Seminar Pri Biotehnologiji Ta Prav 1

UNIVERZA V LJUBLJANIBIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŽIVILSKA TEHNOLOGIJA

REKOMBINANTNI PROTEINI*

Daniela PERDIH, Eva MRAVLJAK, Brigita PRIMC, Tina PUCIHAR

(3. letnik študija Živilstvo in prehrana)

prof. dr. Peter Raspor in asist. dr. Maja Paš (mentorja)

Ljubljana, 2012

*Seminarska naloga pri predmetu Osnove biotehnologij

Rekombinantni proteini, Seminar, Biotehniška fakulteta, Študij živilstva in prehrane, 2012.

POVZETEK

Odkritje in selekcija mikroorganimov za proizvodnjo v prehrambeni in kemični industriji je v zadnjih letih nadgradil napredek tehnologij rekombinantne DNA. Tako se je povečalo pridobivanje rekombinantnih proteinov, ki so predvsem na področju medicine in prehrambene industrije, omogočili večjo in bolj ekonomično proizvodnjo. Prvi rekombinantni protein izražen v bakteriji Escherichia coli, ki se je pred 30 leti pojavil na ameriškem tržišču, je bil humani inzulin. Temu je sledil strm vzpon tovrstnih učinkovin. Na področju prehrambene industrije, natančneje sirarstva, je kot posledica hitrega razvoja genskega inženiringa, danes zelo pogosto uporabljen rekombinantni protein kimozin, ki ga uporabljamo kot procesni agens za koagulacijo mleka. S pomočjo znanega sklopa metodologij in postopkov smo s pomočjo štirih shem prikazali pridobivanje rekombinantnega kimozina, od bioprocesnega pridobivanja v mešalnem bioreaktorju do izolacije in prečiščevanja proteinskih produktov. Sprva moramo goveji gen za kimozin izraziti v bakteriji E. coli. Nato celice E. coli namnožimo na tekočem gojišču, zatem pripravimo inokulum in končno vcepimo v bioreaktor, kjer se odvije sinteza kimozina. Po končani sintezi, celice iz bioprocesne brozge ločimo s centrifugiranjem. Sledi celična liza, ponovno centrifugiranje in izvedba afinitetne kromatografije. Tako izoliran in prečiščen protein se nazadnje posuši z metodo z razprševanjem, aseptično zapakira in uporabi v proizvodnji sira.

Ključne besede: genski inženiring, rekombinanti kimozin, Escherichia coli, proizvodnja sira

SUMMARY

The selection and discovery of microorganisms for food production and for usage in chemical industry was upgraded by the progress of recombinant DNA technology in recent years. Recombinant proteins allow a bigger and more economical production, that is why making those proteins is increasing, especially in medicine and food industry. The first recombinant protein expressed in Escherichia coli, which appeared 30 years ago on the U.S. market, was the human insulin. This was followed by a big increase of those substances. In the food industry, specifically cheesemaking, as a result of the rapid development of genetic engineering, nowadays chymosin is a very commonly used recombinant protein, used as a milk clotting agent. We showed the production of recombinant protein chymosin in four schemes with the help of a well-known set of methodologies and processes, from the first step- fermentation in a bioreactor to isolation and purification of proteins. Firstly, we have to express the gene for calf chymosin in E. coli. Secondly, we have to multiply the cells in a liquid medium, making inoculum and then cultivating the bacteria in a bioreactor, where the synthesis of chymosin takes place. Thirdly, we separate the cells from broth by centrifugation, then the cell lysis, centrifugation and affinity chromatography happen. This isolated and purified protein is finally dried by the spray method, aseptically packed and used in cheese manufacture.

Keywords: genetic engineering, recombinant chymosin, Escherichia coli, cheese manufacture

2


KAZALO VSEBINE

1 UVOD.......................................................................................................................... 4

2 SHEME........................................................................................................................ 62.1 PROCESNA SHEMA............................................................................................ 62.2 TEHNOLOŠKA SHEMA......................................................................................82.3 MATERIALNA SHEMA....................................................................................... 92.4 PROSTORSKA SHEMA.....................................................................................10

3 ZAKLJUČEK............................................................................................................. 13

4 LITERATURA........................................................................................................... 144.1 PROGRAMI........................................................................................................ 14

KAZALO SHEM

SHEMA 1: PROCESNA SHEMA..........................................................................................6SHEMA 2: TEHNOLOŠKA SHEMA......................................................................................8SHEMA 3: MATERIALNA SHEMA......................................................................................9Shema 4: Prostorska shema........................................................................................... 10

3


1 UVOD

Gensko inženirstvo oz. tehnologije rekombinantne DNA predstavljajo v biotehnologiji, s stališča industrijske biosintezne proizvodnje različnih produktov, uporabo spoznanj molekularne biologije v proizvodnji farmacevtskih, kemijskih in prehrambenih proizvodov (Komel in Gubenšek, 1992).

S tehnikami rekombinantne DNA, ki je v 70-letih postavila prelomnico v razvoju moderne biotehnologije, pravzaprav vključimo fragment DNA iz ene vrste celic v DNA druge vrste, ki se je sposobna podvojevati. Ko se prejemniška celica deli, njene potomke proizvedejo več kopij hibridne DNA, s tem je DNA klonirana. Če fragment z zapisom za točno določen protein vstavimo na omenjen način v gostiteljsko celico (pogosto je to bakterijska celica, lahko uporabimo tudi kvasovke, živalske, rastlinske celice), bodo le-te izrazile in proizvajale kopije tega zapisa oz. proteina. Ta postopek je pomemben za proizvodnjo večjih količin rekombinantnih proteinov (Boyer, 2005).

Prizadevanja industrijskega genskega inženiringa so bila v samem začetku usmerjena v poskuse proizvodnje težko dostopnih humanih proteinov, ki jih ni mogoče pridobiti v zadostnih količinah (Komel in Gubenšek, 1992). Tako je bil humani inzulin prvi rekombinantni protein, izražen v celicah E. coli, ki je leta 1982 prišel na ameriški trg (Boyer, 2005).

V zadnjih desetih letih pa se tudi v živilski industriji uporablja vedno več rekombinantnih encimov, proizvedenih v heterolognih ekspresijskih sistemih (gostiteljskih organizmih v katere gen za encim presadimo iz organizma darovalca). Prvi na tak način proizveden encim, ki je prišel v redno uporabo v živilstvu, je rekombinantni goveji kimozin, ki ga pri proizvodnji sira uporabljajo kot agens za koagulacijo mleka (Francky in sod., 1994).

Koagulacija mleka je posledica specifične proteolitske cepitve kazeina, ki nato v prisotnosti kalcijevih ionov tvori koagulum. S koagulacijo prevedemo mleko v fizično stanje, ki omogoča enostavno in poceni odstranjevanje vode z odcejanjem in prešanjem koagulata (Francky in sod., 1994).

V sirarstvu so sicer za izdelavo sira sprva uporabljali nativen kimozin, izoliran iz telečjih želodcev. Z razmahom sirarske proizvodnje pa je začelo primanjkovati želodcev, zato so začeli iskati druge možnosti pridobivanja proteolitičnih encimov s podobnimi lastnostmi za koagulacijo mleka (Rogelj in Perko, 2003).Tako so leta 1983 prenesli goveji gen za kimozin v bakterijo E. coli in omogočili nastanek, danes široko uporabnega, rekombinantnega kimozina (Francky in sod., 1994).

Prednost pridobivanja rekombinantnega kimozina ni le hitra in ekonomična proizvodnja večjih količin omenjenega proteina v industrijskih bioreaktorjih, ampak tudi njegovo izredno visoko razmerje med koagulacijsko aktivnostjo in nespecifično proteolitično aktivnostjo. kar zagotavlja ustrezne senzorične lastnosti sirov (Rogelj in sod., 2001).

4


V prvi stopnji proizvodnje rekombinantnega kimozina moramo najprej izvesti molekularno kloniranje, in sicer goveji gen za kimozin moramo prenesti v bakterijo E. coli in zagotoviti ustrezno ekspresijo vnešenega gena. Bakterijske celice z ustreznim genom, nato nacepimo v tekoče gojišče LB (Luria Bertani, ki vsebuje 5 % kvasnega ekstrakta, 10 % peptona, 5 % NaCl ter ustrezni antibiotik (100 mg/L ampicilina), ki onemogoča rast ostalih mikroorganizmov, razen želene bakterijske culture) in inkubiramo s stresanjem 8 ur na 37 °C. Iz tega nato pripravimo inokulum, ki ga vcepimo, v isto gojišče, v bioreaktorju. Pri tem dodana bakterijska kultura ne sme preseči 10 % celotnega volumna svežega gojišča v bioreaktorju (Mihelič, 2007).

Sledi inkubacija pri 37 °C, ob intezivnem mešanju (600 obratov na minute), prezračevanju (30 L/ zraka na minute) in pH 6.85. Ko celice dosežejo optično gostoto 0,6 – 0,8, merjeno pri 600nm (okoli 3 - urna inkubacija), v bioreaktor dodamo IPTG (isopropil-β-D-tiogalaktopiranosid) induktor (33 g na 1 liter procesne brozge). Ta sproži prepis gena za kimozin in posledično njegovo sintezo. Kulture nato ohladimo in jih centrifugiramo pri 8000 vrtljajih na minuto, 20 minut pri 4 °C, da ločimo celice od bioprocesne brozge (Ramesh, 2012).

Tekoči del brozge odstranimo, medtem ko usedlino, ki vsebuje namnoženo biomaso, obravnavamo naprej. Usedlino suspendiramo v pufru za lizo (50 mM Tris/HCl, pH 8,00,1 M NaCl, 1 mM EDTA) in znova centrifugiramo. V supernatantu se nahajajo topni proteini, v usedlini pa deli celic in inkluzijska telesca (agregirane molekule rekombinantnega proteina in nekatere nečistoče). Topne proteine, ki se nahajajo v supernatantu ločimo z afinitetno kromatografijo, tako, da uporabimo kolono Ni-NTA (nikelj nitro acetilna kislina). Ta se uporablja za izolacijo proteinov, ki imajo na C- ali N-koncu pripet histidinski označevalec. Zaporedje 6 histidinov v nevtralnem ali rahlo alkalnem pH-ju veže Ni ²+ ione, ki so vezani na sefarozni matriks. Ostali proteini potujejo skozi kolono brez interakcij. Vezane proteine (kimozin) nato speremo s kolone s prekinitvijo interakcije med histidinskim označevalcem in Ni ²+ ioni, tako da povišamo koncentracijo imidazola, dodamo EDTA in znižamo pH vrednost elucijskega pufra (20 mM kalijev fosfat, pH 7.0, 0,5 M NaCl, 500 mM imidazol). Inkluzijska telesca denaturiramo v pufru z 8M ureo (pH 8,0) pri 25 °C za 1 uro. Nato pufer razredčimo s fosfatnim pufrom (pH 10,7) za renaturacijo kimozina, 1 uro pri 25 °C. Znova izvedemo afinitetno kromatografijo s kolono Ni-NTA (Mihelič, 2007).

Po končani kromatografiji pridobljene proteine še dodatno očistimo z sterilno filtracijo skozi filtre z velikostjo por 0,2 μm. Proteine na koncu posušimo z metodo sušenja z razprševanjem (spray drying). Ta metoda je primerna predvsem za sušenje večjih volumnov raztopin encimov, ki morajo biti čim bolj toplotno obstojni. V sušilniku zgoraj razpršujemo encimsko raztopino, nasproti pa pihamo ogret zrak. Osušen produkt pada na dno posode. Posušene proteine aseptično zapakiramo in uporabimo v proizvodnji sira (Kregar, 1992).

5


2 SHEME

2.1 PROCESNA SHEMA

Shema 1: Procesna shema

6


LEGENDA NAPRAV:

7


2.2 TEHNOLOŠKA SHEMA

Shema 2: Tehnološka shema

8


2.3 MATERIALNA SHEMA

Shema 3: Materialna shema

9


2.4 PROSTORSKA SHEMA

Shema 4: Prostorska shema

10


LEGENDA PREHODOV IN POTI :

Pot zaposlenih - nečisti del

Pot zaposlenih – čisti del

Prehod med čistimi in nečistimi potmi

Pot surovine

Pot produkta

Servisni prehod

LEGENDA TEHNOLOŠKE IN DRUGE OPREME :

1) epruveta z inokulatom2) bioreaktor3) centrifuga4) mešalna posoda za ekstrakcijo5) centrifuga6) mešalna posoda za denaturacijo in renaturacijo7) kromatograf8) mešalna posoda za eluacijo9) naprava za filtriranje10) naprava za sušenje z razprševanjem11) produkt

LEGENDA PROSTOROV :

PR 1) vhod za zaposlenePR 2) hodnikPR 3) sprejem surovinPR 4) prostor za čistila in opremoPR 5) sanitarije – ženskePR 6) sanitarije – moškiPR 7) skladišče za surovinePR 8) shramba za mikroorganizmePR 9) prostor za dezinfekcijoPR 10) Mikrobiološki laboratorijPR 11) Prostor za pripravo inokulumaPR 12) Prostor za pripravo substrataPR 13) Prostor za proizvodnjo produktaPR 14) Prostor za čistilaPR 15) Ekološki otokPR 16) Prostor za organske odpadkePR 17) Prostor za ostale odpadke

11


PR 18) Nadzorna sobaPR 19) Prostor za pakiranje produktovPR 20) Skladišče končnega produkta in odvozPR 21) Laboratorij za analizno kemijoPR 22) Raziskovalni laboratorijPR 23) Prostor za testiranje produktaPR 24) Prostor za dezinfekcijoPR 25) Prostor za čistilaPR 26) PralnicaPR 27) KuhinjaPR 28) JedilnicaPR 29) Direktorska pisarnaPR 30) Pisarna za zaposlenePR 31) Sejna soba PR 32) Sanitarije – ženskiPR 33) Sanitarije – moškiPR 34) Garderoba- ženske (nečisti del)PR 35) Umivalnica – ženskePR 36) Garderoba – ženske (čisti del)PR 37) Garderoba- moški (nečisti del)PR 38) Umivalnica – moškiPR 39) Garderoba – moški (čisti del)

12


3 ZAKLJUČEK

V seminarski nalogi smo poskušali stopiti v vlogo tehnologov, in s pomočjo shem, predstaviti proizvodnjo biotehnološko zanimivega produkta, ki ima še posebej pomembno vlogo v prehrambeni industriji, natančneje v sirarstvu.Proizvodnjo rekombinantnega kimozina smo tako prikazali s procesno, tehnološko in materialno shemo. S prostorsko shemo smo celoten proces, z dvodimenzionalnim pogledom, vključili v prostor in prikazali kot del velikega indutrijskega kompleksa.

S procesno shemo smo s pomočjo mednarodno priznanih znakov in podatkov o zmogljivosti oz. območju delovanja naprav prikazali proizvodnjo rekombinantnega kimozina na industrijskem nivoju. Temu primerno so v shemi simboli ustrezno označeni, hkrati je v procesu jasno razvidno katere komponente vstopajo v sistem, in katere ga zapuščajo. Slednje prav tako niso »zanemarjene«, saj se vse vodijo preko čistilnih naprav. V proces smo vključili tako pripravljalne procese (upstream), kot tudi zaključne procese (downstream), med katerimi pa ima zagotovo napomembnejšo vlogo bioproces, ki se odvija v ustreznem bioreaktorju.

V tehnološki shemi, za razliko od procesne, nismo uporabili mednarodno priznanih znakov, ampak fotografije samih naprav in opreme. Poleg tega smo pri posamezni napravi opredelili tudi tehnološko pomembne parametre, kot je temperatura, ph, čas,...

Z materialno shemo smo prikazali vse materialne tokove s količinami. Pri izračunu smo izhajali iz suspenzije E. coli, ki je vsebovala 1x105 celic. V shemo smo vključili količine vstopnih surovin (substrat, suspenzija E. coli, fiziološka raztopina, induktor, pufer, urea, elucijski pufer) in količine izstopnih surovin (odpadne snovi, kot je brozga, ostanki celic, ostali proteini, odpadna voda). S sledečim izračunom naj bi pridobili 100 kg rekombinantnega kimozina.

Pri prostorski shemi smo izrisali tloris prostorov, opremo posameznega prostora ter z upoštevanjem sistema HACCP primerno označili tudi poti surovine, produkta in zaposlenih. Temperatura prostorov je večinoma sobna, 21 °C, razen v prostorih za skladiščenje, kjer se vzdržuje nižja temperatura, okoli 12 °C.

Ameriški vladni urad za hrano in zdravila (FDA) je rekombinantni kimozin, pridobljen s kloniranjem v E. coli K12, opredelil kot primerno nadomestilo naravnega kimozina, izoliranega iz živalskih želodcev, ki odgovarja GRAS standardu (zdravju neškodljiv), (Mohanty A.K. in sod., 1999).

S senzoričnega stališča, ki je za nas kot živilce še posebej zanimiv, pa Rogelj in sod. (2001) navajajo, da pri proizvodnji sira z rekombinantnim kimozinom ne prihaja do nikakršne izgube okusa ali teksture, v primerjavi s tradicionalno proizvodnjo sira s kimozinom živalskega izvora.

13


4 LITERATURA

1. Komel R., Gubenšek F. 1992. Proizvodi tehnologije rekombinantne DNA. V: Biotehnologija. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 437-451

2. Boyer R. 2005. Osnove biokemije. Ljubljana. 2. izd. Ljubljana, Študentska založba: 634 str.

3. Francky A., Mozetič-Francky B., Pungerčar J., Štrukelj B., Kregar I. 1994. Procesni agensi pridobljeni z gensko tehnologijo-primer kimozin. V: 16. Bitenčevi živilski dnevi: Aditivi. Raspor P. (ur.). Ljubljana: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 119-127

4. Rogelj I., Perko B. 2003. Mlečni izdelki. V: Mikrobiologija živil živalskega izvora. Bem Z., Adamič J., Žlender B., Smole Možina S., Gašperlin L. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, oddelek za živilstvo: 541-578

5. Rogelj I., Perko B., Francky A., Penca V. in Pungerčar J. 2001. Recombinant lamb chymosin as an alternative coagulating enzyme in cheese production. Journal of Dairy Science, 84, 5:1020–1026

6. Mohanty A.K., Mukhopadhyay U.K., Grover S., Batish V.K. 1999. Bovine chymosin: Production by rDNA technology and application in cheese manufacture. Biotechnology Advances, 17: 205–217

7. El-Sohaimy S. A., Elsayed. E., Hafez in El-Saadani M. A.. 2010. Cloning and in vitro-transscription of chymosin gene in E.coli. The Open Nutraceuticals Journal, 3, 63-68

8. Kregar I. 1992. Metode izolacije proteinov. V: Biotehnologija. Raspor P. (ur.). Ljubljana, Bia: 325-353

9. Ramesh. M., Ravindra babu V., Adarsh G. 2012. Optimization of production and purification prosecc for recombinant protein (VRP-5) in Escherichia coli using analytical methods. Journal of Pharmacy Research, 5(5), 2970-2976

10. Mihelič M. 2007. Interakcija mišjih in človeških katepsinov S in L z inhibitornim fragmentom invariantne verige p41asociirane z molekulami MHC razreda II. Doktorsko delo. Ljubljana, Medicinska fakulteta: 69 str.

11. Ignatowitz E. 1996. Kemijska tehnika. Ljubljana. Jutro: 456 str.

4.1 PROGRAMI

1. Microsoft Office Visio 2007.2. Corel Draw X43. Edraw Max 6.7

14


15

Documents

Seminar Pri Biotehnologiji Ta Prav 1