Skizofreni Sammenhængen mellem den neuropsykiatriske sygdom og menneskets genetiske kode

Stefni Ravichandran, Kirstine Birkebæk Okkels og Amalie Bruno-Johansen 2.w Stenhus Gymnasium og HF

Indledning

Skizofreni er en psykisk sygdom i hjernen. Ca. en halv procent af den danske befolkning er ramt af denne lidelse. Man mener, at skizofreni skyldes en ubalance i det dopaminerge system. Grundet øget mængde af dopamin i de mesolimbiske baner, oplever patienten positive symptomer, hvilket er symptomer, der bliver ”lagt til” såsom halluci-nationer, vrangforestillinger og storhedsvanvid. Mangel på dopamin i det præfrontale cortex menes at være årsag til de negative symptomer, som er symptomer, der bliver ”taget fra” den syge såsom indadvendthed, manglende initiativ og energi. Derudover ses kognitive forstyrrelser som evnen til at organisere, planlægge og have overblik1. Man kender ikke den egentlige årsag til skizofreni, men man ved, at det ofte opstår i de unge år og som følge af en blanding af arvelige og miljømæssige aspekter.

Der findes i dag medicin, der kan afhjælpe symptomerne men ikke helbrede syg-dommen. Denne medicin virker typisk ved at blokere for dopaminet og har særlig god effekt over for de positive symptomer. Medicinen kan give anledning til bivirk-ninger, og der er således et klart udækket behov for at finde medicin med færre bivirkninger og bedre virkning over for især negative og kognitive symptomer1.

2. DNA-SEKVENTERING

Inden for DNA-sekventering findes der allerede flere forskellige metoder, og samtidig udvikles der hele tiden flere og mere præcise samt fuldendte sekventeringsmetoder. Udgangspunktet var Sanger-metoden, men i dag er det hovedsageligt henholdsvis Illumina- og 454-metoden, der anvendes. Da 454 er den mest komplekse (og derfor også den langsomste) metode, er den også den bedst egnede til sekventering af menneske-DNA.

Illumina sekventering:Ved Illumina, også kaldet Solexa sekventering2, fragmenteres DNA-prøven og adaptere tilføjes i hver ende. DNA-fragmenterne bliver størrelsesdefineret vha. gelelektroforese, og stykker med 200-300 basepar bliver anvendt i sekventeringen. Disse fragmenters ene ende binder sig tilfældigt til primere, som er placeret på et objektglas. Da disse DNA-stykker er enkeltstrengede, vil polymeraser danne de komple-mentære strenge, og tilsammen forme dobbeltstrengede DNA-fragmenter. Dernæst replikeres DNA ved ”bridge PCR”-metoden2, hvor DNA-stykkerne bukkes således at enderne af DNA-stykkerne alle er koblet til objektglasset, og DNA-fragmenterne på den måde danner en bro. DNA-strengene slipper hver deres ende, så enkeltstrengede DNA-stykker (dvs. ssDNA3) kommer til at stå lodret. Denne proces fortsætter til der er dannet en slags koloni af ens DNA-stykker, som består af det antal af gener, der er relevant for forskningen, og DNA’et sekventeres derefter4.

454 sekventering:For at overskueliggøre processen, kan 454-metoden opdeles i fire step5,6.

Step 1Det DNA-genom der skal undersøges, forberedes, og der etableres en samling af kopier af DNA molekyler fra den pågældende person7. DNA’et sprænges til mindre DNA-fragmenter (dog stadig dsDNA7) med en størrelse på omkring 400 til 600 basepar. ”A” og ”B” adaptere med farvestof tilsættes væsken med DNA-fragmenterne, og både en ”A” og en ”B” adapter kobles vha. et enzym til hver deres ende af hvert DNA-fragment. Fragmenterne tilkobles derefter enkeltvis på specielle dråber (såkaldte beads). Under opvarm-ning bliver hydrogenbindingerne i DNA-fragmenterne ustabile, og den dobbeltstrengede struktur ændrer sig til enkeltstrengede. Resultatet er mange ’beads’ med identiske enkeltstrengede DNA-fragmenter5.

Step 2Emulsionsvæske (dvs. en vand/olie-blanding) tilsættes reagensglasset med DNA-prøven samt enzymer. For at replikere DNA-fragmenterne, påhæftes de til en anden type beads –”micron-sized beads”. Kombina-tionen af vand og olie samt rystning af blandingen, resulterer i, at der dannes yderligere dråber (droplets) uden om beads’ne, kaldet emulsioner. PCR-teknikken ”Emulsion PCR”8 igangsættes ved, at det tilsatte enzym påvirker DNA-fragmentet i hver dråbe, til at replikere. Det fører til omkring 10 millioner kopier af DNA, som alle er koblet til beads. Beads’ne separeres fra emulsionsvæsken og renses5.

Step 3Syntese sekventering startes, og de enkeltstrengede DNA-fragmenter kopieres ved hjælp af et enzym, for på den måde at lave DNA-fragmenterne dobbeltstrengede. Polymerase sætter sig på den ene ende af de enkeltstrengede DNA-fragmenter, og påsætter enkelt-nukleotider, der er komplementære til den en-keltstrengede DNA, for at opnå starten på den dobbeltstrengede struktur. Beads’ne med DNA placeres i en plade, hvor der kun er plads til en enkelt bead pr. rum. Pladen placeres i sekventeringsmaskinen, og sekventeringen påbegyndes5.

Step 4I selve sekventeringsprocessen påsættes baser, der er komplementære til baserækkefølgen på det en-keltstrengede DNA via polymerasen. Hver gang en komplementær base tilkobles det enkeltstrengede DNA udsendes et lys, der registreres af sekventeringsmaskinen. Hver base har hver deres farve. Lysglimtet er proportionelt med antallet af ens baser der påsættes samtidigt. Dvs. at hvis der påsættes 3 komplementære baser til 3 A’er der sidder i træk på den enkeltstrengede DNA, vil det fremkaldte lys være tre gange så kraftigt som hvis der kun sad ét A. Sekventeringsmaskinen analyserer lysglimtene, og danner en oversigt over genomet5.

3. CNV’er associeret med skizofreni

Efter at det menneskelige genom nu er identificeret, er der fundet forskellige typer af kromosomforandringer, der kan associeres til psykiske sygdomme. Der kan være tale om deletioner eller duplilkationer – såkaldte CNV’er og SNP’er. Udover deletioner og duplikationer, kan de komplementære basepar sidde forkert overfor hinanden og dermed danne kromosomforandrigner.Der er fundet mange forskellige CNV’er og SNP’er (snipper), der er associeret med skizofreni, men vi har valgt at tage udgangspunkt i to højrisiko CNV’er (10-20 gange højere risiko for at udvikle skizofreni end normalt): 22q11.2 og 2p16.39.

Når man har CNV’en 19a17.2 (fiktiv), er 19 et udtryk for, hvilket kromosom, der er tale om. ”A” fortæller noget om, hvor på kromosomet, denne CNV sidder. Det kan bla. være på ”højre arm” af kromosomet og derefter fortæller ”17.2”, hvor på højre arm, CNV’et er placeret.

22q11.2 deletionen er en CNV, hvor et stykke af kromosom 22 mangler. Dette sted er betegnet q11.2 og er placeret omkring midten af kromosomet.Man har længe vidst, at patienter med 22q11.2 variationen har lidelser, der er meget karakteristiske for netop denne variation, såsom ganespalte, infektioner forårsaget af et dårligt imunforsvar og hjertefejl, som oftest opstår ved fødslen.Derudover har børn med denne CNV større risiko for at udvikle ADHD og autisme end børn uden denne CNV har. Nu er det så fundet at der også ses øget risiko for at udvikle psykiske sygdomme såsom skizofreni i ungdomsårene og frem, hvis man lider af denne CNV. 22q11.2 variationen er betegnelse for mangel på en sekvens på ca. 3.000.000 basepar på kromosom 22. Det medfører, at ca. 30-40 gener mangler. Et af disse gener er COMT, som ligger i regionen 22q11.2. Genet kan medvirke til at forklare, hvorfor der kan være øget risiko for psykiske sygdomme og hvorfor de ramte kan have adfærdsmæssige problemer9.Forskere mener også at være kommet frem til, at tabet af genet TBX1, sandsynligvis forårsager mange af de karakteristiske lidelser, der følger med CNV’en9.22q11.2 variationen bliver opdelt i mange undergrupper, da der er mange symptommæssige varianter. Ca. 1 ud af 4.000 har denne CNV og dette tal kan endda være langt højere, da det ikke er alle, der viser tegn på 22q11.2 variationen.22q11.2 variationen forekommer ofte tilfældigt i den tidlige udvikling af fosteret eller når kønscellerne dannes9. Affected people typically have no history of the disorder in their family, though they can pass the condition to their children.

CNV’en 2p16.3, hvis funktion ligger i genet NRXN 1, der koder for produktionen af proteinet Neurexin 1, som er et præsynaptisk (før synapse) protein, der hjælper neuroner til at blive limet på synapsen10. Dette præsynap-tiske protein kaldes et celleadhæsionsmolekyle11, og kan associeres med skizofreni, da NRXN1 er et gen, der fungerer i nervesystemet.Deletioner i NRXN1 er oftest forbundet med autisme, men kan relateres til skizofreni-familien. Der er lavet forsøg, hvor NRXN1 og dets meget nært beslægtede gener, NRXN2 og NRXN3 er undersøgt for CNV’er i 2.977 skizo-frenipatienter og derudover er 33.746 kontrolpersoner, fra syv forskellige europæiske befolkningsgrupper, testet. Man fandt ingen CNV’er i NRXN2 og NRXN3. Dog fandt man 66 deletioner og 5 duplikationer i NRXN1 hos skizofrenipatienterne mod henholdsvis 49 og 3 hos kontrolpersonerne.12

For nylig har man fundet frem til flere væsentlige, men også sjældne CNV’er. To eksempler er 1q21.1 og 15q13.3. Dog kender man ikke deres præcise funktion endnu. Derfor er forskere begyndt at undersøge disse CNV’er. Man har, vha. undersøgelser, fundet frem til at 45 patienter på verdensplan har CNV’en 1q21.113,14.

Det er dog svært at redegøre for, og bestemme vigtigheden af forskellige CNV’er, da skizofreni er en meget kompleks sygdom og man derfor langt fra har opdaget og/eller kortlagt alle genforskelle. Der findes ikke én genforandring, der er årsag til skizofreni, så på nuværende tidspunkt antages det, at sygdommen kan være fremkaldt af flere genforandringer, der tilsammen giver sygdommen.Da skizofreni også er en sygdom, der fremprovokeres og påvirkes af det miljø, den syge færdes og befinder sig i, kan CNV’er (samt SNP’er) derfor ikke bestemmes til at være den eneste årsag til sygdommen. Det kan tænkes, at NRXN1 virker som en antagonist, som sætter sig på receptoren således, at dopamiet ikke har mulighed for det15.

4. Museforsøg

Kendskab til CNV’er associeret med skizofreni åbner muligheden for at få ny viden om såvel sygdommen som mulig behandling af denne.Da det er for risikabelt at starte med at teste ukendte lægemidler på mennesker, bruges ofte laverestående dyr som mus og evt rotter som menneskellige sygdomsmodeller. Man søger således at introducere en given CNV, som man ønsker at undersøge i eksempelvis mus, som derved fungerer som in vivo model for denne gen-variation.Man introducerer disse CNV’er i generne hos mus, ved at tage udgangspunkt i en menneskelig stamcelle og ved hjælp af kromosomteknik udføres deletioner, duplikationer, translokationer og inversioner af store stykker DNA16. Når den ønskede defekt er produceret, indsprøjtes DNA’et i en ægcelle fra en mus. Derefter sættes denne ægcelle op i en rugemus, og der ventes nu et musefoster med den givne CNV. På denne måde kan mus med denne CNV produceres17.Ved at studere og teste disse mus vil man kunne lære, hvordan de adskiller sig fra normale mus og på denne måde danne sig et billede af, hvad der karakteriserer mennesker med det givne gen defekt, og hvad det de-fekte gens funktion er. Et eksempel er, at man har fundet ud af, at CNV’en 2p16.3 på NRXN 1 genet koder for celleadhæssionsmolekylet neurexin-110. Mus introduceret med denne CNV, vil kunne fungere som model når man ønsker at teste stoffer for, om de har en effekt der ligner neurexin-1, dvs. om de virker som celleadhæs-sionsmolekyle og således vil kunne bruges som en screening af nye potentielle lægemidler til behandling af skizofreni, måske især hos de patienter der har den givne gendefekt.Som nævnt har man i disse museforsøg også mulighed for at se hvad funktionen er af en given gendefekt. Man har således observeret, at mus med den nævnte gendefekt har påvirket kognition og indlæring. I forbindelse med videretestning af stoffer, der har effekt som neurexin 1, ville det være naturligt at teste om de havde effekt på eksempelvis indlæring.

5. Behandling

CNV’en 2p16.3 sidder på genet NRXN1, der koder for dannelse af proteinet Neurexin 1. Kunne man finde et stof, der virker som Neurexin 1, ville det kunne hjælpe de skizofreniramte patienter.Der er to stadier i forskningsarbejdet: Det første er at identificere, hvilken given adfærd, der karakteriserer mus med den introducerede CNV. Dernæst kan man, når denne adfærd kendes, relatere dette til kendte skizofrenisymptomer. I musemodeller kan man afprøve forskellige kemiske stoffer for, om de virker som de skal. Gør de dette, vil de(t) evt. kunne bruges i behandlingen af patienter med de givne symptomer. Et eksempel kan være: Introduktion af CNV’erne i musene. Derefter skal musenes adfærd karakteriseres.Et forsøg har vist, at mus med Neuraxin 1a deletioner, har adfærds- mæssige ændringer, der korrelerer med kognitive udfordringer. Det kan eksempelvis være problemer med at planlægge og arrangere. Det kunne være interessant at opsætte flere forsøg, der på forskellig vis kunne vise musenes forskellige adfærd. Ved at finde et stof, der virker på samme måde som Neurexin 1a vil man måske kunne finde et præparat, der kunne have effekt på den skizofrene patients kognitive symptomer, som er et af de udækkede behov, der er ved behandlingen af mange skizofrenipatienter.Hvis man laver andre forsøg, hvor musene reagerer anderledes, kan det korrelere til andre aspekter og dermed give ny og større viden.18

6. Brug af vores genetiske sekvens til diagnosticering

At vi i dag kan kortlægge hele genomer og dermed også bruge genetiske sekvenser til diagnosticering af sygdomme og vurdering af risici og disponeringsfaktorer er nyt, og med ny viden følger også nyt ansvar og nye overvejelser. Viden om vores genetiske koder, genfejl og disses sammenhængen med vores nervesystem kan være med til, at man kan udvikle medicin, der er specialiseret og tilpasset præcis en bestemt genfejl eller kombinationen af visse bestemte genfejl der disponerer for en sygdom, sådan at man i fremtiden kan give symptombehandling rettet mod de specifikke områder genfejlene påvirker. Behandling og medicinering efter det enkelte individs genom vil dermed give mulighed for bedst mulig behandling. Kortlægningen af genetiske sekvenser vil også give mulighed for yderligere forståelse for koblinger mellem genfejl og kroppens funktioner og helbredet. Risikovurdering og disponering for sygdomme ud fra viden om genetiske sekvenser kan være vejen til forøgede chancer for succesfuld behandling og eventuel helbredelse, da man ved at kende genetiske sekvenser kan være ekstra opmærksom på områder hvor et individ er meget disponibel for en sygdom, og man på den måde kan være opmærksom på symptomer for den eller de pågældende sygdomme, og dermed gribe væsentlig hurtigere ind og igangsætte behandling. Ved kortlægning af genomer og brug af genetiske sekvenser til diagnosticering er der dog også eventuelle konsekvenser der bør overvejes. Informering om disponering for sygdomme kan øge den pågældende persons opmærksomhed på helbred og eventuelle sygdomstegn, og opmærksomheden risikerer at blive en angst, der måske kan fremprovokere den egentlige sygdom, som fx skizofreni. Der er risiko for at nogle personernes livskvalitet kan nedsættes ved viden om risici, der derfor kan have en meget bevidstgørende virkning. Derudover bør der tages etiske overvejelser i forbindelse med behandling og opdagelse af nye koblinger mellem fx CNV’er og sygdomme. Denne store viden kan muligvis give mulighed for opdagelse af disponering for syg-domme allerede på embryon-stadiet. Hvis gentests af fostre udbygges til en fuldstændig genom-kortlægning med bl.a. oversigt over risici for udvikling af sygdomme, skal abortregler og regler for etik omkring ægsortering sandsynligvis tages op til revision. Er et foster meget disponibel for udvikling af skizofreni, vil det så være i orden at vælge det fra ved abort, eller for forskere at afslutte graviditeten for at bruge arvematerialet til forskning for eventuel opnåelse af yderligere viden omkring sygdomme der muligvis vil være banebrydende og kan være en afgørende hjælp for mange mennesker med samme genfejl i fremtiden? Her kan en diskussion om deontologi (også kaldet pligtetik)19 mod utilitarisme (også kaldet nytteetik)20 opstå. Når de etiske overvejelser tages med, er det spændende om vi ved at forske videre, en dag vil kunne helbrede alle skizofrene, eller i hvert fald finde en ny og mere effektiv behandling med kun ganske få og harmløse bivirkninger.

Referenceliste:

1. http://www.levemedskizofreni.dk/patienter/symptomer 2. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing 3. http://www.denstoredanske.dk/Natur_og_miljø/Biokemi_og_molekylærbiologi/Molekylærbiologi/DNA 4. http://www.youtube.com/watch?v=77r5p8IBwJk 5. http://www.454.com/downloads/news-events/how-genome-sequencing-is-done_FINAL.pdf 6. http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc 7. http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/Dsdna 8. http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing 9. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/22q112-deletion-syndrome10. http://en.wikipedia.org/wiki/Neurexin11. http://www.ugeskriftet.dk/LF/UFL/2010/12/pdf/VP57641.pdf12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894572013. http://en.wikipedia.org/wiki/1q21.1_duplication_syndrome 14. http://ghr.nlm.nih.gov/condition/15q133-microdeletion15. http://www.biotechacademy.dk/Bioindex/Drughunters/skizofreni/udviklingen_af_medicin_mod_skizofreni.aspx 16. http://www.research.umn.edu/advance/documents/gia/S09Bagchi.pdf 17. http://publikationer.ku.dk/filer/forskning/hjerne_og_bevidsthed.pdf18. http://www.pnas.org/content/106/42/17998.full.pdf19. http://da.wikipedia.org/wiki/Deontologi 20. http://da.wikipedia.org/wiki/Utilitarisme