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SEQUENCIAMENTO
DE
DNA
SEQUENCIAMENTO DE DNA
• TÉCNICA
• PRÁTICA MÉDICA HOJE
• FUTURO
TÉCNICA:
1. EXTRAÇÃO DO DNA: A TÉCNICA VARIA DE ACORDO COM O MATERIAL.
PROTEINASE
DETERGENTES
CENTRÍFUGA
ETANOL
TÉCNICA
2. AMPLIFICAÇÃO
PCR {DNA + PRIMER + dNTP + Taq polimerase
95o C : denatura
60o C: anelamento do primer e extensão da molécula pela taq polimerase
3. ANÁLISE E QUANTIFICAÇÃO DO MATERIAL AMPLIFICADO
TÉCNICA
4. MARCAÇÃO
PCR { MATERIAL AMPLIFICADO + PRIMER+ dNTPs + ddNTPs MARCADOS + Taq polimerase
A Taq pol pode adicionar também análogos dos nucleotídeos. O método de Sanger usa essa
habilidade para incorporar ddNTPs à sequência. Quando um ddNTPs é incorporado à cadeia, a
extensão termina seletivamente em A,C,G ou T devido a falta o grupo 3´OH.
TÉCNICA
5. SEQUENCIAMENTO: o sequenciador automático detecta a fluorescência dos 4 diferentes ddNTPs marcados. As quatro cores podem ser detectadas isoladamente , graças a eletroforese capilar.
PREVENÇÃO GENOTÍPICA
PREVENÇÃO FENOTÍPICA