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Simonetta GalleriniResponsabile di Laboratorio
Seminari ALA ‐ L’Accreditamento: significato per i Laboratori ed applicazione nei controlli degli alimenti ARPAM, Pesaro 20 Novembre 2013
La struttura della Biochemie Lab si articola in quattro diversi settori:CHIMICO (environment, food e non food)MICROBIOLOGICO (analisi microbiologiche di base e di ricerca nel settore
alimentare, agro‐zootecnico, ecologico‐ambientale, cosmetico, food‐packaging, igiene industriale, ristorazione collettiva)ECOTOSSICOLOGICO BIOLOGIA MOLECOLARE (OGM)
Al fine di assicurare la qualità del dato Biochemie Lab partecipa costantemente a circuiti interlaboratorio nazionali e internazionali (UNICHIM, QM UK, FAPAS, FEPAS, LG Standard) e confronti interlaboratorio gestiti da vari Dip.ti ARPA.
Biochemie Lab è un’impresa giovane e dinamica, che ha sempre prestato attenzione al miglioramento del servizio, a favore della qualità e della tecnologia.
In particolare:per quanto riguarda la qualità, questa scelta ha segnato tutto il percorso di
sviluppo della Biochemie Lab, che fin dal principio ha ottenuto la certificazione UNI CEI EN 45001, successivamente aggiornata in UNI CEI EN ISO IEC 17025 rilasciata prima da SINAL e oggi mantenuta con ACCREDIA con 422 prove accreditate. L’ulteriore conseguimento delle certificazioni ISO 9001 (CERTIQUALITY) su tutti gli ambiti di attività e ISO 14001 (DNV), completano il percorso;
per quanto riguarda la tecnologia, Biochemie Lab ha sempre investito in strumenti di ultima generazione ed in processi innovativi grazie ai quali si sono potute sviluppare sia la qualità sia l’attuale potenzialità produttiva.
Di recente, Biochemie Lab si è dotata di un Laboratorio Mobile equipaggiato con strumentazione avanzata, che lo rende in grado di operare autonomamente in molti settori. Ciò significa spostarsi velocemente con tutto l’occorrente su tutto il territorio nazionale, eseguire le prove “on site” nel momento in cui servono.
Questo tipo di servizio permette di avere risultati analitici immediati e poter quindi decidere immediatamente che tipo di azioni di risanamento effettuare con un notevole risparmio economico e di tempo per i clienti.
Certificazioni, autorizzazioni e riconoscimenti ACCREDITAMENTO ACCREDIA, con il numero 0195 come laboratorio operante in
conformità alla Norma UNI CEI EN ISO IEC 17025:2005.CERTIFICAZIONE UNI EN ISO 9001/2008 “Servizi di analisi chimiche, fisiche,
microbiologiche, biomolecolari, ecotossicologiche, di ricerca, di campionamento, di consulenza tecnica e di formazione”, certificata da CERTIQUALITY.CERTIFICAZIONE UNI EN ISO 14001/2004 “Erogazione di servizi di analisi chimiche, fisiche,
microbiologiche, biomolecolari, ecotossicologiche, di ricerca e di assistenza tecnica, di campionamento, di consulenza e di formazione”, certificata da DNV. ISCRIZIONE in via definitiva nell’elenco della Regione Toscana dei laboratori che effettuano
analisi nell’ambito delle procedure di autocontrollo delle industrie alimentari (n. di iscrizione 010). Autorizzazione del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali, Dipartimento della
Qualità dei Prodotti Agroalimentari e dei Servizi, ad eseguire per l’intero territorio nazionale analisi ufficiali nel settore oleico, ai sensi della regolazione nazionale e comunitaria in materia (Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 02/02/2004 – Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 09/05/2007 ‐ Decreto del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali del 21/01/2011).RICONOSCIMENTO del COI (Consiglio Oleicolo Internazionale). QUALIFICA del Ministero della Salute nell’elenco dei laboratori relativo ai programmi di
qualificazione per l’analisi sull’amianto (MOCF, FT‐IR).ABILITAZIONE della Regione Toscana alle analisi previste dagli allegati al D.Lgs 99/1992
“utilizzo dei fanghi di depurazione in agricoltura”.ISCRIZIONE del Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali nell’elenco nazionale
dei laboratori competenti a prestare i servizi necessari a verificare la conformità dei prodotti in materia di fertilizzantiINTERCALIBRAZIONI con ARPA (Lombardia, Liguria, Toscana, Campania, Sardegna, Sicilia).
Metodo interno MP 015:Determinazione del contenuto di istamina nel pesce fresco e conservato, nei prodotti di gastronomia a base di pesce, nei prodotti ittici mediante HPLC
Riferimenti bibliografici: UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 “Requisiti generali per la competenza dei laboratori
di prova e taratura”Documento ACCREDIA RT‐08 “Prescrizioni per l'accreditamento dei laboratori di
prova”Documento ACCREDIA DT‐0002 “Guida per la valutazione e l’espressione
dell’incertezza nelle misurazioni”ARPA Emilia Romagna 2002, “Linee guida per la validazione dei metodi analitici e
per il calcolo dell’incertezza di misura”Manuali UNICHIM 179/0, 179/1, 179/2, 179/3 Linee guida per la convalida dei metodi
analiticiManuale Unichim 177/14 Ed.1995 Linee guida per la taratura della strumentazione
analitica – cromatografi in fase liquidaReg UE n.1019/2013 della Commissione del 23/10/2013 che modifica l’allegato I del
Regolamento (CE) n. 2073/2005 relativo all’istamina nei prodotti della pesca IZS Regioni Lazio e Toscana, “Validation and comparison of analytical methods for
the determination of histamine in tuna fish samples”, Journal of Chromatography A, 1032 (2004), 79‐85
Valutazione e scelta del metodo da accreditare
La prima operazione che il laboratorio deve compiere per corrispondere alle esigenze del cliente ed individuare un metodo appropriato per la prova da eseguire consiste nel verificare i seguenti passaggi:
Aggiornamento
LegislativoRichiesta del
cliente
SI
Metodo interno
Verifica parametri di qualità del metodo,
verifica adeguatezza ai limiti di legge, verifica
esigenze del cliente
Metodo conforme
Scelta del metodo
NO
Metodi Normalizzati
1) Metodi ufficiali pubblicati in GU
2) Metodi internazionali
1) Metodi pubblicati su riviste scientifiche
2) Metodi progettati e sviluppati dal laboratorio
Convalida metodo interno
Ulteriori requisiti valutati nello studio di fattibilità di un metodo analitico:
Ottimizzazione dei tempi analiticiStrumentazione idoneaFacilità di utilizzo e semplificazione dei passaggi analitici in modo da ottenere in
tempi brevi risultati analitici affidabiliAssenza di requisiti ambientaliRiduzione dei volumi di rifiuti prodottiGrado di precisione ed accuratezza adeguatiRiduzione del rischio legato alla sicurezza degli operatori
PIANO DI VALIDAZIONE DEL METODO
1.Controlli di buon funzionamento dello strumento e verifica della linearità della retta di
taratura del metodo
2.Determinazione della precisione e dell’accuratezza del metodo e verifica del t‐test
3.Calcolo dell’incertezza di misura da associare al dato analitico
4.Studio dell’andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione
5.Partecipazione a circuiti interlaboratorio o acquisto di matrici certificate
6.Monitoraggio delle prestazioni del metodo mediante carte di controllo
7.Riesame annuale della validazione del metodo
Per la convalida di un metodo interno il laboratorio deve verificare le proprie prestazioni per i seguenti punti:
1.Limite di rilevabilità2.Limite di quantificazione3.Linearità4.Accuratezza5.Precisione6.Ripetibilità7.Specificità
Inoltre, valuta la partecipazione a circuiti interlaboratorio (ad es. FAPAS) o l’acquisto di matrici certificate da inserire periodicamente a sorpresa nella routine analitica per valutare il mantenimento dei requisiti prestazionali sia del metodo sia dell’operatore.
1. Limite di rilevabilità e limite di quantificazione del metodo
Per il limite di rilevabilità, è stata determinata in modo empirico una concentrazione soglia (cut off) al di sotto della quale la selettività diventa inapplicabile. Sono state replicate per 6 volte una serie di determinazioni a concentrazione su campione pari a 10 mg/Kg, fortificando la matrice priva dell’analita di interesse ed è stato valutato quante volte si è avuto esito positivo; ci siamo imposti una soglia di accettabilità di positivi/negativi pari a 80%. Il risultato costituisce il valore di soglia da considerarsi come limite di rilevabilità.
Come limite di quantificazione, è stato adottato il punto più basso della retta di taratura, calcolando ovviamente la concentrazione che corrisponde nel campione.
2. Verifica della linearità della retta di taratura del metodo
La linearità di un metodo analitico è la capacità dello stesso di produrre risultati che siano direttamente proporzionali alla concentrazione dell’analita in un range determinato.
La linearità viene determinata calcolando sia il coefficiente di correlazione (r2) in una regressione lineare dei risultati ottenuti dall’analisi di campioni contenenti differenti concentrazioni di analita sia lo scarto tipo dei residui della retta.
La linearità è verificata mediante la costruzione del grafico dei residui della regressione riportando in ordinata i residui (yisper – yicalc) e in ascissa i valori teorici corrispondenti.
Criteri di accettabilità:C’è correlazione lineare se il grafico dei residui mostra una distribuzione casuale dei residui attorno all’asse delle ascisse.Il coefficiente di correlazione (r2) ≥0,990Scarto tipo dei residui della retta ≤10%
3. Determinazione della precisione e dell’accuratezza del metodoPer i criteri di accettabilità abbiamo fatto riferimento alla Tabella 2 della Decisione CE 657/2002 che attua
la direttiva 96/23/CE, relativa al rendimento dei metodi analitici e all’interpretazione dei risultati.
Come criterio di accettabilità del CV% abbiamo fatto riferimento alla Tabella 3 della Decisione CE
657/2002 ed è stato considerato che doveva essere ≤16%.
Per la determinazione della precisione e dell’accuratezza del metodo è stata valutata la ripetibilità (6 prove) a 3 livelli:il primo livello a una concentrazione bassa del campo di misura del metodo (35 mg/Kg)il secondo livello viene effettuato a una concentrazione intermedia del campo di misura (80 mg/Kg)il terzo livello viene effettuato a una concentrazione vicino al limite di legge del parametro interessato (200 mg/Kg)
Intervallo di concentrazione (μg/kg)
Intervallo raccomandato recupero
<1.0 ‐50 ‐ +20 %
1 – 10 ‐30 – +10 %
>10 ‐20 – +10 %
Intervallo di concentrazione (μg/kg) CV % raccomandato
100 23
1000 16
4. Verifica del t‐test
Per verificare se i risultati analitici devono essere corretti o no per il recupero è stato
valutato il t‐test tramite la seguente formula:
per n=6, il tp,ν assume il valore pari a 2.52
Se t sperim ≤ tp,ν , allora il risultato finale può non essere corretto per la percentuale di recupero, altrimenti il valore analitico dovrà essere corretto per il recupero.
In questo caso i risultati del t‐test per tutti i livelli valutati sono conformi alla relazione sopra indicata, pertanto il laboratorio non corregge i risultati per il recupero.
5. Calcolo dell’incertezza di misura da associare al dato analitico
Per ogni grandezza di ingresso devono essere calcolate le sue incertezze di ingresso che possono essere divise in due categorie, denominate A e B, in relazione al modo in cui sono stimate: categoria A, se è stimata a partire da dati sperimentali ricavati dalla misurazione diretta di una o più grandezze di ingresso come parte del procedimento per ottenere i valori del misurandocategoria B, se il suo valore è ricavato da informazioni o dati esterni alla sperimentazione condotta per determinare i valori del misurando
I contributi all’incertezza estesa sono i seguenti:Incertezza relativa di ripetibilitàIncertezza relativa di taratura, viene utilizzato il criterio di accettabilitàdefinito per la verifica intermedia di taratura. In questo caso tale incertezza èintesa come incertezza rettangolare e pertanto va divisa per .
Ad es. prima di ogni ciclo di analisi si verificano due punti della retta di taratura (il primo e il terzo): la concentrazione letta dallo strumento deve ricadere nell’intervallo ±10% rispetto al valore ottenuto in sede di taratura precedente alla verifica. In questo caso l’incertezza di taratura relativa sarà
Incertezza relativa di taratura della bilanciaIncertezza relativa di vari contributi (MR, matraccio, pipetta)
Parametro: Operatore:Metodo: Data: Matrice/Campione:
mg/Kg Recupero (%) RecuperoProva 1 64,6 80,7 0,807Prova 2 76,3 95,4 0,954Prova 3 79,4 99,2 0,992Prova 4 66,7 83,4 0,834Prova 5 66,9 83,6 0,836Prova 6 81,2 101,5 1,015
Calcolo dell'incertezza della ripetibilità: Incertezza ripetibilità relativa 0,041Valore medio (mg/Kg) 72,5 Incertezza relativa recupero 0,041Varianza 52,802 Incertezza taratura relativa 0,058Scarto tipo 7,27 Incertezza relativa del MR 0,00E+00Coeff. di variazione % 10,0 Incertezza tarat. relativa bilancia 1,330E-03Unità di formato 0,001 Incertezza relativa vetreria 0,000
52,802 Incertezza relativa pipetta 0,0008,800
Scarto tipo della media 2,967Limite di ripetibilità (mg/Kg) 26,4Incertezza ripetibilità relativa 0,041
0,100
Scarto tipo relativo metodo normalizzato
Incertezza relativa recupero:valore medio recupero (%) 91varianza recupero 8,250E-03scarto tipo recupero 0,091
0,037Incertezza relativa recupero 0,041
Incertezza della taratura:10
Incertezza taratura relativa 0,058
Incertezza del materiale di riferimento:Incertezza del MR in % (come da certificato)Incertezza relativa del MR
Incertezza taratura relativa della bilancia:
Incertezza tarat. relativa bilancia 1,330E-03
Incertezza relativa della vetreria:incertezza vetreria: 0,007volume (mL): 10Incertezza relativa vetreria 4,04E-04
Incertezza relativa della pipetta:
Incertezza relativa pipetta
Incertezza estesa:6,68E-03
Incertezza composta relativa 0,082Incertezza composta 5,928Incertezza estesa (mg/Kg) 15,2Incertezza estesa relativa 0,210repliche effettuate per calcolo ripetibilità (n) 6repliche effettuate per det campione (m) 1
9,11E-03Incert. estesa relativa su campione 0,25Incert. estesa relativa su campione (%) 25Gradi di libertà 36
Pesce
Dati Grafico
Scarto tipo relativo
Istamina Andrea DrioliMP 015 21/09/2011
Incertezza ripetibilità relativa
Incertezza relativa recuperoIncertezza
taratura relativa
Incertezza relativa del MR
Incertezza tarat. relativa bilancia
Incertezza relativa vetreria
Incertezza relativa pipetta
Contributi incertezza estesa relativa
Incertezza ripetibilità relativaIncertezza relativa recuperoIncertezza taratura relativaIncertezza relativa del MRIncertezza tarat. relativa bilanciaIncertezza relativa vetreriaIncertezza relativa pipetta
6. SpecificitàPuò essere definita come la proprietà di un metodo di determinare
inequivocabilmente l’analita di interesse, con un livello prefissato di
accuratezza, in presenza di interferenze.
Per l’istamina si utilizza come detector il DAD a una λ specifica (214
nm).
Sono state lette, quindi, le matrici tali e quali, denominate bianchi,
verificandone l’assenza di principi attivi e segnando i picchi di matrice
di intensità tale da poter essere considerati delle interferenze.
Sono stati poi lette le soluzioni dei Materiali di Riferimento e di seguito
le matrici con l’aggiunta al campione iniziale di quantità scalari note di
Materiali di Riferimento.
Si è eseguito successivamente il confronto degli spettri tra le risposte dei
campioni fortificati, quelle originate dalle soluzioni ed i bianchi.
7. Studio dell’andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione
Occorre valutare l’andamento dello scarto tipo di ripetibilità in funzione della concentrazione, ovvero scegliere
il modello di funzione che correli nel miglior modo la ripetibilità alla concentrazione così da poterlo poi
applicare per calcolare la ripetibilità all’interno di tutto il campo di applicazione del metodo. Si fa
riferimento al Manuale Unichim 179/1 «Linee guida per la validazione di metodi analitici nei Laboratori
chimici». Si possono presentare due casi:a) lo scarto tipo di ripetibilità si mantiene statisticamente costante in tutto l’intervallo esaminatob) lo scarto tipo di ripetibilità varia in tutto l’intervallo considerato
Nel caso a) si calcola la media quadratica pesata degli scarti tipo Sr ottenuti nelle prove di ripetibilità, che saràassunta come parametro caratteristico del metodo.
Nel caso b) si indaga sulla relazione funzionale che meglio approssima l’andamento dello scarto tipo Sr con la media. Il criterio applicato dal laboratorio per decidere se vale il caso a) oppure il caso b) si basa sul confronto delle varianze S2r .
In particolare, dato che il laboratorio conduce per ogni livello lo stesso numero di prove (6), il criterio viene espresso dalla formula:
dove S2rmax e S2rmin sono rispettivamente la varianza massima e la varianza minima, Fρ è la variabile di Fisher il cui valore è
tabulato nel Prospetto 8 del Manuale Unichim 179/1. Nel nostro caso, essendo sempre n pari a 6, il valore di F è
5.05.
Se la formula precedente è verificata allora le varianze si possono giudicare equivalenti e quindi anche gli scarti
tipo, altrimenti occorre determinare la funzione che meglio correla la ripetibilità alla concentrazione.
Nel caso in cui la formula precedente non sia soddisfatta, si prendono in esame tre modelli di relazione
funzionale:
Relazione I, retta passante per l’origine
Relazione II, retta con intercetta diversa da zero
Relazione III, curva logaritmica per c+d<1
La varianza dei residui di una curva di regressione ottenuta con una delle tre relazioni sopra citate èdata dalla seguente formula:
Si sceglie il modello di relazione funzionale che meglio approssima i punti sperimentali con la minima varianza dei residui.
Per impiegare questo criterio basta calcolare il valore numerico di mediante la formula
precedente per ciascuna relazione f unzionale considerata e adottare quella a cui corrisponde il
minimo.
Tuttavia, potrebbe essere risultato tale solo per caso; per controllare questa ipotesi, si procede alla verifica della
omogeneità delle varianze secondo Bartlett. La formula da utilizzare è la seguente:
La verifica si effettua consultando il caso denominato “a due vie” riportato nel prospetto 10 del Manuale Unichim
n.179/1, tenendo conto che i gradi di libertà sono ν=f‐1 essendo f il numero totale delle relazioni considerate e
quindi anche il numero delle varianze da confrontare, mentre il livello di probabilità ρ=(1‐α/2)‐α/2 è fissato a 0.95.
Il criterio per giudicare se le varianze sono omogenee può essere così espresso:
I valori di χ2ν=f‐1,ρ=0.025 e χ2ν=f‐1,ρ=0.975 sono tabulati nel prospetto 10 del Manuale Unichim n.179/1.
Se questo criterio risulta essere soddisfatto, si può affermare che le varianze sono fra loro omogenee e nessuna in
particolare può essere ritenuta effettivamente minore delle altre e in questo caso si può considerare che tutte le
curve approssimano i punti sperimentali in modo equivalente. Quindi viene scelta la relazione I che è la più
semplice.
Se il risultato della verifica è invece tale che M cade all’esterno dell’intervallo definito e cioè
allora si può affermare che le varianze non sono fra loro omogenee e che la varianza
è realmente inferiore alle altre.
Relazione I Sr sperimentali y media Sr stimati con la relazione I residui residui al
quadrato N° livelli
0,04603 0,648 0,02953 0,01650 0,000272 30,08200 2,383 0,10860 -0,02660 0,000707
0,28356 9,067 0,41330 -0,12974 0,016832
b 0,04558(V(ej))f=I 0,008906
Relazione II Sr sperimentali y media 1/Sj2 ymediaj/Sj
2 (ymediaj)2/Sj2 1/Sj ymediaj/Sj
Sr stimati con relazione II
0,04603 0,648 471,928141 305,730781 198,062591 21,723907 14,073471 0,0441300,08200 2,383 148,714364 354,311973 844,148276 12,194850 29,054230 0,0896030,28356 9,067 12,437068 112,766899 1022,457478 3,526623 31,975889 0,264831
T1 633,079574T2 772,809653T3 2064,668344T4 37,445380T5 75,103590
a1 0,027148b1 0,026214
Sr stimati con relazione II 1/Sj
2 ymediaj/Sj2 (ymediaj)2/Sj
2 1/Sj ymediaj/Sj
0,055806 321,097775 208,017842 134,760892 17,919201 11,6086560,062636 254,892931 607,282409 1446,850339 15,965367 38,0374860,088953 126,380156 1145,888874 10389,774425 11,241893 101,930243
T1 con relaz II 702,370862T2 con relaz II 1961,189125T3 con relaz II 11971,385656T4 con relaz II 45,126461T5 con relaz II 151,576385
a2 0,053255b2 0,003937
Sr sperimentali y media Sr stimati con relazione II residui residui al
quadrato0,04603 0,648 0,0558 0,0098 0,0000960,08200 2,383 0,0626 -0,0194 0,0003750,28356 9,067 0,0890 -0,1946 0,037871
(V(ej))f=II 0,038341
Relazione IIISr sperimentali y media log y media (log y media)2 log Sr (log y
media)(log Sr)0,04603 0,648 -0,188537 0,035546 -1,336938 0,2520620,08200 2,383 0,377033 0,142154 -1,086176 -0,4095240,28356 9,067 0,957464 0,916737 -0,547359 -0,524076
T1 1,145960T2 1,094436T3 -2,970473T4 -0,681539
c -1,25374d 0,69003
Sr sperimentali y media log y medialog Sr stimati con relazione
III
Sr stimati con relazione III residui
residui al quadrato
0,04603 0,648 -0,188537 -1,383839 0,04132 -0,00471 0,0000220,08200 2,383 0,377033 -0,993576 0,10149 0,01949 0,0003800,28356 9,067 0,957464 -0,593059 0,25524 -0,02832 0,000802
(V(ej))f=III 0,001204
C 1,37500V(ej) 0,014339
M 1,779 0,051<M<7,378 vedi prospetto 10 MU 179/1 ed. 2001
Commenti: il criterio è soddisfatto pertanto le tre varianze sono equivalenti e quindi si utilizza la relazione I per descrivere l'andamento degli scarti tipo sperimentali.
2975.0,1
2025.0,1 =−==−= ≤≤ ρνρν χχ ff M
