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Small RNA-seq解析
Small RNAは細胞の発生・分化やがん、心血管疾患、神経変性疾患、精神疾患、慢性炎症性疾患などの発症と進行など種々の生物学的プロセスの調節で重要な役割を果たしている。
・アダプター除去・各種トリミング・アノテーション・発現値定量・発現変動遺伝子の同定・疾患、薬剤などのデータベースとの照合 ect・・・・・
次世代シークエンサーより出力されるデータは膨大であり、有用な情報を導き出すにはそのビックデータに対し様々な解析を実行する必要がある。
コマンドラインや多くのパラメータ設定などバイオインフォマティクス知識が必要
解析のために高度なスペックのPCが必要
多くの解析ツール使用すると時間がかかる
ROSALINDとは
✔バイオインフォマティクススキルは不要 ✔高速計算サービス
✔ライフサイエンス業界向けの革新的な製品ソリューションの中で最高のものを表彰
実験設計から解釈までをパイプライン化
シークエンスデータのインポートだけで様々な結果を同時解析！
高スペックPCは不要
クラウド型で高速に計算され時間も短縮
インターネット環境があればログイン可能
✔最小限の費用で解析
ご自身でのNGS解析や受託解析等と組み合わせることでユーザーに合わせたデータ解釈を得ることが可能
解析ワークフロー
Uploding Data
ROSALINDは、サンプルの情報入力とシークエンスデータ（Fastq）のインポートを行うだけで、簡単にシークエンスデータの生物学的意義を調べることができます。
QC Check
ROSALIND は補完的かつ視覚的なQCレポートを提供します。直感的なQCグラフとコンタミネーション検出レポートを使用してサンプルの品質を確認できます。
Differential Expression Analysis
発現変動の見られたmiRNAが表示されます。ヒートマップや構造図様々なデータベースにアクセスすることで、データの意義をより深めることが可能です。
✔最小限の解析ステップで様々なデータ表示が可能です。
Uploding Data
Design a New Experimentを選択し実験名と実験内容について入力
解析内容を選択
解析内容：small RNA-seqは次世代シークエンサーより出力される生データ（FASTQ）を読み取るかすでに発現値が算出された表を読み込み解析する解析（Processed Counts）が選択できます。
またNanoString社のnCounterのパネル解析より得られたシークエンスデータ解析も可能です。
生物種とゲノムビルドを選択します。対応生物種は弊社HPにて紹介しています。
ライブラリー調整に使用した
・キットのメーカー・製品名・製品ロット
を入力します。
Uploding Data
Replicateの有無全サンプル数を入力します。
サンプルの属性を選択します。
※Replicateは反復するデータ数（n数）を意味し全サンプル中に存在するかの有無を選択します。
control
Test
n=3
n=3
Replicate 【 Yes 】
処理年齢動物モデルバッチ細胞株投与量病期健康状態表現型性別タイムコース
など様々な属性を複数組み合わせることで次の群分けの項目でスムーズに分けることができます。
Uploding Data
サンプル名と実験室内でのサンプル名の入力します。
-Sample Name：サンプル名-Laboratory Identifier：研究室でのサンプル名・番号など
Replicateの選択します。
control
Test
Uploding Data
1サンプルずつ属性に対しての情報を入力します。このメタデータは、次に出てくる群分けに不可欠です。
例）control-Test など
これまで指定したサンプルデータが表示されます。データを確認後次のステップに移ります。
Uploding Data
ドラッグアンドドロップでデータセットを作成します。前項目で作成した属性を加えることで簡単に群分けができます。もちろん、サンプルを個々に指定して群分けすることもできます。
比較のためのデータセットを作成します。
作成後次のステップに進みます。
Uploding Data
FASTQ、GZ、およびGZIPファイルに対応しています。
✔単純な生物学的な質問に答えることで、解析準備が整います。
クリックしデータを選択することでアップロードがスタートします。
Uploding Data
解析ワークフロー
Uploding Data
ROSALINDは、サンプルの情報入力とシークエンスデータ（Fastq）のインポートを行うだけで、簡単にシークエンスデータの生物学的意義を調べることができます。
QC Check
ROSALIND は補完的かつ視覚的なQCレポートを提供します。直感的なQCグラフとコンタミネーション検出レポートを使用してサンプルの品質を確認できます。
Differential Expression Analysis
発現変動の見られたmiRNAが表示されます。ヒートマップや構造図様々なデータベースにアクセスすることで、データの意義をより深めることが可能です。
✔最小限の解析ステップで様々なデータ表示が可能です。
QC Check
インポート時に設定した内容が表示されます。
解析が終了すると登録したメールアドレスに解析完了のメールが届きROSALINDのprojectに作成した実験データを閲覧できるようになります。
サンプル相関ヒートマップ
データ行、列にはサンプル間の相関値が含まれ、最も濃い青が最も強い相関を表します。
上軸の樹状図は、サンプルのクラスタリングを示します。密接に関連しているサンプル（つまり、同じReplicateグループ内のサンプル）
がプロット内で強く相関していること、および樹状図の最も近い部分であることがわかります。
バイオリンプロット
実験の各サンプルの正規化されていない遺伝子数の対数の分布を表示するために、ボックスプロットをバイオリンプロットに重ねています。
ボックスプロットは要約統計量のみをグラフ化しますが、バイオリンプロットはデータの実際の分布を示します。
QC Check
RNA分布
このプロットは、マッピングされたリードがゲノム全体でどのようにRNAタイプに分布しているかを示しています。
含まれるゲノム領域は以下のとおりです。・miRNA ・snoRNA・snRNA ・scaRNA・rRNA ・lincRNA
ect
MDSプロット
多次元尺度構成法（ＭＤＳ）プロットは、一組のオブジェクト間の近接性（すなわち、類似性または距離）のパターンの視覚的表現です。この場合は、実験内のサンプル間の発現差をプロットします。
QC Check
ファイルアップロード時に設定したサンプルを見ることができます。
生データやROSALINDで解析されたデータをサンプルごとにダウンロードできます。
注） Rawファイル（FASTQ ）は実験が分析を完了した後30日間までダウンロード有効です。
✔ ✔
QC Check
QC情報が確認できます。また、表のエクセルファイルのダウンロードが可能です。またQCの情報までは料金が発生しないので安心して解析に進むことができます。
確認できるQC情報は以下のとおりです。
・Reads サンプルに対するリードの合計数。・Q30 品質スコアが30以上の塩基の割合。この値はリード長さ全体にわたる平均であり、リードの終わりに向かってエラー率は増加します。・Reads Too Short トリミング後に短すぎたために破棄されたリード数の割合。・Bases Trimmed トリミングによって除去された塩基の数の割合。・Length Before Trimming 初期サンプルのリードの中央長・Length After Trimming トリミング後のサンプル内リードの中央長・mature miRNA 成熟マイクロRNAに対応するトリミング後リードの総数の割合
✔ここまで無料で解析できます！
✔
QC Check
解析ワークフロー
Uploding Data
ROSALINDは、サンプルの情報入力とシークエンスデータ（Fastq）のインポートを行うだけで、簡単にシークエンスデータの生物学的意義を調べることができます。
QC Check
ROSALIND は補完的かつ視覚的なQCレポートを提供します。直感的なQCグラフとコンタミネーション検出レポートを使用してサンプルの品質を確認できます。
Differential Expression Analysis
発現変動の見られたSmallRNAが表示されます。ヒートマップや構造図様々なデータベースにアクセスすることで、データの意義をより深めることが可能です。
✔最小限の解析ステップで様々なデータ表示が可能です。
Differential Expression Analysis
使用可能なユニット数（この場合28ユニット） 今回の分析で必要なユニット数
（この場合6ユニット必要）
全てのサンプルの正規化されたデータの閲覧ができます。
発現変動のあったmiRNAについて様々な視点から結果を閲覧することができます。
（比較のため2サンプル以上のデータが必要です。）
ロック解除前 ロック解除後
ロックを解除することでより詳細な実験結果を得ることができます。ロック解除には購入したユニットを使用します。
解除後は正規化データの表の閲覧・Differential Expression 結果の閲覧の選択画面に移ります。
✔
NORMALIZED EXPRESSIONでは正規化されたすべてのmiRNAの表を閲覧することができます。またカンマ区切りファイルでダウンロードも可能です。
任意のmiRNAを検索できます。
サンプル名遺伝子情報
最上列をクリックすることで表の並べ替えができます。
NORMALIZED EXPRESSION
NORMALIZED EXPRESSION
このアイコンより各miRNAの箱ひげ図を閲覧できます。Import時に設定した属性もしくはReplicateのグループ間で比較を行うことができます。
箱ひげ図の他、選択したmiRNAに対する各サンプルごとの発現量を棒グラフにしたデータを閲覧できます。
pig形式で図を保存できます。
Differential Expression Analysis
✔Differential Expression は発現変動を示すmiRNAについて詳細な結果の閲覧ができます。
発現変動のあったmiRNAリスト 選択したmiRNAの詳細結果 様々な視点からの詳細結果
✔発現変動のあったmiRNAリストではmiRNAの並べ替えやフィルターによる調節ができます。
FILTERの⊕より新たなフィルターを作成できます。フィルターは・フィルター名・上下方調整の数値・p-Adjもしくはp-Valueの値 を設定できます。APPLYをクリック後SAVE＆RUN ANALYSISで設定したフィルターが保存されます。
フィルターは作成後保存され別の解析に使用することもできます。
Differential Expression Analysis
GROUP BYクラスターによる表示に切り替えることができます。
SORT BY並べ替えの条件を変更することができます。
フィルターの条件と変動のあったmiRNA総数
現在選択しているmiRNA名
Fold ChangeとP-Value 現在選択しているmiRNAの説明
Differential Expression Analysis
虫メガネアイコンをクリックするとmiRBaseにアクセスすることができます。
✔画面下の表示では簡単な遺伝子の情報が表示されます。
ボルケーノプロット・MAプロット選択したmiRNAのプロットが大きく表示されます。
正規化リストと同様に選択したmiRNAに対して発現量の棒グラフ、箱ひげ図が表示されます。
Differential Expression Analysis
PNG、SVGファイルでダウンロードできます。
ヒートマップ選択したmiRNAに該当するレーンが赤く表示されます。
構造図選択したmiRNAの構造図を表示することができます。
Differential Expression Analysis
ROSALINDでは発現変動miRNAを様々な視点からさらに絞り込むことが可能です。
現在（19.7）下記の検索が可能です。
・予測される影響を受ける遺伝子の特定
・検証された影響を受ける遺伝子の特定
・疾患
・薬物
虫メガネアイコンを選択するとより詳細な結果を見ることができます。
Differential Expression Analysis
Differential Expression Analysis
関連する遺伝子や情報上記は疾患の詳細情報
遺伝子や疾患にかかわる高発現・低発現の総数
気になる情報をクリックすると・・・
Differential Expression Analysis
✔情報に関連し高発現もしくは低発現したmiRNAが表示されます。上図は膵がんに関連し高発現・低発現するmiRNAが色付けされされてます。
さらに気になるmiRNAをクリックすると・・・
Differential Expression Analysis
✔選択したmiRNAが他の情報にも関連していないかどうか確認できます。関連する出版物、データベースが表示されます。これらの情報をエクセルファイルで出力することができます。 さらに気になる出版物をクリックすると・・・
Differential Expression Analysis
✔関連する出版物を選択するとPubMedにアクセスし関連する論文情報を得ることができます。
Differential Expression Analysis
その他の絞り込み
【予測される影響を受ける遺伝子の特定】
生物学的検証なしにin silicoで行われた計算およびアラインメントの結果です。予測スコアとそれが由来するデータベースを見ることができます。
Differential Expression Analysis
その他の絞り込み
【検証された影響を受ける遺伝子の特定】
miRNAと遺伝子間の直接的な影響を示すin vitro生物学的アッセイの結果検証アッセイが行われた出版物にアクセスすることもできます。
Differential Expression Analysis
その他の絞り込み
【薬剤】
薬剤情報にかかわるmiRNA結果関連する出版物にアクセスすることもできます。
データの共有
ROSALINDでは先ほどまでの解析データを共有することができます。
追加費用無しですべての解析データの閲覧ができます。共有相手のメールアドレスを指定するだけなので簡単に解析データを共有でき情報交換等ができます。
ROSALINDの共有動画
・データトリミングなどの複雑なパラメータ設定なしでデータ解析の全プロセスを解析することができます。
・高スペックPCなしで解析できます。
・発現変動遺伝子の抽出だけでなく様々なアプローチでより生物学的意味のあるデータを得ることが可能です。
・ご自身でのNGS解析や受託解析等と組み合わせることでユーザーに合わせたデータ解釈を得ることが可能
同様な操作性でRNA-Seq・ChIP-Seq解析が可能です。
利用料金も共通です。
ChIP-Seq
・ヒートマップ、TSSプロットノート、ピーク分布図、FRiPスコアなどのデータの視覚化・サンプル間のピーク検出比較ベン図、Binding Heatmap、モチーフ解析、Gene Ontology term enrichment検索・ChIP-Seq-Tracksによる柔軟なピークや染色体の表示
RNA-Seq
・発現値のテーブル作成・発現変動遺伝子の抽出・ボルケーノプロット、階層クラスタリングなど多彩な解析・パスウェイ解析(WikiPathWay、KEGG（アカデミックユーザー）、REACTOME、BIOCYC）
・GENE ONTOLOGY解析・プロテインなど様々なデータベースへのアクセス。・ADVAITAとの連携
アカウントの取得は弊社HPへ 【弊社HP ROSALIND紹介ページ】
