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를 이용한 결핵의RNA
분자생물학적 진단방법의
유용성 평가
연세대학교 대학원
임상병리학과
홍 성 룡
-
를 이용한 결핵의RNA
분자생물학적 진단방법의
유용성 평가
지도 이 혜 영 교수
이 논문을 석사 학위논문으로 제출함
년 월 일2011 7 7
연세대학교 대학원
임상병리학과
홍 성 룡
-
홍성룡의 석사 학위논문을
인준함
심사위원 인
심사위원 인
심사위원 인
연세대학교 대학원
년 월 일2011 7 7
-
감사의 말씀
이렇게 한 편의 논문과 함께 석사 졸업하기까지 결핵에
대한 과학자의 소명과 믿음을 보여주시고 기회와 용기를 주신
이혜영 교수님께 진심으로 감사드립니다 그리고 많은 가르침.
과 조언을 주신 오옥두 교수님께 김종배 교수님께 김태우, ,
교수님께 박용석 교수님께 김윤석 교수님께 이기종 교수님, , ,
께 깊이 감사드립니다.
열정의 시간을 보내고 새로운 도전을 향해 나가시는 분
자진단연구실의 방혜은 박사님 김현철 박사님 진현우 박사, , ,
개인적으로 많은 도움을 준 최연임 박사에게 감사하고 축하드
리며 꿈과 미래를 위해 도전하고 있는 분자진단연구실의 상,
정과 성현 현정과 아름에게 고마운 마음을 전합니다 또 든, .
든함을 주신 이규상 박사님 이동섭 선배님께 감사드리며 새,
로운 앞길에 성공과 축복이 있으시기 바랍니다 지금 이 시.
간 진리 탐구를 위해 젊은 날을 보내고 있을 우리학과 연구,
실의 선 후배님들의 앞날에 영광이 함께 하길 바랍니다· .
결핵 분자진단을 위해 연구하시는 엠앤디 회사의 여러
분께 감사드리며 연구에 복에 복이 함께 하시기 바랍니다, .
아버지 어머니 형과 형수 그리고 예영이와 예진이, ,
항상 사랑합니다.
년 월 홍성룡 드림2011 7
소신과 열정 그리고 역량을 가지고,
참됨을 힘쓰고 거짓없는 자세로 결실을 보이도록 하며,
뒤로 미루거나 다른 상황을 생각하지 말고 현재에 충실하자.
무실역행- ( )-務實力行
-
- i -
차 례
그림
차례·······················································································ⅲ
표
차례··························································································ⅳ
약기호표·························································································ⅴ
국문
요약·······················································································ⅵ
제 장 서론1
·····················································································
1
제 장 재료 및 방법2
······································································
7
균주 및 배양1.
········································································
7
및 추출2. DNA RNA
··································································
7
유전자와3. 16S rRNA rpo 유전자의 및B mRNA PCR
전기영동················································································10
4. 와16S rRNA rpo 의 및 전기영동B mRNA RT-PCR ·················11
5. 유전자의16S rRNA real-time PCR
····································12
6. 의16S rRNA real-time
RT-PCR···········································13
7. 의16S rRNA real-time NASBA
·············································13
제 장 결과3
·····················································································16
유전자 증폭 및 검출을 위한 및1. 16S rRNA primer
제작probe
··········································································16
과 을 이용한 및 표적2. PCR RT-PCR DNA RNA
민감도 비교
········································································21
을 이용한3. RT-PCR rpo 및 표적B mRNA 16S rRNA
민감도 비교
········································································23
결핵균 검출을 위한 과 민감도 비교4. PCR RT-PCR ········25
-
- ii -
결핵균 검출을 위한5. real-time PCR과 real-time RT-PCR
민감도
비교·········································································28
결핵균 검출을 위한 민감도6. real-time NASBA ·············30
제 장 고찰4 33
참고
문헌·······················································································36
영문
요약·······················································································43
-
- iii -
그 림 차 례
Figure 1. Schematic presentation of the NASBA
technology including molecular beacons
for real-time detection
······················································15
Figure 2. Target region of 16S rRNA gene
of Mycobacterial species
····················································18
Figure 3. Gel electrophoresis of amplicons
targeting 16S rRNA gene and 16S rRNA
····························22
Figure 4. Gel electrophoresis of amplicons
targeting rpoB mRNA and 16S rRNA
····································24
Figure 5. Gel electrophoresis of amplicons
produced by PCR and RT-PCR
················································27
Figure 6. Delta Rn values of real-time PCR
and real-time RT-PCR
····························································29
Figure 7. Signal values of 16S rRNA amplicons
produced by real-time NASBA
··············································31
-
- iv -
표 차 례
Table 1. Comparison of real-time NASBA and
other nucleic acid amplification methods ····················
6
Table 2. Forward and reverse primers of PCR,
RT-PCR, real-time PCR, real-time RT-PCR,
and real-time NASBA to analyse M. tuberculosis ······19
Table 3. Probes of real-time PCR, real-time RT-PCR
and real-time NASBA to analyse M. tuberculosis ········20
Table 4. Sensitivities of real-time NASBA and
other nucleic acid amplification methods
····················32
-
- v -
약 기 호 표
AMV : avian myeloblastosis virus
cDNA : complementary DNA
CTAB : cetyltrimethyl ammonium bromide
DEPC : diethylpyrocarbonate
DTT : dithiothretol
FAM : fluorescein amidite
M-MLV : moloney - murine leukemia virus
NASBA : nucleic acid sequence-based amplification
PCR : polymerase chain reaction
rpoB : RNA polymerase β - subunit
rRNA : ribosomal RNA
RT : reverse transcriptase
-
- vi -
국 문 요 약
를 이용한 결핵의 분자생물학적 진단방법의RNA
유용성 평가
결핵균의 검출을 위해 사용되는 세균학적 검사법은 오랜
시간이 소요되고 민감도와 특이도의 한계가 있어 최근 을PCR
이용한 핵산증폭법이 결핵검사에 많이 이용되고 있다 그러나.
현재까지 사용되고 있는 결핵검사용 핵산증폭법은 대부분 DNA
를 표적으로 하고 있다 그런데 같은 수의 세포일 경우 특정.
유전자의 보다 가 더 많은 수로 존재한다 따라서DNA RNA . RNA
를 표적으로 하는 핵산증폭법의 민감도가 더 높을 수 있다.
또한 복제과정을 응용하여 개발된 보다 전사된 로DNA PCR RNA
부터 를 합성하고 합성된 로부터 많은 양의 를 다시DNA DNA RNA
전사하는 nucleic acid sequence-based amplification
을 이용한다면 결핵검사의 민감도를 더 높일 수 있을(NASBA)
것이다 이에 본 연구에서는. Mycobacterium bovis 에서 추BCG
출한 와 를 이용하여DNA RNA PCR, RT-PCR, real-time RT-PCR,
를 수행하여 및 를 표적으로 한 결핵real-time NASBA DNA RNA
검사법의 민감도를 비교하는 한편 및 를 이용한 결, PCR NASBA
-
- vii -
핵검사법의 민감도를 비교하였다 그 결과 유전자. , 16S rRNA
를 표적으로 한 의 민감도는PCR 103
및 이었고cfu/ 100 pg ,㎖
를 표적으로 한 의 민감도는16S rRNA RT-PCR 102
및cfu/ 10㎖
로 나타나 보다 를 표적으로 한 결핵검사법이 더 민pg DNA RNA
감하였다 또한. rpo 와 를 각각 표적으로 하여B mRNA 16S rRNA
을 수행한 결과RT-PCR , rpo 를 표적으로 하였을 때의 민B mRNA
감도가 105 인 반면 를 표적으로 한 의cfu/ 16S rRNA RT-PCR㎖
민감도가 102 로 나타나 의 표적에 따라 민감도가 달cfu/ RNA㎖
라짐을 알 수 있었다 이어 를 표적으로 한 과. 16S rRNA RT-PCR
형광 표지 를 이용한 및probe real-time RT-PCR real-time
를 수행하여 핵산증폭법에 따른 민감도를 비교한 결과NASBA ,
에서 과 의 민감real-time RT-PCR 10 fg real-time NASBA 1 fg
도를 확인하였다 따라서 를 표적으로. RNA real-time RT-PCR,
등을 이용하여 결핵균을 검출할 경우 보다real- time NASBA
민감한 결핵검사가 가능할 것으로 사료된다.
핵심되는 말 결핵균 결핵검사 핵산증폭검사: , , , RNA, 16S
유전자rRNA , real-time RT-PCR, real-time NASBA
-
- 1 -
제 장 서 론1
결핵 은 인형 결핵균(tuberculosis) (Mycobacterium
tuberculosis 에 의하여 주로 폐 등 호흡기에 감염되는 전염)
성 질환이다1. 결핵균은 비운동성의 호기성 항산균으로 소수성
의 두꺼운 세포벽 과 긴 세대 시간 시간( 10 ) (17 18 )∼ ㎚ ∼
의 특성으로 유해 환경 및 숙주 방어 기전에 대한 저항력이
있으며 휴면 상태로 장기간 생존할 수 있다2.
결핵균의 병원성은 면역기전을 극복하고 증식하는 정도
와 면역 반응의 정도 즉 균의 침습력과 숙주의 감수성에 의,
한 것으로 폐에서 육아종을 형성하여 잠복하다 면역 반응이
약화되었을 때 활동성 결핵으로 발전한다3 활동성 결핵 환자.
는 기침 재채기로 객담 비말과 함께 결핵균을 배출하며 이를,
다른 사람이 소량 개 만 흡입하여도 감염되고(1 10 )∼ 4,5, 치료
되지 않은 환자는 매년 명의 다른 사람에게 전염시킬10 15∼
수 있다6.
세계 인구의 정도가 결핵균에 감염되어 있을 것으로1/3
추정하며 년 만 명의 새로운 결핵 환자가 발생하고, 2009 940
만 명이 결핵으로 사망하고 있다170 7,8 특히 아프리카와 아시.
아의 저개발 국가에서 높은 결핵 유병률을 나타내고 산업화된
국가에서도 결핵 재출현 양상을 나타내고 있으며 최근 인간
면역결핍 바이러스 의 창(Human immunodeficiency virus, HIV)
-
- 2 -
궐과 함께 다제 광역 내성 결핵/ (multi/ extensively drug
의 출현으로 결핵의 위resistant tuberculosis, MDR/XDR-TB)
험이 급격히 증가하고 있다6,7.
이러한 결핵에 대하여 세계보건기구는 년 세계 결1993 ‘
핵 비상 을 선포하여 결핵(Global Tuberculosis Emergency)’
이 인류 건강을 심각히 위협하고 있음을 알리고 년 유엔, 2000
과 함께 새천년 발전 목표‘2015 (Millenium Development
를 정하고 전 세계의 결핵 발병률과 사망률을 낮추기Goals)’
위하여 세계적인 대응을 진행하고 있다7 이를 위해. 결핵의 치
료와 관리의 향상 및 정확한 진단을 위해 노력하고 있으며 결
핵균에 대한 신속하고 민감한 검사법이 요구되고 있다9.
결핵의 검사실 진단 방법으로 세균학적 검사법인 항산균
도말 검사 항산균 배양 검사법이 널리 쓰이고 있으며 최근, ,
분자생물학적 검사법 또한 이용되고 있다10 전통적으로 이용.
되는 항산균 도말 검사는 저렴하고 신속하게 검사 결과를 얻
을 수 있어 세계적으로 널리 사용되고 있지만 결핵균 수가, 5
×103 4∼ 개 이상 있어야 검출할 수 있어 배양검사에 비해 민감
도가 낮으며 결핵균 이외의 항산균을 구분할 수 없다는 제한
점이 있다11-13. 이에 비하여 배양 검사는 결핵균이 101 2∼ 개 있
어도 검출할 수 있고 특이도가 높은 장점이 있으나 증식의,
특성상 오랜 시간 주 주 이 소요되어 신속한 결핵 진단(4 8 )∼
에 한계가 있다14,15.
이에 보다 신속하고 정확한 검사를 위해 분자생물학적
-
- 3 -
방법인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR),
실시간 중합효소연쇄반응 등으로 결핵균의- (real- time PCR)
를 확인하는 핵산증폭 검사가 개발되고 있다DNA15-17. 대표적인
분자생물학적 방법인 은 검체 의 특이 부위를PCR DNA 235개 이
상 증폭하여 이를 전기영동으로 확인하여18도말 검사 및 배양
검사에 비해 당일 내로 빠르고 정확한 결과를 제공할 수 있으
나 방법상 숙련도가 필요하고 증폭산물로 인한 핵산 진, DNA
단 검사 환경의 오염으로 위양성 결과를 유발하는 단점이 있
다19-21 이에 보다 편리하고 안전한 검사를 위해 형광 염료를.
표지한 특이 를 이용하여 증폭산물을oligonucleotide probe
실시간 확인할 수 있는 이 사용되고 있다real-time PCR 22.
결핵의 분자생물학적 검사에는 주로 를 이용하여DNA IS
염기서열6110 23,24, 유전자 부위16S ribosomal RNA (rRNA)
25,26 유전자, 16S - 23S rRNA ITS (internal transcribed
부위spacer) 27,28 등이 사용되고 있다 이 중 유전자. 16S rRNA
는 모든 원핵 세포에 상동하게 존재하며 보존된 부위와 다양
한 부위로 구성된 염기서열이 대체로 잘 밝혀져 있어 균의 검
출을 위한 분자생물학 연구에 일반적으로 이용되고 있다29,30.
이와 함께 결핵균의 유전자를 이용한 검출에 대하여16S rRNA
연구되고 있으며31 상용화되고 있다17, 19.
핵산증폭 검사를 위해 와 함께 또한 이용 가능하DNA RNA
며 특히 는 리보솜의 필수 성분으로 세포 내에 보다rRNA DNA
많이 존재(103 4∼ 하고 보다 안정하며 전) messenger RNA (mRNA)
-
- 4 -
체 의 약 를 차지하여RNA 80%32세균의 연구에 사용되고 있으며
마이코박테리아의 연구에도 이용되고 있다31, 33-34
.
를 확인할 수 있는 핵산증폭법인 역전사중합효소연쇄RNA
반응 은(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) complementary
를 만든 후 로 증폭하여 전기영동으로 증폭산물DNA (cDNA) PCR
을 확인하는 방법으로 특이 를 이용하여 실시간으로도probe
확인할 수 있다 그러나 에서 로 만들어야하는 방법상. RNA cDNA
번거로움이 있다 이에 반해 일정한 온도 조건 에서. (41 ) AMV℃
와 를 이용reverse transcriptase RNase H, T7 RNA polymerase
하여 증폭산물을 확인할 수 있는 핵산염기서열기반증폭법RNA
(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA 은 를 표) RNA
적으로 하는 핵산증폭에 보다 편리하고 유용한 장점이RT-PCR
있다35,36 (Table 1).
는 분 이내에NASBA 90 109-12개의 산물을 증폭하여RNA
보다 편리하고 민감하며RT-PCR 최근 시약이 상용화됨에NASBA
따라 를 이용한RNA 바이러스 및 세균의 검출에 사용될 수 있
다 또한 형광 염료를 표지한 특이 를. molecular beacon probe
사용한 실시간 핵산염기서열기반증폭법- (real-time NASBA 으로)
실시간 정량 확인이 가능하며37,38 이를 이용하여 인간 면역결,
핍 바이러스 형 간염 바이러스 인플루엔자 바(HIV), B (HBV), A
이러스 등의 연구에 이용되고 있다39-41.
이에 본 연구에서는 결핵균 검출을 위해 Mycobacterium
bovis 에서 추출한 와 를 이용하여BCG DNA RNA PCR, RT-PCR,
-
- 5 -
를 수행하여 및 를real-time RT-PCR, real-time NASBA DNA RNA
표적으로 한 결핵검사법의 민감도를 비교하는 한편 및, PCR
를 이용한 결핵검사법의 민감도를 비교하였다NASBA .
-
- 6 -
Table 1. Comparison of real-time NASBA and other nucleic
acid amplification methods
Target DNA RNA
Methods
Properties
PCR,
Real-time
PCR
RT-PCR,
Real-time
PCR
NASBA,
Real-time
NASBA
Amplification
conditionThermal cyclic Isothermal
Required
enzyme1 2 3
Denaturing
AgentHeat RNase H
-
- 7 -
제 장 재료 및 방법2
균주 및 배양1.
Mycobacterium bovis 와BCG (Pasteur 1173P2) M.
smegmatis 를 액체배지(ATCC 25855) Middlebrook 7H9 (Becton
에서 진탕 배양하여Dickinson, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)
사용하였으며 대조군으로, Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Escherichia coli 를(ATCC 25922) brain heart
액체배지infusion (BHI) (Becton Dickinson, Franklin Lakes,
에서 진탕 배양하여 사용하였다NJ, U.S.A.) .
및 추출2. DNA RNA
배양한 균주는 McFarland Standard (bioMérieux,
로 균수 를 확Durham, NC, U.S.A.) (colony forming unit, cfu)
인 표준번호( 3, 9 × 108 하고 생리 식염수cfu/ ) (0.85%㎖
로 배 단계 희석sodium chloride, NaCl) 10 (1.2 × 108 1.2∼
× 101 하여cfu/ ) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide)㎖
추출법으로 추출 또는 추출법으로 추출하여DNA TRIzol RNA
사용하였다42-45.
-
- 8 -
추출법으로 를 추출하기 위해 배양한 균주를CTAB DNA
에서 분 간 원심분리하여 상층액을 제거하였다10,000 ×g 10 .
침전된 균주에 TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM
를 넣고Ethylene diamine tetra-acetic acid, EDTA) 400 ㎕
재부유하여 에서 시간 동안 균을 불활성화하였다 이후80 1 .℃
10 / lysozyme (Roche, Penzburg, Upper Bavaria,㎎ ㎖
를 넣고 에서 시간 반응하였다Germany) 50 37 1 . 10%㎕ ℃
sodium dodecyl sulphate (SDS, Duksan, Ansan, Korea) 70 ㎕
와 15 / proteinase K (Roche, Penzburg, Upper Bavaria,㎎ ㎖
를 넣고 에서 분 간 반응한 후Germany) 5 65 10 5 M NaCl㎕ ℃
와(Duksan, Ansan, Korea) 100 10% CTAB / 0.7 M NaCl 100㎕
를 넣고 혼합물이 우윳빛으로 될 때까지 잘 섞어준 후 65㎕ ℃
에서 분 간 반응하였다10 . 24:1(v/v) chloroform / isoamyl
을 넣고 잘 섞어준 후 에서alcohol 750 4 , 12,000 ×g 5㎕ ℃
분 간 원심분리하였다 상층액을 새로운. 1.5 ㎖
에 옮겨 을 넣고microcentrifuge tube isopropanol 450 DNA㎕
침전물이 생길 때까지 잘 섞어 준 후 에서4 , 12,000 ×g 30℃
분 간 원심분리하였다 상층액을 제거하고. 70% ethanol 500
를 넣고 에서 분 간 원심분리하여4 , 12,000 × g 10㎕ ℃
을 제거하고 침전된 를 상온에서 건조하였다 건조ethanol DNA .
된 는 를 넣고 재부유하여DNA TE buffer 400 10 /㎕ ㎎ ㎖
를 넣고 에서 시간 반응하였다 추출된RNase A 1 37 1 .㎕ ℃
는 에서 전기DNA 1%(w/v) Tris-Borate EDTA (TBE) agarose gel
-
- 9 -
영동 또는 InfiniteⓇ200 (Tecan Systems, San Jose, CA,
으로 정량 측정 후 에 보관하여 사용하였다 이U.S.A.) -70 .℃
후 과 을 수행하기 위하여PCR real-time PCR 1.2 × 108
1.2∼
× 101
의 배양 균주에서 추출한 와cfu/ DNA 1.2 × 10㎖8cfu/
의 배양 균주에서 추출하여 까지 배 단계100 ng 1 fg 10㎖ ∼
희석한 를 이용하였다DNA .
추출법으로 를 추출하기 위해 배양한 균주를TRIzol RNA
에서 분 간 원심분리한 후7,500 ×g 20 2 microcentrifuge㎖
에 옮겨 에서 분 간 원심분리하여 상층액을tube 12,000 ×g 10
제거하였다 침전된 균주에. TRIzol (Invitrogen, Carlsbad,
와 를 넣고 상온에서 분CA, U.S.A.) 1 0.2 glass bead 5㎖ ㎜
간 반응하였다. Precellys 24 (Bertin Technologies, bis
에서 초Avenue Ampèere, Montigny-le-Bretonneux, France) 60
간 회 하고 상온에서 분 간 반응한 후4 bead-beating 20
를 넣고 잘 섞어 상온에서 분 간 반응한chloroform 200 3㎕
후 에서 분 간 원심분리하였다 상층액 층4 , 12,000 ×g 15 .℃
을 새로운 에 옮겨1.5 microcentrifuge tube isopropanol㎖
을 넣고 잘 섞어 상온에서 분 간 반응한 후500 10 4 ,㎕ ℃
에서 분 간 원심분리하였다 상층액을 제거하고12,000 ×g 10 .
75% ethanol / diethylpyrocarbonate (DEPC, Bioseum, Seoul,
를 넣고 에서 분 간 원심Korea) water 1 4 , 7,500 ×g 5㎖ ℃
분리하여 을 제거하고 침전된 를 상온에서 건조하ethanol RNA
였다 건조된 는 를 넣어 재부유하여. RNA DEPC water 20 4㎕ ℃
-
- 10 -
에서 시간 반응하였다 추출된 를 전기영동 또는 정량1 . RNA
측정 후 에 보관하여 사용하였다 이후 과-70 . RT-PCR℃
를 수행하기 위하여real-time RT-PCR, real-time NASBA 1.2 ×
108
1.2 × 10∼1
의 배양 균주에서 추출한 와cfu/ RNA 1.2㎖
× 108
의 배양 균주에서 추출하여 까지cfu/ 100 ng 1 fg㎖ ∼
배 단계 희석한 를 이용하였다10 RNA .
유전자와3. 16S rRNA rpo 유전자의 및B mRNA PCR
전기영동
추출한 를 주형으로 증폭을 위한 시약 및 주형DNA DNA
의 조성으로DNA 2.5 mM dNTP 2 ,㎕ Taq polymerase 0.2 ,㎕
10 × Taq buffer 2 , 10 µM forward primer 1 , 10 µM㎕ ㎕
멸균된 증류수 와 각각의 주형reverse primer 1 , 8.8㎕ ㎕
로 총 의 반응용액을 사용하였다DNA (100 ng 1 fg) 20 .∼ ㎕
유전자와16S rRNA rpo 유전자 특이 와B mRNA forward primer
를 사용하였으며 증폭반응을 위한reverse primer PCR thermal
는cycler GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems,
을 사용하였다 반응조건으로Foster city, CA, U.S.A.) . 94℃
에서 분 간 반응한 후 에서 초 에서 초5 94 30 , 58 30 , 7℃ ℃
에서 초의 반응주기를 주기 시행하고 에서 분2 30 40 72 7℃ ℃
-
- 11 -
간 반응하여 산물을 증폭하였다PCR .
증폭산물 를5 2.5% TBE agarose gel (Bioneer,㎕
과 를 사용하여Daejeon, Korea) 0.5 × TBE buffer 280 V, 25
분 간 전기영동하였다 이후. 0.2 mM ethidium bromide (EtBr)
용액에서 분 간 염색하고 멸균된 증류수에서 분 간 탈10 , 20
색하여 Gel-doc XR System (Bio-rad Laboratories, Hercules,
로 유전자와CA, U.S.A.) 16S rRNA rpo 유전자의 증폭산B mRNA
물을 확인하였다 증폭산물의 크기를 확인하기 위해. 25/100
를 함께 전기영동하bp DNA ladder (Bioneer, Daejeon, Korea)
였다.
와4. 16S rRNA rpo 의 및 전기영동B mRNA RT-PCR
추출한 를 주형으로 제작을 위한 시약 및 주형RNA cDNA
의 조성으로RNA 2.5 mM dNTP 4 , 10 µM reverse primer 1㎕
와 각각의 주형 로, DEPC water 3 RNA (100 ng 1 fg)㎕ ㎕ ∼
총 의 반응용액을 사용하였다 유전자와13 . 16S rRNA㎕ rpoB
유전자 특이 와 를 사용하reverse primer PCR thermal cycler
였다 반응조건으로 에서 분 간 반응한 후. 65 5 0.1 M DTT 2℃
를, M-MLV reverse transcriptase 1 , 5 × buffer 4㎕ ㎕ ㎕
첨가하여 총 의 반응용액을 에서 분 에서20 25 10 , 37㎕ ℃ ℃
분 에서 분 간 반응하여 를 제작하였다 이50 , 70 15 cDNA .℃
-
- 12 -
를 주형으로 하여 방법에서와 같이 산물을 증폭cDNA PCR PCR
하였다.
증폭산물을 와 함께 전기영동한 후 염색DNA ladder EtBr
및 탈색하여 Gel-doc XR System (Bio-rad Laboratories,
로 와Hercules, CA, U.S.A.) 16S rRNA rpo 의 증폭산물을B mRNA
확인하였다.
유전자의5. 16S rRNA real-time PCR
유전자 특이 와16S rRNA forward primer reverse
와 를 표지한 를 사용하였으며primer, FAM dye BHQ1 dye probe
와real-time PCR premix ROX (6-carboxy-X-rhodamine)
는reference dye Prime Ex Taq (Takara Bio, Otsu, Shiga,
을 사용하였다 는Japan) . Real-time PCR thermal cycler 7500
Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster
을 사용하였다city, CA, U.S.A.) .
추출한 를 주형으로 하여 증폭을 위한 시약 및DNA DNA
주형 의 조성으로DNA 2 × real-time PCR premix 10 , ROX㎕
reference dye 0.4 , 10 µM forward primer 1 , 10 µM㎕ ㎕
멸균된 증류수reverse primer 1 , 10 µM probe 0.5 ,㎕ ㎕
와 각각의 주형 로 총 의 반2.1 DNA (100 ng 1 fg) 20㎕ ∼ ㎕
응용액을 사용하였다 에서. 7500 Fast Real-Time PCR System
-
- 13 -
반응조건으로 에서 분 간 반응한 후 에서 초95 10 95 15 ,℃ ℃
에서 초의 반응주기를 주기 시행하였다55 30 40 . 7500 Fast℃
Real-Time PCR software (Applied Biosystems, Foster city,
를 이용하여 매 반응주기마다 산물CA, U.S.A.) real-time PCR
의 형광 신호를 자동 수집하여 유전자의16S rRNA real-time
결과를 분석하였다PCR .
의6. 16S rRNA real-time RT-PCR
유전자 특이 와16S rRNA forward primer reverse
를 표지한 을 사용하였으며primer, dye probe, Prime Ex Taq
을 사용하였다7500 Fast Real-Time PCR System .
추출한 를 주형으로 방법에서와 같이 를RNA RT-PCR cDNA
제작하고 이 를 주형으로 하여 을 시행하, cDNA real-time PCR
여 를 이용하여 매 반응주7500 Fast Real-Time PCR software
기마다 산물의 형광 신호를 자동 수집하여real-time PCR 16S
의 결과를 분석하였다rRNA real-time PCR .
의7. 16S rRNA real-time NASBA
유전자 특이 염기16S rRNA T7 RNA polymerase promotor
-
- 14 -
서열이 포함된 와 과forward primer reverse primer, FAM
를 표지한 를 사용하였으며Dabcyl dye molecular beacon probe
는real-time NASBA premix NucliSens EasyQ Basic kit V2
를(bioMérieux, Chemin de l'Orme, Marcy-l'Etoile, France)
사용하였다 는. Real-time NASBA isothermal cycler NucliSens
EasyQ Basic Incubator (bioMérieux, Chemin de l'Orme,
를 사용하였으며Marcy-l'Etoile, France) NucliSens EasyQ
Basic Analyzer (bioMérieux, Chemin de l'Orme,
를 사용하였다Marcy-l'Etoile, France) .
추출한 를 주형으로 하여 증폭을 위한 시약 및RNA RNA
주형 의 조성으로RNA reagent solution 64 , 80 mM KCl㎕
을 섞은working solution 24 , primer-beacon mixture 8㎕ ㎕
와 각각의 주형 로master mixture 5 RNA (100 ng 1 fg)㎕ ∼
총 의 반응용액을 사용하였다10 . NucliSens EasyQ Basic㎕
에서 반응조건으로 에서 분 에서 분Incubator 65 5 , 41 5℃ ℃
간 반응하였다 이후. AMV reverse transcriptase, RNase H,
가 포함된 을 첨가T7 RNA polymerase enzyme solution 2.5 ㎕
하여 총 의 반응용액을12.5 NucliSens EasyQ Basic㎕
에서 에서 시간 분 간 반응하였다Analyzer 41 2 30 .℃
NucliSens EasyQ Basic Analysis software (bioMérieux,
를 이용하여 매Chemin de l'Orme, Marcy-l'Etoile, France) 1
분마다 산물의 형광신호를 자동 수집하여real-time NASBA
의 결과를 분석하였다16S rRNA real-time NASBA (Figure 1).
-
- 15 -
Figure 1. Schematic presentation of the NASBA technology
including molecular beacons for real-time detection38.
-
- 16 -
제 장 결 과3
유전자 증폭 및 검출을 위한 및1. 16S rRNA primer
제작probe
결핵균 유전자의 특이적인 부위를 확인하기 위16S rRNA
하여 NCBI (National Center for Biotechnology Information)
에서 마이코GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
박테리아 종별 특이 부분이 있는 유전자 부위를 증16S rRNA
폭하기 위한 와 를 제작하였으forward primer reverse primer
며 이를 이용하여 유전자 및(Figure 2), 16S rRNA 16S rRNA
를 표적으로 한 PCR, RT-PCR, real-time PCR, real-time
를 수행하였다 이와 함께 의 표적에 따른 민감도를RT-PCR . RNA
비교하기 위하여 결핵균 rpo 유전자 부위를 증폭하기B mRNA
위한 와 를 제작하였으며 이를forward primer reverse primer ,
이용하여 rpo 및 를 표적으로 한 을 수B mRNA 16S rRNA RT-PCR
행하였다.
또한 를 표적으로 하여 를 이용한 민RNA real-time NASBA
감도를 비교하기 위하여 결핵균 유전자 부위를 증폭16S rRNA
하기 위한 에 로 증폭 가능하도록forward primer NASBA T7 RNA
염기서열이 포함하여 를polymerase promotor forward primer
제작하였으며 이를 이용하여 를 표적으로 한, 16S rRNA
-
- 17 -
를 수행하였다real-time NASBA (Table 2).
과 로 증폭산물을 검출하Real-time PCR real-time RT-PCR
기 위해 결핵균 유전자의 특이적인 부위를 이용하여16S rRNA
말단에 를 표5’ FAM (6-carboxy- fluorescein) reporter dye
지하고 말단에3’ BHQ1 (black hole quencher 1) quencher
를 표지하여 를 제작하였으며 이를 이용하여dye probe , 16S
유전자를 표적으로 한 과 를 표적rRNA real-time PCR 16S rRNA
으로 한 을 수행하였다real-time RT-PCR .
또한 로 증폭산물을 검출하기 위해 결핵real-time NASBA
균 유전자의 특이적인 부위를 이용하여 과16S rRNA 5’ 3’
말단에 을 형성할 수 있는 를 추가beacon-shape arm sequence
하였다 그리고 말단에 를 표지하고. 5’ FAM reporter dye 3’
말단에 를 표지하여Dabcyl quencher dye molecular beacon
를 제작하였으며 이를 이용하여 를 표적으로probe , 16S rRNA
한 를 수행하였다 모든 와real-time NASBA (Table 3). primer
는 주문제작probe, molecular beacon probe (Genotech,
하여 사용하였다Daejeon, Korea) .
-
-18-
Figure2.Targetregionof16SrRNAgeneofMycobacterialspecies.
ArrowsindicateforwardandreverseprimersequencesforamplificationofDNAfragments
(Ampliconsize:124bp).Redboxindicatespolymorphicregionofthe16SrRNAthatisgoodfor
speciesdifferentiationofmycobacteria.
-
-19-
Table2.ForwardandreverseprimersofPCR,RT-PCR,real-timePCR,real-timeRT-PCR,and
real-timeNASBAtoanalyseM.tuberculosis
Methods
Target
Oligonucleotides(5'
3')
→Amplicon
Size
PCR,RT-PCR,
real-timePCR,
real-timeRT-PCR
16SrRNA
F:CTTCGGGATAAGCCTGGGAAA
R:CACCCCACCAACAAGCTGATA
124bp
PCR,RT-PCR
rpoBmRNA
F:CGCTATAAGGTCAACAAGAAGCT
R:TGCCGAAGTGGTCGATGTCGT
187bp
real-timeNASBA
16SrRNA
F:[T7*]-[Extra**]-CTTCGGGATAAGCCTGGGAAA
R:CACCCCACCAACAAGCTGATA
124bp
*
T7:T7RNApolymerasepromotorsequence,[AATTCTAATACGACTCACTATAGGG]
**Extra:Extrapurineresidues,[AGAAGG]
-
-20-
Table3.Probesofreal-timePCR,real-timeRT-PCRandreal-timeNASBAtoanalyseM.
tuberculosis
Methods
Oligonucleotides(5'
3')
→Size
Real-timePCR,
real-timeRT-PCR
[FAM]-ACGGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGC-[BHQ1]
30bp
Real-timeNASBA
[FAM]-[5'Arm*]-TAAAGCGCTTTCCACCACAAGACA-[3'Arm**]
-[Dabcyl]
24bp
* 5'Arm:5'armsequenceforbeacon-shapeformation,[CGATCG]
**3'Arm:3'armsequenceforbeacon-shapeformation,[CGATCG]
-
- 21 -
과 을 이용한 및 표적 민감도2. PCR RT-PCR DNA RNA
비교
와 표적에 따른 결핵균의 검출 민감도를 비교하DNA RNA
기 위하여 배양된 M. bovis 를BCG 1.2 × 108 1.2 × 10∼ 1
까지 배 단계 희석하여 와 를 추출하고 이를cfu/ 10 DNA RNA ,㎖
이용하여 각각 과 을 수행하였다 이를 위하여 결핵PCR RT-PCR .
균의 유전자 부위를 증폭하기 위한16S rRNA forward primer
와 를 사용하였다reverse primer .
각각의 증폭된 산물을 로 전기영동2.5% TBE agarose gel
하여 확인한 결과 를 표적으로 한 유전자의, DNA 16S rRNA PCR
증폭산물은 108 10∼ 3 까지의cfu/㎖ M. bovis 에서 확BCG DNA
인하였으며 를 표적으로 한 의 방법으로, RNA 16S rRNA RT-PCR
는 108 10∼ 2 까지의cfu/㎖ M. bovis 에서 증폭산물을BCG RNA
확인하였다 (Figure 3).
이를 통해 배양된 균주를 단계 희석하여 추출한 를RNA
표적으로 한 의 민감도가 더 높음을 알 수 있었으며RT-PCR ,
이후의 결핵균 검출 비교를 위해 를 표적으로 사용하였다RNA .
-
- 22 -
Figure 3. Gel electrophoresis of amplicons targeting 16S
rRNA gene and 16S rRNA.
(A) 16S rRNA gene amplicons produced by PCR with serially
diluted M. bovis BCG DNA (108 10∼ 1 cfu/ ) and (B) 16S㎖
rRNA amplicons produced by RT-PCR with serially diluted
M. bovis BCG RNA (108 10∼ 1 cfu/ ) were run on 2.5% TBE㎖
agarose gel.
-
- 23 -
을 이용한3. RT-PCR rpo 및 표적B mRNA 16S rRNA
민감도 비교
rpo 와 표적에 따른 결핵균의 검출 민감B mRNA 16S rRNA
도를 비교하기 위하여 배양된 M. bovis 를BCG 1.2 × 108 ∼
1.2 × 101
까지 배 단계 희석하여 를 추출하고cfu/ 10 RNA ,㎖
이를 이용하여 을 수행하였다 이를 위하여 결핵균RT-PCR .
rpo 유전자 부위를 증폭하기 위한 와B mRNA forward primer
그리고 유전자 부위를 증폭하기 위reverse primer 16S rRNA
한 와 를 사용하였다forward primer reverse primer .
각각의 증폭된 산물을 로 전기영동2.5% TBE agarose gel
하여 확인한 결과, rpo 를 표적으로 한 증폭산물B mRNA RT-PCR
은 108 10∼ 5 까지의cfu/㎖ M. bovis 에서 확인하였으BCG RNA
며 를 표적으로 한 방법으로는, 16S rRNA RT-PCR 108 10∼ 2
까지의cfu/㎖ M. bovis 에서 증폭산물을 확인하였다BCG RNA
(Figure 4).
이를 통해 배양된 균주를 단계 희석하여 추출한 의RNA
표적에 따라 민감도가 다르고 를 표적으로 한16S RNA RT-PCR
의 민감도가 더 높음을 알 수 있었으며 이후의 결핵균 검출,
비교를 위해 를 표적으로 사용하였다16S rRNA .
-
- 24 -
Figure 4. Gel electrophoresis of amplicons targeting rpoB
mRNA and 16S rRNA.
(A) rpoB mRNA and (B) 16S rRNA amplicons produced by
RT-PCR with serially diluted M. bovis BCG RNA (108 10∼ 1
cfu/ ) were run on 2.5% TBE agarose gel.㎖
-
- 25 -
결핵균 검출을 위한 과 민감도 비교4. PCR RT-PCR
마이코박테리아는 액체 배양에서 을 이루며 증clumping
식하는 특성을 갖고 있다 이로 인해 배양된. M. bovis 을BCG
1.2 × 108 1.2 × 10∼ 1 까지 배 단계 희석하여cfu/ 10㎖
및 를 추출한 결과 그 양이 일정하지 않았다DNA RNA , .
이를 통해 배양된 M. bovis 를 단계 희석하고 및BCG DNA
를 추출할 때 재현성이 낮으며 이를 이용하여 핵산증폭법RNA ,
의 민감도를 비교하는데 한계를 확인하였다.
이에 이후의 결핵균 검출을 위한 비교에 배양된 M.
bovis 를BCG 1.2 × 108 로 희석하여 와 를 추출cfu/ DNA RNA㎖
하고 정량하였으며 이를 이용하여 까지 배, 100 ng 1 fg 10∼
단계 희석하여 각각의 핵산증폭법에 사용하였다.
과 에 따른 결핵균 검출의 민감도를 비교하기PCR RT-PCR
위하여 M. bovis 에서 추출하여 배 단계 희석한 와BCG 10 DNA
를 이용하여 과 을 수행하였으며 이를 위하여RNA PCR RT-PCR ,
결핵균의 유전자 부위를 증폭하기 위한16S rRNA forward
와 를 사용하였다primer reverse primer .
각각의 증폭된 산물을 로 전기영동2.5% TBE agarose gel
하여 확인한 결과 유전자의 증폭산물은, 16S rRNA PCR 100 pg
의 M. bovis 까지 확인하였으며 의 은BCG DNA , 16S rRNA RT-PCR
의10 pg M. bovis 까지 증폭산물을 확인하였다BCG RNA
-
- 26 -
(Figure 5).
이를 통해 결핵균의 검출을 위하여 를 이용한16S rRNA
이 더 높은 민감도를 나타냄을 알 수 있었다RT-PCR .
-
- 27 -
Figure 5. Gel electrophoresis of amplicons produced by
PCR and RT-PCR.
(A) Amplicons targeting 16S rRNA gene with serially
diluted M. bovis BCG DNA (100 ng 1 fg) and (B)∼
Amplicons targeting 16S rRNA with serially diluted M.
bovis BCG RNA (100 ng 1 fg) were run on 2.5% TBE∼
agarose gel.
-
- 28 -
결핵균 검출을 위한 과5. real-time PCR real-time
민감도 비교RT-PCR
과 에 따른 결핵균 검출Real-time PCR real-time RT-PCR
민감도를 비교하기 위하여 M. bovis 에서 추출하여BCG 10 ng
까지 배 단계 희석한 와 를 이용하여1 fg 10 DNA RNA∼
과 을 수행하였다 이를 위하real-time PCR real-time RT-PCR .
여 결핵균의 유전자 부위를 증폭하기 위한16S rRNA forward
와 를 사용하였으며 와primer reverse primer FAM dye BHQ1 dye
를 표지한 를 사용하였다probe .
각각의 형광 신호를 자동 수집하여 분석한 결과, 16S
유전자의 형광 신호는 의rRNA real-time PCR 100 fg M. bovis
까지 확인하였으며 의 은BCG DNA , 16S rRNA real-time RT-PCR
의10 fg M. bovis 까지 형광 신호를 확인하였다BCG RNA
(Figure 6).
이를 통해 결핵균의 검출을 위하여 를 이용한16S rRNA
에서 의RT-PCR 10 pg M. bovis 까지 확인된 것보다BCG RNA
이 더 높은 민감도를 나타냄을 알 수 있었real-time RT-PCR
다.
-
- 29 -
Figure 6. Delta Rn values of real-time PCR and real-time
RT-PCR.
(A) Delta Rn value targeting 16S rRNA gene with serially
diluted M. bovis BCG DNA (10 ng 1 fg) and (B) Delta Rn∼
value targeting 16S rRNA with serially diluted M. bovis
BCG RNA (10 ng 1 fg) were analysed by 7500 Fast∼
Real-Time PCR software.
-
- 30 -
결핵균 검출을 위한 민감도6. real-time NASBA
를 이용한 결핵균 검출 민감도를 확인하Real-time NASBA
기 위하여 M. bovis 에서 추출하여 까지 단BCG 10 ng 1 fg∼
계 희석한 를 이용하여 를 수행하였다 이RNA real-time NASBA .
를 위하여 결핵균에 특이적인 를 증폭하기 위한16S rRNA T7
염기서열이 포함된RNA polymerase promotor forward primer
와 를 사용하였으며 와 를reverse primer FAM dye Dabcyl dye
표지한 를 사용하였다molecular beacon probe .
형광 신호를 자동 수집하여 분석한 결과 의, 16S rRNA
는 의real-time NASBA 1 fg M. bovis 까지 형광 신호를BCG RNA
확인하였다 (Figure 7).
이를 통하여 결핵균의 검출을 위하여 를 이용한16S rRNA
에서 의real-time RT-PCR 10 fg M. bovis 까지 확인된BCG RNA
것보다 의 민감도가 더 높음을 알 수 있었다real-time NASBA
(Table 4).
-
- 31 -
Figure 7. Signal values of 16S rRNA amplicons produced by
real-time NASBA.
(A) Signal values of 16S rRNA amplicons produced by
real-time NASBA in the presence of serially diluted M.
bovis BCG RNA (10 ng 1 fg) and (B) Signal values of∼
negative control were analysed by NucliSens EasyQ Basic
Analysis software.
-
- 32 -
Table 4. Sensitivities of real-time NASBA and other
nucleic acid amplification methods
Target DNA RNA
Methods PCRReal-time
PCRRT-PCR
Real-time
PCR
Real-time
NASBA
Sensitivity
(fg)105 102 104 101 1
-
- 33 -
제 장 고 찰4
결핵균(Mycobacterium tuberculosis 의 신속한 검출은)
결핵의 진단 및 치료를 위해 매우 중요하다 검체에서 결핵균.
을 검출하기 위한 기존의 검사법은 균의 세균학적 특성 즉,
물리적 특성 항산성 염색 현미경적 검사 등 생리적 특성( , ),
특정 배지에서의 성장 등 또는 생화학적 특성 세포벽의 지( ), (
질 조성 등 에 대한 분석을 바탕으로 한다 이러한 검사법은) .
결핵균을 검출하기 위해 검체에서 상대적으로 높은 농도의 균
이 필요하며 오랜 검사 시간이 소요된다.
이에 비해 검체에서 균으로부터 추출한 핵산의 유무를
검출하는 분자진단법 즉 핵산증폭법은 민감하고 상대적으로,
신속하다 이러한 핵산증폭법으로 를 검출하기 위한 과. DNA PCR
을 이용하고 있다 각각의 방법은 증폭을 위한real-time PCR .
온도조건 및 효소의 조건이 다르며 다양한 방법으로 증폭된,
산물을 검출할 수 있다.
이러한 핵산증폭법은 세균학적 검사법을 이용한 결핵균
의 검출법에 비해 시간이 단축되고 민감도와 특이도를 개선하
여 최근 을 이용한 핵산증폭법이 결핵검사에 많이 이용되PCR
고 있다 그러나 현재까지 이용되고 있는 결핵검사용 핵산증.
폭법은 대부분 를 표적으로 하고 있다DNA .
일반적으로 같은 수의 세포일 경우 특정 유전자의 보DNA
-
- 34 -
다 가 더 많이 존재한다 급속성장기의 결핵균에서도RNA . DNA
와 가 의 비율로 존재하며 나균RNA 1:2 , (M. leprae 에서는)
개 이상의 이 존재한다2,000 ribosome46-48
따라서 결핵균의 검.
사를 위해 를 표적으로 하여 핵산증폭법을 수행한다면 민RNA
감도를 더 높일 수 있을 것이다.
최근 를 검출하기 위하여 와 를RNA NASBA real-time NASBA
이용하고 있으며 바이러스 및 세균에 대한 연구에 활용되고
있다 는 로부터 를 합성하고 이로부터 많은 양의. NASBA RNA DNA
를 다시 전사하는 방법으로 단일 온도 조건에서 수행되어RNA
기존의 보다 편리하고 민감한 증폭이 가능하다 따RT-PCR RNA .
라서 결핵균의 검사를 위해 를 표적으로 하여 를 수RNA NASBA
행한다면 더 높은 민감도를 얻을 수 있다.
이에 본 연구에서는 결핵균 검출을 위해 Mycobacterium
bovis 에서 추출한 와 를 이용하여BCG DNA RNA PCR, RT-PCR,
를 수행하여 표적에 따른real-time RT-PCR, real-time NASBA
결핵검사법의 민감도를 비교하고 및 를 이용한 결, PCR NASBA
핵검사법의 민감도를 비교하였다.
결핵균의 검출을 위해 유전자를 표적으로16S rRNA PCR
을 수행하고 를 표적으로 을 수행하였다 그 결16S rRNA RT-PCR .
과 보다 를 표적으로 한 결핵검사법이 배 민감하였, DNA RNA 10
다 또한 결핵균의 검출을 위해. RNA rpoB 와 를mRNA 16S rRNA
표적으로 을 수행하였다 그 결과RT-PCR . , rpoB 보다mRNA 16S
를 표적으로 하였을 때rRNA 103 배 민감하였으며 의 표적에RNA
-
- 35 -
따라 민감도가 달라짐을 알 수 있었다 이에 결핵균의 검. RNA
출 민감도를 비교하기 위해 를 표적으로 과16S rRNA RT-PCR
및 를 수행하였다 그 결real-time RT-PCR real-time NASBA .
과 보다 를 이용한 결핵검사법이, RT-PCR real-time RT-PCR 103
배 민감하였으며 를 이용한 결핵검사법이, real-time NASBA 104
배 민감하였다.
이를 통해 를 표적으로RNA real-time RT-PCR, real-
등을 이용하여 결핵균을 검출할 경우 보다 민감한time NASBA
결핵검사가 가능할 것으로 사료된다.
-
- 36 -
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ABSTRACT
Evaluation of Molecular technologies
by Using RNA for Tuberculosis Diagnosis
Hong, Sung Ryong
Dept. of Biomedical Laboratory Science
The Graduate School
Yonsei University
Recently, nucleic acid amplification test (NAT) such
as polymerase chain reaction (PCR), for the detection of
Mycobacterium tuberculosis (MTB) has been widely used in
tuberculosis (TB) diagnosis. Since conventional
microbiological diagnostic methods are time-consuming and
have limits of sensitivity and specificity, NAT has
improved TB diagnosis. However, most of NAT methods are
targeting DNA sequence for MTB detection, currently. In
the same number of the cells, there is more RNA than the
DNA of specific gene. So, NAT method for targeting RNA
will detect target organism with more sensitively. Also,
if use nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)
which is a transcription-based method using reverse
transcriptase, T7 RNA polymerase, and RNase H. NASBA
amplifies more than 1012 copies of single strand RNA from
the target RNA. Therefore, it can generate a better
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sensitivity for MTB detection than PCR. In this study,
the sensitivities of NAT; PCR, RT-PCR, real-time RT-PCR
and real-time NASBA were compared by using the DNA and
RNA from M. tuberculosis BCG. And, the PCR-based and
NASBA-based NAT method for MTB was tested. As a result,
the sensitivity of PCR targeting the 16S rDNA was 103
cfu/ and 100 pg, while that of RT-PCR targeting the 16S㎖
rRNA was 102 cfu/ and 10 pg. So, the RNA detection is㎖
more sensitive than DNA. And, Sensitivity of RT-PCR
targeting the rpoB mRNA and the 16S rRNA was 105 cfu/㎖
and 102 cfu/ , respectively. So, it was shown that the㎖
sensitivity can vary depending on the target RNA. Also,
real-time RT-PCR and real-time NASBA with probe targeting
the 16S rRNA was 10 fg and 1 fg, respectively. Therefore,
the results from this study seem to suggest that it is
possible to detect TB with more sensitive by using of
real-time RT-PCR and real-time NASBA targeting the RNA of
MTB.
Key words : Mycobacterium tuberculosis, Tuberculosis
diagnosis,
Nucleic acid amplification test, RNA, 16S rRNA gene,
real-time RT-PCR, real-time NASBA
