot multi-
comparative (o cerinta a pietei, avand in vedere faptul ca majoritatea departamentelor de
dezvoltare farmaceutica pleaca la drum cu mai multe propuneri de formulari) cu teste
relevante in vitro. In capitolul III.2 al acestei lucrari se va discuta pe larg acest subiect si se va
propune o metoda noua de triere a formularilor de clopidogrel, adaptata profilului
biofarmaceutic si farmacocinetic al medicamentului parinte (studiu IVIVC).
Pagina|27
Urmand calea metabolica inactiva a clopidogrelului, primul si cel mai semnificativ metabolit
din punct de vedere cantitativ este clopidogrelul acid carboxilic, format prin hidroliza
enzimatica mediata de carboxilesteraze [Zhu H. et. al., 2013], reprezentand aproximativ 85%
dintr-o doza de medicament parinte administrata [SmPC Plavix, 2013]. Pentru acest metabolit
expunerea totala inregistrata este de 5000 de ori mai mare decat cea a medicamentului parinte,
demonstrand ca aceasta cale metabolica este una cu potential mare de conversie.
La randul sau, clopidogrelul acid carboxilic este in proportii semnificative (aproximativ 16%
pe baza datelor privind ASC obtinute in studiu) convertit la clopidogrel acil glucuronid, sub
actiunea UDP-glucuroniltransferazei. Data fiind instabilitatea demonstrata de acest metabolit
ex-vivo si faptul ca prin trans-esterificare acesta duce la reformarea clopidogrelui parinte
[Silvestro et. al., 2011], prezinta un deosebit interes investigarea potentialelor cai metabolice
prin care acest proces ar putea sa aiba loc si in vivo. Acest subiect va fi aprofundat in capitolul
III.3 al acestei lucrari unde sunt descrise doua studii pe care le-am realizat pe animale de
laborator si respectiv oameni, pentru a deslusi soarta metabolica a acestui compus conjugat.
Prin metabolism hepatic oxidativ, pasul intermediar in procesul de activare al clopidogrelului
implica formarea tiolactonei 2-oxo-clopidogrel, mediata de izoenzimele CYP2C19, 1A2 si
2B6. Acest metabolit se regaseste in plasma umana in concentratii de 18 ori mai mari decat
clopidogrelul si de doua ori mai mari decat metabolitul activ H4 (pe baza datelor privind ASC
obtinute in studiu). Intrucat se cunoaste deja faptul ca rata de formare a metabolitului activ
este limitata si variabila, o intrebare foarte importanta este care dintre cele doua etape
oxidative mediate de izoenzimele CYP este saturabila, incetinind astfel global formarea de
metabolit activ? Judecand dupa rezultatele obtinute: Cmax similar dar ASC de doua ori mai
mare pentru oxoclopidogrel comparativ cu H4 si timp de injumatatire de 19 ori mai
indelungat, se pare ca cea de a doua etapa oxidativa este cea critica. In timp ce intr-adevar
CYP2C19 contribuie substantial la ambele etape oxidative, este important de observat faptul
ca totusi principala izoenzima responsabila pentru conversia oxoclopidogrelului la H4 activ
este CYP3A4. Prin urmare ar trebui reflectat asupra tendintei generale de a incrimina
poliformismul CYP2C19 ca principala sursa a variabilitatii farmacologice a clopidogrelului
fara a lua in calcul si faptul ca vasta majoritate a pacientilor primeste concomitent si alte
tratamente de fond iar aproximativ 50% din xenobioticele existente pot fi considerate
substraturi competitoare pentru CYP 3A4. In capitolul III.4 al acestei lucrari se va discuta pe
larg acest subiect si se vor prezenta comparativ rezultatele unor studii de interactiune in vitro
intre clopidogrel sau 2-oxo-clopidogrel si diferite medicamente ce sunt substraturi
competitoare sau inhibitori CYP 2C19 sau 3A4.
Pagina|28
III.2 Dezvoltarea unui model IVIVC biorelevant ce poate fi aplicat pentru predictia
biodisponibilitatii formularilor generice de clopidogrel
Din punct de vedere al sistemului biofarmaceutic de clasificare a medicamentelor,
clopidogrelul bisulfat se incadreaza in Clasa II, demonstrand solubilitate scazuta si
permeabilitate ridicata [Lassoued et. al., 2011]. Tinand cont de acest aspect, ne putem astepta
ca una din cauzele importante de variabilitate a biodisponibilitatii sale sa fie chiar cinetica de
cedare partiala si oscilanta in functie de conditiile de pH intalnite pe parcursul tractului gastro-
intestinal. Pana in prezent acest aspect nu a fost inca studiat cu rigurozitate. Obiectivele
principale ale acestui proiect experimental sunt evaluarea cineticii de dizolvare a
clopidogrelului in medii gastrice si intestinale ce simuleaza conditii pre- si post-prandiale,
determinarea farmacocineticii clopidogrelului dupa administrarea lui la voluntari sanatosi in
conditii pre- si post-prandiale utilizand metode analitice HPLC-MS/MS de ultima ora si
incercarea de a dezvolta un model predictiv de corelare intre datele in vitro si in vivo. De
asemenea, pe baza corelarilor realizate, s-a dorit identificarea testului de dizolvare biorelevant
care s-ar preta cel mai bine ca surogat la testarea biodisponibilitatii in vivo.
Componenta in vivo
Tabel III-5. Caracteristici demografice ale subiectilor din studiul de biodisponibilitate pre-
prandiala
Numar de subiecti Inrolati: 28
Dozati: 27
Sexul subiectilor dozati
(si procentul raportat la populatia studiului)
Femei: 15 (55.56%)
Barbati: 12 (44.44%)
Rasa subiectilor dozati
(si procentul raportat la populatia studiului)
Caucaziana: 27
(100.00%)
Varsta subiectilor dozati
(medie, (± deviatie standard)) 34.92 (± 14.80)
Indicele de masa corporala al subiectilor dozati
(medie, (± deviatie standard)) 24.10 (± 3.10)
Datele demografice medii ale subiectilor inrolati in studiul cu administrare in conditii post-
prandiale standardizate sunt prezentate in tabelul urmator:
Pagina|29
Tabel III-6. Caracteristici demografice ale subiectilor din studiul de biodisponibilitate post-
prandiala
Numar de subiecti Inrolati: 12
Dozati: 12
Sexul subiectilor dozati
(si procentul raportat la populatia studiului)
Femei: 7 (58.33%)
Barbati: 5 (41.67%)
Rasa subiectilor dozati
si procentul raportat la populatia studiului)
Caucaziana: 12
(100.00%)
Varsta subiectilor dozati
(medie, (± deviatie standard)) 37.25 (±15.04)
Indicele de masa corporala al subiectilor dozati
(medie, (± deviatie standard)) 25.84 (± 1.78)
Conform ghidului FDA cu privire la studiile de biodisponibilitate pentru identificarea
efectului mancarii [FDA-CDER, 2002], administrarea unei forme farmaceutice pentru uz oral
in conditii post-prandiale poate duce la modificari ale biodisponibilitatii unei substante active
prin diferite mecanisme incluzand: intarzieri in golirea gastrica, stimularea secretiei de acizi
biliari, modificari de pH pe parcursul tractului gastro-intestinal, intensificarea circulatiei
sangvine in compartimentul abdominal sau interactiuni de natura fizica/chimica cu o forma
farmaceutica sau substanta activa.
Pentru a garanta faptul ca administrarea se realizeaza in conditii post-prandiale standardizate,
voluntarii au petrecut 15 ore sub supraveghere la Centrul Clinic inainte de dozare.
Confirmarea faptului ca acestia nu au adus asupra lor alimente sau bauturi interzise s-a realizat
printr-un control amanuntit al bagajelor inainte de internare. Incepand cu momentul internarii
si pana la recoltarea ultimei probe de sange pentru determinari farmacocinetice voluntarii au
avut o dieta standardizata din punct de vedere al continutului meselor si al orarului acestora.
Cu 11 ore inainte de administrarea medicatiei, subiectii au luat o cina standardizata;
urmatoarea masa a fost micul dejun lipidic servit inainte de administrarea medicatiei, urmand
ca mai apoi sa li se impuna post pana la 5 ore dupa dozare.
In conformitate cu “Ghidul cu privire la Investigarea Biochivalentei” aplicabil local
[CPMP/EWP/ QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **], cu exact 30 minute inainte de administrarea
Pagina|30
medicatiei de studiu, voluntarilor le-a fost oferit un mic dejun cu continut ridicat de calorii si
lipide, avand urmatoarea compozitie standard:
Tabel III.7 Mic dejun standardizat oferit cu 30 minute inainte de dozare in studiul de
biodisponibilitate post-prandiala
Aliment Kilocalorii Proteine
(g)
Lipide
(g)
Carbohidrati
(g)
1 felie de paine (aprox. 25 g) 58.75 2.125 0.25 12
2 oua fierte 150 15 10 0
unt, 10 g 74.7 0 8.3 0
1 felie bacon (25 g) 90.5 5.62 7.5 0.13
cartofi prajiti, 125 g 401.23 6.25 23.75 40.62
lapte integral, 250 ml 156.25 8.125 8.75 11.25
TOTAL 931.43 37.12
(= 148.48 Kcal)
58.55
(=526.95 Kcal)
64
(=256 kcal)
Continut caloric relativ
(% din numarul total de Kcal adus de clasa
de nutrienti)
15.94 56.57 27.48
Subiectii au consumat intregul continut al mesei standardizate in decurs de 20 – 25 minute de
la servirea acesteia iar medicatia de studiu a fost administrata la 5 – 10 minute dupa
consumarea meniului.
Componenta in vitro
Testele de cedare in vitro au fost realizate pe un sistem de dizolvare DT 800 (produs de
Erweka GmbH, Germania) folosind aparatul 2 (agitator cu palete) la 50 rotatii pe minut.
Pentru studierea cineticii de cedare a clopidogrelului, a fost utilizat un set de patru medii
biorelevante reprezentative: mediul gastric simulat pre-prandial (FaSSGF - Fasted State
Simulated Gastric Fluid), mediul gastric simulat post-prandial (FeSSGF - Fed State Simulated
Gastric Fluid), mediul intestinal simulat pre-prandial (FaSSIF - Fasted State Simulated
Intestinal Fluid) si mediul intestinal simulat post-prandial (FeSSIF - Fed State Simulated
Intestinal Fluid). Au fost de asemenea realizate teste de dizolvare si in mediile compendiale ce
simuleaza fluidul gastric (SGF – Simulated Gastric Fluid) si intestinal (SIF– Simulated
Intestinal Fluid) [USP 32, 2009].
Pagina|31
Tabel III-8. Compozitia mediilor de dizolvare gastrice compendiale si biorelevante
Compus SGF FaSSGF FeSSGF
Cloruradesodiu 2.0g 34,2mM 237,02mM
Pepsina 3,2g 0,1g ‐
Acidacetic ‐ ‐ 17,12mM
Acetatdesodiu ‐ ‐ 29,75mM
Lapte/Tampon ‐ ‐ 1:1
Taurocolatdesodiu ‐ 80µM ‐
Lecitina ‐ 20µM ‐
Acidclorhidric 7ml q.s.adpH1,6 q.s.adpH5
Apa(q.s.ad) 1L 1L 1L
pH 1.2 1.6 5.0
Tensiunedesuprafata(mN/m) 70 42.6 52.3±0.3
Osmolaritate(mOsm/kg) 120.7±2.5 400±10
Capacitateadetamponare
(mmol/L/ΔpH)
25
Volumdedizolvare(mL) 1000 500 500
Tabel III-9. Compozitia mediilor de dizolvare gastrice compendiale si biorelevante
Compus SIF FaSSIF FeSSIF
Fosfatdesodiumonobazic 6.8g 3.438g ‐
Cloruradesodiu ‐ 6.186g 11.874g
Acidacetic ‐ ‐ 8.65g
Hidroxiddesodiu(pelete) ‐ ‐ 4.04g
Pancreatina 10g ‐ ‐
Taurocolatdesodiu ‐ 3mM 15mM
Lecitina ‐ 0.75mM 3.75mM
Hidroxiddesodiu q.s.adpH6.8 q.s.adpH6.5 q.s.adpH5.0
Apa(q.s.ad) 1L 1L 1L
pH 6.8 6.5 5.0
Tensiunedesuprafata(mN/m) 54 48
Pagina|32
Compus SIF FaSSIF FeSSIF
Osmolaritate(mOsm/kg) 270±10 670
Capacitateadetamponare
(mmol/L/ΔpH)
12 72
Volumdedizolvare(mL) 1000 500 1000
Toate mediile de dizolvare au fost preparate conform literaturii de specialitate [Dressman et.
al., 1998; Jantratid et. al., 2008; Vertzoni et. al., 2010]. Experimentele au fost realizate in
triplicat.
Pentru compararea curbelor de dizolvare pentru clopidogrel in diferitele medii testate a fost
utilizat factorul de similaritate (f2), conform formulei:
descrisa in Appendixul I al Ghidul cu privire la Investigarea Biochivalentei publicat de
Agentia Europeana a Medicametului [CPMP/EWP/ QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **]. Usoara
modificare adusa este aceea ca in loc de a compara doua formulari diferite (R=referinta si
T=test) se compra aceeasi formulare referinta in doua medii de dizolvare diferite (R=mediul
de dizolvare de referinta, T=mediul de dizolvare comparat), termenii utilizati in aceasta
formula devenind astfel: n - numarul de timpi de evaluare; R(t) - procentul mediu de substanta
dizolvata in mediul referinta la “t” timp dupa inceperea studiului si T(t) - procentul mediu de
substanta dizolvata in mediul de comparatie la “t” timp dupa inceperea studiului.
Comparatiile privind gradul total de dizolvare au luat in calcul parametrul Arie de Sub
Curba (ASC), estimat utilizand metoda trapezoidala.
Modele predictive in silico
Au fost realizate simulari computerizate pentru estimarea ratei si gradului de absorbtie
regionala, utilizand modelul ACAT (Advanced Compartmental Absorption and Transit Model
= Model Compartimental Avansat de determinare a Absorbtiei si Tranzitului), asociat
versiunii 8.0 a programului GastroPlus™ (dezvoltat de Simulations-Plus Inc.; Lancaster, CA,
USA). In specificatiile modelului, tractul gastrointestinal apare divizat in noua compartimente
consecutive descrise ca stomac, duoden, jejun (format din doua compartimente distincte),
Pagina|33
ileon (format din trei compartimente distincte), cecum si colon ascendant; pe langa acest
factor de fragmentare unde este luat in calcul pH-ul specific fiecarui compartiment, modelul
mai tine cont si de efluxul intestinal al medicamentului si metabolism [Tubic et. al., 2006].
Au fost rulate simulari diferite pentru modul pre-prandial si post-prandial.
Datele de farmacocinetica si constantele de transfer inserate in model sunt cele ce s-au obtinut
pe cale experimentala in cadrul studiilor in vivo descrise anterior.
Corelarea punct cu punct a datelor experimentale obtinute in vivo si in vitro (corelare de tip A)
a fost realizata cu ajutorul modulului IVIVC Plus ModuleTM integrat in programul
GastroPlus™.
Pentru estimarea fractiei absorbite (FRA) necesara corelarii, a fost utilizata o abordare de
deconvolutie bazata pe modelul Loo-Riegleman. Fractia de medicament absorbita la fiecare
timp de evaluare a fost reprezentata grafic versus procentul corespunzator de medicament
dizolvat la timpul respectiv iar apoi s-a aplicat o analiza bazata pe constructia unei regresii
lineare pentru a evalua corelarea obtinuta.
Rezultatele testelor de dizolvare in mediu gastric nu sunt prezentate in acest rezumat
(pot fi studiate in capitolul integral) deoarece s-a demonstrate faptul ca sunt irelevante din
punct de vedere fiziologic si nu se coreleaza cu datele obtinute in-vivo.
Dizolvarea a fost incompleta atat in mediul intestinal pre-prandial (FaSSIF) cat si in
mediul intestinal simulat post-prandial (FeSSIF), date reprezentate in Figura III.12.
Clopidogrel release in simulated interstinal media
0 50 1000
50
100
FaSSIF
FeSSIF
SIF
Time (min)
% R
elea
sed
Figura III.12 Dizolvarea in vitro a clopidogrelului in medii compendiale simuland conditiile
intestinale (SIF) si in medii biorelevante intestinale ce simuleaza conditiile pre-prandiale si post-
prandiale
Pagina|34
Desi adaosul sarurilor biliare a crescut solubilitatea clopidogrelului prin intermediul
micelelor, asa cum se poate observa prin compararea mediului compendial SIF cu cel FaSSIF,
cedarea in mediu intestinal a ramas in continuare modesta (doar 60% in decurs de 2 ore).
Cantitatea de substanta activa eliberata in mediu simulat post-prandial a fost semnificativ mai
mare (80% cedare in decurs de 2 ore), permintand astfel sa concluzionam ca si in mediu
intestinal se aplica acelasi principiu de corelare invers proportionala intre solubilitate si pH.
Diferenta dintre curbele de dizolvare SIF si FeSSIF, deja vizibila pe grafic, a fost pusa
in perspectiva prin calcularea factorului de similaritate (unde valoarea calculata pentru f2 a fost
26.1) si a ratiei ASC FeSSIF/SIF (2.56).
Cunoscut fiind faptul ca absorbtia clopidogrelului are loc aproape exclusiv in mediu
intestinal [Lins, 1999; Müller et. al., 2003], este de asteptat ca aceste diferente de cedare
observate in vitro sa aiba impact asupra absorbtiei in vivo si astfel biodisponibilitatea
clopidogrelului dupa administrarea in conditii post-prandiale sa fie mai mare decat cea in
conditii pre-prandiale. Rezultatele obtinute in mediile ce simuleaza conditii intestinale indica
faptul ca solubilitatea clopidogrelului este strans corelata cu pH-ul mediului, avand loc o
dizolvare completa si rapida la pH 1.2 - 1.6 in contrast cu o marcata tendinta spre precipitare
la pH-urile mai bazice ce se regasesc in mediul intestinal (6.5 - 6.8).
Rezultatele sunt in concordanta cu datele de biodisponibilitate publicate de
FDA in dosarul NDA (New Drug Application), document in care se descrie evaluarea in studii
clinice de eficienta terapeutica a interactiuniunilor de tip medicament-mancare pentru
produsul farmaceutic original Plavix 75 mg. Totodata, rezultatele sunt in perfecta concordanta
cu curba de solubilitate versus pH generata in silico pentru clopidogrel utilizand programul
GastroPlusTM (profil prezentat in Figura III.13).
Figura III.13 Profil de solubilitate versus pH pentru clopidogrel, generat in programul
GastroPlusTM
Pagina|35
Stabilitatea clopidogrelului a fost testata in intervale de cate 48 ore pentru toate
mediile de dizolvare utilizate in studiul in vitro. Degradarea clopidogrelului nu a depasit
pragul de 2% din cantitatea initiala in medii intestinale.
Simularea absorbtiei regionale in diversele compartimente ale tractului
gastrointestinal, realizata cu ajutorul modelului ACAT, a indicat faptul ca absorbtia are loc
majoritar in intestinul subtire si in colon, iar in stomac aceasta este neglijabila (simulare
prezentata mai jos in Figura III.14).
Figura III.14 Simularea distributiei regionale a absorbtiei pentru clopidogrel, pe parcursul
tractului gastrointestinal
Aceste predictii demonstreaza faptul ca fractia de clopidogrel dizolvata in mediu
gastric nu este si absorbita in acest compartiment. Urmand acest rationament, devine clar
faptul ca dizolvarea completa a clopidogrelului in mediu gastric ar putea duce implicit la o
biodisponibilitate crescuta doar daca aceasta cantitate ar putea ramane dizolvata pe intreagul
parcurs catre compartimentul gastrointestinal unde se realizeaza absorbtia sistemica. Datele
prezentate anterior au aratat insa faptul ca fractia de clopidogrel eliberata in mediu stomacal
este ulterior supusa unei tendinte de a precipita in compartimentele unde fluidele intestinale au
un pH mai ridicat. Este posibil ca acest efect de precipitare observat sa fi fost chiar usor
subestimat in vitro, acolo unde solubilitatea intestinala a atins punctul de saturatie chiar si in
conditii volumetrice si de agitare ideale. Daca luam in considerare si faptul ca volumul
fiziologic normal al fluidelor intestinale este estimat la aproximativ 80 mL [Mudie et. al.,
2014] dupa ce un om bea 240 mL de apa (cazul aplicabil in cadrul studiilor in care au fost
evaluate biodisponibilitatea orala pre- si post-prandiala) iar volumul mediilor de dizolvare
utilizate in vitro este de 500 sau 1000 mL (in functie de tipul de fluid simulat), devine clar
Pagina|36
faptul ca atingerea punctului de saturatie si ulterior precipitarea clopidogrelului eliberat la
nivel stomacal sunt inevitabile. Se poate deci spune ca ideea dezvoltarii unui model IVIVC ce
ia in calcul ca date in vitro rezultatele testelor de dizolvare obtinute in mediu gastric este pur si
simplu nerealista.
0 5 10 150
1000
2000
3000
Time (h)
Co
nce
ntr
atio
n (p
g/m
L)
0 5 10 150
5000
10000
15000
20000
Subj 1Subj 2Subj 3Subj 4Subj 5Subj 6Subj 7Subj 8Subj 9Subj 10Subj 11Subj 12Subj 13Subj 14Subj 15Subj 16Subj 17
Subj 19Subj 18
Subj 20Subj 21Subj 22Subj 23Subj 24
Subj 26Subj 27
Subj 25
Time (h)
Co
nce
ntr
atio
n (
pg
/mL
)
Figura III.15 Profilele farmacocinetice medii si individuale obtinute dupa administrarea de clopidogrel
(n=27 voluntari, doza=75 mg, conditii pre-prandiale)
Coeficientul de variatie intra-individuala estimat prin modelul ANOVA, aplicat pe seturi
replicate de date privind Cmax transformate logaritmic anterior rularii testului statistic, a fost
mai mare de 30%, permitand astfel sa concluzionam faptul ca clopidogrelul poate fi clasificat
ca produs medicamentos foarte variabil. Modelul ANOVA utilizat a luat in calcul tratamentul,
perioada de administrare, si interactiunea subiect-tratament ca efecte fixe.
0 5 10 15 20 250
2000
4000
6000
8000
10000
Time (h)
Co
nc
en
tra
tio
n (
pg
/mL
)
0 5 10 150
5000
10000
Subj 1Subj 2Subj 3Subj 4Subj 5Subj 6Subj 7Subj 8Subj 9Subj 10Subj 11Subj 12
Time (h)
Co
nc
entr
atio
n (
pg
/mL
)
Figura III.16 Profilele farmacocinetice medii si individuale obtinute dupa administrarea de clopidogrel
(n=12 voluntari, doza=75 mg, conditii post-prandiale)
Pagina|37
Parametrii farmacocinetici principali determinati pentru clopidogrel dupa administrarea pre-
prandiala si post-prandiala sunt prezentati in tabelul III-10.
Tabelul III-10. Parametrii farmacocinetici principali in conditii pre- si post-prandiale
Pre-prandial (N=27)
Date medii ± deviatie standard
Post-prandial (N=12)
Date medii ± deviatie standard
Cmax (ng/mL) 1.71 ± 3.23 7.48 ± 1.34
ASC0-t (ng/mL x h) 2.99 ± 4.78 11.29 ± 3.0
AUC0-∞ (ng/mL x h) 3.09 ± 4.78 11.58 ± 3.38
Kel (1/h) 0.132 ± 0.063 0.071 ± 0.012
Conform datelor obtinute, administrarea clopidogrelului dupa masa ii creste atat rata
de absorbtie (Cmax) cat si gradul total de absorbtie (ASC), iar in acelasi timp reduce
variabilitatea inter-individuala.
Modelarea compartimentala a datelor medii a demonstrat, in pofida variabilitatii
crescute a datelor sursa, o potrivire buna cu solutiile bicompartimentale de modelare atat
pentru datele pre-prandiale (Figura III.17) cat si pentru cele post-prandiale (Figura III.18).
Figura III.17 Modelarea compartimentala a datelor medii de farmacocinetica obtinute in conditii pre-
prandiale; a. linear-linear, b. log-linear
Pagina|38
Figura III.18 Modelarea compartimentala a datelor medii de farmacocinetica obtinute in
conditii post-prandiale; a. linear-linear, b. log-linear
Prezentarea logaritmica a datelor arata faptul ca partea terminala a curbelor a putut fi bine
definita prin intermediul unei regresii lineare, permitand astfel estimarea corecta a constantei
de eliminare si utilizarea ulterioara a acesteia in calcule pentru a se determina fractia absorbita
(FRA). Constantele de transfer derivate din model sunt prezentate in Tabelul III-11.
Tabelul III-11. Constante de transfer in conditii pre- si post-prandiale, obtinute prin modelare
bicompartimentala
Parametru Unitate de
masura
Valoare
Pre-prandial Post-prandial
ke 1/h 1.09 1.31
k12 1/h 0.51 0.56
k21 1/h 0.19 0.13
ka 1/h 1.79 2.15
Unde:
ke = constanta ratei de eliminare de ordin I din compartimentul central;
ka = constanta ratei de absorbtie de ordin I;
k12 si k21 = constantele ratelor de transfer de ordin I dintre compartimentul central si
cel periferic.
Din moment ce farmacocinetica clopidogrelului a fost cel mai bine descrisa prin modele
bicompartimentale atat in conditii de repaus alimentar cat si dupa hranire, a fost utilizata o
Pagina|39
abordare de deconvolution bazata pe modelul Loo-Riegleman pentru estimarea fractiei
absorbite in vivo (FRA). Rezultatele (Tabelul III-12) au fost utilizate pentru dezvoltarea unei
corelatii punct-la-punct (de grad A) intre dizolvarea in vitro (FRD - fractia dizolvata) si
absorbtia in vivo (FRA).
Tabelul III-12. Fractiile dizolvate si absorbite luate in calcul pentru dezvoltarea modelului
IVIVC
Conditii pre-prandiale Conditii post-prandiale
FRA FRD (FaSSIF) FRD (SIF) FRA FRD (FeSSIF)
0.350 0.139 0.108 0.174 0.107
0.556 0.277 0.235 0.317 0.258
0.685 0.367 0.269 0.426 0.377
0.911 0.476 0.337 0.632 0.651
0.965 0.490 0.349 0.731 0.704
0.978 0.507 0.362 0.777 0.722
0.981 0.530 0.354 0.797 0.760
0.983 0.528 0.359 0.805 0.767
0.984 0.554 0.360 0.811 0.775
Corelatiile in medii intestinale biorelevante (FaSSIF si FeSSIF), s-au dovedit a fi
liniare (figurile III.19 si III.20). In ceea ce priveste administrarea post-prandiala, un aspect
remarcabil este faptul ca panta de corelatie liniara este foarte aproape de 1, ceea ce sugereaza
o suprapunere intre dizolvarea in vitro si absorbtia in vivo. Panta calculata pentru corelarea
pre-prandiala a fost mai mare decat unitatea (1.74), lucru care reflecta o supraestimare a
fractiei de medicament absorbit; aceasta limitare a fost cauzata de faptul ca nu au fost luat în
considerare in model date privind biodisponibilitatea absoluta (din cauza lipsei acestor date
din literatura de specialitate).
Datele de dizolvare obtinute in mediu compendial (SIF) au putut fi corelate doar
printr-o ecuatie exponentiala FRA/ FRD (Figura III.19). Corelarea non-lineara este cauzata de
solubilitatea scazuta a clopidogrelului in mediul de dizolvare. In absenta agentilor fiziologici
cu efect surfactant, mediul SIF prezinta o tendinta generala de subestimare a cineticii de
eliberare a medicamentelor bazice [Pahomi et. al., 2012].
Pagina|40
0.0 0.2 0.4 0.60.0
0.5
1.0
y=1.743x+0.086
r2=0.9902
FaSSIF
y=0.219e4.184x
r2=0.9944
SIF
FRD
FR
A
Figura III.19 IVIVC in mediu intestinal biorelevant (FaSSIF) si compendial (SIF) in conditii pre-
prandiale
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0
0.5
1.0
y=0.9484x+0.068
r2=0.9912
FeSSIF
FRD
FR
A
Figura III.20 IVIVC in mediu intestinal biorelevant (FaSSIF) si compendial (SIF) in conditii post-
prandiale
Datele de farmacocinetica au aratat faptul ca in vivo expunerea sistemica la clopidogrel
este de 4 ori mai mare atunci cand administrarea se face in conditii post-prandiale. S-a aratat,
de asemenea, ca administrarea dupa o masa reduce variabilitatea intre subiecti in ceea ce
priveste atat rata (Cmax) cat si amploarea (ASC) absorbtiei.
S-au stabilit corelatii liniare intre datele reale de farmacocinetica obtinute in vivo si
datele in vitro de dizolvare în medii intestinale simulate care mimeaza conditiile fiziologice
pre-prandiale (FaSSIF) si post-prandiale (FeSSIF). Modelul IVIVC dezvoltat pentru conditiile
post-prandiale a relevat o similaritate remarcabila (panta de corelatie liniara foarte aproape de
1), demonstrand astfel validitatea corelatiei si faptul ca ecuatiile de regresie pot fi folosite
pentru estimarea profilurilor de absorbtie pe baza datelor de dizolvare in vitro. Modelele pot fi
folosite ca substitute pentru testarea biodisponibilitatii in vivo, fiind mult mai ieftine si mai
rapide decat realizarea unui studiu pilot de bioechivalenta ca instrument de screening initial
pentru formularile generice.
Pagina|41
Cresterea solubilitatii atunci cand administrarea medicamentului se realizeaza dupa o
masa este datorata atat faptului ca in mod fiziologic sunt prezente concentratii mai mari de
agenti tensio-activi cat si faptului ca nivelul pH-ului in compartimentele de absorbtie scade si
el in comparatie cu conditia de repaus alimentar. Aceasta crestere a solubilitatii duce la randul
ei la o reducere semnificativa privind variabilitatea absorbtiei. Puse in perspectiva, aceste date
confirma faptul ca solubilitatea scazuta a clopidogrelului in mediile biologice prezente la locul
de absorbtie reprezinta una din sursele importante de variabilitate ce afecteaza farmacocinetica
clopidogrelului.
III.3 Evaluarea cailor de metabolizare prin mecanisme de conjugare a clopidogrelului:
studii farmacocinetice pe soareci si subiecti umani sanatosi ce descriu absorbtia,
disponibilitatea si eliminarea clopidogrelului acil glucuronid
Datorita tendintei clopidogrelului acil glucuronid de reconversie la clopidogrel in vitro, unul
dintre obiectivele cercetarii a fost acela de a evalua daca un proces similar este posibil si in
vivo prin trans-esterificare sau sub actiunea glucuronidazei. Deoarece nu este disponibil un
standard de clopidogrel acil glucuronid potrivit pentru uz uman, a fost efectuat un studiu pe
animale. Am determinat farmacocinetica si metabolismul clopidogrelului acil glucuronid
dupa administrarea metabolitului la o rasa de soareci (C57BL) care, asemeni omului, dispune
de enzima lizozomala glucoronidaza in tesuturile din ficat, rinichi si tractul intestinal [Gad,
2007].
Un al doilea scop important al cercetarii este acela de a stabili daca clopidogrelul acil
glucuronid este implicat in circuite de reciclare enterohepatica si, daca da, de a caracteriza
procesul din punct de vedere cantitativ si calitativ (stiind ca hidroliza bacteriala este uneori
asociata procesului de recirculare, identificarea eventualului compus rezultat in urma unei
asemenea hidrolize prezinta un interes special). Investigatiile au presupus compararea datelor
farmacocinetice la om pentru clopidogrel si metabolitii clopidogrel acid carboxilic si
clopidogrel acil glucuronid, dupa administrarea unui comprimat de 75 mg de Plavix, cu sau
fara administrare ulterioara de carbune activ (regim conceput pentru a intrerupe ciclul
enterohepatic [Elomaa et. al., 2001; Wang et. al., 2014] fara a modifica absorbtia). Pentru o
intelegere mai amanuntita a caii metabolice clopidogrel - clopidogrel acid carboxilic -
clopidogrel acil glucuronid au fost colectate, in cadrul aceluiasi studiu de interactiune cu
carbunele activat, date privind principala lor cale de excretie (urina sau materie fecala).
Intrucat intreruperea ciclului enterohepatic prin efectul ligand al carbunelui activ asupra bilei
are ca rezultat si modificarea cineticii de excretie pentru un analit reciclat (excretia este
Pagina|42
accelerata prin captarea bilei), datele de excretie renala colectate pentru clopidogrel acil
glucuronid in prezenta si respectiv absenta carbunelui activat au fost coroborate cu
rezultatele PK inainte de a se emite o concluzie cu privire la implicarea metabolitului intr-un
proces de reciclare enterohepatica. Determinarea modului in care se excreta clopidogrelul
acil glucuronid (nemodificat/conjugat in continuare) se numara de asemenea printre
obiectivele studiului.
Studiu de farmacocinetica cu administrarea pe cale orala si intravenoasa a
clopidogrelului acil glucuronid la soareci
Toate procedurile utilizate au fost in concordanta cu standardele formulate in cea de a 8-a
editie a Ghidului privind ingrijirea si utilizarea animalelor de laborator (Academia Nationala
de Stiinte, Tipografia Academiei Nationale, Washington D.C.). Animalele de laborator
(C57BL/6 soareci, masculi, greutate 20 ± 4g, varsta 25 ± 1 zile) s-au nascut, au fost crescute si
ingrijite la Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie
Cantacuzino, situat in Bucuresti, Romania. Partea experimentala a avut loc in sectia de
farmacologie a Institutului National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica (ICCF)
situat in Bucuresti, Romania. Studiul a fost efectuat conform unui design paralel, pe un lot de
71 animale de laborator (5 pe fiecare timp de recoltare dupa fiecare mod de administrare, plus
6 animale tratate cu solutie salina normala, doar pentru a obtine plasma blank pentru
prepararea de probe analitice pentru controlul calitatii). Animalele au fost randomizate pe
brate de tratament si au primit, in conditii sterile, o doza de 200 µl de solutie proaspat
preparata de 1,25 mg/ml clopidogrel acil glucuronid in solutie salina normala, fie per os (prin
gavaj), fie intravenos (prin injectarea in vena caudala). Probele de sange (150 μl) au fost
colectate in tuburi continand K2EDTA, racite in prealabil, la 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa doza
orala sau la 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 si 8 ore dupa administrarea intravenoasa.
Nu au fost identificate concentratii de clopidogrel parinte peste LLOQ-ul metodei analitice in
nici una dintre probele de plasma recoltate de la soareci, ceea ce ne face sa concluzionam ca,
fie concentratiile au fost mai mici de 0.01 ng/ml, fie, cel mai probabil, nu s-a format deloc
clopidogrel. In calitate de unici analiti detectati (dintre cei trei analiti determinati in plasma),
profilurile farmacocinetice medii ale clopidogrelului acil glucuronid si acid carboxilic,
obtinute dupa administrarea intravenoasa si orala de clopidogrel acil glucuronid la soareci,
sunt prezentate in Figura III.22, graficele A si B.
Pagina|43
Figura III.22 Metabolitii determinati in plasma, dupa administrarea de clopidogrel acil glucuronid intravenos (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp de recoltare) si oral (n = 30 paralel, 5 animale
pe fiecare timp de recoltare)
In Figura III.23 am prezentat prin suprapunere si pe scara ln-lineara, curbele farmacocinetice
medii pentru ambii metaboliti, dupa administrarea pe cale intravenoasa si orala:
Figura III.23 Curbe medii de clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic in plasma, dupa administrarea de clopidogrel acil glucuronid pe cale intravenoasa si orala la soareci (prezentare
suprapusa pe scala ln-lineara)
Parametrii farmacocinetici estimati pentru clopidogrel acil glucuronid si acid carboxilic de
clopidogrel dupa administrarea intravenoasa si orala de 200µl de solutie 1.25mg/ml
clopidogrel acil glucuronid la soareci:
Administrare intravenoasa (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp
de recoltare)
Administrare orala (n = 30, paralel, 5 animale pe fiecare timp
de recoltare) Cmax
[±SD] (ng/ml)
ASC0-t
[±SD] (ng*ora/ml)
Tmax
(ore)
Cmax
[±SD] (ng/ml)
ASC0-t
[±SD] (ng*ora/ml)
Tmax (ore)
Clopidogrel acil glucuronid
23454 [±1755]
15425 [±8645]
0.3 2280
[±331] 4586
[±807] 1.0
Pagina|44
Administrare intravenoasa (n = 35, paralel, 5 animale pe fiecare timp
de recoltare)
Administrare orala (n = 30, paralel, 5 animale pe fiecare timp
de recoltare) Cmax
[±SD] (ng/ml)
ASC0-t
[±SD] (ng*ora/ml)
Tmax
(ore)
Cmax
[±SD] (ng/ml)
ASC0-t
[±SD] (ng*ora/ml)
Tmax (ore)
Acid carboxilic de clopidogrel
18395 [±1382]
99265 [±4980]
6.0 45000
[± 5207] 93660
[±13806] 1.0
Raportul procentual al ariilor de sub curba determinate in intervalul de recoltare (0-8 ore) a
fost de 29.73% [ASC0-8 clopidogrel acil glucuronid x 100 / ASC0-8 clopidogrel acid
carboxilic], sugerand faptul ca clopidogrel acil glucuronid este supus unei hidrolize pre-
sistemice intense, ce duce la formarea clopidogrelului acid carboxilic si nu a clopidogrelului
parinte.
Dupa administrarea directa de clopidogrel acil glucuronid la soareci pe cale orala (gavaj) si
intravenos (vena caudala), analiza HPLC/MS-MS a probelor farmacocinetice recoltate post-
doza a aratat ca nu au loc reactii care sa duca la generarea de clopidogrel parinte. In timp ce
trans-esterificarea in vivo la clopidogrel nu a avut loc, hidroliza care duce la formarea de
clopidogrel acid carboxilic a fost cel mai important proces metabolic observat pentru
clopidogrel acil glucuronid.
Datele obtinute in urma administrarii orale au scos la iveala o metabolizare foarte rapida a
clopidogrelului acil glucuronid in primele 2 ore de la administrare, care a avut loc probabil in
tractul gastro-intestinal prin degradare chimica si/sau hidroliza enzimatica. Ratia procentuala
a ariilor de sub curba determinate dupa administrarea pe cale orala vs administrare iv,
estimata pentru metabolitul conjugat in intervalul de recoltare (0-8 ore) a fost de 29.73%.
In cazul caii intravenoase, deoarece metabolizarea a fost limitata doar la degradarea
sistemica a clopidogrelului acil glucuronid, rata conversiei la forma de acid carboxilic a fost
mai scazuta. Mai precis, datele obtinute cu administrarea orala au aratat ca atat clopidogrelul
acil glucuronid administrat, cat si clopidogrelul acid carboxilic format, au atins nivelele
plasmatice maximale simultan, la o ora dupa dozarea prin gavaj; pe de alta parte, dupa
injectarea intravenoasa in coada timpul scurs pana la atingerea nivelelor plasmatice maxime
pentru clopidogrel acid carboxilic a fost de 6 ore si concentratiile maxime atinse au fost de
2.5 ori mai scazute decat dupa doza orala. Totusi, expunerea totala la acidul carboxilic de
clopidogrel a fost aproape identica, indiferent de calea de administrare a clopidogrelului acil
glucuronid (raportul mediu al ariilor de sub curba i.v./p.o. a fost de 1.05), aratand astfel ca
conversia sistemica este si ea foarte semnificativa (asa cum era de asteptat, avand in vedere
Pagina|45
faptul ca fractiile lizozomale si microzomale ce contin beta-glucuronidaza si esteraze sunt
abundent raspandite in ser si organe, altele decat ficatul, in organismul soarecilor C57BL/6
[Peng et. al., 2013; Tegelstrom et. al. 1981; Lusis et. al., 1977]).
Studiu asupra excretiei si farmacocineticii clopidogrelului parinte, clopidogrelului acid
carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid, dupa administrarea orala a 75 mg
clopidogrel la om
Sase subiecti sanatosi, adulti, au fost inrolati si au incheiat studiul privind farmacocinetica si
excretia la om. Populatia studiului a constat din 3 barbati si 3 femei care nu erau gravide si
nu alaptau, cu varste cuprinse intre 18 si 51 de ani (varsta medie 32.17 ± 14.48).
Studiul s-a desfasurat la Spitalul Clinic al Ministerului Sanatatii din Republica Moldova,
situat in Chisinau. Protocolul studiului a fost revizuit si aprobat de un Comitet Etic
Institutional si toti cei 6 subiecti inrolati au fost informati cu privire la medicatia si
procedurile studiului si si-au dat consimtamantul pentru participarea la studiu. Investigatiile
clinice au fost facute cu respectarea principiilor din Declaratia de la Helsinki.
Medicatia administrata a constat intr-o doza orala unica din medicamentul referinta (Plavix
75 mg, achizitionat de pe piata), in fiecare perioada de studiu.
Design-ul a fost incrucisat: intr-una din perioadele studiului subiectii au primit doar
clopidogrel si in cealalta clopidogrel plus un regim ce consta in administrarea de 20 g
carbune activ suspendat in 240 ml de apa la 6, 12, 24, 36, 48 si 60 de ore de la administrarea
clopidogrelului. Probele de sange (4 ml) pentru cuantificarea clopidogrelului parinte,
clopidogrelului acid carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid in plasma au fost colectate
in tuburi racite in prealabil, continand K2EDTA ca anticoagulant, la 1, 2, 6, 9, 24, 36, 48 si
72 de ore de la administrarea dozei de clopidogrel.
In acelasi studiu a fost colectata urina in ambele perioade, pana la 72 de ore post-doza, in
timp ce materiile fecale au fost colectate pe aceeasi perioada de timp, dar numai atunci cand
clopidogrelul a fost administrat fara carbune activ (din experienta anterioara se crede ca
prezenta carbunelui in proba de scaun duce la rezultate ambigue).
Profilele de concentratie vs. timp pentru clopidogrel parinte, clopidogrel acil glucuronid si
clopidogrel acid carboxilic, obtinute de la subiecti umani dupa administrarea de clopidogrel
cu si fara carbune, sunt prezentate in Figura III.24.
Pagina|46
Figura III.24 Curbele farmacocinetice medii pentru cei trei analiti, dupa administrarea de clopidogrel
la subiecti umani (n = 6) cu si fara carbune (model display linear-linear la graficele 3-A, C, E si ln-
linear la graficele 3-B, D, F)
Pentru cei doi metaboliti, profilele sunt practic superpozabile, indiferent de administrarea de
carbune, in timp ce pentru clopidogrel nivelele circulante inregistrate pe parcursul fazei
terminale de eliminare au fost usor crescute cand a fost administrat si carbune. Analiza ASC
a scos la iveala faptul ca cresterea nu a fost semnificativa din punct de vedere statistic
0.000
0.250
0.500
0.750
1.000
0 12 24 36
Con
cent
rati
e de
clo
pido
grel
(ng
/mL
)
Timp (ore)
A. Curbe medii de Clopidogrel dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara
administrare ulterioara de carbune activat (linear-linear)
Fara carbune Cu carbune
0.000
0.001
0.010
0.100
1.000
0 12 24 36 Con
cent
rati
e de
clo
pido
grel
(ng
/mL
)
Timp (ore)
B. Curbe medii de Clopidogrel dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara
administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)
Fara carbune Cu carbune
0
100
200
300
400
500
600
0 12 24 36
Clo
pido
grel
aci
l glu
curo
nid
(ng/
mL
)
Timp (ore)
C. Curbe medii de Clopidogrel acil glucuronid dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (linear-
linear)
Fara carbune Cu carbune
0.0
0.1
1.0
10.0
100.0
1000.0
0 8 16 24
Clo
pido
grel
aci
d gl
ucur
onid
(ng
/mL
)
Timp (ore)
D. Curbe medii de Clopidogrel acil glucuronid dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om
cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)
Fara carbune Cu carbune
0
600
1200
1800
2400
3000
3600
4200
0 12 24 36 48
Clo
pido
grel
aci
d ca
rbox
ilic
(ng/
mL
)
Timp (ore)
E. Curbe medii de Clopidogrel acid carboxilic dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (linear-
linear)
Fara carbune Cu carbune
1
10
100
1000
10000
0 12 24 36 48
Clo
pido
grel
aci
d ca
rbox
ilic
(ng/
mL
)
Timp (ore)
F. Curbe medii de Clopidogrel acid carboxilic dupa administrarea orala a unui comprimat de Plavix 75mg la om
cu si fara administrare ulterioara de carbune activat (ln-linear)
Fara carbune Cu carbune
Pagina|47
(valoarea p data de testul ANOVA pentru efectul tratamentului a fost de 0.055, peste nivelul
de semnificatie de 0.05).
TABELUL III-14 Principalii parametrii farmacocinetici determinati pe voluntari umani (n =
6) pentru clopidogrel, clopidogrel acid carboxilic si clopidogrel acil glucuronid dupa
administrarea orala de Plavix 75mg cu si fara administrare ulterioara de carbune activ (intr-
un studiu randomizat, dublu-incrucisat):
Parametru
Fara
carbune
(medie
geom.)
Cu
carbune
(medie
geom.
Raportul
carbune/
fara
carbune
(%)
Rezultatele ANOVA
pentru tratament
ca efect fix
(valoarea p, interpretare)
Clopidogrel Cmax [±DS]
(ng/ml)
0.700
[±0.402]
0.741
[±0,343]
105.939
% 7.51009E-01, N.S.
ASC0-t
[±DS]
(ng*ora/ml)
1.778
[±1.559]
2,396
[±0.982]
134.796
% 5.53473E-02, N.S.
Clopidogrel
acid
carboxilic
Cmax [±DS]
(ng/ml)
2735.808
[±587]
2589.044
[±729] 94.635% 6.34597E-01, N.S.
ASC0-t
[±DS]
(ng*ora/ml)
9599.435
[±4468]
10039.278
[±1460]
104.582
% 8.04498E-01, N.S.
Clopidogrel
acil
glucuronid
Cmax [±DS]
(ng/ml)
428.937
[±83]
419.236
[±74] 97.738% 6.53555E-01, N.S.
ASC0-t
[±DS]
(ng*ora/ml)
1372.074
[±673]
1513.754
[±591]
110.326
% 3.44311E-01, N.S.
Pentru clopidogrel parinte, timpul mediu de injumatatire (t½) a fost de 8.1 ore in conditii
standard de administrare si 10.6 ore cand a fost administrat si carbune; s-a constatat ca
aceasta diferenta nu este semnificativa din punct de vedere statistic (testul-T pentru
esantioane perechi aplicat a returnat o valoare de 0.082, peste nivelul de semnificatie de
0.05). Pentru clopidogrel acid carboxilic, t½ a fost de 7.8 ore pentru clopidogrel administrat
singur si 6.8 ore cand a fost administrat si carbune, in timp ce pentru clopidogrel acil
glucuronid acelasi t½ de 5.6 ore a fost estimat pentru ambele regimuri de administrare.
Pagina|48
Din moment ce concentratiile de clopidogrel au ramas practic nemodificate, indiferent daca
s-a administrat sau nu carbune, se poate spune ca programul de administrare pentru agentul
de captare al bilei a fost corect definit pentru a nu modifica absorbtia [Stass et. al., 2005;
Taft, 2009; AACT, 2005] si ca clopidogrelul (in sine) nu este implicat in niciun ciclu
enterohepatic (presupunand ca regenerarea clopidogrelului prin reciclare ar fi avut loc in
mod normal, intreruperea procesului ar fi rezultat in reducerea concentratiilor de medicament
in prezenta carbunelui).
Avand in vedere datele farmacocinetice obtinute pentru clopidogrel acil glucuronid, mai ales
referitoare la timpul de injumatatire (care a fost de 5.6 ore, indiferent de administrarea de
carbune) si rezultatele comparatiei intre profilele plasmatice ale metabolitului generate in
prezenta si absenta carbunelui activ (proportia cu/fara carbune de 0.98 pentru Cmax si 1.10
pentru ASC), se poate concluziona ca orice reciclare entero-hepatica a clopidogrelului acil
glucuronid care ar putea avea loc este nesemnificativa. Concluzia este intarita si de testele
statistice aplicate pentru compararea parametrilor farmacocinetici primari ai clopidogrel acil
glucuronid in cele doua conditii de administrare (testul ANOVA de verificare a termenului
“tratament” ca efect fix a returnat valori ale lui p peste nivelul de semnificatie statistica
(0.05) pentru datele Cmax si ASC0-t).
Date cantitative colectate in studiul asupra excretiei si farmacocineticii clopidogrelului
parinte, clopidogrelului acid carboxilic si clopidogrelului acil glucuronid, dupa
administrarea orala a 75 mg clopidogrel la om
Am constatat ca aproximativ 15% dintr-o doza de clopidogrel administrata (calculata ca
raport micromolar) este recuperata in urina sub forma de analiti cuantificabili.
0
10
20
30
40
Urina Materie fecala
Urina Materie fecala
Urina Materie fecala
Clopidogrel Clopidogrel acil glucuronid
Clopidogrel acid carboxilic
Rec
uper
are
tota
la (
mic
roM
)
Recuperarea totala a analitilor din probe de urina si materie fecala
Figura III.25 Recuperarea totala de clopidogrel parinte, clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic din probele de urina si scaun pe parcursul a 72 h post-doza, dupa administrarea de
clopidogrel la subiecti umani (n = 6)
Pagina|49
Cei mai indelungati timpi de recuperare au fost pentru clopidogrel acid carboxilic (excretia
pe cale urinara continua in intervalul de recoltare de 60 pana la 72 de ore post-doza) si pentru
clopidogrel acil glucuronid (recuperat in urina pana la 60 de ore post-doza). Pentru
clopidogrel au fost identificate doar urme in urina (recuperare totala mult sub 0.001 microM)
pana la 36 de ore post-doza, in timp ce, asa cum era de asteptat, clopidogrelul neschimbat
care nu a fost absorbit la nivel intestinal a fost recuperat mai ales in fecale. Cantitatea de
analiti recuperata din probele de scaun a reprezentat doar 1.2% din doza administrata.
Presupunand ca datele sunt normal repartizate (ceea ce este greu de verificat pe numarul
actual de observatii), a fost folosit testul t unilateral pentru esantioane independente pentru
a compara datele referitoare la excretia urinara in intervalele de timp de 0-12 h, 12-24 h, 24-
36 h, 36-48 h, 48-60 h si 60-72 h, pentru cei trei analiti, dupa administrarea de clopidogrel cu
sau fara administrare ulterioara de carbune activ (vezi Figura III.26).
0
10
20
30
40
Cu carbune
Fara carbune
Cu carbune
Fara carbune
Cu carbune
Fara carbune
Clopidogrel Clopidogrel acil glucuronid
Clopidogrel acid carboxilic
0.00 0.00
18.18
31.35
4.25 4.27
Rec
uper
are
tota
la (
mic
roM
)
Recuperarea totala a analitilor in urina in prezenta si in abseta carbunelui medicinal activat
Figura III.26 Recuperarea totala de clopidogrel, clopidogrel acil glucuronid si clopidogrel acid carboxilic din probele de urina, dupa administrarea de clopidogrel la subiecti umani (n = 6) cu sau
fara carbune activ
S-a descoperit ca diferentele cu privire la cantitatile de analiti ce au fost recuperate in
conditiile cu si fara carbune pe parcursul seriei de intervale studiate nu au fost semnificative
din punct de vedere statistic (valorile p: pentru clopidogrel 0.231, pentru clopidogrel acid
carboxilic 0.488 si pentru clopidogrel acil glucuronid 0.181).
Recuperarea urinara pe intervale de colectare pentru clopidogrel acil glucuronid este
prezentata in Figura III.27 (graficul din stanga), in timp ce cantitatea de urina eliminata in
aceste intervale este descrisa in Figura III.27 (graficul din dreapta).
Pagina|50
Figura III.27 Recuperarea de clopidogrel acil glucuronid din urina (n = 6), expusa pe intervale de colectare (stanga) si cantitatea de urina excretata pe intervale de colectare (dreapta)
Nu a fost identificata nicio diferenta semnificativa din punct de vedere statistic in
recuperarea urinara a clopidogrelului acil glucuronid cu sau fara carbune carbune activat, in
niciunul din intervalele de colectare.
In urma analizei datelor acumulate, clopidogrel acil glucuronid poate fi caracterizat ca un
metabolit terminal al clopidogrelului, important din punct de vedere cantitativ dar incapabil
sa contribuie la regenerarea de compusi implicati in lantul metabolic ce duce la formarea
metabolitului activ. Totusi, nu poate fi exclus potentialul acilului glucuronid de a juca alte
roluri importante in activitatea clopidogrelului.
Dupa cuantificarea celor trei analiti in probe de scaun si insumarea cantitatilor recuperate s-a
constatat faptul ca reprezinta doar 1.2% din doza administrata, destul de putin comparativ cu
rezultatele studiului de bilant de masa, publicat anterior in literatura de specialitate [Lins et.
al., 1999], care a aratat o recuperare fecala cumulativa a radioactivitatii intre 35 si 57% dupa
o singura administrare de 75 mg de clopidogrel etichetat C14. Acest fapt este un puternic
indicator ca alti metaboliti (si/sau produse de degradare) inca necaracterizati sunt implicati in
acest proces de excretie prin materie fecala. Rezultatul este in concordanta cu Rezumatul
Caracteristicilor Produsului pentru Plavix, unde se afirma ca douazeci de metaboliti distincti
ai clopidogrelului au fost identificati in matrice biologice.
Datele cu privire la excretia urinara confirma ceea ce am presupus pe baza rezultatelor
farmacocinetice prezentate anterior, de la aceiasi subiecti, si anume ca derivatul acil
glucuronid nu este supus unei reciclari entero-hepatice majore, in cazul in care este supus
vreunei reciclari. Daca s-ar fi intamplat acest lucru, administrarea de carbune ar fi accelerat
excretia metabolitului si nu invers. De asemenea, nu exista dovezi ca vreunul dintre cei trei
analiti cuantificati este implicat in reciclarea entero-hepatica.
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
12 24 36 48 60 72
Clopidogrel acil glucuronid
Rec
uper
are
tota
la (
mic
roM
)
Cu carbune
Fara carbune
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
12 24 36 48 60 72
Volum de urina
mL
Cu carbune
Fara carbune
Pagina|51
In concluzie, in ciuda unei mari afinitati catre aceasta reactie observata mai ales in vitro, nu
s-au gasit dovezi care sa sugereze ca clopidogrel acil glucuronid ar putea fi reconvertit in
vivo la clopidogrel parinte prin trans-esterificare. Pe baza compararii profilelor
farmacocinetice obtinute dupa administrarea de clopidogrel singur si in prezenta carbunelui
activ, se poate afirma ca este destul de improbabil si ca alti metaboliti, in afara de
clopidogrel acil glucuronid, sa fie capabili de a reforma clopidogrel (ca atare), prin
participarea intr-un ciclu entero-hepatic. In concluzie, cantitatea de clopidogrel convertita de
carboxilesteraza la acid carboxilic inactiv (cam 85% dintr-o doza administrata), nu redevine
disponibila pentru metabolizare de catre izoenzimele CYP, astfel incat sa poate fi oxidata si
sa formeze metabolitul tiolic activ.
III.4 Evaluarea interactiunilor medicamentoase intre clopidogrel si substraturi
competitoare sau inhibitori CYP2C19 sau CYP3A4 si determinarea impactului lor
asupra ratei de formare a metabolitului activ H4: studii in vitro realizate pe microzomi
hepatici
Desi pana in prezent au fost formulate multe ipoteze cu privire la motivele pentru care unii
pacienti nu raspund sau au un raspuns diminuat la tratamentul cu clopidogrel, impactul
individual sau chiar si cumulat al factorilor celor mai citati nu explica pe deplin faptul ca
aproximativ 20% pana la 40% din populatia tratata prezinta un raspuns suboptimal la regimul
standard de terapie [Zhang H et. al., 2014]. Factorii cel mai adesea incriminati sunt
variabilitatea intra si inter-individuala cu privire la formarea metabolitului activ, rezistenta
generala la xenobiotice si reactivitatea trombocitara individuala pre-tratament [Gurbel et. al.,
2003; Müller et. al., 2003].
In ceea ce priveste variabilitatea inter-individuala crescuta a ratei de formare a metabolitului
activ (tiolic), s-a demonstrat existenta unei legaturi intre polimorfismul genetic al izoenzimei
CYP2C19, formarea metabolitului activ si evenimente adverse clinice. Desi aceasta legatura
este una logica avand in vedere faptul ca izoenzima este implicata in ambele procese oxidative
ce conduc la formarea metabolitului, corelarea dintre genotipul individual si raspunsul la
tratament reuseste sa explice numai 12% din variabilitatea totala cu privire la eficacitatea
tratamentului cu clopidogrel [Krishna et. al., 2012; Nissen et. al., 2011; Shuldiner et. al.,
2009]. Clopidogrelul este un promedicament; pentru a rezulta metabolitul activ care inhiba
agregarea plachetară, clopidogrelul trebuie metabolizat pe calea izoenzimelor citocromului
P450 [Dansette et. al., 2012; Tuffal et. al., 2011]. In vitro si in vivo, clopidogrelul este
metabolizat pe doua cai metabolice principale: una mediata de esteraze care determina
Pagina|52
hidroliza la derivatul sau carboxilic inactiv (85% dintre metabolitii circulanti) si una mediata
de izoenzimele citocromului P450. In vederea activarii, clopidogrelul este metabolizat mai
intai la metabolitul intermediar 2-oxo-clopidogrel. Metabolizarea consecutiva a metabolitului
intermediar 2-oxo-clopidogrel determina formarea metabolitului activ, un derivat tiolic al
clopidogrelului. In vitro, aceasta cale metabolica este mediata de CYP3A4, CYP2C19,
CYP1A2 si CYP2B6 [RCP Clopidogrel Medana, 2012]. Rezultatele obtinute intr-un studiu
propriu realizat in vivo pe 12 voluntari sanatosi [date prezentate in capitolul experimental
III.1], in care s-au cuantificat atat concentratiile de 2-oxo-clopidogrel cat si cele de metabolit
activ, sugereaza faptul ca cea de a doua etapa oxidativa limiteaza rata de formare a H4.
Testele in vitro efectuate de Kuzui si colaboratori folosind izoforme umane P450 exprimate
prin ADNc au demonstrat ca clopidogrelul este metabolizat la 2-oxo-clopidogrel, precursorul
imediat al metabolitului sau activ farmacologic într-o reactie catalizata de CYP1A2, CYP2B6
si CYP2C19 cu o contributie individuala la formarea de 2-oxo-clopidogrel de 35.8, 19.4 si,
respectiv, 44.9%. Folosind 2-oxo-clopidogrel ca substrat, a fost necesara adaugarea de
glutation la sistem pentru detectarea metabolitului activ al clopidogrelului. CYP2B6,
CYP2C9, CYP2C19 si CYP3A4 au contribuit la producerea metabolitului activ iar
contributiile lor individuale s-au dovedit a fi 32.9, 6.76, 20.6 si, respectiv, 39.8%. Studiile au
demonstrat ca CYP2C19 a contribuit substantial la ambele etape de oxidare necesare pentru
formarea metabolitului activ si ca CYP3A4 a contribuit substantial la a doua etapa oxidativa
[Kazui et. al., 2010]. Aceste rezultate explica efectul polimorfismului genetic al CYP2C19
dar, de asemenea, identifica CYP3A4 ca fiind principala izoenzima responsabila pentru
conversia oxoclopidogrelului la H4 activ.
Desi in anul 2010 FDA a aprobat un nou prospect pentru clopidogrel, ce contine un
avertisment cu privire la eficacitatea diminuata a acestuia la pacientii cu o capacitate
insuficienta de a converti medicamentul la forma sa activa [Holmes et. al., 2010], exista date
in literatura ce sugereaza ca relatia dintre genotipul CYP2C19*2 si agregarea plachetara nu
explica decat in proportii mici variabilitatea totala a raspunsului terapeutic observata la
pacienti in urma tratamentului cu clopidogrel [Shuldiner et. al., 2009]. Prin urmare, se impune
sa luam in calcul si faptul ca vasta majoritate a pacientilor sub tratament cu clopidogrel
primeste concomitent si alte tratamente de fond iar aproximativ 50% din xenobioticele
existente pot fi considerate substraturi competitoare pentru CYP 3A4.
Prin prezentele teste s-a dorit identificarea altor factori importanti (in afara de polimorfismul
genetic CYP2C19) ce ar putea contribui la variabilitatea raspunsului terapeutic la clopidogrel
prin testarea potentialelor interactiuni la nivel metabolic intre clopidogrel / oxo-clopidogrel si
Pagina|53
alte medicamente administrate uzual in practica medicala concomitent cu clopidogrelul printr-
o abordare cinetica ce ia in calcul concentratiile realizate in plasma de competitorii/inhibitorii
testati.
Microzomi hepatici umani caracterizati cu privire la activitatea izoenzimatica individuala, au
fost utilizati ca sursa de enzime CYP [InVitroCYPTM H-classTM Human Liver Microsomes,
Celsis In Vitro Inc, Baltimore, SUA]. Preparatul contine microzomi de la 50 de donori
apartinand ambelor sexe si atat continutul enzimatic final in CYP, FMO si UGT cat si datele
demografice ale donatorilor individuali sunt cunoscute, iar media obtinuta este una
reprezentativa pentru populatia generala, permitand astfel extrapolarea realista a rezultatelor
obtinute in-vitro.
Microzomii au fost selectati ca sistem preferat de testare deoarece, spre deosebire de
hepatocite, ei permit cuantificarea aportului isoenzimelor CYP fara interferente din partea
altor factori de confuzie precum transportul intra-celular. Microzomii hepatici reprezinta un
model biologic bine caracterizat, preparat din tesuturi care sunt analizate si selectate astfel
incat mixul final sa prezinte activitate mare peste intreg panoul de enzime relevante ale
citocromului P450.
Sistemul redox utilizat ca sursa de energie regeneranta a fost compus din glucoza-6-fosfat,
glucozo-6-fosfat dehidrogenaza si NADP in tampon fosfat de potasiu [rapidSTARTTM
NADPH Regenerating System, XenoTech LLC, Lenexa, SUA].
In mixul de incubare a mai fost utilizata si fluorura de potasiu in scopul de a inchide/minimiza
impactul cantitativ al cailor orizontale care conduc la formarea de metaboliti carboxilici ai
clopidogrelului.
Desi exista literatura care sugereaza ca formarea in vitro a metabolitul tiolic activ al
clopidogrelului este dependenta de adaugarea de glutation redus (GSH) in amestecurile de
incubare [Gong et. al., 2012], testele efectuate in scopul de a optimiza continutul amestecului
de incubare au aratat ca metabolitul este format chiar si in absenta GSH, dar cu o scadere de
70% a ratei de formare.
Reactiile au fost realizate in mixuri de incubare de 300μL ce contineau urmatoarele
componente la concentratiile finale indicate in paranteze:
• Microzomi hepatici (2.00 mg/mL)
• Substrat (clopidogrel 1 μM/ 10 μM sau 2-oxo-clopidogrel 1 μM/10 μM)
• Solutie tampon Fosfat Sodic (50mM, pH 7.4)
• Clorura de magneziu (3.0mM)
• EDTA (1.0mM, pH 7.4)
Pagina|54
• Glucozo-6-fosfataza (12.5mM, pH 7.4)
• Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (2.5 Unitati/mL)
• NADP (2.5mM, pH 7.4)
• Glutation redus (10 mM)
• Fluorura de Potasiu (100 mM)
± Inhibitor (omeprazol, simvastatin, atorvastatin, gliclazid, glimepirid sau naringenina in
raport de 10:1 sau 1:1 sau 0.1:1 fata de substratul probei: clopidogrel 1/ 10 μM sau 2-oxo-
clopidogrel 1/ 10 μM)
• Apa purificata pana la un volum final de 300 μL
Au fost preparate probe de control al conceptului [conform tabelului III-16] prin excluderea
anumitor componente din mixul standard de incubare.
Tabel III-16. Probe de calibrare a sistemului in vitro si identificare a tipurilor de reactii ce au loc in
mixul de incubare
Microzomi Mix NADPH GSH KF Scop
✓ ✓ ✓ NU Determinarea cantitativa si calitativa a metabolitilor rezultati
atunci cand actiunea esterazelor nu este inhibata
✓ ✓ NU ✓ Testarea ipotezei conform careia formarea metabolitului activ
este dependenta de prezenta glutationului
✓ NU ✓ ✓
Determinarea dependentei de un sistem energetic a reactiilor
de metabolizare. Prin urmare, orice metabolit obtinut in aceste
probe este rezultat in urma actiunii esterazelor si nu a
izoenzimelor hepatice
NU ✓ ✓ ✓ Determinarea dependentei de izoenzime hepatice a reactiilor
de metabolizare.
NU NU ✓ ✓ Determinarea stabilitatii substratului (clopidogrel/oxo-
clopidogrel) in mixurile de incubare
Pentru aceste teste de metabolizare realizate cu clopidogrel si 2-oxo-clopidogrel ca substrat,
probele complete si probele de control au fost incubate in aceleasi conditii.
Pentru a putea determina curbe de conversie, s-au incubat probe timp de 15, 30 si 60 minute.
Pentru oprirea reactiilor de metabolizare, dupa expirarea timpului dorit de incubare, probele au
fost imediat tratate cu un volum egal (300μL) de acetonitril la 4° C.
Pe baza concentratiilor de metabolit activ determinate in probele unde substratul a fost incubat
in prezenta diferitilor inhibitori/competitori in raport de concentratie 0.1, 1.0 si 10.0, s-au facut
reprezentari grafice si s-a modelat dependenta intre variabile in scopul predictiei inhibitiei in
vivo in functie de raporturile uzuale intre concentratiile plasmatice terapeutice. In graficele de
Pagina|55
mai jos, pe axa “y” sunt prezentate concentratiile de metabolit activ determinate in probe iar
pe axa “x” proportiile de concentratie inhibitor:substrat la care s-au obtinut rezultatele. Apoi,
pe baza ecuatiei care descrie cel mai bine datele experimentale [coeficientul de corelatie R2 cel
mai mare], s-au calculat concentratiile de metabolit activ care ar rezulta daca ratia
substrat:inhibitor in proba ar fi una fiziologic-relevanta. Pentru determinarea raportului
relevant substrat-inhibitor pentru fiecare pereche testata, s-au luat in calcul rapoartele
fiziologice ale concentratiilor plasmatice maxime (Cmax) realizate dupa administrarea unei
doze unice din fiecare medicament – calculate pe baza datelor obtinute in studii de
farmacocinetica. Prin introducerea in ecuatie a acestui raport fiziologic-relevant, s-a putut
prezice concentratia de metabolit activ care s-ar forma si respectiv, puterea inhibitorie maxima
a fiecarui competitor/ inhibitor.
Puterea inhibitorie maxima a fost calculata procentual iar ca 0% inhibitie au fost considerate
mediile valorilor de metabolit activ rezultate dupa 60 minute de incubare a clopidogrelului 1
μM, clopidogrelului 10 μM, 2-oxo-clopidogrelului 1μM si respectiv 2-oxo-clopidogrelului 10
μM. Pe langa faptul ca toate testele au fost realizate in triplicat, utilizarea a doua concentratii
diferite de substrat in aceleasi conditii de raport inhibitor:clopidogrel/2-oxo-clopidogrel
permite un control aditional asupra acuratetii si reproductibilitatii ecuatiilor predictive.
In Figura III-28 [A - D] de mai jos sunt prezentate graficele de formare a metabolitului activ
atunci cand activitatea CYP nu este inhibata/redusa competitiv prin incubarea concomitenta a
altor medicamente.
Pagina|56
Figura III-28. Metabolizarea clopidogrelului si 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4, utilizand microzomi
hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
Pagina|57
Cresterile semnificative si graduale inregistrate pe parcursul celor 60 de minute de incubare
reflecta functionalitatea sistemului energetic regenerant utilizat pentru a cataliza activitatea
CYP. Prezenta oxo-clopidogrelului in sistem in cantitati semnificative in reactiile ce au ca
substrat clopidogrelul si alura aproape paralela a celor doua curbe de conversie sugereaza ca
intr-adevar exista limitari substantiale a ratei de conversie in cea de-a doua etapa oxidativa,
conversia la H4 neputand sa tina pasul cu formarea 2-oxo-clopidogrelului. Limitele ratei de
conversie a 2-oxo-clopidogrelului la H4 sunt vizibile si prin faptul ca multiplicarea
concentratiei de substrat nu duce la cresteri proportionle in formarea de H4, observatie
valabila si atunci cand se porneste de la clopidogrel ca substrat, in contextul in care
concentratia microzomilor in probe asigura faptul ca sistemul nu este saturat la concentratiile
testate.
Teste de interactiuni:
Atorvastatina: este o substanta medicamentoasa din grupul inhibitorilor HMG-CoA-
reductazei, utilizata frecventa in prevenirea evenimentelor cardiovasculare si tratamentul bolii
coronariene in asociere cu clopidogrelul. Atorvastatina este metabolizata de izoenzima 3A4 a
citocromului P450 [RCP TORVACARD, 2009] fiind astfel un substrat competitor in a doua
etapa oxidativa a clopidogrelului.
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD)
Ratie fiziologica Cmax = 5.354 (ATO + 2-OH)
y = -10.83ln(x) + 129.3 R² = 0.89397
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10.0
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4
111.13 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 24.23%
atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD)
Ratie fiziologica Cmax = 5.354 (ATO + 2-OH)
y = -48.25ln(x) + 233.83 R² = 0.95166
0
90
180
270
360
450
0.10 1.00 10.00
Metabolit
ac
v H4 (n
g/mL)
Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ clopidogrel
Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4
152.87 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 23.81%
Figura III-29. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta atorvastatinei, utilizand microzomi
hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicate
Pagina|58
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM
atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax = 0.484 (ATO + 2-OH)
y = -29.13ln(x) + 736.63 R² = 0.98269
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.0
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4
648.02 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 20.00%
atorvastatin (Ato 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax = 0.484 (ATO + 2-OH)
y = -251.1ln(x) + 1561.2 R² = 0.99581
0
500
1000
1500
2000
2500
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Atorvastatin + 2-OH-atorvastatin/ Ox0-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta atorvastatin: formarea metabolitului activ H4
1743.27 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 20.81%
Figura III-30. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta atorvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul atorvastatinei puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 20%, destul de
substantiala avand in vedere faptul ca aceasta molecula este doar substrat pentru CYP3A4, si
pare sa derive exclusiv din inhibarea celei de a doua etape oxidative (de la 2-oxo-clopidogrel
la H4 activ).
Simvastatina: este o substanta medicamentoasa ce face parte tot din grupul inhibitorilor HMG-
CoA-reductazei, utilizata frecventa in prevenirea evenimentelor cardiovasculare si tratamentul
bolii coronariene in asociere cu clopidogrelul. Este metabolizata de izoenzima 3A4 a
citocromului P450 [RCP SIMVASTATIN, 2006] fiind astfel un substrat competitor in a doua
etapa oxidativa a clopidogrelului.
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
simvastatina (Simv. 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 6.782
y = -5.452ln(x) + 77.118 R² = 0.98828
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Simvastatin / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4
66.68 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 54.54%
simvastatina (Simv. 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 6.782
y = -25.89ln(x) + 137.18 R² = 0.94128
0
90
180
270
360
450
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Simvastatin / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4
87.62 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 56.34%
Figura III-31. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta simvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
Pagina|59
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM
simvastatina (Simv. 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 0.614
y = -6.509x + 428.2 R² = 0.9759
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Simvastatin / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4
424.21 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 47.63%
simvastatina (Simv. 40mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 0.614
y = ‐168.4ln(x) + 1163.4 R² = 0.98011
0
500
1000
1500
2000
2500
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Simvastatin / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta simvastatin: formarea metabolitului activ H4
1245.67 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 43.41%
Figura III-32. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta simvastatinei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul simvastatinei puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 45% pentru a
doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) si 55% global (de la clopidogrel la
H4) avand astfel un potential mult mai mare de a cauza interactiuni nedorite la administrarea
concomitenta cu clopidogrelul, comparativ cu atorvastatina (reprezentant al aceluiasi grup
terapeutic).
Omeprazol: este un medicament pentru tratamentul ulcerului gastro-duodenal si al bolii de
reflux gastro-esofagian din grupul inhibitorilor pompei protonice. Deoarece printre indicatiile
sale terapeutice se numara si profilaxia ulcerelor la pacientii cu risc crescut, este in mod
frecvent asociat tratamentului standard clopidogrel + acid acetilsalicilic pentru a combate
efectul iritant gastric al celui din urma. Metabolismului sau este dependent in principal de
CYP2C19, responsabil pentru formarea metabolitului major in plasma (hidroxil-omeprazol)
iar CYP3A4 este izoenzima responsabila pentru formarea de omeprazol sulfona. Ca o
consecinta a afinitatii omeprazolului catre CYP2C19, exista un potential pentru inhibarea
competitiva si interactiuni metabolice medicamentoase cu alte meldicamente care reprezinta
substrat pentru CYP2C19 [RCP OMEPRAZOL LPH, 2015]. Desi in momentul de fata
Rezumatul Caracteristicilor Produsului pentru omeprazol nu discuta si puterea sa inhibitorie
asupra CYP2C9 (posibil deoarece este mai mica decat cea asupra CYP2C19), aceasta a fost
observata prin studii de interactiuni medicamentoase si descrisa in literatura [Li et. al., 2004].
Pagina|60
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
omeprazol (Omeprazol 20mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 371.531
y = -11.68ln(x) + 96.06 R² = 0.95708
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Omeprazol / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4
26.94 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 81.63%
omeprazol (Omeprazol 20mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 371.531
y = ‐10.11ln(x) + 91.14 R² = 0.90306
0
90
180
270
360
450
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
ml)
Raport concentratii Omeprazol / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4
31.31 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 84.40%
Figura III-33. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta omeprazolului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM
omeprazol (Omeprazol 20mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 33.607
y = -24.72ln(x) + 235.42 R² = 0.95749
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.0
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Omeprazol / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4
148.54 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 81.66%
omeprazol (Omeprazol 20mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 33.607
y = -145.7ln(x) + 951.37 R² = 0.99023
0
500
1000
1500
2000
2500
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
cvti
v H
4 (n
g/m
L)
Raport concentratii Omeprazol / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta omeprazol: formarea metabolitului activ H4
439.27 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 80.04%
Figura III-34. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta omeprazolului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul omeprazolului puterea inhibitorie maxima globala pare sa fie extrem de ridicata
suprimand in proportie de aproximativ 82% formarea de metabolit activ H4 pornind de la
clopidogrel, atunci cand acesta din urma este administrat in momentul de maxima abundenta a
omeprazolului in circulatia sistemica. Trebuie mentionat in cazul testelor realizate cu
omeprazol pornind de la clopidogrel, ca este probabil ca rezultatele privind puterea inhibitorie
sa fie supraestimate deoarece punctul ce reprezinta ratiile fiziologice ale Cmax se afla intr-o
zona de extrapolare a curbei (extrapolare realizata in baza ecuatiei predictive) situata mult in
Pagina|61
afara graficului construit. Daca intelegem insa faptul ca situatiile prezentate in graficele din
acest capitol reprezinta cel mai rau scenariu posibil in care clopidogrelul si competitorul sau
ating simultan Cmax si corelam aceasta informatie cu date din literatura in care se arata ca dupa
administrarea concomitenta a omeprazolului [Tmax = 2h] cu clopidogrel [Tmax clopidogrel =
0.75h, conform datelor prezentata in Capitolul III.1], expunerea la metabolitul activ este
redusa cu 46% [Wang et. al., 2015], putem sa concluzionam ca in realitate supraestimarea nu
pare sa fie una substantiala.
Pe langa efectul global puternic, putem observa in graficele de conversie de la 2-oxo-
clopidogrel la H4 activ faptul ca rata de formare prin cea de-a doua etapa oxidativa este redusa
cu aproximativ 80% prin efectul inhibitor asupra CYP2C9 si CYP2C19 si competitor asupra
CYP3A4.
Gliclazid: este un medicament din clasa sulfonamide - derivati de uree, utilizat in
managementul diabetului zaharat non-insulino-dependent (de tip 2) al adultului, atunci cand
regimul dietetic, efortul fizic si scaderea in greutate nu sunt suficiente pentru a controla
glicemia [RCP Gliclazida Krka 60 mg, 2013]. Intrucat pacientii ce sufera de diabet sunt expusi
unui risc mai mare de aparitie a evenimentelor cardiovasculare comparativ cu populatia
generala, tratamentul concomitent cu antidiabetice orale si antiagregante plachetare este unul
des intalnit in practica medicala. Gliclazida este substrat CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19
[Sultanpur et. al., 2010; Elliot et. al., 2007; Zhang et. al., 2007].
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
gliclazid (Gliclazid 30mg SD/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 674.188
y = 96.175x-0.093 R² = 0.95575
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Gliclazid / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4
52.48 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 64.22%
gliclazid (Gliclazid 30mg SD/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 674.188
y = -15.71ln(x) + 172.25 R² = 0.95679
0
90
180
270
360
450
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Gliclazid / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4
69.92 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 65.15%
Figura III-35. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta gliclazidei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
Pagina|62
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM
gliclazid (Gliclazid 30mg SD/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 60.985
y = -29.5ln(x) + 526.75 R² = 0.99523
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Gliclazid / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4
405.49 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 49.94%
gliclazid (Gliclazid 30mg SD/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 60.985
y = -182.9ln(x) + 1928.7 R² = 0.98554
0
700
1400
2100
2800
3500
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Gliclazid / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta gliclazid: formarea metabolitului activ H4
1176.87 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 46.54%
Figura III-36. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta gliclazidei, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul gliclazidei, puterea inhibitorie maxima cauzata prin interferenta cu CYP2C9 si
CYP3A4 se situeaza in jurul valorii de 48% pentru a doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-
clopidogrel la H4 activ) si 65% global (de la clopidogrel la H4), demonstrand faptul ca
afinititatea glicazidei ca substrat competitor pentru CYP2C19 este mai mare decat cea a
clopidogrelului fiind astfel afectata semnificativ si prima etapa oxidativa (de la clopidogrel la
2-oxo-clopidogrel).
Glimepirid este un alt reprezentant al grupei farmacoterapeutice antidiabetice orale -
sulfonamide - derivati de uree, utilizat (asemeni glicazidei) in managementul diabetului
zaharat non-insulino-dependent (de tip 2), atunci cand regimul dietetic, efortul fizic si
scaderea in greutate nu sunt suficiente pentru a controla glicemia. Potentialul de interactiune
cu clopidogrelul rezulta din faptul ca glimepiridul este substrat competitor pentru CYP2C9
[RCP Anaryl 1 mg, 2009; Tirkkonen et. al. 2010], izoenzima implicata in cea de-a doua etapa
oxidativa.
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
Pagina|63
Incubare Clopidogrel 1 μM Incubare Clopidogrel 10 μM
glimepirid (Glimepirid 1mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 48.259
y = -15.18ln(x) + 109.36 R² = 0.97744
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Glimepirid / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4
50.51 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 65.56%
glimepirid (Glimepirid 1mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 48.259
y = -22.27ln(x) + 156.02 R² = 0.99188
0
90
180
270
360
450
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Glimepirid / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 10 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4
69.69 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ
Putere inhibitorie maxima: 65.27%
Figura III-37. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta glimepiridului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM Incubare Oxo-clopidogrel 10 μM
glimepirid (Glimepirid 1mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 4.365
y = -32.58ln(x) + 501.33 R² = 0.99783
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Glimepirid / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4
453.32 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ Putere inhibitorie maxima: 44.04%
glimepirid (Glimepirid 1mg SD/Clopidogrel 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 4.365
y = -195.9ln(x) + 1487.6 R² = 0.98793
0
700
1400
2100
2800
3500
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Glimepirid / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 10 µM in prezenta glimepirid: formarea metabolitului activ H4
1198.90 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ
Putere inhibitorie maxima: 45.54%
Figura III-38. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta glimepiridului, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul glimepiridului, puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 45% pentru a
doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) dar tot 65% global (de la
clopidogrel la H4), sugerand ca nu este o alternativa mai sigura decat gliclazidul in ceea ce
priveste potentialul de a interactiona cu clopidogrelul.
Naringenina: este flavonona (un tip de flavonoid) predominanta din sucul de grapefruit, care
se gaseste de asemenea in portocale si in coaja de tomate. Prezinta efect inhibitor asupra
CYP3A4, CYP2C9 si CYP2C19 [Ho et. al. 2001; Lu et. al., 2011] ceea ce sugereaza ca are un
potential ridicat de a interactiona cu clopidogrelul. Valoarea Cmax luata in calcul pentru a
Pagina|64
estima ratia fiziologica naringenina:clopidogrel este cea obtinuta dupa ingestia a 8 ml suc
proaspat de portocale per Kg corp [Erlund et. al., 2001].
y = -9.707ln(x) + 117.77 R² = 0.9622
0
40
80
120
160
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Naringenina / Clopidogrel
Incubarea clopidogrel 1 µM in prezenta naringeninei: formarea metabolitului activ H4
Incubare Clopidogrel 1 μM naringenina (8ml/kg corp suc portocale/Clopi 75mg SD); Ratie fiziologica Cmax= 137.923
69.95 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ
Putere inhibitorie maxima: 52.31%
Figura III-39. Metabolizarea clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta naringenina, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
y = ‐9.5755x + 592.02 R² = 0.9352
0
150
300
450
600
750
900
0.10 1.00 10.00
Met
abol
it a
ctiv
H4
(ng/
mL
)
Raport concentratii Naringenina / Oxo-clopidogrel
Incubarea oxo-clopidogrel 1 µM in prezenta naringeninei: formarea metabolitului activ H4
Incubare Oxo-clopidogrel 1 μM naringenina (8ml/kg corp suc portocale/Clopi 75mg SD) Ratie fiziologica Cmax= 12.476
472.56 ng/mL concentratie calculata de metabolit activ
Putere inhibitorie maxima: 41.66%
Figura III-40. Metabolizarea 2-oxo-clopidogrelului la metabolit activ H4 in prezenta naringenina, utilizand microzomi hepatici umani (N=50 indivizi) ca sursa CYP – curbe medii estimate din probe in triplicat
In cazul naringeninei, puterea inhibitorie maxima se situeaza in jurul valorii de 42% pentru a
doua etapa oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ) si 52% global (de la clopidogrel la
H4), demonstrand ca asocierea intre clopidogrel si sucul de portocale sau grapefruit poate sa
reduca semnificativ eficienta medicamentului dar si ca potentialul de interactiune este mai mic
decat in cazul medicamentelor ce concureaza pentru aceleasi trei izoenzime.
Prezenta oxo-clopidogrelului in sistem in cantitati semnificative in reactiile ce au ca substrat
clopidogrelul si alura aproape paralela a celor doua curbe de conversie (clopidogrel -> 2-oxo-
clopidogrel si 2-oxo-clopidogrel -> H4 activ) sugereaza ca intr-adevar exista limitari
substantiale a ratei de conversie in cea de-a doua etapa oxidativa, conversia la H4 neputand sa
tina pasul cu formarea 2-oxo-clopidogrelului. Limitele ratei de conversie a 2-oxo-
Pagina|65
clopidogrelului la H4 sunt vizibile si prin faptul ca multiplicarea concentratiei de substrat nu
duce la cresteri proportionle in formarea de H4, observatie valabila si atunci cand se porneste
de la clopidogrel ca substrat, in contextul in care concentratia microzomilor in probe asigura
faptul ca sistemul nu este saturat la concentratiile testate.
In conditii relevante din punct de vedere fiziologic (luand in calcul ratiile de Cmax obtinute in
studii farmacocinetice), conversia clopidogrelului la metabolitul activ este inhibata de
comedicatia testata cu urmatoarea ordine de potenta: omeprazol > glimepirid > gliclazid >
simvastatin > naringenina > atorvastatin.
0
25
50
75
100
atorvastatin simvastatin gliclazid glimepirid naringenina omeprazol
Pu
tere
inh
ibit
orie
max
ima
(%)
Puterea inhibitorie asupra formarii de metabolit activ H4 pornind de la clopidogrel
Figura III-41. Puterea inhibitorie maxima prezisa pentru medicamentele testate asupra metabolizarii
clopidogrelului la metabolit activ H4
Este interesant de observat faptul ca nu toate substraturile competitoare CYP3A4 au putere
inhibitorie similara si ca in pofida abundentei acestei izoenzime in mediul hepatic, se observa
interferente semnificative atunci cand clopidogrelul intra in competitie cu medicamente ce au
o afinitate mai mare catre CYP3A4. De asemenea, judecand dupa diferentele observate intre
puterea inhibitorie maxima a simvastatinei si atorvastatinei, putem deduce si faptul ca
afinitatea pentru izoenzima poate sa varieze substantial in cadrul aceleiasi clase de compusi,
impunandu-se un studiu individual pentru selectarea celei mai bune optiuni terapeutice atunci
cand se prevede co-administrarea cu clopidogrel.
Un efect inhibitor marcat a fost inregistrat si pentru glimepirid, substrat cu afinitate mare
pentru CYP2C9. Puterea inhibitorie maxima este foarte similara cu cea a glicazidului, care
este substrat competitor al clopidogrelului pentru nu una ci trei enzime catalizatoare
Pagina|66
(CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19), insa pare ca afinitatea specifica pentru ele nu este una atat
de ridicata.
Naringenina, desi este inhibitor CYP2C9, CYP3A4 si CYP2C19, are un potential de a
interactiona cu clopidogrelul mult mai redus atunci cand este administrata in cantitati uzuale
(estimarile sunt facute pentru un consum de 400 mL fresh de portocale pentru o persoana cu
masa corporala de 50 kg) decat cel al omeprazolului, desi acesta din urma este doar substrat
competitor pentru CYP3A4 si inhibitor CYP2C9/ CYP2C19.
Probabil cel mai important mesaj de retinut este acela ca nu putem aplica o logica prea
elementara in ceea ce priveste potentialul medicamentelor de a interactiona cu clopidogrelul.
De exemplu, nu putem spune ca un substrat competitor ce afecteaza doar o izoenzima nu are
un potential semnificativ de a interfera cu rata de formare a metabolitului activ H4. In realitate
impactul depinde de potenta inhibitorului, afinitatea competitorului si rata de conversie a
reactiei cu care medicamentul interfera.
Dupa cum poate fi observat in figura III-42 de mai jos, efectul inhibitor global observat pentru
medicamentele testate este datorat in cea mai mare parte interferentei cu a doua etapa
oxidativa (de la 2-oxo-clopidogrel la H4 activ), chiar daca acest lucru nu ar fi fost neaparat
predictibil judecand dupa datele disponibile in literatura cu privire la implicarea individuala a
izoenzimelor CYP in aceasta reactie.
0
25
50
75
100
atorvastatin simvastatin gliclazid glimepirid naringenina omeprazol
Pu
tere
inh
ibit
orie
max
ima
(%)
Puterea inhibitorie asupra formarii de metabolit activ H4 pornind de la 2-oxo-clopidogrel si contributia la efectul inhibitor global
Inhibarea etapei clopidogrel => 2-oxo-clopidogrel Inhibarea etapei 2-oxo-clopidogrel => H4
Figura III-42. Puterea inhibitorie maxima prezisa pentru medicamentele testate asupra metabolizarii clopidogrelului la metabolit activ H4
Pagina|67
Cel mai probabil explicatia acestui fenomen sta tocmai in faptul ca cea de-a doua etapa
oxidativa, care este deja destul de lenta, este mult mai susceptibila interferentelor externe
tocmai din cauza limitarilor pre-existente.
Global, putem concluziona ca testele de interactiune in-vitro sunt o unealta utila in
identificarea potentialelor interactiuni medicamentoase ce pot afecta formarea metabolitului
activ (si consecutiv eficienta clopidogrelului) iar utilizarea lor ar trebui sa fie incurajata
intrucat, dupa cum am aratat, potentialul inhibitor nu poate fi dedus, extrapolat pe clase de
compusi sau pe tipuri de interferenta (competitie/inhibitie). De asemenea, s-ar impune ca in
viitorul apropiat clinicienii sa dea dovada de o mai mare responsabilizare cu privire la
medicamentele pe care le prescriu pentru uz concomitent cu clopidogrelul. De exemplu: chiar
avem nevoie sa co-administram omeprazol pentru a combate efectul a 100mg/zi acid
acetilsalicilic din cadrul tratamentului dual antiagregant plachetar?...nu ar putea oare sa fie el
inlocuit cu famotidina, care nu are efect inhibitor asupra izoenzimelor citocromului 450?!
IV.2 CONCLUZII FINALE Scopul colectiv al proiectelor de cercetare realizate a fost acela de a contribui la o intelegere
mai amanuntita a surselor de variabilitate ce afecteaza raspunsul individual la
tratamentul cu clopidogrel si de a evalua solutii optimizate de administrare pentru
maximizarea expunerii la metabolitul farmacologic activ.
1) Au fost identificate surse de variabilitate care pot afecta determinarile farmacocinetice
fara a fi insa in realitate o sursa de variabilitate in raspuns terapeutic. In particular,
testele de stabilitate realizate pentru depistarea potentialelor cai de metabolizare ex-
vivo ale 2-oxo-clopidogrelului au aratat ca sub actiunea paroxonazei-1, in mediu ex-
vivo are loc o conversie a acestuia la un metabolit cu o structura si un timp de
retentie foarte similare cu cele ale metabolitului activ (un izomer “endo” al
acestuia) care este influentata de conditiile de prelevare (anticoagulant) si de
pastrare/prelucrare a probelor (temperatura). Evitarea reconversiei clopidogrelului
acil glucuronid la clopidogrel parinte s-a dovedit un alt aspect important pentru a
obtine rezultate corecte.
2) S-a aprofundat evaluarea metabolismului conjugativ al clopidogrelului, caracterizand
in particular clopidogrelul acil glucuronid. In urma analizei tuturor datelor acumulate,
clopidogrel acil glucuronid poate fi caracterizat ca un metabolit terminal al
clopidogrelului, important din punct de vedere cantitativ dar incapabil sa
contribuie la regenerarea de compusi implicati in lantul metabolic ce duce la
Pagina|68
formarea metabolitului activ. In ciuda unei mari afinitati catre reactii de
transesterificare, observata clar in vitro, nu s-au gasit dovezi care sa sugereze ca
clopidogrel acil glucuronid ar putea fi reconvertit in vivo la clopidogrel. Pe baza
compararii profilelor farmacocinetice obtinute dupa administrarea de clopidogrel
singur si in prezenta carbunelui activ, se poate afirma si ca este destul de improbabil
ca alti metaboliti, in afara de clopidogrel acil glucuronid, sa fie capabili de a
reforma clopidogrel (ca atare), prin participarea intr-un ciclu entero-hepatic. In
concluzie, cantitatea de clopidogrel convertita de carboxilesteraza la acid carboxilic
inactiv (cam 85% dintr-o doza administrata), nu redevine disponibila pentru
metabolizare de catre izoenzimele CYP, astfel incat sa poate fi oxidata si sa formeze
metabolitul tiolic activ.
3) Din punct de vedere al metabolismului oxidativ, s-au efectuat o serie de teste prin care
s-a dorit identificarea altor factori importanti (in afara de polimorfismul genetic
CYP2C19) ce ar putea contribui la variabilitatea raspunsului terapeutic la clopidogrel:
interactiunile medicamentoase. S-au testat potentiale interactiuni la nivel metabolic
intre clopidogrel / oxo-clopidogrel si alte medicamente administrate uzual in
practica medicala concomitent cu clopidogrelul, printr-o abordare cinetica
utilizand microzomi hepatici umani “in vitro”. In conditii relevante din punct de
vedere fiziologic (luand in calcul ratiile de Cmax obtinute in studii farmacocinetice),
conversia clopidogrelului la metabolitul activ este inhibata de comedicatia testata
cu urmatoarea ordine de potenta: omeprazol > glimepirid > gliclazid >
simvastatin > naringenina > atorvastatin. Aceste rezultate se coreleaza bine cu
datele de ordin farmacodinamic din studii clinice deja publicate si subliniaza faptul ca
o atentie sporita ar trebui dedicata in practica medicala pentru a evita interactiuni
potential periculoase.
4) Observatiile “in vitro” si “in vivo” au aratat clar ca metabolismul oxidativ este
aproape de saturatie la dozele clinice uzuale si poate fi postulat ca viteza si
compartimentul de cedare/absorbtie vor dicta in mare parte disponibilitatea
pro-medicamentului pentru metabolizarea oxidativa.
5) O alta observatie importanta este aceea ca solubilitatea scazuta a clopidogrelului in
mediile biologice prezente la locul de absorbtie reprezinta una din sursele
importante de variabilitate ce afecteaza farmacocinetica clopidogrelului.
6) Este interesant insa ca eficienta de conversie a medicamentului parinte la
metabolitul activ se coreleaza mai degraba cu timpul de rezidenta a
Pagina|69
clopidogrelului in compartimentul central decat cu concentratiile plasmatice
realizate de acesta. Motivul pentru care observam acest comportament este acela ca a
doua sau ambele etape oxidative mediate de izoenzimele CYP450 limiteaza rata de
conversie. Astfel, reinventarea clopidogrelului ca medicament eficient pentru un
procent mai mare din populatia tratata se va baza, cel mai probabil, pe dezvoltarea
unor forme farmaceutice cu eliberare prelungita.
REFERINTE BIBLIOGRAFICE CITATE IN REZUMAT
AACT (American Academy of Clinical Toxicology) and European
Association of Poisons Centres and Clinical Toxicologists (2005) Position Paper:
Single-Dose Activated Charcoal, Clinical Toxicology 43: 61-87.
Adkins S., Gan K.N., Mody M., La Du B.N. (1993) Molecular basis for the
polymorphic forms of human serum paraoxonase/arylesterase: glutamine or arginine
at position 191, for the respective A or B allozymes. American Journal of Human
Genetics 52(3): 598–608.
Billecke S., Draganov D., Counsell R., Stetson P., Watson C., Hsu C., La Du
B.N. (2000) Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze
lactones and cyclic carbonate esters. Drug Metabolism and Disposition28(11): 1335-
1342.
Bouman H.J., Schomig E., van Werkum J.W., Velder J., Hackeng C.M.,
Hirschhäuser C., Waldmann C., Schmalz H.G., ten Berg J.M., Taubert D. (2011)
Paraoxonase-1 is a major determinant of clopidogrel efficacy. Nature Medicine 17(1):
110-116.
Dansette P. M., Rosi J., Bertho G., Mansuy D. (2012) Cytochromes P450
catalyze both steps of the major pathway of clopidogrel bioactivation, whereas
paraoxonase catalyzes the formation of a minor thiol metabolite isomer. Chemical
Research in Toxicology 25(2): 348-356.
Dressman, J.B., Amidon, G.L., Reppas, C., Shah V.P. (1998) Dissolution
testing as a prognostic tool for oral drug absorption: immediate release dosage forms.
Pharmaceutical Research 15(1): 11-22.
Elliot D.J., Suharjono Lewis B.C., Gillam E.M., Birkett D.J., Gross A.S.,
Miners J.O. (2007) Identification of the human cytochromes P450 catalysing the rate-
limiting pathways of gliclazide elimination. British Journal of Clinical Pharmacology
64(4): 450-457.
Elomaa K., Ranta S., Tuominen J., Lähteenmäki P. (2001) The possible role of
enterohepatic cycling on bioavailability of norethisterone and gestodene in women
using combined oral contraceptives, Contraception 63(1): 13-18.
EMA-CHMP (European Medicines Agency - Committee for Medicinal
Products for Human Use), Guideline on the investigation of bioequivalence
[CPMP/EWP/QWP/1401/98 Rev. 1/ Corr **], 20 January 2010 Disponibil on-line la
adresa:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2010/01/WC50007003
9.pdf
Erlund I., Meririnne E., Alfthan G., Aro A. (2001) Plasma kinetics and urinary
excretion of the flavanones naringenin and hesperetin in humans after ingestion of
orange juice and grapefruit juice. Journal of Nutrition 131(2): 235-241.
FDA-CDER (U.S. Food and Drug Administration - Center for Drug
Evaluation and Research), Guidance for Industry: Food-Effect Bioavailability and
Fed Bioequivalence Studies, 2002. Disponibil on-line la adresa:
http://www.fda.gov/downloads/RegulatoryInformation/Guidances/UCM126833.pdf
FDA New Drug Application (NDA) dossier for the innovator clopidogrel
product (Plavix). Disponibil on-line la adresa:
http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2002/20-
839S019_Clopidogrel%20Bisulfate_EAfonsi.pdf
FDA-CDER (U.S. Food and Drug Administration - Center for Drug
Evaluation and Research), Product-Specific Recommendations for Generic Drug
Development: Draft Guidance on Clopidogrel Bisulfate, Recommended Oct 2005,
Revised Aug 2008. Disponibil on-line la adresa:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm083
335.pdf
Furlong M. T., Savant I., Yuan M., Scott L., Mylott W., Mariannino T.,
Kadiyala P., Roongta V., Arnold M.E. (2013) A validated HPLC-MS/MS assay for
quantifying unstable pharmacologically active metabolites of clopidogrel in human
plasma: Application to a clinical pharmacokinetic study. Journal of chromatography.
B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 926: 36-41.
Gad S.C. (2007) The mouse, in Animal models in toxicology (2nd Edition,
Shayne C. Gad) pp 19 -146, CRC Press (Taylor & Francis Group, LLC), Florida.
Gong I.Y., Crown N., Suen C.M., Schwarz U.I., Dresser G.K., Knauer M.J.,
Sugiyama D., DeGorter M.K., Woolsey S., Tirona R.G., Kim R.B. (2012) Clarifying
the importance of CYP2C1 and PON1 in the mechanism of clopidogrel bioactivation
and in vivo antiplatelet response. European Heart Journal 33(22): 2856 – 2864a.
Gurbel P.A., Bliden K.P., Hiatt B.L., O’Connor C.M. (2003) Clopidogrel for
coronary stenting: response variability, drug resistance, and the effect of pretreatment
platelet reactivity. Circulation 107(23): 2908-2913.
Holmes D.R. Jr., Dehmer G.J., Kaul S,. Leifer D., O'Gara P.T., Stein C.M.
(2010) A Report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on
Clinical Expert Consensus Documents and the American Heart Association Endorsed
by the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions and the Society of
Thoracic Surgeons: clopidogrel clinical alert: approaches to the FDA “boxed
warning”. Circulation 122(5): 537-557.
Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. (2001) Inhibition of human CYP3A4
activity by grapefruit flavonoids, furanocoumarins and related compounds. Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 4(3): 217-227.
Jantratid E., Janssen N., Reppas C., Dressman J.B. (2008) Dissolution media
simulating conditions in the proximal human gastrointestinal tract: an update.
Pharmaceutical Research 25(7): 1663-1676.
Karazniewicz-Lada M., Danielak D., Tezyk A., Zaba C., Tuffal G., Glowka F.
(2012) HPLC–MS/MS method for the simultaneous determination of clopidogrel, its
carboxylic acid metabolite and derivatized isomers of thiol metabolite in clinical
samples. Journal of Chromatography B 911: 105-112.
Kazui M., Nishiya Y., Ishizuka T., Hagihara K., Farid N.A., Okazaki O., Ikeda
T., Kurihara A. (2010) Identification of the human cytochrome P450 enzymes
involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its
pharmacologically active metabolite, Drug Metabolism and Disposition 38(1): 92-99.
Krishna V., Diamond G.A., Kaul S. (2012) Do platelet function testing and
genotyping improve outcome in patients treated with antithrombotic agents? The role
of platelet reactivity and genotype testing in the prevention of atherothrombotic
cardiovascular events remains unproven. Circulation 125 (10): 1288-1303.
Lassoued M.A., Khemiss F., Sfar S. (2011) Comparative study of two in vitro
methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus Everted
Gut Sac. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 14(1): 117-127.
Li X.Q., Andersson T.B., Ahlström M., Weidolf L. (2004) Comparison of
inhibitory effects of the proton pump-inhibiting drugs omeprazole, esomeprazole,
lansoprazole, pantoprazole, and rabeprazole on human cytochrome P450 activities.
Drug Metabolism and Disposition 32(8): 821-827.
Li Y.H., Song, M., Tai-Jun Hang T.J. (2015) Development of an LC−MS/MS
method for determination of 2-oxo-clopidogrel in human plasma, Journal of
Pharmaceutical Analysis 5(1): 12-17.
Lins R., Broekhuysen J., Necciari J., Deroubaix X. (1999) Pharmacokinetic
profile of 14C-labeled clopidogrel. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 25(Suppl
2): 29-33.
Lindegardh N., Davies G.R., Tran T.H., Farrar J., Singhasivanon P., Day N.P.,
White N.J. (2006) Rapid Degradation of Oseltamivir Phosphate in Clinical Samples
by Plasma Esterases, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(9): 3197–3199.
Lusis A.J., Paigen K. (1977) Relationships between levels of membrane-
bound glucuronidase and the associated protein egasyn in mouse tissues. The Journal
of Cell Biology 73: 728-735.
Lu W.J., Ferlito V., Xu C., Flockhart D.A., Caccamese S. (2011) Enantiomers
of naringenin as pleiotropic, stereoselective inhibitors of cytochrome P450 isoforms.
Chirality 23(10): 891-896.
Mudie D.M., Murray K., Hoad C.L., Pritchard S.E., Garnett M.C., Amidon
G.L., Gowland P.A., Spiller R.C., Amidon G.E., Marciani L. (2014) Quantification of
Gastrointestinal Liquid Volumes and Distribution Following a 240 mL Dose of Water
in the Fasted State. Molecular Pharmacology 11(9): 3039-3047.
Müller I., Besta F., Schulz C., Massberg S., Schönig A., Gawaz M. (2003)
Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris
scheduled for elective coronary stent placement. Thrombosis and Haemostasis 89
(5):783–787.
Nissen S.E. (2011) Pharmacogenomics and clopidogrel: irrational exuberance?
Journal of the American Medical Association, 306 (24): 2727-2728.
Pahomi G., Corlan G., Anuta V., Sandulovici R.C., Mircioiu I. (2012) Study
of the influence of bile salts and lecithin on distribution of ketoconazole between
plasma and methylene chloride. Farmacia 60(6): 809-821.
Peng L., Cui J.Y., Yoo B., Gunewardena S.S., Lu H., Klaassen C.D., Zhong
X.B. (2013) RNA-Sequencing Quantification of Hepatic Ontogeny of Phase-I
Enzymes in Mice. Drug Metabolism and Disposition 41(12): 2175–2186.
RCP (Rezumatul Caracteristicilor Produsului) Clopidogrel Medana 75 mg
comprimate filmate, versiune revizuita Martie 2012.
RCP (Rezumatul Caracteristicilor Produsului) Plavix, revizuit 26 Iulie 2013.
Shuldiner A.R., O'Connell J.R., Bliden K.P., Gandhi A., Ryan K., Horenstein
R.B., Damcott C.M., Pakyz R., Tantry U.S., Gibson Q., Pollin T.I., Post W., Parsa A.,
Mitchell B.D., Faraday N., Herzog W., Gurbel P.A. (2009) Association of
cytochrome P450 2C19 genotype with the antiplatelet effect and clinical efficacy of
clopidogrel therapy. Journal of the American Medical Association 302(8): 849-857.
Silvestro L., Gheorghe M., Iordachescu A., Ciuca V., Tudoroniu A., Rizea
Savu S., Tarcomnicu I. (2011) Development and validation of an HPLC-MS/MS
method to quantify clopidogrel acyl glucuronide, clopidogrel acid metabolite, and
clopidogrel in plasma samples avoiding analyte back-conversion. Analytical and
Bioanalytical Chemistry 401(3): 1023-1034.
Silvestro L., Gheorghe M.C., Tarcomnicu I., Savu S., Savu S.R., Iordachescu
A., Dulea C. (2010) Development and validation of an HPLC–MS/MS method to
determine clopidogrel in human plasma. Use of incurred samples to test back-
conversion. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications
878(30): 3134–3142.
Stass H., Kubitza D., Moller J.G. and Delesen H. (2005) Influence of activated
charcoal on the pharmacokinetics of moxifloxacin following intravenous and oral
administration of a 400 mg single dose to healthy males. British Journal of Clinical
Pharmacology 59(5): 536-541.
Sultanpur C.M., Satyanarayana S., Reddy N.S., Kumar K.E, Kumar S. (2010)
Drug–drug Interaction between Pravastatin and Gemfibrozil (Antihyperlipidemic)
with Gliclazide (Antidiabetic) in Rats. Journal of Young Pharmacists 2(2): 152 -155.
Taft D.R. (2009) Drug excretion, in Pharmacology: Principles and Practice
(Hacker M, Messer WS II and Bachmann KA eds.), pp 175-199, Academic Press
(Elsevier), Massachusetts.
Taubert D., Kastrati A., Harlfinger S., Gorchakova O., Lazar A., von
Beckerath N., Schömig A., Schömig E. (2004) Pharmacokinetics of clopidogrel after
administration of a high loading dose. Thrombosis and Haemostasis 92(2): 311-316.
Tegelstrom H., Ryttman H. (1981) Sex differences and androgenic regulation
of esterases in the house mouse. Herreditas 94:189-201.
Tirkkonen T., Heikkilä P., Huupponen R., Laine K. (2010) Potential CYP2C9-
mediated drug-drug interactions in hospitalized type 2 diabetes mellitus patients
treated with the sulphonylureas glibenclamide, glimepiride or glipizide. Journal of
Internal Medicine 268(4): 359-366.
Topol E.J.; Schork N.J. (2011) Catapulting clopidogrel pharmacogenomics
forward. Nature Medicine 7(1): 40-41.
Tubic M., Wagner D., Spahn-Langguth H., Bolger M.B., Langguth P. (2006)
In silico modeling of non-linear drug absorption for the P-gp substrate talinolol and of
consequences for the resulting pharmacodynamic effect. Pharmaceutical Research
23(8): 1712-1720.
Tuffal G., Roy S., Lavisse M., Brasseur D., Schofield J., Delesque Touchard
N., Savi P., Bremond N., Rouchon M.C., Hurbin F., Sultan E. (2011) An improved
method for specific and quantitative determination of the clopidogrel active
metabolite isomers in human plasma. Thrombosis and Haemostasis 105(4): 696-705.
Vertzoni M., Diakidou A., Chatzilias M., Soderlind E., Abrahamsson B.,
Dressman J.B., Reppas C. (2010) Biorelevant media to simulate fluids in the
ascending colon of humans and their usefulness in predicting intracolonic drug
solubility. Pharmaceutical Research 27(10): 2187-2196.
Wang X., Mondal S., Wang J., Tirucherai G., Zhang D., Boyd R.A., Frost C.
(2014) Effect of activated charcoal on apixaban pharmacokinetics in healthy subjects,
American Journal of Cardiovascular Drugs 14(2): 147-154.
Wang Z.Y., Chen M., Zhu L.L., Yu L.S., Zeng S., Xiang M.X., Zhou Q.
(2015) Pharmacokinetic drug interactions with clopidogrel: updated review and risk
management in combination therapy, Therapeutics and Clinical Risk Management 11:
449-467.
Zhang H., Hollenberg P.F., Clopidogrel: Pharmacology, Clinical Uses and
Adverse Effects, Chapter 4 “From Mechanism to Therapeutics: Overcoming Inter-
Individual Variability in Clopidogrel Therapy”. Nova Science Publishers, New York,
2014; p121.
Zhang Y., Si D., Chen X., Lin N., Guo Y., Zhou H., Zhong D. (2007) nfluence
of CYP2C9 and CYP2C19 genetic polymorphisms on pharmacokinetics of gliclazide
MR in Chinese subjects. British Journal of Clinical Pharmacology 64(1): 67-74.
Zhu Y., Zhou J. (2013) In Vitro Biotransformation Studies of 2-Oxo-
clopidogrel: Multiple Thiolactone Ring Opening Pathways Further Attenuate Prodrug
Activation. Chemical Research in Toxicology 26: 179-190.