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UNIVERSIDAD DE JAÉN Facultad de Ciencias Experimentales
Alumno: MARÍA DE LA PAZ RUIZ BARRERO
JULIO, 2014
Sensor para análisis de compuestos de interés
agroalimentario
2
UNIVERSIDAD DE JAÉN
FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES
GRADO EN QUÍMICA
Sensor para análisis de compuestos de interés
agroalimentario María de la Paz Ruiz Barrero
JAÉN, 2014
Firma del Alumno: María de la Paz Ruiz Barrero
3
ÍNDICE
1. Resumen……………………………………………………………...……………...4
2. Objetivos……………………………………………………………………………..6
3. Introducción………………………………………………….....…………………..6
3.1. Sistemas en flujo……………………….…………………………………..6
3.2. Multiconmutación ……………………………………………….…………9
3.3. Sensores y soporte solido…………..…………………………………..13
3.4. Fluorescencia inducida fotoquímicamente (PIF)……..……………..16
3.5. Implementación de Multiconmutación con PIF………………...……18
4. Analito: Clotianidina…..……………………………………………………….....19
5. Procedimiento experimental……………………………………………………20
5.1. Reactivos…………………………………………………………………...20
5.2. Instrumentación……………………………………………….…………..21
5.3. Estudio de variables experimentales…………………..…………..….25
5.4. Configuración del flujo y resumen de variables optimizadas…….37
6. Calibración del sistema. Parámetros analíticos.……………….…………...38
7. Aplicaciones analíticas……………………………..……………………………41
8. Conclusiones………………………………………………………………….…..43
9. Bibliografía……………………………...………………………………………….44
4
1. RESUMEN
En esta memoria se lleva a cabo el desarrollo de un sensor espectroscópico en
flujo continuo con detección por fluorescencia inducida fotoquímicamente
(photochemically induced fluorescence, PIF) para el análisis de compuestos de
interés agroalimentario.
El analito a determinar con este optosensor es clotianidina, un plaguicida que fue
prohibido por la Comisión Europea (CE) junto con el imidacloprid y el tiametoxan,
ya que su uso estaba relacionado con la muerte masiva de abejas.
En primer lugar se realizará el montaje del sensor, el cual trata de una
implementación entre la multiconmutación (un sistema de flujo continuo basado
en la sincronización de tres válvulas solenoides controladas por un software que
permite la inyección de la muestra) y la fluorescencia inducida fotoquímicamente
(basada en un fotorreactor por el cual se hace pasar el analito durante un
determinado tiempo para irradiarlo y convertirlo en un fotoproducto al cual se
medirá la señal analítica).
Se realizará una exhaustiva optimización de las variables que afectan a este
sensor: variables de retención-detección (soporte sólido), variables instrumentales
(longitudes de onda, rendijas de excitación y emisión y voltaje), variables químicas
(concentración y pH del portador e influencia del pH en la muestra), y variables
propias del sistema de inyección en flujo (caudal, tiempo de irradiación y tiempo
de inserción).
Una vez optimizadas todas las variables se procederá a la calibración del
optosensor con el fin de encontrar una ecuación que relacione la señal
fluorescente con la concentración del analito.
Por último se aplicará el optosensor para la determinación del analito a muestras
reales de diferentes aguas minerales, estimando el rango de tolerancia del
optosensor al analito.
5
Este sistema presenta una alta sensibilidad y selectividad, características que
derivan de la retención y detección del analito sobre el soporte un sólido. Además
el empleo de fotones como reactivo aporta otras características para los analitos
que requieren derivatización, como rapidez, simplicidad y bajo coste. Por su parte,
el sistema en flujo continuo, multiconmutación, también aporta un aumento de la
automatización y la reproducibilidad del sistema, simplicidad y un menor consumo
de reactivos.
SUMMARY
In this report is carried out the development of a spectroscopic sensor streaming
with photochemically induced fluorescence detection (Photochemically induced
fluorescence, PIF) for the analysis of compounds of agricultural interest.
The analyte to be determined with this optosensor is clothianidin, a pesticide that
was banned by the European Commission (EC) with imidacloprid and tiametoxan,
since its use was related to the mass death of bees.
In the first place mount the sensor is construted, which is an implementation
between multicommutation (continuous flow system based on the synchronization
of three solenoid valves controlled by software that allows the injection of the
sample) and PIF (based on a photoreactor by which the analyte is passed for a
certain time to radiate and make it a photoproduct whose analytical signal is
measured).
Next, an exhaustive optimization of the variables affecting the sensor was
performed: Retention-detection variables (solid support), instrumental variables
(wavelengths of excitation and emission slits and phase), chemical variables (pH
and carrier concentration and influence of pH in the sample), and flow injection
system variables (flow time of irradiation, time of insertion, etc).
Once all variables are optimized will proceed to calibration the optosensor in order
to find an equation that relates the fluorescent signal with the analyte
concentration.
Finally the optosensor was applied to the determination of the analyte to real
samples of different mineral waters, estimating the tolerance range of the analyte
optosensor.
6
This system has a high sensitivity and selectivity, characteristics arising from the
retention and detection of the analyte on a solid support. Besides the use of
photons as a reagent provides other features for analytes requiring derivatization
as speed, simplicity and low cost. Meanwhile, the continuous flow system,
multicommutation, also provides increased automation and reproducibility of the
system, simplicity and lower reagent consumption.
2. OBJETIVOS
El objetivo principal de esta memoria es el desarrollo y optimización de un sensor
espectroscópico en flujo continuo mediante PIF.
Una de las finalidades de esta memoria es hacer que compuestos de naturaleza
no o débilmente fluorescente presenten fluorescencia mediante el uso de la
derivatización fotoquímica.
Otro objetivo es el análisis de los analitos, inducidos fotoquímicamente, mediante
el sistema en flujo continuo, la multiconmutación, para poder obtener un aumento
de la reproducibilidad, sensibilidad y selectividad. Además de economizar y
facilitar el análisis debido a la sencillez que el sistema presenta.
3. INTRODUCCIÓN
3.1. Sistemas en flujo
La primera definición de los sistemas en flujo o análisis por inyección en flujo
(FIA) fue dada en 1975 por los padres de esta técnica Ruzicka y Elo Harald
Hansen como “la inserción secuencial de disoluciones discretas de muestra en un
flujo continuo y no segmentado con la subsiguiente detección del analito”. A lo
largo de los años esta definición ha ido sufriendo modificaciones, destacando las
diferentes características de la técnica. Hoy en día sigue siendo difícil formular
una definición exacta. Se puede decir que es una técnica de análisis automático
en flujo continuo, en el que no se alcanza el equilibrio físico ni químico, y que se
basa en la inserción y dispersión controlada de un volumen de muestra en una
7
corriente continua de portador, que es transportado hasta un detector donde se
registra una señal transitoria.
El acrónimo FIA es un anglicismo (Flow Injection Analysis) ampliamente
extendido.
Las características generales de estos sistemas son:
Flujo no segmentado, por lo que no existen burbujas de aire en ninguna de
las líneas del sistema.
Inyección directa de un volumen bien definido de muestra en el flujo
Transporte del bolo de muestra inyectado a través del sistema.
Dispersión o dilución parcial del analito durante el transporte, que puede
ser controlada a través de las características geométricas e hidrodinámicas
del sistema.
Señal transitoria proporcionada por un sistema de detección continua, que
es registrada (fiagrama)
No se alcanza el equilibrio físico ni químico cuando se registra la señal por
lo que se enmarca dentro de los métodos cinéticos de análisis.
Necesidad de reproducibilidad del tiempo de operación, ya que las medidas
se realizan en condiciones de no equilibrio.
Un sistema FIA básico está compuesto por una serie de componentes
fundamentales que proporcionan unas condiciones ideales:
Sistema de
propulsión
Sistema de
inyección
Sistema de
transporte
Sistema de
reacción
Sistema de
detección
Fig.1. Componentes básicos del sistema FIA
8
Sistema de propulsión, debe suministrar un flujo constante y regular en el
sistema, además de ser perfectamente reproducible. Otra característica
deseable es que proporcione un flujo libre de pulsos. Existen diferentes
mecanismos que permiten la propulsión de las diferentes disoluciones
empleadas en el sistema por sus correspondientes líneas: presión con
gases, bombas peristálticas y flujo electro-osmótico entre otros. El sistema
de propulsión más utilizado son las bombas peristálticas, que también se
empleará en este trabajo.
Sistema de inyección, estos dispositivos deben introducir una cantidad
precisa de muestra en el sistema FIA de forma reproducible sin alterar el
flujo. Además es deseable que permita la variación del volumen de muestra
insertado en un amplio rango, ya que esto permite un aumento de la
versatilidad del sistema. La primera forma de inyección se realizó mediante
jeringas con agujas hipodérmicas. Hoy en día está muy generalizado el uso
de válvulas rotatorias y de inyectores proporcionales.
Sistema de transporte, cumple la misión de conectar entre si los diferentes
elementos y conseguir en el transporte de los fluidos un adecuado grado de
dispersión de la muestra en la corriente portadora. Se desea que estos
sean fácilmente modificables e interconectables entre sí.
Sistemas de detección, deben permitir la medida continua de una
propiedad de la muestra o de un producto de esta, proporcionando
información cuantitativa y cualitativa. Los sistemas de detección utilizados
en FIA abarcan diferentes tipos como son los detectores ópticos, que son
los más utilizados debido al gran número de especies que pueden
determinarse por este tipo de técnicas. Los más usados son los detectores
de absorción molecular, seguidos por los de fluorescencia molecular,
siendo estos últimos los empleados en este trabajo. Los detectores
electroquímicos son menos utilizados pero tienen una elevada utilidad en
sistemas hidrodinámicos debido a su selectividad, sensibilidad y linealidad
de respuesta en un amplio rango de concentración.
9
Otros sistemas de flujo continuo no segmentado que han tenido una gran difusión
son:
Análisis por Inyección Secuencial (SIA): se caracteriza por la aspiración
secuencial de muestra y reactivos hasta un reactor mediante una válvula
de múltiple selección.
Multiconmutación: sigue siendo un sistema FIA que presenta un mayor
desarrollo en el procedimiento para la manipulación de soluciones y el
control de la dispersión de las mismas. Este es el sistema en flujo continuo
en el que se basa esta memoria y que se explica detenidamente en el
siguiente apartado.
3.2. Multiconmutación
La multiconmutación es una técnica que utiliza como dispositivo fundamental
válvulas solenoides de 3 vías. Es una metodología orientada al diseño de
métodos analíticos con un alto grado de automatización y un mínimo impacto
medio ambiental.
El funcionamiento de la multiconmutación se realiza mediante un software que
controla el tiempo y, por tanto, el volumen de inserción de las distintas
disoluciones, el número de ciclos de muestras y reactivos, y sincroniza el
comienzo de cada ciclo analítico. Con el método de inserción de muestra basado
en el control electrónico del tiempo durante el cual la válvula solenoide está
activada por un pulso de corriente, y a un caudal constante y conocido, la
incertidumbre del volumen de muestra depende principalmente de la precisión con
la que se controla dicho tiempo.
Por tanto, la principal aportación de la multiconmutación al análisis en flujo es la
sustitución de los volúmenes de inyección por tiempos de inserción, lo que
permite desarrollar diseños basados en el tiempo, más precisos y reproducibles.
10
La introducción de disoluciones en los sistemas de multiconmutación se realiza,
bien por la aspiración a través de canales de bombeo (bombas peristálticas) o
bien aprovechando el avance por gravedad.
La válvula solenoide de 3 vías es el dispositivo más empleado en esta técnica,
como ya se ha comentado anteriormente. Cuando pasa la corriente por la bobina
solenoide, el pistón es atraído hacia la cubierta de la válvula, comprimiendo el
resorte y haciendo, de esta forma, que cualquier pieza unida al pistón siga esta
trayectoria. Cuando cesa el voltaje, el resorte empuja el pistón lejos de la cubierta
de la bobina y, en consecuencia, cualquier pieza unida al pistón también se
mueve. Se comporta, de este modo, como un interruptor en dos estados posibles:
ON y OFF.
Fig.2. Esquema de una válvula solenoide de 3 vías. Posición ON y OFF
11
La posición ON permite la entrada de la muestra a la válvula la cual está
conectada al detector que en este caso será un fluorímetro, mientras que la
posición OFF recircula la muestra en lugar de hacerla llegar hasta el detector.
Los montajes realizados para sistemas de multiconmutación contienen:
Un equipo electrónico, desde este se controla el tiempo y la inserción de
muestra.
Válvulas solenoides de 3 vías.
Tubos conectores (tetrafluoroetileno, PTFE) responsables del transporte de
muestra y reactivo(s).
bomba peristáltica, se utiliza como sistema de propulsión.
Célula de flujo en cuyo interior hay soporte sólido donde se retiene el
analito, para poder obtener la señal analítica. La cubeta se coloca en el
interior del detector.
Detector, proporciona la señal analítica (en este caso es un fluorímetro).
El equipo electrónico está conectado al detector y a las válvulas solenoides, de
manera que desde estos controlamos todo el proceso de inyección. El sistema
consta generalmente de 3 válvulas solenoides enumeradas, por cada una de
ellas pasa una solución diferente: portador, muestra y eluyente. En cada válvula a
su vez hay 3 vías: una vía para la aspiración de muestra o reactivo, otra para la
recirculación, y una última que llega hasta el detector.
12
Las ventajas que presenta la multiconmutación se describen a continuación:
Consumo reducido de muestras y reactivos. El consumo de muestras es
mínimo, ya que pueden insertarse volúmenes en el orden de microlitros
correspondientes a tiempos de inserción de fracciones de segundo.
Flexibilidad y versatilidad. La multiconmutación permite variar la longitud de
los tubos de reacción e insertar volúmenes variables, sin necesidad de
modificar físicamente el montaje y sin que el perfil de inserción se vea
afectado.
Incremento de la reproducibilidad y automatización. Las válvulas
solenoides requieren una intervención mínima por parte del operador. El
proceso de inserción puede ser controlado por vía software de forma
reproducible y durante tiempos considerablemente prolongados.
Incremento del tiempo de residencia. Las interacciones muestra/reactivo
comienzan en la etapa de muestreo, incrementándose el tiempo de
residencia.
Rapidez. Tiene su mayor incidencia en la frecuencia o velocidad de
muestreo. Factores como volumen de muestra, volumen interno del reactor
y caudal son decisivos al establecer la velocidad de muestreo.
22
Bomba peristáltica
PC
Válvulas soleinodes
Detector
Muestra
Portador
Fig.3. Esquema de un sistema de multiconmutación.
13
Sencillez. La multiconmutación se caracteriza por una gran sencillez debido
a montajes no sofisticados, de fácil ensamblaje y manejo. Su aplicación al
análisis rutinario es muy útil y la manipulación de su diseño para adaptar el
montaje a diferentes analitos resulta sencillo y rápido.
Sin embargo, la multiconmutación también presenta algunos inconvenientes:
Necesidad de una unidad de bombeo. Debido a que las válvulas de 3 vías
actúan como conmutadores, una de sus dos posiciones de entrada o de
salida debe invariablemente estar en OFF y la circulación a través de este
canal parada. Esto requiere una unidad de propulsión situada antes o
después de las válvulas.
Restricciones en los volúmenes de inserción. Con segmentos de muestras
y reactivos muy pequeños, la operación del sistema de propulsión debe
estar sincronizada con las microinserciones. En caso contrario, los pulsos
de bombeo introducen distorsiones irreproducibles en los perfiles de
inserción.
3.3. Sensores y soporte sólido
Un sensor químico ideal puede definirse como un dispositivo analítico que
responde de manera directa, reversible, continua, rápida, exacta y precisa a los
cambios de concentración de una o más especies de una muestra. Consta de una
microzona sensora, donde tiene lugar una reacción química o bioquímica y/o un
proceso de separación, que está conectada con un transductor, que en el caso de
los optosensores se trata de un transductor óptico. Algunas de las propiedades de
los sensores coinciden con características esenciales de la metodología FIA,
como son exactitud, precisión, sensibilidad y selectividad; otras, se refieren al tipo
de funcionamiento: reversibilidad y reutizabilidad en procesos irreversibles o
regenerables. Otras características básicas son aquellas relacionadas con el
tiempo: respuesta lo más próxima posible a tiempo real y rapidez en los procesos
reversibles y en los de regeneración y estabilidad. Finalmente, cabe destacar
otras características: la simplicidad de construcción y operación, robustez, bajo
14
costo, posibilidad de utilización de muestras complejas y la necesidad de no
interpretación por parte del operador.
Los sensores en flujo continuo son compatibles con detectores espectroscópicos
moleculares, recibiendo de este modo el nombre de optosensores. El bolo de
muestra es insertado en la corriente de portador y la radiación interacciona
directamente con la zona sensora integrada en el área de detección. Estos
dispositivos proporcionan una respuesta rápida, reversible y continua que es
transducida al detector espectroscópico molecular no destructivo.
El soporte sólido es el elemento más importante de los optosensores, ya que
constituye la zona sensora del mismo. La elección del soporte entre la gran
variedad de materiales sintéticos y naturales que pueden empelarse, constituye
una parte esencial del diseño del sensor, ya que sobre la superficie del mismo se
va a producir la retención junto con la detección espectroscópica. Los requisitos
de un soporte solido deben ser:
El tamaño de la partícula debe ser lo suficientemente grande como para
que el flujo circule libremente.
El material escogido debe ser químicamente inerte a los componentes de
las disoluciones y resistentes al flujo, garantizando así la reproducibilidad
del optosensor.
Compatible son el sistema de detección
El proceso de retención-elución debe ser lo suficientemente rápido.
Los materiales más utilizados como soporte sólido son:
Cambiadores iónicos derivados de polímeros de estireno: (Dowex 1, Dowex
50W,etc) Unidos al anillo aromático
se encuentran los grupos
cambiadores de iones, que pueden
presentar carácter ácido para
cambiadores catiónicos, o de base
para cambiadores aniónicos. En el
empleo del desarrollo de
optosensores hay que destacar que son muy útiles para la
15
retención/elución de complejos inorgánicos o en el caso de cambiadores
catiónicos, para la retención irreversible de reactivos orgánicos que formen
complejos con cationes. Los cambiadores aniónicos son menos útiles para
la retención irreversible de reactivos ya que al estar cargados
negativamente el anclaje sobre el cambiador se produce a través de los
grupos quelantes, inactivándolos.
Cambiadores iónicos derivados de polímeros de dextrano:(Sephadex SE y
SP, acido fuerte; Sephadex
GE, TEAE, QAE, base fuerte;
etc) están formados por
polisacáridos que se obtienen
entrecruzando dextrano con
epiclorhidrina, siendo por
tanto cambiadores de
naturaleza polar, debido a los
numerosos grupos hidroxilo existentes en los anillos de la estructura. Estos
soportes pueden ser utilizados para la retención de complejos con ligandos
tanto orgánicos como inorgánicos, ya que la naturaleza no aromática del
cambiador hace que la retención se produzca mediante interacciones casi
exclusivamente electrostáticas, facilitándose mucho la elución con respecto
a los cambiadores mencionados anteriormente.
Resinas absorbente sin grupos funcionales: están constituidas por cadenas
de poliestireno entrecruzadas mediante moléculas de divinilbenceno, pero
carentes de grupos funcionales cambiadores de iones. Estas resinas son
capaces de retener gran cantidad de reactivos aromáticos por adsorción;
de este modo los grupos funcionales quedan libres y no pierden su
capacidad de complejación. Pero su alta opacidad en toda la región del
visible limita fuertemente su uso.
Sílice con fases enlazadas: son soportes constituidos por microesferas de
sílice que poseen cadenas lineal hidrocarbonadas enlazadas a los grupos
silanol exteriores. La cadena suele ser de 2, 8, o 18 átomos de carbono.
Son materiales no porosos, por lo que presentan gran resistencia a los
cambios físico-químicos del medio. Estos son altamente útiles para la
retención de compuestos orgánicos aromáticos o no, ya que retienen
16
débilmente a estos compuestos y la elución puede conseguirse fácilmente
aumentando el porcentaje de disolvente orgánico en el medio. Son menos
selectivos que los cambiadores iónicos.
3.4. Fluorescencia inducida fotoquímicamente (PIF)
La fluorescencia molecular es un potente método de análisis ya que presenta una
alta sensibilidad y selectividad. Pero existen muchos compuestos en los que su
fluorescencia es nula o muy débil, por lo que su determinación fluorimétrica no
sería posible.
En algunos casos, la radiación produce fotoconversiones en la estructura del
analito originándose cambios en su fluorescencia, es decir, al irradiar el analito se
obtiene un fotoproducto, el cual se puede determinar fluorimetricamente. Este
fenómeno ha hecho poner a punto multitud de métodos que mediante el uso de
reacciones fotoquímicas aumente la sensibilidad, selectividad y reproducibilidad
de la detección fluorimétrica. Este método es la “Fluorescencia Inducida
Fotoquímicamente” que se denominará con las siglas PIF.
La radiación tiene propiedades que la hace un reactivo universal, ya que
dependiendo de la estructura química del compuesto, esta puede actuar
oxidando, reduciendo, hidrolizando y dando lugar a una gran variedad de
transformaciones.
En muchos compuestos la reacción fotoquímica lleva a un aumento del
coeficiente de absorción y del rendimiento cuántico de la fluorescencia con
relación a los de analito.
Para que se produzca una fotorreacción en la que se generen compuestos
fluorescentes a partir de analitos que no lo son, se deben cumplir una serie de
requisitos:
El analito debe absorber fuertemente en la región del UV.
17
La radiación absorbida debe ser de una longitud de onda que no sea
absorbida significativamente para los fotoproductos.
Deberá haber un aumento de la rigidez estructural o de la aromaticidad de
los fotoproductos que dé lugar a un aumento del coeficiente de absorción y
a un rendimiento cuántico de fluorescencia mayor que los del analito.
Estabilidad química y térmica de los fotoproductos.
Proceso de fotoconversión muy eficiente y alto rendimiento fotoquímico.
Este trabajo está basado en la implementación del PIF y optosensores en flujo
continuo. Por ello que la instrumentación necesaria será aquella utilizada
habitualmente en el FIA multiconmutado además de un nuevo elemento necesario
para llevar a cabo la fotoconversión del analito. Este nuevo elemento es el
fotorreactor, donde se encuentra la fuente de radiación.
En sistemas de flujo, la fotorreacción se lleva a cabo on-line con lámparas de baja
intensidad (aunque la potencia depende del analito) en el interior del fotorreactor,
que normalmente se construye de un material reflectante. El uso de
politetrafluoroetileno (PTFE) en sistemas de flujo es la forma más simple y
eficiente de construir un fotorreactor, esto consiste en enrollar helicoidalmente el
PTFE sobre la lámpara. En algunos casos es necesario un sistema de
refrigeración, puesto que la muestra puede calentarse y derivar en otro producto
no deseado, este puede ser un baño termostatizado o un ventilador dentro del
fotorreactor. Se debe tener en cuenta la fuente de radiación considerando
especial importancia en su longitud de onda, intensidad, tamaño y geometría. En
el mercado existen muchos tipos de lámparas que pueden usarse para llevar a
cabo una fotorreacción: lámparas de arco que contienen mercurio, xenón o
mezcla de ambos; de deuterio, hidrógeno, incandescentes, fluorescentes,
germicidas y láseres.
El tiempo de irradiación es un factor crucial que viene determinado por la longitud
del fotorreactor y el caudal en sistemas de flujo continuo. Existe un tiempo de
irradiación óptimo al cual se obtiene la máxima señal analítica, es decir, se
obtiene la máxima cantidad de fotoproducto. A valores inferiores al tiempo de
irradiación óptimo, existe una posibilidad de encontrar una cierta cantidad de
18
analito no fotoconvertido. Si por el contrario los valores son superiores, la
intensidad de la señal disminuye debido a que el fotoproducto se está degradando
en el medio de reacción en el que se encuentra.
3.5. Implementación de multiconmutación con PIF
Se han utilizado diferentes métodos fluorimétricos para la determinación de
compuestos fluorescentes, pero recientemente se ha descrito el método PIF, para
poder analizar compuestos de una fluorescencia nula o muy débil, originando un
fotoproducto el cual se puede medir con un método fluorimétrico. Por ello uno de
los objetivos de este trabajo es la implementación de sistemas de inyección en
flujo, como es la multiconmutación, con la metodología PIF.
El procedimiento está basado en retener, medir y eluir el analito previamente
fotoconvertido, mediante la metodología PIF. Desde el software se selecciona el
tiempo de inyección de la muestra, haciéndola pasar por el fotorreactor, donde se
produce una fotorreacción en la que el analito no fluorescente se convierte en un
fotoproducto, el cual llega hasta la célula de flujo, quedándose retenido en el
soporte sólido de su interior y por último el detector proporcionará la señal
analítica máxima del fotoproducto y se hará pasar un eluyente que permita la total
recuperación del soporte sólido.
Fig .4. Esquema general de multiconmutación implementada con PIF
19
Las primeras aplicaciones de este acoplamiento datan de 1991, para la
determinación de fenotiazinas en fármacos. Otras aplicaciones se describieron a
posteriori para compuestos de interés farmacológico, como el ansiolítico
diazepam, el analgésico paracetamol, etc. También han sido descritas otras
aplicaciones en matrices más complejas como la determinación de principios
activos como son las sulfonamidas o vitaminas K1, K3 y B1.
Al campo de análisis de residuos de pesticidas también se ha aplicado este
sistema como en la determinación de imidacloprid, tiabendazol, azoxistrobin.
En este trabajo este sistema se aplicará en la determinación de pesticidas como
es clotianidina que se describe a continuación.
4. ANALITO: Clotianidina
El analito propuesto para el desarrollo del sensor descrito en esta memoria es la
clotianidina, un pesticida que presenta gran interés agroalimentario.
La clotianidina [(E) -1 - (2-cloro-1,3-tiazol-5-ilmetil)-3-metil-2-nitroguanidina]
pertenece a la familia de los Neonicotinoides y fue desarrollado por Takeda
Chemical Industries y Bayer AG. Presenta actividad insecticida para aplicación al
suelo, agua, y tratamientos de semillas contra Hemípteros, Tisanópteros,
Lepidópteros, Dípteros y Coleópteros. Es absorbida por las plantas y luego
liberada a través del polen y el néctar como modo de acción en control de plagas,
haciéndola peligrosa para los insectos que se alimentan de estos productos de la
planta. Fue aprobada para el uso convencional como pesticida bajo registro
condicional por la United States Environmental Protection Agency en abril del
2003. En la Unión Europea también fue aprobada como pesticida, pero en 2013
20
se prohibió su uso junto con el tiametoxan y el imidacloprid. Su estructura se
muestra continuación.
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
5.1. Reactivos
Los reactivos utilizados fueron:
- Disolución madre de clotianidina 100 mg/L
- Tampón HAc/NaAc pH 5 0.015 M como portador
- Agua desionizada a pH básico
Las disoluciones estándar de los analitos se prepararon pesando una cantidad
determinada del patrón y disolviéndolo en agua desionizada, creando una
disolución madre de 100 mg/L, a partir de esta se prepararon las disoluciones
estándar a menores concentraciones para su determinación. Como portador se
utilizo un tampón de HAc/NaAc con pH 5 y una concentración 0.015 M, se preparó
pesando una cantidad determinada de acetato sódico, disolviéndolo en agua
Fig .5. Estructura de la Clotianidina. Sólido de cristales incoloros, poco volátil y no
fluorescente
21
desionizada y añadiendo el volumen adecuado de acido acético para conseguir el
pH del tampón.
Por último de eluyente se utilizó agua desionizada a pH básico, la basicidad se
consiguió añadiendo NaOH 0.03M (de este solo hace uso en las aplicaciones).
5.2. Instrumentación
La instrumentación utilizada es la requerida para sistemas en flujo continuo,
descrita anteriormente:
Sistema de propulsión: bomba peristáltica Gilson Miniplus-3
Fig.6. Bomba peristáltica Gilson Miniplus‐3
22
Sistema de inserción de muestra y selección de reactivos: está
compuesto por 3 válvulas solenoides de 3 vías tipo NResearch 161T031
conectadas a una interfaz electrónica y controladas mediante un software
desarrollado para este sistema.
Fig. 7. Válvulas solenoides de 3 vías tipo NRsearch 161T031
Fig.8. software empleado para la programación de las válvulas solenoides
23
Fotorreactor, está compuesto por una caja de aluminio en cuyo interior se
encuentra una lámpara de mercurio de 15W y sobre ella enrollado el tubo
de PTFE que transporta la muestra o reactivo(s).
Sistema de transporte: tubos de PTFE con un diámetro de 0.8 mm
Sistema de detección: compuesto por un espectrofluorímetro Varian Cary
Eclipse con lámpara de xenón de 75KW, controlado mediante un software
llamado kinetics. Para las medidas de fluorescencia se utilizó una célula
de flujo Hellma 176.725 QS de 25 µl de volumen interno y con un paso
óptico de 1.5 mm. En la que se añade lana de vidrio en el orificio de salida
para evitar la pérdida del soporte sólido.
Fig.9. Fotorreactor PIF listo para su implementación en sistemas de flujo
24
Fig.10. Espectrofluorímetro Varian Cary Eclipse
Fig.11. Software empleado para el control del espectrofluorímetro
25
5.3. Estudio de variables experimentales
Se consideran cuatro grupos de variables experimentales:
- Variables de la unidad de retención-detección
- Variables instrumentales
- Variables químicas
- Variables del sistema de flujo
Variables de la unidad de retención-detección
El primer paso que se realiza en la optimización del sensor es el estudio de las
variables de la unidad de retención-detección, que engloba las características de
la célula de flujo, la naturaleza del soporte sólido y el nivel de este en la célula.
En el apartado 5.2. Se describen las características de la célula de flujo utilizada
en este trabajo, la celda Hellma 176.725 QS.
Fig.12. Célula de flujo Hellma 176.725 QS
26
Puesto que la estructura del fotoproducto generado es desconocida, no se podía
predecir a priori el tipo de soporte sólido más idóneo y por ello se ensayaron
soportes de diferente naturaleza:
- no iónicos, gel de sílice C18
- aniónicos, Sephadex QAE-A25
- catiónicos, Sephadex SPC-25
Se realizó un primer ensayo con gel de sílice C18. El fotoproducto se quedaba
fuertemente retenido y la señal obtenida para este era muy intensa pero el
fotoproducto no llegaba a eluirse y era necesario el uso de un eluyente para que
la señal volviera a restablecerse. Por otra parte, la C18 generaba sobrepresiones y
era muy difícil mantener el flujo continuo.
El soporte sólido del tipo dextrano, Sephadex QAE A-25, no retenía el
fotoproducto, por lo que no se obtuvieron resultados para este.
Por último, el ensayo con el soporte Sephadex SPC-25 arrojó resultados
favorables, ya que el fotoproducto generado era fuertemente retenido en él,
obteniéndose así una señal elevada y de fácil elución; no era necesario el uso de
un eluyente.
De todos ellos el soporte seleccionado es el cambiador catiónico tipo dextrano,
Sephadex SPC-25, ya que este presenta las características adecuadas para el
sensor que queremos optimizar.
Para la determinación de la cantidad de soporte sólido en el interior de la célula
de flujo, se rellenó completamente la célula con el soporte y en el
espectrofluorímetro se irradió a una longitud de onda correspondiente a la región
del visible y con ayuda de un espejo se determinó la zona de incidencia del haz
sobre el soporte sólido. De esta manera la célula se rellenó con la mínima
cantidad de soporte sólido requerida para ello.
27
Variables instrumentales
El espectrofluorímetro utilizado permite la modificación de diversos parámetros
que pueden afectar a la señal analítica registrada. Estos parámetros deben ser
optimizados e incluyen la longitud de onda de excitación y emisión, anchura de las
rendijas de excitación y emisión, y el voltaje del detector.
Longitudes de onda PIF
La clotianidina no presenta fluorescencia, pero si esta es irradiada genera un
fotoproducto del cual si se puede medir su fluorescencia. De manera que las
longitudes de onda de excitación y emisión que se deben optimizar son las del
fotoproducto generado y así poder monitorizarlo sobre el soporte seleccionado,
Sephadex SPC-25.
A continuación se exponen los espectros de excitación y emisión obtenidos para
el analito una vez retenido en el soporte sólido:
28
Las longitudes de onda seleccionadas como optimas son 354 y 421 nm
correspondientes con los máximos de intensidad PIF de excitación y emisión
encontrados.
Voltaje y anchura de las rendijas de excitación y emisión
El estudio del voltaje y la anchura de las rendijas de excitación y emisión se
realizan conjuntamente, su optimización es necesaria para minimizar la señal de
fondo, obtener señales bien definidas y medir el fotoproducto en un amplio rango
de concentraciones.
Para la optimización de estas variables se consideraron los siguientes rangos:
rango de voltajes desde 650 hasta 750 para un ancho de rendijas 5/10; 10/10 y
10/20 respectivamente.
A
B
354 nm
421 nm
Fig.13. Espectro PIF para Clotianidina.
Concentración 500 ng/ml de clotianidina.
A) Espectro de excitación
B) Espectro de emisión
29
Como se puede observar en la figura 14, cuanto más abiertas se encuentran las
rendijas mayor es el valor de fluorescencia obtenido. No obstante, hay que tener
en cuenta la señal de fondo que proporciona el soporte sólido, llegando a una
solución de compromiso entre una señal de fondo baja y un valor de intensidad de
fluorescencia alto. Para un voltaje de 700 y 750 se obtenía saturación de la señal
por parte del soporte sólido cuando se empleaban rendijas de excitación y
emisión de 10 y 20 nm respectivamente.
Finalmente, el valor de voltaje seleccionado como óptimo es de 750 voltios,
siendo la anchura óptima para las rendijas de excitación y emisión, 5 y 10
respectivamente. De esta manera la señal de fondo del soporte sólido se
encuentra en torno a 300 unidades de fluorescencia.
0
200
400
600
800
1000
1200
5/10 10/10 10/20
voltaje 650
voltaje 700
voltaje 750
Voltaje y Rendijas de excitación/emisión
excitación/emisión
IFR
Fig.14. Representación grafica de los resultados obtenidos para la optimización del voltaje y las rendijas
excitación/emisión. Concentración 600 ng/ml de clotianidina.
30
Variables químicas
Como variables químicas de interés se estudiaron la naturaleza y concentración
del portador y eluyente, así como su pH y la influencia de este en la muestra.
Naturaleza, concentración y pH del portador y del eluyente
Se ha de tener en cuenta que la especie monitorizada no es la clotianidina sino un
fotoproducto generado a partir de ella, por lo que la disolución portadora debe ser
tal que no solo produzca retención en el soporte, sino que además debe ser
apropiada para la degradación de la clotianidina.
En primer lugar el portador ensayado fue una disolución de metanol en agua a
distintas concentraciones de metanol (10%, 20% y 40%), pero la intensidad de la
señal obtenida era mínima. Por ello se decidió utilizar como portador un tampón,
lo cual era coherente, si tenemos en cuenta la naturaleza iónica del soporte
sólido. Se llevó a cabo un estudio para varios tampones a distintos pHs y
concentraciones, en la siguiente tabla se recogen los tampones estudiados.
Portador (tampón) pH Concentración (M)
Na2HPO4/NaOH
8.2 0.03
6 0.03
HAc/NaAc
4.0 0.03
4.8 0.0075;0.015;0.02;0.03
5.0 0.0075;0.015;0.02;0.03
Tabla.1. Tampones estudiados para la optimización del portador
31
Para el tampón Na2HPO4/NaOH con un pH de 8,2 y 0.03 M no se obtuvo señal
fluorescente, por lo que se probó con este tampón Na2HPO4/NaOH a pH de 6. En
este caso la señal presentaba una intensidad elevada para una concentración de
500 ng/ml de clotianidina, pero este tampón estropeaba con facilidad el soporte
sólido.
De manera que se realizó un estudio sobre el tampón HAc/NaAc a diferentes
concentraciones y pHs. Se obtuvieron buenos resultados y no estropeaba el
soporte.
En la figura 15 se representa el estudio realizado para la optimización del portador
HAc/NaAc. A partir de esta representación, se puede observar que, el tampón
HAc/NaAc a pH 5 y una concentración 0.015 M, ya que se obtuvo una elevada
intensidad de la señal y eluyó el fotoproducto sin dificultad. Para una
concentración de 0.075 M la señal era mayor pero retenía fuertemente el
fotoproducto y la elución era muy lenta. Para el tampón HAc/NaAc a pH 4,8 las
intensidades de la señal fluorescente eran notablemente más bajas. El tampón
HAc/NaAc a pH 4.0, 0.03 M impedía la retención total del fotoproducto e interfería
en la señal disminuyendo su intensidad. Por todo ello, se seleccionó el tampón
HAc/NaAc a pH 5, 0.015 M, como óptimo.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0,0075 0,01 0,015 0,02
tampon ph 4,8
tampon ph 5
Estudio portador (tampón HAc/NaAc)
Cont. (M)
IFR
Fig.15. Estudio sobre el portador. Tampón HAc/Ac a pHs 4.8 y 5.0. Concentración clotianidina
500 ng/ml.
32
Este tampón hacía que el fotoproducto quedase retenido en el soporte, se
obtuviera la señal de éste y se eluyera, regenerándose así el soporte. Esto
simplifica el sensor, ya que evita el uso de otra disolución que actúe como
eluyente.
Sin embargo, se ha comprobado que cuando se usan muestras reales (aguas
minerales) esta elución no se produce completamente, debido a la mayor
complejidad de la matriz comparada con el agua bidestilada. Fue necesario el uso
de un eluyente. Para su optimización se ensayó utilizando como eluyente agua
desionizada y agua a pH básico. El agua desionizada eluía lentamente al
fotoproducto, mientras que el agua a pH básico, ajustada con NaOH 0.03M, si
eluía el fotoproducto rápidamente y regeneraba el soporte (Sephadex SPC-25)
completamente. Concentraciones más bajas de NaOH no alcanzaban el pH
idóneo para conseguir una elución completa.
Influencia del pH en la muestra
Se realizó un estudio del pH de la muestra, ya que dependiendo de la acidez o
basicidad que presenta la muestra pueden variar los resultados en la
determinación del fotoproducto generado.
Teniendo en cuenta que el portador presentaba un pH ácido, si el pH de la
muestra fuese básico tendríamos cambios bruscos en la señal de fondo debido a
la diferencia entre los pHs de ambos. De manera que el pH óptimo debería ser un
pH ácido o próximo al del tampón, HAc/NaAc pH 5.0, 0.015 M.
El estudio se realizó con disoluciones con una concentración de clotianidina de
100 ng/ml, que variaban desde pH ácido a básico.
33
El valor óptimo de pH seleccionado para la muestra fue de 5.0, valor que coincide
con el del tampón. El pH se ajustó con la disolución tampón HAc/NaAc pH 5.0
0.015 M, utilizada como portador.
Variables del sistema de flujo
Una vez optimizadas las variables químicas se procedió al estudio de las
variables del sistema de inyección en flujo utilizado, siendo estas: el tiempo de
irradiación, tiempo de inserción y caudal.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 2 4 6 8 10 12
Ph muestraIFR
pH
Fig.16. Estudio pH de la muestra. Concentración clotianidina 100 ng/ml.
34
Tiempo de irradiación
El tiempo de irradiación puede ser considerado una variable química, pero se
estudia dentro de las variables del sistema de flujo porque en definitiva consiste
en el tiempo de permanencia en el fotorreactor, el cual depende de la longitud y
voltaje de la lámpara de este último y del caudal. Siendo la intensidad de
radiación constante, el tiempo de irradiación tiene un efecto decisivo en la
reacción fotoquímica y por tanto en la sensibilidad obtenida. Es todo esto el
criterio utilizado para la optimización de esta variable. El efecto del tiempo de
irradiación en la fluorescencia de la muestra se evaluó inyectando un volumen
constante de muestra, 1.3 ml de una disolución de clotianidina de 100 ng/ml. Una
vez que todo el bucle de muestra se encontró en el fotorreactor, cuya longitud era
de 45 cm y voltaje de la lámpara 15 W, se detuvo el flujo (stop-flow). Fue
entonces cuando se irradió la muestra durante intervalos crecientes de tiempo.
Por último se determinó la señal fluorescente del fotoproducto generado. En la
figura 17 se representa el estudio realizado sobre el tiempo de irradiación.
.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo de irradiación (stop‐flow)IFR
t.irradiacion (s)
Fig.17. estudio del tiempo de irradiación. Concentración clotianidina 100 ng/ml.
35
El tiempo de irradiación seleccionado como óptimo, es de 54 s.
Tiempo de inserción
El tiempo de inserción es el tiempo durante el cual se inyecta la muestra, que
dependerá de la velocidad con la que se mueva la bomba peristáltica (sistema de
propulsión). Esto es una de las bases del sistema de flujo multiconmutado, como
ya se ha comentado anteriormente. Una vez conocido el tiempo de inserción y el
caudal será posible calcular el volumen de inyección.
En la figura 18 podemos observar el estudio realizado para esta variable. De
donde determinamos que el tiempo de inserción óptimo es 70 s. A partir de este
tiempo la intensidad de la señal, la cual tiende a aumentar conforme aumenta el
tiempo de inserción, presenta una ligera tendencia a curvarse en lugar de seguir
aumentando. No hay incremento lineal a partir de 70 segundos.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 20 40 60 80 100 120
tiempo de insercion
tiempo (s)
IFR
Fig.18. estudio del tiempo de inserción. Concentración clotianidina 400 ng/ml.
36
Caudal
En el apartado anterior ya se ha descrito que el volumen de inyección es una
consecuencia del tiempo de inserción de la muestra. La optimización del volumen
de inyección se llevo a cabo manteniendo el tiempo de inserción constante, 70 s,
y variando la velocidad de la bomba peristáltica.
En la tabla que se presenta a continuación se recogen los caudales, volúmenes y
señales para las distintas velocidades de la bomba peristáltica.
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
Volumen de inyección
Volumen (ml)
Velocidad bomba Caudal (ml/min) Volumen (ml) IFR
8 0,9 1,05 57
9 1 1,16 72
10 1,1 1,28 85
11 1,2 1,4 99
12 1,3 1,51 113
13 1,4 1,63 120
Fig. 19. Volumen de inyección. Concentración 100 ng/ml clotianidina.
Tabla.2. Datos experimentales para el volumen de inyección
IFR
37
Para un volumen de 1.63 ml se comprueba que empieza a perderse la linealidad
de manera que el incremento de sensibilidad es lineal hasta un caudal de 1.3
ml/min.
Por tanto, el volumen de inyección seleccionado como óptimo es 1,51 ml,
correspondiente a un caudal de 1,3 ml/min. Este caudal seleccionado como
óptimo no genera sobrepresiones, hace que se retenga el fotoproducto a su
debido tiempo y se mantiene un buen ritmo de inyección de muestras.
5.4. Configuración del flujo y resumen de variables optimizadas
En la figura 20 se representa la configuración del sistema de flujo una vez
optimizado. Se puede observar esquemáticamente el sistema FIA multiconmutado
y su implementación con la metodología PIF.
La muestra tamponada con HAc/NaAc pH 5.0, 0.015 M se inyecta a través de la
válvula 3 seguida del portador (controlado por la válvula 5), pasando por el
fotorreactor durante 54 s. El fotoproducto generado se transporta hasta el soporte
sólido emplazado en la célula de flujo, donde se retiene y mide su señal analítica.
Una vez alcanzada la señal máxima el portador no es capaz de eluir
completamente el fotoproducto cuando se aplica a muestras reales. Será
necesario el uso de un eluyente. Después de inyectar la muestra se hace pasar el
eluyente, agua a pH básico, controlado por la válvula 2.
Fig.20. Configuración del sistema de flujo
38
6. Calibración del sistema de flujo. Parámetros analíticos
Una vez optimizadas las variables experimentales que influyen en la respuesta del
sensor, es necesario comprobar la existencia de una relación lineal entre la
intensidad de fluorescencia relativa y la concentración de clotianidina, el intervalo
de concentraciones en el que existe esa relación y la función de calibrado
correspondiente.
Se prepararon para ello diferentes disoluciones patrón de clotianidina de
concentraciones crecientes y se inyectaron en el sistema. Para cada nivel de
concentración se realizo la inyección por duplicado.
Variables de retención‐detección
• Soporte sólido: SPC‐25
Variables Instrumentales
• λexc/λem (nm): 354/421
• Rexc/Rem: 5/10
• Voltaje (v): 750
Variables Quimicas
• portador:HAc/NaAc
• pH portador: 5.0
• Conct. portador (M): 0.015
• pH muestra: 5.0
Variables del Sistema de Flujo
• Tiempo de irradiación (s): 54
• L.fotorreactor (cm)/potencia(w): 45/15
• Caudal (ml/min): 1.3
• Ttiempo de inserccion (s): 70
• Volumen de inyección (ml): 1.51
Resumen de las variables optimizadas:
Tabla.3. Resumen de las variables optimizadas
39
Concentración de
clotianidina ( ng/ml ) IRF
5 44.5
10 54
20 65
50 92.5
150 167
300 271
450 374.5
600 414
800 483
Fig.21. Fiagrama de calibración para la clotianidina.
Concentraciones en ng/ml
Tabla.4. Disoluciones patrón de la recta de calibrado. Concentración y señal.
40
De la figura 22 obtenemos la ecuación de la recta de calibrado que relaciona la
intensidad de fluorescencia con la concentración del analito: 74.497313.0 xy
R2= R=√0.9979 0.9989; es el coefieciente de correlación.
Los parámetros analíticos evaluados son el límite de detección y cuantificación,
frecuencia de muestreo y repetitividad.
Para el cálculo del límite de detección y cuantificación (LOD Y LOQ
respectivamente) consideramos el primer punto de calibración como el LOQ, de
manera que el LOD será: 3.3. Tendremos así: LOQ = 5; LOD = 1.5.
La frecuencia de muestreo (número de muestras que pueden ser analizadas en
una hora) es de 14 muestras la hora.
La repetitividad del sensor se evaluó inyectando diez disoluciones de clotianidina
de 250 ng/ml y determinando la señal analítica obtenida. Mediante el análisis
y = 0,7313x + 49,74R² = 0,9979
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 100 200 300 400 500
Recta de CalibradoIFR
Conc (ng/ml)
Fig.22. Recta de calibrado para la clotianidina.
41
estadístico se obtiene la desviación estándar relativa: 0.75%. Se pone así de
manifiesto que el sensor propuesto es muy reproducible.
7. Aplicaciones analíticas
El sensor propuesto ha sido aplicado a la determinación de clotianidina en tres
aguas minerales diferentes adquiridas comercialmente, enumeradas del 1 al 3.
En primer lugar se realizó un análisis de cada tipo de agua mineral, tal cual
llegaron al laboratorio, y como era de esperar, no se obtuvo señal analítica puesto
que no contenían clotianidina. Por lo que hubo que fortificar las muestras, esto es,
añadir una cantidad conocida de clotianidina a las muestras y determinar la señal
analítica. De esta forma se comprueba la aplicabilidad del sensor.
Al tratarse de agua mineral no fue necesario realizar un tratamiento previo de la
muestra. En la tabla 5 se describen las concentraciones para la fortificación y la
recuperación del analito.
Fig.23. Repetitividad del sistema. Concentración clotianidina de 250 ng/ml.
42
Las recuperaciones se encuentran entre 98.4 y 103 % con RSD inferior a 3, por lo
que la recuperación en los diversos tipos de agua es satisfactoria.
Para la determinación de clotianidina en aguas minerales fue necesario el uso de
un eluyente. Al medir el fotoproducto se obtenía señal pero este se quedaba
retenido y no se recuperaba la línea base. Esto fue debido a las sales y cationes
que se encuentran en el agua, las cuales ocupaban los poros del soporte
impidiendo la elución completa del fotoproducto. Para evitar este problema se usó
como eluyente agua a pH básico ajustada con NaOH 0.03 M, de esta forma el
analito se eluía sin problema y el soporte se regeneraba completamente.
Agua mineral
Fortificado
(ng/ml)
Señal (nm)
Recuperación
(%) ± RSD
1
200 202 100.2 ± 1
300 293 100.9 ± 1
500 392 98.4 ± 2
2
200 198 101.2 ± 1
300 291 100.8 ± 3
500 350 99.6 ± 1
3 150 191 103 ± 2
400 322 100.3 ± 2
Tabla .5. Determinación de clotianidina de las distintas aguas minerales.
43
8. CONCLUSIONES
De los estudios realizados podemos concluir que:
El sensor optimizado goza de unas características que hacen de este un
método sencillo, de alto grado de automatización, preciso y reproducible ya
que se basa en el tiempo de inserción de la muestra.
El soporte sólido proporciona la ventaja de aumentar la señal analítica ya
que preconcentra el fotoproducto generado al quedar retenido de manera
que se podrán determinar concentraciones muy pequeñas.
La derivatización fotoquímica presenta claras ventajas frente a la
derivatización química como en la rapidez de la fotoconversión y el uso de
radiación UV en lugar de reacciones derivatizadoras que evita la dilución de
la muestra y esto supone un aumento de la sensibilidad y un ahorro
económico puesto que no es necesario el uso de reactivos químicos,
resultando ser también respetuoso con el medio ambiente.
Es necesario un eluyente para reponer el soporte. El eluyente debe ser
básico para eliminar los cationes que quedan retenidos, lo cual, provoca un
cambio de pH que permite la recuperación de la línea base y por tanto del
sensor.
44
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45
