1

Vježba 1. OSNOVE MIKROSKOPIRANJA

Tipična životinjska stanica je promjera 10 do 20 µm, ili je oko pet puta manja od najmanje

čestice vidljive golim okom. Ljudsko oko ne može vidjeti predmete koji su manji od 0,1 mm.

Veličina eukariotskih stanica kreće se od 10-100 µm. Stoga, sve dok nije postao dostupan

dobar svjetlosni mikroskop, u prvoj polovici 19. st., nije se moglo otkriti da su biljna i životinjska

tkiva, zapravo nakupine pojedinačnih stanica. To otkriće, označava formalno rođenje stanične

biologije. Matthias Schleiden, botaničar i Theodor Schwan, zoolog 1838. godine, predlažu

staničnu teoriju, prema kojoj se stanica počinje smatrati osnovnom jedinicom živog

organizma.

1.1 Oko

Sastavni dio oka je konvergentna leća koja od predmeta koji se nalazi ispred nje stvara

realnu, umanjenu i obrnutu sliku na stražnjoj strani oka, odnosno na mrežnici (slika 1.1). Za

leću oka aproksimativno vrijedi jednadžba tanke leće

gdje je jakost leće j, najčešće izražena u dioptrijama (dpt=m-1), f je žarišna duljina, a

udaljenost predmeta od leće, b je udaljenost slike od leće. Da bi slike predmeta koji se

nalaze na različitim udaljenostima od oka bile oštre, potrebno je mijenjati žarišnu daljinu leće

oka time što se mijenja zakrivljenost leće (geometrija očne jabučice ne može se bitno

promijeniti). Tu pojavu nazivamo akomodacija oka. Krajnje točke na koje se oko može

akomodirati nazivamo daleka i bliza točka oka. Za normalno oko daleka točka je u

beskonačnosti, a bliza točka je na udaljenosti 25 cm od oka. Što je predmet bliži oku, veći je

vidni kut (kut pod kojim vidimo predmet) i predmet doživljavamo većim. Slijedi da prividna

veličina predmeta ovisi o vidnom kutu. No predmet ne možemo postaviti bliže oku od blize

točke oka, jer je tada slika koja pada na mrežnicu oka mutna i ne mogu se uočiti detalji na

slici.

α1

P1

P2

P1

α2

P2

Slika 1.1 Stvaranje slike u oku. Prikazana su dva predmeta P1 i P2 na dvije različite udaljenosti, pripadni vidni kutovi te pripadne slike predmeta na mrežnici P1` i P2`.

1.2 Lupa (povećalo)

Kako bismo povećali sliku predmeta kojeg promatramo služimo se lupom (ili povećalom).

Lupa je konvergentna leća žarišne daljine manje od 25 cm i ako se naš predmet nalazi

1

f a

1 1

b j = + =

2

između žarišta i leće, dobit ćemo virtualnu, uspravnu i uvećanu sliku predmeta, y´ (slika 1.2).

Time se povećao vidni kut αααα´ pod kojim vidimo virtualnu sliku predmeta. Omjer kutova αααα1111 i αααα´

naziva se kutno povećanje lupe.

F1

F2

25 cm

y

y

α

α

Slika 1.2 Stvaranje slike lupom. Lupa je konvergentna leća žarišne daljine manje od 25 cm. Stvara virtualnu, uvećanu i uspravnu sliku predmeta.

1.3 Mikroskop

Mikroskop je optički instrument kod kojeg je kutno povećanje veće nego kod lupe. Sastoji se

od mehaničkih i optičkih dijelova (slika 1.3). Mehanički dijelovi mikroskopa su: podloga,

stalak, tubus, stolić za preparat te tri vrste vijaka; makrovijak koji služi za velike pomake

tubusa, mikrovijak za fine pomake tubusa i vijak kondenzora za pomicanje kondenzora. U

optičke dijelove ubrajaju se: okular - sustav leća smješten na vrhu tubusa, objektiv - sustav

leća na dnu tubusa i sprava za osvjetljavanje koja se sastoji od ogledala, kondenzora,

predleće kondenzora i irisa. Na mikroskopu se najčešće nalazi nekoliko objektiva različitog

povećanja koji su pričvršćeni za pokretni nosač - “revolver”. Okretanjem revolvera objektiv

željenog povećanja se “namješta”, odnosno postavlja u optičku os mikroskopa.

Slika 1.3 Osnovni dijelovi svjetlosnog mikroskopa

okular

tubus

objektiv

frontalna leća objektiva

stolić za preparat

iris kondenzor

zrcalo

podloga

stalak

revolver (nosač objektiva)

sprava za osvjetljavanje

makrovijak

mikrovijak

vijak kondenzora

3

S obzirom na to da su biološki preparati uglavnom prozirni, najčešće se osvjetljavaju s donje

strane. Pri osvjetljavanju se može koristiti prirodna ili umjetna rasvjeta. Na dnu mikroskopa

nalazi se ogledalo s ravnom i udubljenom stranom. Ogledalo usmjerava svjetlost na sustav

leća zvanih kondenzor. Leće kondenzora sabiru zrake svjetlosti tako da se one sijeku u

žarištu koje se nalazi u ravnini preparata (slika 1.4b). Zbog toga će, u slučaju kada koristimo

slabije objektive, središnji dio vidnog polja biti jarko osvijetljen, a periferni slabije. Da bismo

izbjegli nejednoliko osvjetljenje vidnog polja potrebno je spustiti žarišnu ravninu kondenzora

kako bi se zrake svjetlosti sjekle ispod ravnine preparata (slika 1.4a). Žarišna ravnina

kondenzora može se mijenjati upotrebom predleće kondenzora ili spuštanjem samog

kondenzora pomoću vijka. Kako je kod objektiva velikog povećanja promjer vidnog polja

malen, vrijedi pravilo da se predleća koristi samo uz objektive najslabijeg povećanja.

stolić s preparatom

kondenzor

predleća kondenzora

zrcalo

iris zaslon

zrake

svjetlosti

(a) (b)

Slika 1.4 Uloga kondenzora i njegove predleće.

U blizini donje žarišne ravnine kondenzora smješten je iris. Pomoću male poluge moguće je

mijenjati njegov otvor, a time se mijenja širina stošca zraka svjetlosti kojim osvjetljavamo

preparat.

Uloga irisa: Strukture koje gledamo mikroskopom vidljive su ili zbog toga što su različito

obojane pa različito apsorbiraju svjetlost (apsorpcijska slika) ili pak zato što se na njima

ogiba svjetlost i stvara kompliciran difrakcijski uzorak (difrakcijska slika). Slika koja nastaje

u mikroskopu obično je kombinacija apsorpcijske i difrakcijske slike. Iris se nalazi u blizini

donje žarišne ravnine kondenzora. Njegov otvor je moguće po potrebi mijenjati, a time se

mijenja i širina stošca svjetlosti kojim osvjetljavamo preparat. Apsorpcijska slika dolazi

najbolje do izražaja kad je preparat osvijetljen širokim stošcem svjetlosti, dakle kada je iris

otvoren. Difrakcijska slika je izraženija kada je stožac kojim osvjetljavamo preparat uzak.

Preparati se najprije promatraju uz otvoren iris, a zatim se postupno otvor irisa sužava.

Postupno postaju sve bolje vidljive sve pojedinosti predmeta koje nisu kontrastne. Slika

postaje tamnija, ali i bogata kontrastima. Iris se, ipak ne smije previše zatvoriti, jer će tada

rubovi struktura biti okruženi difrakcijskim rubovima i slika predmeta neće biti vjerna. Obično

4

se preparat pogleda uz otvoreni iris. Tada se otvor sužava sve dok se ne pojave difrakcijski

rubovi, nakon čega se ponovo proširuje sve dok rubovi ne nestanu.

1.3.1 Stvaranje slike u mikroskopu

Stvaranje slike u mikroskopu prikazano je na slici 1.5. Mikroskop se sastoji od dvije

konvergentne leće: objektiva i okulara. Objektiv je konvergentna leća okrenuta prema

objektu kojeg promatramo. Objektiv ima malu žarišnu daljinu. Predmet (y) kojeg promatramo

nalazi se nešto dalje od žarišne daljine objektiva. Zbog toga objektiv daje realnu, obrnutu i

uvećanu sliku predmeta (y´) daleko od svoje žarišne daljine. Okular ima žarišnu daljinu

manju od 25 cm. Mikroskop je konstruiran tako da slika predmeta koju stvara objektiv pada

unutar žarišne daljine okulara pa je zbog toga slika koju stvara okular (y´´) virtualna i

uvećana. Okular možemo zamisliti kao lupu kojom gledamo sliku predmeta (y´).

yF

obF

ob

Fok

Fok

y

y

okular

objektiv

25 cm

Slika 1.5 Stvaranje slike u mikroskopu.

Ukupno povećanje mikroskopa jednako je umnošku povećanja objektiva i okulara i iznosi:

P ukupno = P objektiva x P okulara

1.3.2 Moć razlučivanja (γγγγ)

Prilikom mikroskopiranja vrlo su važna dva pojma: povećanje - ili koliko puta veći izgleda

predmet u usporedbi s normalnom veličinom i moć razlučivanja - što je svojevrsna mjera

jasnoće slike. Svjetlosni mikroskop ne može razlučiti detalje manje od 0,2 µm, što otprilike

odgovara veličini mitohondrija ili bakterije. Slika dobivena svjetlosnim mikroskopom može se

po želji povećavati. Međutim, na taj se način ne može poboljšati rezolucija (kvaliteta slike).

Odnosno, strukture manje od 0,2 µm i dalje se neće vidjeti. Moć razlučivanja svjetlosnog

mikroskopa ograničena je valnom prirodom vidljive svjetlosti i da bismo mogli shvatiti moć

5

razlučivanja potrebno je razumjeti što su to difrakcija svjetlosti i numerička apertura

objektiva.

1.3.3 Ogib (difrakcija) svjetlosti

Zamislimo pukotinu na koju pada paralelan snop monokromatske svjetlosti. Ako je promjer

te pukotine velik u odnosu na valnu duljinu svjetlosti, na zastoru koji se nalazi nekoliko

metara iza pukotine vidjet će se okrugla slika pukotine. Međutim, ako je pukotina kroz koju

propuštamo svjetlost mala, točnije, ako je njen promjer manji od polovine valne duljine

svjetlosti, na zastoru nećemo dobiti samo svijetli trag pukotine, već ćemo vidjeti i niz svijetlih

i tamnih pruga s obje strane svijetlog područja (slika 1.6a). Slično tome, kada se obasjava

mali točkasti objekt, njegova slika na zastoru nije točkasta sjena tog objekta, već izgleda kao

svijetli disk okružen tamnim i svijetlim krugovima (slika 1.6b). Takva slika se naziva difrakcijska

slika i nastaje uslijed ogibanja zraka svjetlosti na nekoj pukotini ili prepreci. Zrake svjetlosti se,

naime, šire i iza pukotine, odnosno iza točkaste zapreke te međusobno interferiraju. Rezultat

interferencije je difrakcijska slika. Engleski astronom G. B. Airy je 1834. godine matematičkom

analizom proučavao prirodu difrakcijskih uzoraka (ako žele, studenti se upućuju na matematički

izvod iz Hardy i Perrin, 1932.). Pokazao je da se difrakcijski uzorak sastoji od najintenzivnije

osvijetljenog središnjeg diska (nulti maksimum) koji je okružen nizom maksimuma viših redova

(maksimumi prvog, drugog itd. reda) i to tako da je intenzitet svakog narednog maksimuma

slabiji. Između maksimuma nalaze se tamna područja, difrakcijski minimumi.

(b)(a)

nulti maksimum

prvi minimum

prvi maksimum

drugi minimum

drugi maksimum

Slika 1.6 Difrakcija svjetlosti. (a) Difrakcija valova svjetlosti na jednoj pukotini. (b) Difrakcijska slika četiriju točkastih izvora svjetlosti.

Pretpostavimo da mikroskopom promatramo dvije točke. Nakon difrakcije, ogibne zrake

svjetlosti ulaze u objektiv mikroskopa koji stvara difrakcijsku sliku točaka u svojoj gornjoj

žarišnoj daljini. Difrakcijska slika će se sastojati od dva difrakcijska diska. U slučaju da su te

dvije točke previše blizu, tada će se difrakcijski diskovi preklapati do te mjere da se više ne

mogu razlučiti, već izgledaju kao jedan disk. Najmanja udaljenost između dviju točaka

(predmeta) koja se može vidjeti određenim objektivom naziva se moć razlučivanja. Dakle,

to je sposobnost instrumenta da daje slike dviju međusobno bliskih točaka razdvojeno.

6

Ustanovljeno je da moć razlučivanja ovisi o broju difrakcijskih maksimuma koji uđu u

objektiv. Naime, strukture će biti razlučene samo ako u objektiv uđu, osim nultog

maksimuma, još barem maksimumi prvog reda. Da bi što više maksimuma moglo ući u

objektiv, on mora imati što je moguće veći otvorni kut objektiva (slika 1.7), ili točnije, što veću

numeričku aperturu.

Numerička apertura (NA) određena je izrazom:

NA = n sin α

gdje je:

NA - numerička apertura objektiva,

n - apsolutni indeks loma sredstva između

pokrovnice i frontalne leće objektiva, a

α - polovica otvornog kuta objektiva

(slika 1.7).

α

objektiv

Slika 1.7 Otvorni kut objektiva.

Vrijednost numeričke aperture je mjera za moć razlučivanja i obično je označena na

objektivu.

Numerička apertura i moć razlučivanja povezani su izrazom:

=

0,61 λ

NA =

0,61 λ

n sin α

gdje je:

γ - minimalna udaljenost između dviju točaka koje se još vide razdvojeno na preparatu,

α - valna duljina korištene svjetlosti, a

0,61 - empirijski dobivena konstanta proporcionalnosti.

Moć razlučivanja mikroskopa, dakle, ovisi o valnoj duljini svjetlosti, indeksu loma sredstva i o

otvornom kutu objektiva. Moć razlučivanja je to veća što je vrijednost γ manja, odnosno što

je veća numerička apertura objektiva i manja valna duljina korištene svjetlosti.

1.3.4 Imerzijski objektivi

Objektive kod kojih je prostor između njihove frontalne leće i pokrovnice ispunjen zrakom

nazivamo suhi objektivi. Iz izraza za numeričku aperturu očito je da ona za suhi objektiv ne

može biti veća od 1 (apsolutni indeks loma zraka je 1,0, a sin α ne može biti veći od 1). U

praksi suhi objektivi imaju numeričku aperturu do 0,95. Ukoliko se prostor između pokrovnog

stakalca i objektiva ispuni sredstvom koje ima veći indeks loma od zraka (imerzijskim uljem

kao što je primjerice cedrovo ulje ili razna sintetička ulja), numerička apertura objektiva se

može povećati. Objektive kod kojih je prostor između njihove frontalne leće i pokrovnog

0,61 λ 0,61 λ Moć razlučivanja (γ) = ---------------- = -------------- NA n sin α

7

stakalca ispunjen imerzijskim sredstvom nazivamo imerzijski objektivi. Pri mikroskopiranju,

frontalna leća imerzijskih objektiva uranja se u imerzijsko ulje koje se prethodno kapne na

pokrovnicu. Imerzijsko ulje ima apsolutni indeks loma jednak apsolutnom indeksu loma

stakla. Prostor između preparata i objektiva se tako optički homogenizira, gubi se granica

loma na prijelazu staklo - zrak (slika 1.8), a zrake svjetlosti koje izlaze iz preparata se ne

otklanjaju. Otvorni kut objektiva će tako biti veći i više će zraka svjetlosti ući u objektiv. U

praksi imerzijski objektivi imaju vrijednost numeričke aperture do 1,4.

Slika 1.8. Suhi i imerzijski objektivi. (a) Kod suhih objektiva između frontalne leće objektiva i pokrovnog stakalca nalazi se zrak koji ima manji indeks loma u odnosu na staklo. Zbog toga se na granici staklo-zrak zrake svjetlosti otklanjaju. (b) Između pokrovnice i imerzijskog objektiva prostor je ispunjen imerzijskim uljem koje ima jednak indeks loma kao i staklo. Nestaje granice staklo-zrak, zrake se ne otklanjaju pa je veći otvorni kut objektiva (αu > αz). Više maksimuma može ući u objektiv i moć razlučivanja je bolja.

1.4 Zadaci:

1.4.1 Upoznavanje sastavnih dijelova mikroskopa.

• Pronađite sve mehaničke dijelove mikroskopa koristeći se slikom 1.3.

• Zatim pronađite sve optičke dijelove mikroskopa.

• Podignite tubus u najviši položaj makrovijkom i proučite broj i povećanje objektiva

pričvršćenih za „revolver“. Odgovorite koje sve oznake možete očitati na objektivima i

što one znače (imerzijski objektiv ima najveću vrijednost numeričke aperture i

označen je crnim prstenom!).

1.4.2. Namještanje rasvjete na mikroskopu.

Uputa: Uključite lampicu. Namjestite objektiv najmanjeg povećanja u optičku os mikroskopa.

Tubus spustite tako da je frontalna leća objektiva udaljena 1 cm od stolića za preparat.

Namjestite ravnu stranu zrcala. Gledajući u okular pomičite zrcalo sve dok ne dobijete

okruglo vidno polje osvijetljeno jarkom bijelom svjetlošću.

Zrake svjetlosti koje prolaze kroz mikroskop izlaze iz njega kroz mali krug koji se nalazi u

stražnjoj žarišnoj ravnini cjelokupnog optičkog sustava i koji se zove okularni krug (ili

Ramsdenov ili Biotov krug). Kad se zjenica oka poklopi s okularnim krugom, tada će vidno

polje biti okruglo i najbolje osvijetljeno.

1.4.3. Uloga kondenzora i njegove predleće.

imerzijsko ulje

n= 1,5

n= 1,5

zrak n= 1

objektiv

pokrovnica

α z

α u

a) b)

8

Uputa: Namjestite rasvjetu i objektiv najslabijeg povećanja. Odmaknite predleću kondenzora

tako da ne stoji na putu zraka svjetlosti od zrcala ka preparatu. Gledajući u okular polako

podižite tubus makrovijkom sve dok se u vidnom polju ne pojavi slika žarne niti žarulje.

Vratite predleću kondenzora i opišite što ste uočili. Na temelju opažanja odgovorite koja je

uloga predleće kondenzora? Odgovorite zašto predleću ne koristimo uz objektive velikog

povećanja?

1.4.4 Fokusiranje - traženje slike u mikroskopu.

Fokusirati znači pomicati optičke sustave mikroskopa sve dok se ne pojavi jasna i oštra slika

predmeta. Fokusirajte sliku strelice kod različitih povećanja mikroskopa. Opišite kakva je

slika strelice s obzirom na smjer i veličinu. Koristeći se tablicom 1 i vlastitim opažanjima,

odgovorite: a) Što je to radna daljina objektiva, b) kako se ona mijenja u odnosu na

povećanje, c) kako se mijenja promjer vidnog polja u odnosu na povećanje mikroskopa?

Uputa: Na predmetnici nacrtajte malu strelicu flomasterom. Namjestite rasvjetu.

Predmetnicu stavite na stolić mikroskopa. Fokusirajte strelicu na sljedeći način:

1. Podignite tubus i u optičku os namjestite objektiv najslabijeg povećanja. Nagnite glavu

tako da vidite frontalnu leću objektiva.

2. Oprezno spuštajte tubus pomoću makrovijka gledajući bočno, sve dok frontalna leća

objektiva ne bude 5 mm udaljena od preparata.

3. Gledajte u okular i pri tome podižite tubus velikim vijkom dok se u vidnom polju ne pojavi

slika strelice. Ako ne uspijete pronaći sliku strelice ponovite postupak od 1. do 3.

4. Kad ste našli oštru sliku strelice (ako je slika strelice oštra sa svim detaljima, namjestili ste

radnu daljinu), dodatno izoštrite sliku strelice malim vijkom.

5. Ako vidite oštru sliku strelice, bez pomicanja tubusa, u optičku os postavite objektiv većeg

povećanja. Nakon toga, gledajući u okular, izoštravajte sliku isključivo malim vijkom!

(Mikroskop je građen tako da je nakon izoštravanja slike kod slabijeg povećanja određena

radna daljina i za objektiv jačeg povećanja. Zbog toga prilikom postavljanja objektiva jačeg

povećanja u optičku os nije potrebno pomicati tubus, već samo zavrtiti nosač s objektivima i

mikrovijkom do kraja izoštriti sliku.)

9

Tablica 1.1 Odnos povećanja, radne daljine i promjera vidnog polja mikroskopa.

povećanje objektiva povećanje okulara ukupno povećanje promjer vidnog

polja (mm) radna duljina

(mm)

4,4 X 7 X 15 X

30,8 X 66 X

3,8 2,4 31,0

8 X 7 X 15 X

56 X 120 X

2,25 1,3 8,53

40 X 7 X 15 X

280 X 600 X

0,45 0,26 0,41

90 X (imerzija)

7 X 15 X

630 X 1350 X

0,2 0,12 0,10

1.4.5 Uloga irisa

Pogledajte zrnca škroba krumpira kod optimalno otvorenog, previše otvorenog i previše

zatvorenog irisa. Obratite pažnju na oblik, strukturu (zrnca su slojevite građe) i oblik zrnaca

pri različitim otvorima irisa.

Uputa: Kapnite kap vode na predmetnicu. Vrhom iglice zahvatite malo škrobnih zrnaca

krumpira i stavite ih u kapljicu vode. Kapljicu pažljivo poklopite pokrovnicom da ispod nje ne

bude mjehurića zraka. Fokusirajte od najmanjeg povećanja prema većem služeći se

uputama iz zadatka 4. Promatrajte zrnca pri povećanju od 600 X. Nacrtajte zrnca i opišite

svoja opažanja.

Naziv objekta: Solanum tuberosum - krumpir Sadržaj preparata: škrobna zrnca u vodi Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

1.5 Pitanja:

• Čemu služi mikroskop i koji su njegovi dijelovi? • Opišite optičke dijelove mikroskopa. • Navedite mehaničke dijelove mikroskopa. • Navedite osnovni pribor za mikroskopiranje. • Navedite vrste mikroskopskih preparata i objasnite razliku među njima. • Koliko je ukupno povećanje mikroskopa ako je okular povećanja 15x i objektiv

povećanja 40x? • Ovisi li moć razlučivanja isključivo o karakteristikama objektiva ili ovisi i o

karakteristikama okulara? • Izračunajte kolika je najmanja udaljenost između dviju točaka na preparatu koje se

još mogu opaziti svjetlosnim mikroskopom, ako koristimo imerzijski objektiv NA = 1,4 i svjetlost valne duljine 550 nm (ljudsko oko je najosjetljivije na dio spektra od 555 nm).

• Kolika je moć razlučivanja ljudskog oka kod iste valne duljine ako je daljina normalnog vida 25 cm, a polumjer zjenice kod normalne rasvjete 1 mm?

10

Vježba 2. OSNOVNI ORGANIZACIJSKI TIPOVI STANICA

Bez obzira na svu raznolikost, stanice koje postoje na Zemlji mogu se svrstati u jednu od

dvije osnovne organizacijske skupine, u protocite ili prokariotske stanice (pro = prije,

karyon = jezgra, grč.) i eucite ili eukariotske stanice (eu = pravi, karyon = jezgra, grč.).

Analogno tome, organizmi sastavljeni od protocita nazivaju se prokarioti, a organizmi

građeni od eucita eukarioti. Izgleda da je vrlo rani događaj u evoluciji bilo grananje u tri linije

potomstva od zajedničkog pretka, dajući današnje arhebakterije, eubakterije i eukariote.

Prokarioti (mikoplazme, bakterije i cijanobakterije) su mali jednostanični organizmi (∅ 0,3 - 5

µm), jednostavne su građe, nemaju jezgru i nedostaju im mnoge membranske strukture

(slika 2.1). Dijele se jednostavnom diobom na dva dijela (binarno cijepanje). Stanična

membrana sadrži brojne uvrate nazvane mezosomi koji sudjeluju u staničnom disanju i

staničnoj diobi. Smatra se da prokariotske stanice u mnogočemu sliče najranijim ishodišnim

stanicama na Zemlji. Iako relativno jednostavne građe, u stanicama prokariota mogu se naći

svi glavni metabolički putevi uključujući i tri osnovna procesa za dobivanje energije: glikoliza,

stanično disanje i fotosinteza. Iako nemaju organele poput kloroplasta, fotosintezu neki

prokarioti (cijanobakterije) mogu vršiti zahvaljujući molekulama klorofila smještenima po

tilakoidnim membranama.

pili

ribosomi

ovojnica

stanična

stijenka

stanična

membrana

nukleoid

mezosom

bičevi

0,5 µm

(b)(a)

Slika 2.1. Prokariotska stanica. (a) Crtež prikazuje tipičnu štapićastu bakteriju kojoj nedostaje endomembranski sustav. Molekula DNA nalazi se u dijelu citoplazme koji funkcionalno odgovara jezgri pa se naziva nukleoid, a od ostalog prostora nije odijeljen membranom. (b) Elektronsko mikroskopska (EM) snimka kroz presjek bakterije Bacillus coagulans (3).

Eukariotske stanice su veće i složenije su strukture (slika 2.2. i tablica 2.1). Molekula DNA

eukariotskih stanica organizirana je u kromosome i smještena u jezgri, a u citoplazmi se

11

nalaze i mnogi drugi organeli okruženi membranama. Eukariotske stanice su jedinstvene i

po tome što imaju citoskelet građen od proteinskih niti (vlakana), koji pomaže u organizaciji

citoplazme i omogućava kretanje.

mitohondrij

st. membarnaER

citosol

Golgijev aparat

citoskelet

jezgra

lizosomi,

peroksisomi

st. stijenka kloroplast

vakuola

centrioli

(a) (b)

Slika 2.2. Struktura životinjske (a) i biljne (b) stanice. I životinjske i biljne stanice okružene su staničnom membranom i sadrže jezgru, citoskelet te mnoge zajedničke citoplazmatske organele (ER, endoplazmatski retikul). Biljne stanice su osim toga okružene staničnom stijenkom, sadrže kloroplaste i velike vakuole (1).

Tablica 2.1 Usporedba prokariotskih i eukariotskih organizama (1).

PROKARIOTI EUKARIOTI

organizmi mikoplazme, bakterije, cijanobakterije protisti, gljive, biljke i životinje

veličina stanice 1 do10 µm 10 do 100 µm

DNA kružnog oblika, smještena u citoplazmi (nukleoid), nema histona

duge linearne molekule organizirane u kromosome i obavijene jezgrinom

ovojnicom (nukleus) metabolizam aerobni i anaerobni aerobni

organeli vrlo malo ili ništa jezgra, mitohondriji, kloroplasti, ER, Golgijev aparat, lizosomi…

RNA i proteini sinteza RNA i proteina u istom reakcijskom prostoru

sinteza i sazrijevanje RNA u jezgri; sinteza proteina u citoplazmi

citoplazma nema citoskeleta, citoplazmatskog strujanja, endocitoze i egzocitoze

citoskelet se sastoji od proteinskih niti; strujanje citoplazme; endocitoza i

egzocitoza

ribosomi manje veličine (70S) veliki (80S), manji (70) su prisutni u nekim organelima

dioba stanice binarno cijepanje mitoza i mejoza spolno

razmnožavanje nema mejoze, moguć prijenos

fragmenata DNA uključuje mejozu

bičevi jednostavni, od dva gradivna elementa složeni, od više gradivnih elemenata

stanična organizacija jednostanični organizmi jednostanični ili višestanični organizmi s

diferenciranim stanicama

Carstvo protista sačinjava raznolika skupina eukariotskih organizama (slika 2.3). Većina su

jednostanični, ali mogući su i klonalni i jednostavni višestanični oblici. U prirodi se nalaze svuda

12

gdje je prisutna voda; žive kao plankton, na dnu voda ili u tekućinama drugih organizama.

Metabolizam im je aerobni, mogu biti fotoautotrofi, heterotrofi ili miksotrofi. Mnogi imaju trepetljike

i bičeve. Razmnožavaju se uglavnom nespolno. Na staničnoj razini, protisti su najkompleksnije

stanice uopće, što se može i očekivati u slučaju kad jedna jedina stanica obavlja sve radnje koje

u višestaničnom organizmu obavlja niz specijaliziranih stanica.

f

bič

očna pjega

drugi bič

rezerve

hrane

kontraktilna

vakuola

jezgra

(a)

mikronukleus

makronukleus

hranidbene

vakuole

analna pora kontraktilna

vakuola

stanična usta

oralni žlijeb

trepetljike

(b)

(c)(f)

(e)

(d)

(g)

Slika 2.3 Primjeri protista. (a) Euglena - zeleni bičaš; (b) Paramecium - papučica; (c), (d) i (f) različiti trepetljikaši; (e) primjer Dinoflagelata; (g) Heliozoa - sunašce (1).

2.1 Zadaci:

Pomoću svjetlosnog mikroskopa promatrajte, a zatim nacrtajte neke predstavnike prokariota

i eukariota. Usporedite ih međusobno s obzirom na veličinu i složenost. Navedite koje su

glavne razlike u građi između biljne i životinjske stanice!

13

2.1.1 Prokarioti:

2.1.1.1 Bakterije

Na predmetnici označite malu točku flomasterom. Kapnite kap hranjivog medija koji sadrži

bakterije Eschericha coli - soj DH5α i poklopite pokrovnicom. Fokusirajte preparat od

najmanjeg do najvećeg povećanja, bez upotrebe imerzijskog objektiva.

Uputa: Bakterije su vrlo male te se mogu uočiti tek pod najvećim povećanjem mikroskopa.

Zbog toga ćete predmetnicu prethodno označiti flomasterom kako biste kod manjih

povećanja fokusirali oznaku i na taj način odredili radnu daljinu za veće povećanje

mikroskopa.

Nacrtajte stanice i opišite što ste uočili. Procijenite veličinu bakterija koristeći se podacima o

promjeru vidnog polja kod određenog povećanja iz tablice 1. 1.

Objašnjenje: Veličina nekog objekta može se približno odrediti na sljedeći način:

procijenimo koliko puta naša struktura stane u promjer vidnog polja (VP), iz tablice 1.1

očitamo koliki je promjer vidnog polja za određenu kombinaciju okulara i objektiva te tu

vrijednost podijelimo s procijenjenim brojem.

promjer vidnog polja

Veličina objekta procijenjena =

procijenjeni broj koliko puta objekt stane u promjer vidnog polja

Naziv objekta: Eschericha coli - soj DH5α - gram pozitivna bakterija Sadržaj preparata: žive stanice u hranidbenom mediju Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodno bezbojna

2.1.1.2 Cijanobakterije

Histološkom iglom zahvatite malo modrozelene prevlake (Lyngbya sp.) i prenesite u kapljicu

vode na predmetnici te poklopite pokrovnicom. Pronađite populaciju cijanobakterija pri

povećanju od 600 X. Odaberite jednu izdvojenu nit, pogledajte ju uz upotrebu imerzionog

objektiva (povećanje 900 X), proučite građu, nacrtajte i opišite. Nit se sastoji od niza

jednakih pločastih stanica obavijenih stijenkom. U citoplazmi se razlikuje neobojana

citoplazma s nukleoidom (ekvivalent jezgri) i obojani periferni dio – kromatoplazma - u kojoj

su smještene tilakoidne membrane s pigmentima. Niti cijanobakterija obavijene su sluzavim

omotačem.

Naziv objekta: Lyngbya sp. cijanobakterija Sadržaj preparata: žive stanice u vodi Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna modrozelena

14

nukleoid

stanična

membranastanična

stijenka

(a)

b

tilakoidnemembrane

1µm

stanica majka pup (stanica kćer)

10 µm

1µm

(b)

(c)

Slika 2.4. (a) EM slika bakterije Escherichia coli, (b) EM slika cijanobakterije i (c) scanning EM slika kvasca (1).

2.1.2 Eukarioti:

2.1.2.1. Protisti (praživotinje)

Kapnite nekoliko kapi uzorka jezerske vode na predmetnicu, poklopite pokrovnicom te

promatrajte pod srednjim povećanjem. Uočite dva predstavnika protista, papučicu i zelenog

bičaša, nacrtajte ih i opišite. Obratite pažnju na razliku u njihovoj veličini, građi i kretanju.

Naziv objekta: Paramecium - papučica i Euglena viridis – zeleni bičaš Sadržaj preparata: žive stanice u vodi Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

2.1.2.2 Kvasci

Na predmetnicu kapnite suspenziju pekarskog kvasca (Saccharomyces sp.) i poklopite

pokrovnicom. Promatrajte stanice kvasaca pri povećanju od 900 X. Obratite pažnju na

nizove stanica nastale diobom jedne ishodišne stanice. Nacrtajte i opišite. Kvasac je

jednostanični eukariot koji se razmnožava pupanjem (slika 2.4c). Pokušajte pronaći stanicu s

pupom. Odredite približnu veličinu stanice koristeći tablicu 1.1.

Naziv objekta: Saccharomyces sp. - pekarski kvasac Sadržaj preparata: žive stanice u hranidbenom mediju Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodno bezbojna

15

2.1.2.3. Životinjske stanice

Pogledajte polutrajne preparate tumorskih staničnih linija. Stanice su uzgojene u staničnoj

kulturi, fiksirane su metanolom za podlogu na kojoj su rasle te su obojane 12% otopinom

Giemsa boje (specifično boji DNA). Obratite pažnju na oblik stanica. Tumorske stanice su

izgubile kontaktnu inhibiciju rasta, što se najbolje vidi kod HT-29 stanične linije gdje stanice

rastu u nakupinama formirajući stožac. Usporedite ih s normalnim stanicama na slici 2.5.

Nacrtajte i opišite sljedeće stanične linije:

A1235 - stanice ljudskog glioblastoma

HT-29 - ljudski karcinom crijeva

HeLa - ljudski karcinom epitela ušća maternice

Naziv objekta: Homo sapiens - čovjek Sadržaj preparata: fiksirane stanice uzgojene u staničnoj kulturi Vrsta preparata: polutrajni Boja preparata: obojen Giemsa bojom

Promatrajte polutrajne preparate razmaza krvi čovjeka i domaće kokoši. Obratite pažnju na

građu i oblik eritrocita. Eritrociti ptica ovalnog su oblika i imaju jezgru (na preparatima je

obojena ljubičasto), za razliku od eritrocita sisavaca koji su udubljeni (slika 2.6) i nemaju

jezgru. Preparati su fiksirani i diferencijalno obojani.

Naziv objekta: Gallus domesticus - domaća kokoš i Homo sapiens - čovjek Sadržaj preparata: fiksirani razmaz krvi Vrsta preparata: polutrajni Boja preparata: diferencijalno obojan preparat

Slika 2.6 Scanning EM snimka ljudskih eritrocita (1).

a b

Slika 2.5 Slika normalnih stanica u kulturi. a) Fibroblasti iz bubrega mladog hrčka koji su gotovo konfluentni i kontaktno inhibirani b) Pojedinačne epitelne stanice.

16

2.1.2.4 Biljne stanice

• Jednostanične zelene alge

Zelenu prevlaku kišne kuglice (Pleurococcus sp.) s kore drveta prenesite iglom u kapljicu

vode. Promatrajte stanicu pri povećanju od 900 X. Kišna kuglica je jednostanična zelena

alga koja živi u vlažnoj zračnoj sredini. U perifernom dijelu citoplazme smješten je pločasti

kloroplast, a u središnjem jezgra.

Naziv objekta: Pleurococcus sp. - jednostanična zelena alga Sadržaj preparata: žive stanice u vodi Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna žućkasto-zelena

• Stanice lista zelene biljke

Tangencijalni tanki prerez kroz list zelene biljke uklopite u vodu i nacrtajte jednu tipičnu biljnu

stanicu sa svim vidljivim dijelovima, gledajući pri povećanju od 600 X. Usmjerite pažnju na

staničnu stijenku, kloroplaste, vakuolu i plazmodezmije, kojih nema u životinjskim stanicama.

(Plazmodezmiji su kanalići preko kojih komuniciraju susjedne biljne stanice.)

Naziv objekta: zelena biljka Sadržaj preparata: tangencijalni presjek kroz list biljke Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

17

Vježba 3. STANIČNA MEMBRANA

Stanična membrana (plazmatska membrana ili plazmalema kod biljaka) obavija svaku

stanicu i određuje njezin prostor i veličinu. Isto tako održava i regulira bitne razlike između

staničnog sadržaja i njezinog okoliša, djelujući poput visokoselektivne zapreke (barijere).

Sve biološke membrane, uključujući staničnu membranu i unutarnje membrane eukariotskih

stanica, imaju zajedničku strukturu: izgrađene su od lipida, proteina i ugljikohidrata (slika

3.1).

Slika 3.1. Stanična membrana. Dvosloj lipida spontano se uspostavlja zbog hidrofobnih interakcija i čini osnovnu strukturu membrane. Proteini su uronjeni u lipidni dvosloj ili su sa citoplazmatske strane vezani za njega elektrostatskim silama i vodikovim vezama. Ugljikohidrati su vezani kovalentno za lipide ili proteine s vanjske strane stanične membrane (4).

3.1 Građa stanične membrane

Singer i Nicolson su 1972. godine kao model stanične membrane predložili model tekućeg

mozaika prema kojem dvosloj lipida tvori strukturni matriks membrane u koji su uronjeni

proteini. Membranski lipidi su amfipatske molekule (na jednom kraju hidrofilne, a na drugom

hidrofobne) koje spontano stvaraju dvosloj kad se nađu u vodenoj sredini. Svaki sloj

predstavlja dvodimenzionalnu tekućinu gdje molekule mogu bočno difundirati.

Proteini su uronjeni - integralni proteini, ili vezani za površinu - periferni proteini, lipidnog

dvosloja. Oni su odgovorni za funkciju membrane. Djeluju kao specifični receptori, enzimi ili

prenosioci. Količina i vrsta proteina u membrani ovisi o ulozi membrane. Primjerice,

membrane koje služe kao električni izolatori u živčanim stanicama su siromašne proteinima

(čine manje od 25% membranske mase), dok u visokoaktivnim unutrašnjim membranama

mitohondrija i kloroplasta proteini čine i do 75% ukupne mase. U eukariotskim stanicama su

18

uz proteine i/ili lipide vanjskog sloja membrane kovalentno vezani oligosaharidni lanci

(ugljikohidrati). Smatra se da su, između ostalog, odgovorni i za procese prepoznavanja

među stanicama. Važnu komponentu životinjskih staničnih membrana predstavlja i

kolesterol, koji je dogovoran za različitu membransku fluidnost pri različitim temperaturama.

Membrane ne možemo vidjeti pomoću svjetlosnog mikroskopa jer su im dimenzije ispod

granice moći razdvajanja mikroskopa (debljina lipidnog sloja iznosi oko 4 nm, a cijele

membrane 7-10 nm). Međutim, i prije otkrića elektronskog mikroskopa bilo je moguće na

osnovi opažanja i tzv. indirektnih dokaza zaključiti da one postoje. Među takve dokaze koji

su odavno proučeni ubrajaju se hemoliza životinjskih stanica i plazmoliza biljnih stanica

(slika 3.2). U hiperosmotskoj (hipertoničnoj) otopini voda izlazi iz stanice i dolazi do

odvajanja protoplasta od stanične stijenke biljne stanice. Pažljivim promatranjem u

svjetlosnom mikroskopu "vidljiva" je stanična membrana kao granica između plazmoliziranog

protoplasta i lumena stanice (stanični prostor ograničen stijenkom).

smežurana

uvenuta nabubrenaplazmolizirana

normalna lizirana

HIPEROSMOTSKA IZOOSMOTSKA HIPOOSMOTSKA

OTOPINA:

b

a

Slika 3.2 Odgovor životinjske i biljne stanice na promjenu osmolarnosti izvanstanične otopine. Dok životinjska stanica (a) bubri i lizira u hipoosmotskoj otopini, za biljnu stanicu (b) to su idealni fiziološki uvjeti, ona je zaštićena svojom staničnom stijenkom. Obje stanice se skupe u hiperosmotskoj otopini, a kod biljne stanice stanična membrana se odvoji od stanične stijenke (1).

19

3.2 Zadaci:

Na preparatu stanica donje epiderme lista biljke Rhoeo discolor proučite proces plazmolize i

deplazmolize(slika 3.3) te tonoplastne plazmolize (slika 3.4).

3.2.1 Plazmoliza-deplazmoliza

Napravite tanki tangencijalni prerez kroz donju epidermu lista biljke Rhoeo discolor i uronite

prerez u kapljicu vode. Pažljivo pokrijte pokrovnicom i promatrajte pod slabim povećanjem.

Nakon što ste nacrtali stanice zamijenite vodu u preparatu s 1M otopinom NaCl. S jedne

strane pokrovnice prislonite komadić filter papira kako biste upili vodu, a s druge strane

istovremeno kapnite nekoliko kapljica 1M NaCl. NaCl će zamijeniti vodu i stanice će biti

okružene hipertoničnom otopinom. Pritom ne mičite preparat s mikroskopa. Promatrajte i

nacrtajte promjene u stanicama. Nakon toga ponovo zamijenite NaCl vodom na način kako

je gore opisano. Što opažate? Nacrtajte što ste uočili.

1M NaCl 1M NaCl H2O

početak

plazmolize

poodmakla

plazmolizadeplazmoliza

stanična

stijenka

vakuola

citoplazma

jezgra

stanica u vodi

stanična membrana se

počinje odvajati od

stanične stijenke

citoplazma je jako

koncentrirana

(a) (b) (c) (d)

Slika 3.3 Crtež pokusa plazmolize-deplazmolize u stanicama donje epiderme lista biljke Rhoeo discolor. (a) Stanica u vodi (hipotonična otopina); (b) stanica u 1M NaCl, smanjenje volumena uz kontrakciju stanične stijenke, gore lijevo početak plazmolize; (c) nakon dužeg djelovanja 1M NaCl završena je plazmoliza, citoplazma je jako koncentrirana; (d) uklanjanjem 1M NaCl i dodavanjem vode dolazi do deplazmolize.

3.2.2 Tonoplastna plazmoliza

Napravite tangencijalne prereze kroz donju epidermu lista biljke Rhoeo discolor na isti način

kao u zadatku 1. i uronite ih u otopinu 2M KNO3. Poklopite pokrovnicom. Ostavite ih u

otopini oko 1 sat, a zatim promatrajte pod mikroskopom i nacrtajte. Nakon toga odmaknite

pokrovnicu i nasumce žiletom režite presjeke. Ponovno poklopite pokrovnicom i lagano

lupnite po njoj. Promatrajte stanice koje su prerezane i pokušajte pronaći vakuole u prostoru

izvan stanice.

Zbog različite propusnosti stanične membrane i tonoplasta (membrana koja obavija

vakuolu), KNO3 prolazi kroz staničnu membranu u citoplazmu i izaziva bubrenje citoplazme

koje nakon određenog vremena dovodi do pucanja stanične membrane (slika 3.4).

20

Tonoplast propušta samo vodu (koja izlazi iz vakuole) pa će nakon pucanja stanične

membrane plazmolizirana vakuola biti obavijena samo tonoplastom. Ako staničnu stijenku

mehanički oštetimo (rezanjem) tada će vakuole izaći izvan stanice u okolni prostor. Na taj

način dokazali smo postojanje stanične membrane i tonoplasta kao i različitu propusnost tih

dviju membrana. Ovaj tip plazmolize nazvan je tonoplastna plazmoliza.

rezanje

stanične

stijenke

2M KNO3

2M KNO3

2M KNO3

vakuola

obavijena

tonoplastom

izlazi iz stanicestanična

membrana

puca

stanica u vodipočetak

plazmolize

tonoplastna

plazmoliza

stanična

stijenka

vakuola

citoplazma

jezgra

Slika 3.4 Crtež pokusa tonoplastne plazmolize u stanicama donje epiderme lista biljke Rhoeo discolor. Zbog različite propusnosti stanične membrane i tonoplasta (stanična membrana propušta KNO3 dok tonoplast ne) voda iz vakuole ulazi u citoplazmu koja bubri i puca.

21

Vježba 4. ODJELJCI EUKARIOTSKIH STANICA

Eukariotska stanica sadrži niz unutrašnjih membrana koje omeđuju odjeljke poznate kao

stanični organeli. Šest glavnih tipova organela prisutno je u skoro svim stanicama: jezgra,

endoplazmatski retikul, Golgijev aparat, mitohondriji, lizosomi i peroksisomi. Biljne stanice

sadrže još i vakuole, staničnu stijenku i plastide, od kojih su najvažniji kloroplasti.

Ukupna stanična DNA nalazi se u jezgri, koja je omeđena dvostrukom membranom

nazvanom jezgrina ovojnica, a karakteristika je samo eukariotskih stanica (slika 4.1).

Jezgrina ovojnica odvaja središnji genetski proces replikacije DNA i sinteze RNA od

citoplazme, gdje se genetska poruka prevodi u protein.

poraribosom

jazgrina

lamina

jezgrica

kromatin

unutarnja

ovojnica

perinuklearni

prostorglatki

ER

vanjska

ovojnica

hrapavi

ER

1 µm

(b)(a)

Slika 4.1 Crtež jezgre i EM slika jezgre u interfazi. Strelica u (b) označuje jezgricu, a trokutići heterokromatin (2).

Citoplazma sačinjava većinu stanične mase. To je kompleksna smjesa velikih i malih

molekula, koja se sastoji od oko 70% vode i 20% proteina, a preostalih 10% čine drugi

spojevi. Tipična životinjska stanica sadrži oko 106 proteinskih molekula koje sačinjavaju

približno 10.000 različitih vrsta. Kada se živa stanica promatra pod jakim povećanjem u

svjetlosnom mikroskopu, njezina citoplazma izgleda kao amorfna, gelu slična tvar, u kojoj

raštrkane čestice jure u svim smjerovima. Međutim, citoplazma je mnogo organiziranija nego

što svjetlosni mikroskop pokazuje. Kada se promatra pod elektronskim mikroskopom, vidi se

da sadrži mnogo različitih organela, specijaliziranih za određenu funkciju. Citoplazma bez tih

organela zove se citosol, a on je prožet gustom mrežom proteinskih niti koje zajedno

izgrađuju stanični kostur (citoskelet). Citoskelet određuje stanični oblik i općenitu

22

organizaciju citoplazme. Uz to, citoskelet je odgovoran za pokretanje cijelih stanica (prilikom

mišićne kontrakcije primjerice), za unutarstanični transport i položaj organela i drugih

struktura te za kretanje kromosoma tijekom stanične diobe.

Endoplazmatski retikul (ER) se nastavlja na vanjsku jezgrinu membranu (slika 4.2). Dio ER

s ribosomima vezanim na citoplazmatskoj strani membrane naziva se hrapavi ER. To je

mjesto sinteze integralnih membranskih proteina te proteina koji se izlučuju iz stanice. Na

dijelu ER-a za koji nisu vezani ribosomi - glatki ER, sintetiziraju se lipidi i steroidni hormoni.

hrapavi ER

glatki ER

jezgrina ovojnica

(a) (b)

(c)

Slika 4.2 Endoplazmatski retikul. (a) Crtež ER. (b) EM slika hrapavog ER u stanicama jetre štakora. Ribosomi su vezani za citoplazmatsku stranu ER. (c) EM slika glatkog ER u Leydigovim stanicama testisa, koje su aktivne u sintezi steroidnih hormona (1).

Golgijev aparat (GA) sastoji se od organiziranih nakupina plosnatih cisterni i vezikula (slika

4.3). Proteini i lipidi iz ER ulaze u GA na njegovoj cis strani, a izlaze na njegovoj trans strani.

Proteini se u GA kovalentno modificiraju (kao što je selektivno cijepanje i glikozilacija

proteina) i otpremaju na različita odredišta u stanici.

Slika 4.3 Golgijev aparat. (a) Crtež regija GA. (b) EM slika GA (1).

a) b)

23

Lizosomi su organeli koji sadrže pedesetak različitih hidrolitičkih enzima sposobnih za

razgradnju makromolekula i čestica uzetih iz staničnog okoliša. Svi lizosomski enzimi su

kisele hidrolaze, a čine ih nukleaze, proteaze, glikozidaze, lipaze, fosfataze i drugi. Njihovo

djelovanje je omogućeno zahvaljujući aktivnostima protonskih crpki u lizosomskoj membrani,

koje unutar lizosoma održavaju kiselu pH vrijednost (oko 5), za razliku od citoplazme gdje je

pH neutralan. Lizosomi su prikazani na slici 4.4.

KISELE HIDROLAZE

nukleaze

proteaze

glikozidaze

lipaze

fosfataze

sulfataze

fosfolipaze

citosol

a

200 nm

b

Slika 4.4 Lizosomi. (a) Crtež organizacije lizosoma. (b) EM slika lizosoma (1).

Peroksisomi (također poznati kao mikrotjelešca) su mali mjehuričasti organeli (slika 4.5)

koji sadrže enzime uključene u različite metaboličke reakcije (primjerice: katalaza,

peroksidaza i urat-oksidaza). Jedan od najvažnijih metaboličkih procesa peroksisoma jest

oksidacija dugolančanih masnih kiselina.

peroksisomi

Slika 4.5 Peroksisomi. EM slika peroksisoma u stanicama jetre štakora. Dva sadrže parakristalične uklopine enzima oksidaze mokraćne kiseline (2).

Mitohondriji i kloroplasti (u biljkama) su energetski organeli jer stvaraju glavninu adenozin

trifosfata (ATP) koji se koristi za pokretanje energetski nepovoljnih biosintetskih reakcija.

Obrađeni su u Vježbi 5.

24

Općenito, svaki membranom odijeljeni prostor (organel) ima zajedničke ustaljene djelatnosti

u svim tipovima stanica kao i dodatne aktivnosti koje su specifične za određeni stanični tip.

4.1 Zadaci:

4.1.1 Odjeljci eukariotskih stanica vidljivi svjetlosnim mikroskopom

Stanice donje epiderme (pokožica) lista lukovice biljke Allium cepa promatrajte pod

mikroskopom. Što opažate? Nacrtajte jednu stanicu i stijenke susjednih stanica!

Uputa: Na unutrašnjoj strani mesnatog lista lukovice zarežite žiletom pokožicu u obliku

malog trokuta. Pincetom prihvatite za jedan vrh, ogulite i brzo prenesite u kapljicu vode

(dovoljno veliku), tako da ozlijeđena strana bude prema gore. Pažljivo pokrijte pokrovnicom i

promatrajte pod povećanjem 280 X. Zatim promatrajte jednu stanicu pod većim povećanjem

(900 X) i vidjeti ćete sve žive, aktivne dijelove stanice: jezgru, citoplazmu, plastide i nežive,

neaktivne dijelove: uklopine (kristali, škrob, aleuronska zrnca), vakuolu, staničnu stijenku.

Vakuole djeluju prozirno (optički prazno). One zauzimaju najveći dio volumena stanice,

potiskujući citoplazmu i jezgru uz staničnu stijenku. Između samih vakuola uočavaju se tanki

slojevi citoplazme koji djeluju kao niti. Detaljno nacrtajte stanicu.

Naziv objekta: Allium cepa, L. - crveni luk Sadržaj preparata: živa pokožica (epiderma) lista lukovice Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

4.1.2 Odjeljci eukariotskih stanica vidljivi elektronskim mikroskopom

Proučite elektronsko-mikroskopske slike različitih staničnih organela i nacrtajte: a)

endoplazmatski retikul, b) Golgijev aparat, c) jezgru, d) lizosome i peroksisome. Označite

submikroskopske strukture!

25

Vježba 5. STANIČNA ENERGETIKA

Proizvodnja metaboličke energije glavna je aktivnost svih stanica, a dva citoplazmatska

organela posebice su posvećena energetskom metabolizmu i proizvodnji ATP.

Mitohondriji, koji su prisutni u svim eukariotskim stanicama i plastidi (najznačajniji su

kloroplasti) koji se nalaze samo u biljkama, su organeli koji pretvaraju energiju u oblike koji

se koriste za izvođenje brojnih staničnih reakcija: pokretanje, aktivni transport, biosintezu.

Mitohondriji su odgovorni za stvaranje iskoristive energije (u obliku ATPa) koja se dobiva

razgradnjom lipida i ugljikohidrata, dok kloroplasti hvataju sunčevu energiju da bi stvorili ATP

i reducirajuću snagu za sintezu ugljikohidrata iz CO2 i H2O.

Iako različiti, imaju nekoliko zajedničkih osobina. Oba tipa organela sadrže veliku količinu

unutarnjih membrana kojima su omeđeni posebni odjeljci s različitim skupinama enzima

(različiti reakcijski prostori). Oba organela vuku podrijetlo od bakterija (purpurnih bakterija i

cijanobakterija) koje su razvile simbiontski odnos živeći u eukariotskim stanicama. Dokaz za

njihovo tzv. endosimbiontsko podrijetlo je, između ostalog, i njihov vlastiti genetički sustav

koji je odvojen i različit od genetičkog sustava jezgre. Ovi organeli imaju vlastitu DNA koja je

prokariotskog tipa, kružnog je oblika i prisutna je u mnogo kopija po organelu. Ona kodira

svu rRNA, većinu tRNA te dio proteina potrebnih za funkciju tih organela. Ostatak potrebnih

proteina sintetizira se i uvozi iz citoplazme. Dijele se binarnim cijepanjem kao i bakterije.

5.1 Mitohondrij

U eukariotskim stanicama mitohondriji imaju ključnu ulogu u stvaranju metaboličke energije i

stoga su mjesto staničnog disanja. Odgovorni su za transformaciju slobodne energije

dobivene oksidacijom ugljikohidrata i masnih kiselina u posebni oblik molekule koja može

služiti kao prijenosnik slobodne energije u stanici, u ATP. Taj se proces naziva oksidativna

fosforilacija.

100 nm

(a) (b)

matriks

krista

vanjska

membrana

međumembranski

prostor

unutarnja

membrana

Slika 5.1 Crtež i EM slika mitohondrija (1).

Mitohondrij je okružen dvjema membranama koje čine ovojnicu (slika 5.1). Vanjska

membrana propusna je za male molekule jer sadrži proteine - porine, koji stvaraju kanale u

26

membrani kroz koje slobodno prolaze molekule manje od 10 000 daltona*. Unutarnja

membrana nepropusna je za većinu iona i malih molekula i sadrži vrlo veliki postotak

proteina. Nabrana je u mnogobrojne nabore - kriste koji se pružaju u središnji prostor

mitohondrija nazvan matriks. Prostor između dviju membrana naziva se međumembranski

prostor. Mitohondrijski matriks sadrži velik broj različitih enzima koji uz prisutnost velikih

količina molekulskog kisika (O2) oksidiraju piruvat i masne kiseline do acetil CoA, te enzime

ciklusa limunske kiseline koji oksidirajući acetil CoA stvaraju velike količine NADH i

FADH2. Visokoenergetski elektroni iz NADH i FADH2 se tada prenose do molekulskog

kisika, preko posebnih prenosilaca na unutarnjoj membrani mitohondrija (slika 5.2). Energija

koja se pri tome oslobađa pretvara se u energiju protonskog gradijenta preko unutrašnje

membrane, što se, u konačnici, iskorištava za sintezu ATP-a (proces oksidativne

fosforilacije).

piruvat

piruvat

masne kis.

masne kis.

ciklus

limunske

kiseline

acetil CoA

Slika 5.2 Energetski metabolizam mitohondrija. Piruvat i masne kiseline ulaze u mitohondrij, razgrađuju se do acetil CoA, a onda ulaze u ciklus limunske kiseline u kojem se stvaraju NADH i FADH2. U procesu oksidativne fosforilacije visokoenergetski elektroni iz NADH i FADH2 prelaze na kisik pomoću respiratornog lanca na unutrašnjoj membrani, stvarajući kemiosmotskim mehanizmom ATP (1).

* Da, dalton je jedinica molekulske mase definirana kao 1/12 mase 12C (≅ 1,66 x 10-24 g, što po prilici odgovara masi vodikovog atoma). Molekulska težina je omjer mase molekule i 1/12 mase 12C (te je stoga relativan broj). Molekulske mase velikih bioloških molekula (kao što su proteini) najčešće se izražavaju u kilodaltonima (kDa = 1000 Da). Primjerice, masa humanog inzulina je 5,8 kDa, a humanog hemoglobina 64,5 kDa.

Bez mitohondrija stanice životinja i gljiva bile bi anaerobne i ovisile bi o relativno

neučinkovitom procesu anaerobne glikolize u citoplazmi, kojim se glukoza razgrađuje do

27

piruvata uz oslobađanje samo malog dijela ukupne slobodne energije (2 ATP) sadržane u

molekuli glukoze. Kompletnom oksidacijom glukoze do CO2 i H2O može se dobiti 36 do 38

molekula ATPa procesom oksidativne fosforilacije u kojem nastaje ATP kada se elektroni

prenose s NADH ili FADH2 na molekulski kisik putem serije nosača elektrona.

5.2 Kloroplasti i ostali plastidi

Kloroplasti su veliki organeli (5 do 10 µm) prisutni isključivo u biljnim stanicama, a odgovorni

su za fotosintezu. U mnogočemu su nalik mitohondrijima; stvaraju metaboličko gorivo,

endosimbiontskog su podrijetla, imaju vlastiti genetički sustav i umnožavaju se binarnim

cijepanjem. Ipak, kloroplasti su veći i kompleksniji od mitohondrija. Osim što proizvode ATP,

kloroplasti sintetiziraju ugljikohidrate fotosintetskom pretvorbom CO2, većinu aminokiselina,

masne kiseline i lipidne komponente vlastitih membrana. Nadalje, u njima se reducira nitrit u

amonijak, što je ključni korak u ugradnji anorganskog dušika u organske spojeve. Za razliku

od mitohondrija, uz vanjsku i unutarnju membranu koje čine ovojnicu, kloroplasti imaju

još jedan unutrašnji sustav membrana - tilakoidne membrane (slika 5.3). To je mreža

spljoštenih diskova - tilakoida, koji su često poredani u nakupinu koja se naziva granum

(množina grana). Te tri membrane dijele kloroplast u tri različita unutrašnja prostora:

međumembranski prostor - unutar ovojnice, stromu - prostor omeđen unutrašnjom

membranom i tilakoidni prostor - omeđen tilakoidnom membranom. Kao i u mitohondriju,

vanjska membrana je propusna za male molekule i ione, dok je unutrašnja nepropusna.

Stroma kloroplasta je ekvivalent mitohondrijskog matriksa. Sadrži genetički materijal i brojne

skupine metaboličkih enzima, kao što je primjerice skupina enzima za pretvorbu

anorganskog CO2 u ugljikohidrate tijekom fotosinteze. Na tilakoidnoj membrani smješteni su

fotosustavi koji sadrže pigmente (klorofili, karotenoidi i ostali) te sustav prijenosa elektrona.

stroma

međumembranski

prostor

vanjska

membrana

unutrašnja

membrana

tilakoidna

membrana

lumen

tilakoida

Slika 5.3 Struktura kloroplasta. Uz unutrašnju i vanjsku membranu ovojnice, kloroplasti sadrže i treći sustav membrana: tilakoidne membrane. Te tri membrane dijele kloroplast na tri unutrašnja odjeljka (2).

Tijekom fotosinteze (slika 5.4) sunčeva se svjetlost apsorbira i pretvara u iskoristiv oblik

kemijske energije. Apsorpcija svjetlosti pobuđuje elektrone u više energetsko stanje. Oni se

28

zatim prenose preko serije prenosilaca na tilakoidnoj membrani pri čemu se sintetiziraju ATP

i NADPH, uz cijepanje molekule H2O. Pomoću ATP i NADPH u stromi se, zatim, sintetiziraju

ugljikohidrati fiksacijom CO2. Reakcije na tilakoidnoj membrani nazivaju se reakcije na

svjetlu, za razliku od reakcija u stromi koje se nazivaju reakcije u tami ili Calvinov ciklus

(reakcije za koje nije potrebna svjetlost).

Slika 5.4 Fotosinteza: povezivanje reakcija na svjetlu i Calvinovog ciklusa (5). Kloroplasti su članovi veće skupine biljnih organela koji se nazivaju plastidi. Kod gljiva i

nekih visoko specijaliziranih biljnih stanica nema plastida. Svi plastidi imaju isti genom, pa

tako i kloroplasti, ali se potonji razlikuju po strukturi i funkciji. Kloroplasti, koji su se

specijalizirali za fotosintezu, jedini imaju tilakoide i fotosintetski sustav.

Svi tipovi plastida nastaju iz malih (0,5 do 1µm u promjeru), slabo diferenciranih, bezbojnih

proplastida (slika 5.5a), koji su prisutni u nediferenciranim meristemskim stanicama koje se

brzo dijele. Proplastidi se razvijaju u zrele tipove plastida ovisno o potrebama stanice. Razvoj

plastida kontrolira se unutrašnjim programom stanične diferencijacije i čimbenicima okoliša,

od kojih je najvažnije svjetlo. Tako se u fotosintetskim stanicama lista razvijaju kloroplasti.

Ukoliko biljka raste u mraku, razvoj kloroplasta se zaustavlja u stadiju etioplasta. Neke

reakcije u izgradnji fotosintetskog aparata i tilakoida ovisne su o svjetlosti (primjer enzima

ovisnog o svjetlosti je protoklorofil reduktaza). U etioplastu se formiraju tubularne unutarnje

membrane - protilakoidi i parakristalična struktura - prolamelarno tijelo (slika 5.5b), ali se

ne sintetizira klorofil (već žuta preteča klorofila). Ako se takve etiolirane biljke izlože svjetlu,

etioplasti nastavljaju razvoj u kloroplaste.

29

Zreli plastidi se mogu reverzibilno transformirati iz jednog tipa plastida u drugi. Na primjer,

tijekom sazrijevanja plodova (poput rajčice) kloroplasti se transformiraju u kromoplaste

(slika 5.6a). Tijekom tog procesa razgrađuju se tilakoidne membrane i klorofil, dok se

sintetiziraju karoteni. Kromoplasti se mogu razvijati i direktno iz proplastida. Kromoplasti su

fotosintetski neaktivni plastidi koji daju žutu, narančastu i crvenu boju plodovima i cvjetovima.

Sadrže mnogo lipida u obliku lipidnih globula. Jesenja boja lišća mnogih drvenastih biljaka

nastaje na taj način da se najprije razgrade klorofili, tako da preostanu samo karoteni.

Plastidi jesenjih požutjelih listova nazivaju se gerontoplasti.

škrobno

zrnce

(a) (b)

1µm1µm

prolamelarno

tijelo

Slika 5.5 EM slika proplastida i etioplasta. (a) Proplastidi u meristemskim stanicama sadrže malo unutarnjih struktura. (b) Protilakoidi etioplasta zrakasto se pružaju iz prolamelarnog tijela (1). Leukoplasti su nepigmentirani plastidi unutarnjih i epidermalnih stanica koje nisu

fotosintetski aktivne. Imaju pričuvnu ulogu i sadrže škrobna zrnca (amiloplasti), rezervne

proteine (proteinoplasti) ili lipide (elaioplasti) (slika 5.6).

1µm 1µm

škrobno

zrnce

(a) (b)

Slika 5.6 EM slika kromoplasta i leukoplasta (amiloplast). (a) Kromoplasti sadrže lipidne kapljice u kojima su pohranjeni karoteni. (b) Amiloplasti sadrže velike granule škroba (2).

5.3 Zadaci:

30

Nacrtajte stanice s proplastidima, kloroplastima, kromoplastima, leukoplastima, onako kako

ih vidite pod mikroskopom. Proučite EM snimke mitohondrija i kloroplasta, nacrtajte ih i

označite njihove dijelove.

5.3.1 Proplastidi

Proučite pri slabom povećanju anatomiju vegetacijskog vrška vodene kuge, a onda u vršnim

stanicama uočite proplastide. To su stanice meristemskog (embrionalnog) karaktera i

njihove su jezgre relativno velike. U okolnoj citoplazmi opažaju se okrugla sitna tjelešca,

proplastidi. Nacrtajte vegetacijski vršak i opišite.

Uputa: Da biste vidjeli proplastide pod lupom pažljivo izolirajte vegetacijski vršak vodene

kuge. Vršak mora ostati neoštećen, a stanice u njemu žive. Pincetom odstranite listiće pa

kad opazite bijelu kvržicu, tj. vršak prekriven samo s nekoliko listića položite ga u kap vode

na predmetnom staklu i žiletom odrežite vrh iznad mjesta zametanja listića. Iglicom

odstranite listiće, no možete ih ostaviti u kapi jer će pridržavati pokrovnicu da previše ne

pritisne vršak.

5.3.2 Kloroplasti

Kloroplaste ćete lako uočiti u stanicama lista biljke vodene kuge. Pomoću svjetlosnog

mikroskopa može se vidjeti i dioba kloroplasta. U središnjem dijelu organela pojavljuje se

uvrat, koji se sužuje i na kraju prepolovi kloroplast na dva dijela. Potražite kloroplaste u diobi.

Uputa: Staklenku s vodom, u kojoj se nalazi vodena kuga, stavite pred žarulju da se ugrije i

potakne fotosinteza. Listić vodene kuge odvojite od stabljike, prenesite u kapljicu vode i

promatrajte pod povećanjem 900X. Pažljivim promatranjem izdužene stanice, na bazi uz rub

ili uz središnju žilu, uočiti ćete gibanje citoplazme. Ono je uočljivo u starijim, diferenciranim

stanicama, zbog prisutnosti kloroplasta koji su pasivno nošeni citoplazmatskom strujom.

Kružnim gibanjem citoplazme olakšava se raznošenje hranjivih tvari, koje je brže na mjestu

ozljede, uz rub lista i uz središnju žilu. Nacrtajte što vidite.

Naziv objekta: Helodea canadensis - vodena kuga Sadržaj preparata: živi listić, vegetacijski vršak Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodno zelena

5.3.3 Kromoplasti

Kromoplaste ćete vidjeti na prerezima cvjetnih latica (žuti tulipan, perunika, maćuhica i sl.) ili

zrelih plodova (rajčica, crvena paprika). Možete napraviti i prerez korijena mrkve (Daucus

carota).

Naziv objekta: Lycopersicum esculentum - rajčica, Capiscum annuum - crvena paprika, Daucus carota - mrkva Sadržaj preparata: pokožica ploda, prerez kroz korijen mrkve Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

31

5.3.4 Leukoplasti

Leukoplaste ćete lijepo vidjeti u stanicama epiderme lista biljke Rhoeo discolor ili Zebrina sp.

Uočavaju se kao kuglice koje često okružuju jezgru.

Naziv objekta: Rhoeo discolor Sadržaj preparata: stanice donje epiderme lista Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

5.3.5 Amiloplasti

Amiloplaste promatrajte u stanicama gomolja krumpira. Nacrtajte neobojane stanice sa

škrobnim zrncima. Obratite pažnju na izgled škrobnog zrnca. Svaka biljna vrsta ima

karakterističan oblik škrobnih zrnaca prema čemu je moguće vrstu i taksonomski odrediti.

Zatim na preparat krumpira kapnite malo Lugolove otopine (J-KJ) koja će obojiti škrobna

zrnca krumpira u modroljubičasto zahvaljujući histokemijskoj reakciji: škrob + jod = amiloza

(modro) + amilopektin (crveno-ljubičasto). Nacrtajte!

Naziv objekta: Solanum tuberosum - krumpir Sadržaj preparata: prerez kroz gomolj krumpira, leukoplasti i škrobna zrnca Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: a - prirodna sivkasta b - modro-ljubičasta, obojano Lugolovom otopinom

5.3.6 Etioplasti

Etioplaste pogledajte u presjecima listića biljke koja je isklijala i rasla u mraku.

Naziv objekta: Phaseolus sp. - grah Sadržaj preparata: etioplasti iz lista etiolirane biljke Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: prirodna

32

Vježba 6. STANIČNI CIKLUS

Stanični ciklus ili ciklus stanične diobe temelj je razmnožavanja svih živih bića. Kod

jednostaničnih organizama kao što su bakterije i kvasci, svakom staničnom diobom nastaje

novi organizam. Kod višestaničnih organizama potreban je velik broj staničnih dioba da bi

nastala nova jedinka, a odraslom organizmu stanična dioba je neophodna da zamijeni

istrošene i mrtve stanice.

Stanični rast i dioba podijeljeni su na faze staničnog ciklusa: interfazu i M fazu. Stanična

dioba ili M faza sastoji se od dva uzastopna procesa: diobe jezgre (mitoza) i diobe

citoplazme (citokineza). Priprema stanice za diobu odvija se tijekom faze rasta staničnog

ciklusa, interfaze. Prije nego što se tipična stanica podijeli, DNA mora biti vjerno replicirana,

a udvostručeni kromosomi moraju se rasporediti na dvije stanice kćeri. Osim toga, tijekom

staničnog ciklusa stanica mora povećati svoju masu i udvostručiti svoje citoplazmatske

organele. Samo na taj način će dvije novonastale stanice kćeri sadržavati sve komponente

neophodne za rast i diobu. Takav slijed događaja staničnog ciklusa vođen je kontrolnim

sustavom staničnog ciklusa koji ciklički pokreće bitne procese stanične reprodukcije, kao

što su replikacija DNA i razdvajanje kromosoma (slika 6.1).

MG2

G1

Sinterfaza

Slika 6.1 Faze staničnog ciklusa. Ciklus stanične diobe većine eukariotskih stanica podijeljen je u četiri zasebne faze: M, G1, S i G2. M faza se sastoji od diobe jezgre (mitoza) iza koje obično slijedi citokineza (dioba citoplazme). S faza je razdoblje tijekom kojeg se događa replikacija DNA. Stanica raste tijekom interfaze koja uključuje G1, S i G2 fazu (2).

6.1 Interfaza

Interfaza je stadij između dvije diobe stanice, sastoji se od G1, S, i G

2 faze, i obuhvaća oko

90% ukupnog trajanja staničnog ciklusa. Tijekom interfaze stanica se priprema za diobu i

udvostručuje svoj genetički materijal (replikacija DNA). Replikacija DNA ograničena je samo

na dio interfaze, S fazu (S od engl. synthesis = sinteza). Prije S faze događa se G1 faza (G

33

od engl. gap = pukotina) u kojoj se "provjerava" i "odlučuje" da li je stanica spremna za

ulazak u S fazu. U G2 fazi, intervalu između kraja sinteze DNA i početka M faze, "provjerava"

se uspješnost i završetak replikacije DNA i "odlučuje" da li su svi uvjeti zadovoljeni za ulazak

stanice u M fazu. G1 i G

2 faze pružaju dodatno vrijeme za rast stanice.

6.2 M faza

6.2.1 Mitoza

Mitoza je dioba jezgre u kojoj se genetički materijal, udvostručen u prethodnoj interfazi,

raspoređuje na dvije jezgre-kćeri, tako da obje dobiju isti broj kromosoma tj. jednaku

genetičku uputu kao što ju je imala majčinska stanica. To je dioba koja osigurava

konstantnost genetičkog materijala. Mitozu u pravilu prati dioba citoplazme - citokineza.

Mitoza predstavlja kontinuirani i dinamični slijed događaja, međutim, radi lakšeg

razumijevanja, dijelimo je na faze.

(a) (b)

(c)(d) (e)

PROFAZA PROMETAFAZA

METAFAZATELOFAZA

ANAFAZA

diobeno vreteno

jezgrina ovojnica

jezgrica

centromer

sestrinske

kromatide

Slika 6.2. Faze mitoze. (a) U profazi se svaki kromosom sastoji od dvije sestrinske kromatide. Počinje se formirati diobeno vreteno, kromosomi se skraćuju i još su okruženi jezgrinom ovojnicom. (b) Prometafaza započinje fragmentacijom jezgrine ovojnice u membranske vezikule, kromosomi se još više skraćuju. (c) U metafazi su kromosomi maksimalno kondenzirani i leže u ekvatorijalnoj ravnini. (d) Anafaza započinje razdvajanjem sestrinskih kromatida koje sada postaju samostalni kromosomi. Kromosomi putuju prema polovima diobenog vretena. (e) Kromosomi stižu na polove diobenog vretena, formiraju se jezgrina ovojnica i jezgrica, kromosomi se despiraliziraju i mitoza završava (1). 6.2.1.1 Profaza. Mitoza započinje profazom (slika 6.2a). Kromatin koji je difuzan u interfazi

polako se kondenzira u niti koje izgledaju kao klupko. Svaki kromosom se sastoji od dvije

34

sestrinske kromatide koje se drže zajedno na položaju centromera - specifičnog slijeda

nukleotida molekule DNA na koji se veže specijalizirana proteinska struktura - kinetohor.

Prema kraju profaze počinje se formirati diobeno vreteno (diobeno vreteno ne možete

vidjeti pod svjetlosnim mikroskopom).

6.2.1.2 Prometafaza započinje naglim raspadanjem jezgrine ovojnice u membranske

vezikule (fragmentacija jezgre) (slika 6.2b). Na svakoj strani centromera sazrijeva kinetohor i

veže se na posebnu skupinu mikrotubula diobenog vretena nazvanu kinetohorni

mikrotubuli. Preostali mikrotubuli vretena nazivaju se preklapajući ili polarni mikrotubuli,

dok se oni izvan vretena nazivaju zrakasti mikrotubuli (slika 6.3). Kromosomi su podijeljeni

u kromatide koje se jasno vide, a na nekima možemo uočiti centromer, kao mjesto na kojem

se kromosom čini prekinut.

kinetohor

zrakasti

mikrotubuli

kinetohorni

mikrotubuli

polarni

mikrotubuli

Slika 6.3 Tri vrste mikrotubula diobenog vretena (1).

6.2.1.3 Metafaza. Kinetohorna vlakna diobenog vretena poredaju kromosome po sredini

vretena tako da njihovi centromeri leže u ekvatorijalnoj ravnini formirajući metafaznu ploču,

a kraci strše prema jednom ili drugom polu (slika 6.2c). Kromosomi su maksimalno

kondenzirani (transportni oblik kromosoma) i jasno vidljivi (slika 6.4). Stanica može u

metafazi ostati duže vrijeme (satima ili čak danima), sve dok specifičan signal odaslan od

sustava za kontrolu staničnog ciklusa ne signalizira prijelaz iz metafaze u anafazu.

35

metafazni

kromosom

kromatida

kinetohor

kinetohorni

mikrotubuli

centromer

metafazni

kromosom

kromatida

kinetohor

kinetohorni

mikrotubuli

(b)(a)

Slika 6.4 Crtež i EM snimka kromosoma u metafazi (1).

6.2.1.4 Anafaza. Nakon unutarstaničnog signala koji započinje anafazu, mijenjaju se proteini

koji su povezivali sestrinske kromatide u metafaznoj ploči i one se počinju odvajati (slika

6.2d). Parovi kinetohora se također razdvajaju, vukući za sobom i sestrinske kromatide, koje

sada postaju zasebni kromosomi. Kretanje sestrinskih kromatida prema polovima vretena

posljedica je dvaju nezavisnih procesa. Prvo, skraćuju se kinetohorni mikrotubuli (što se

naziva anafaza A), i drugo, produžuju se preklapajući mikrotubuli koji polove vretena još

dodatno razdvajaju (anafaza B).

6.2.1.5 Telofaza. U telofazi (telos = kraj, grč.) razdvojeni kromosomi stižu na polove vretena,

a kinetohorni mikrotubuli nestaju. Preklapajući mikrotubuli se još više izdužuju, ponovo se

stvara jezgrina ovojnica oko svake skupine kromosoma. Kromosomi se despiraliziraju i

postaju duge, tanke niti, a jezgrice koje su nestale u profazi počinju se ponovo pojavljivati i

mitoza završava (slika 6.3e).

6.2.2 Citokineza

Citokineza je dioba citoplazme koja započinje već tijekom anafaze. U životinjskoj stanici se

po sredini, okomito na os vretena i između jezgara kćeri, stvara žlijeb (ubor), koji se

postepeno produbljuje dok ne podijeli stanicu na dvije stanice-kćeri (slika 6.5b). Biljne

stanice imaju čvrstu celuloznu stijenku pa kod njih ne nastaje ubor, već se u ekvatorijalnoj

ravnini formira fragmoplast - bačvasto tijelo u kojem su brojne Golgijeve vezikule sa

sastojcima stanične stijenke (slika 6.5a).

36

Golgijeve vezikule ostaci polarnih mikrotubula

mikrotubuli fragmoplastazačetak stanične stijenke

(a)

telofaza

citokineza

(b)

kontraktilni

prsten

ostaci polarnih

mikrotubula

Slika 6.5 Citokineza u biljnoj i životinjskoj stanici. (a) U biljnoj stanici od polarnih mikrotubula već u telofazi počinje stvaranje fragmoplasta. Golgijeve vezikule koje nose preteče stanične stijenke povezuju se s mikrotubulima, gomilaju na ekvatorijalnoj ravnini i stapaju u staničnu stijenku. Nove Golgijeve vezikule se dodaju na krajevima stanične stijenke koja se izdužuje prema van. (b) Tijekom citokineze u životinjskoj stanici po sredini stanice se stvara kontraktilni prsten od aktinskih i miozinskih vlakana. Kontrakcijom prstena nastaje žlijeb, koji se sve više produbljuje i u konačnici podijeli stanicu na dva dijela (1).

6.3 Citološke tehnike

Među različitim citološkim tehnikama koje se koriste u istraživanjima kromosoma, najčešće

se koristi tehnika "gnječenja" (engl. squash technique). Obrada kromosoma odvija se u

više stupnjeva, a to su: prethodna obrada, fiksacija, pohranjivanje, bojenje, prepariranje. Svi

navedeni postupci ne moraju se uvijek primijeniti: npr. boja može ujedno služiti kao fiksativ

pa se fiksacija, bojanje i preparacija izvrše odjednom.

6.3.1 Prethodna obrada

Živi materijal može se obraditi prije fiksacije ako istraživanja to zahtijevaju. Primjerice, u

profazi mitoze kromosomi su duge, tanke niti koje nije moguće međusobno razlučiti. Lakše ih

je promatrati kada su maksimalno kondenzirani, no tada su gusto poredani na diobenom

vretenu s centromerima u ekvatorijalnoj ravnini pri čemu se međusobno prekrivaju. Tehnika

"gnječenja" nije dovoljna da razdvoji pojedinačne kromosome. Neki kemijski spojevi kao

kolhicin ili 1-monobromnaftalen sprječavaju formiranje diobenog vretena pa se kromosomi

nakon profaze ne mogu pričvrstiti za niti diobenog vretena, već ostanu raštrkani u stanici.

Postupkom gnječenja razmaknu se još više, a to omogućuje točno utvrđivanje broja

kromosoma i njegove morfologije. Kolhicin ima dodatno djelovanje koje se očituje u

razmicanju sestrinskih kromatida i pojačanoj kontrakciji kromosoma. Koristi se 0,01% -

0,05% vodena otopina kolhicina. Materijal se tretira 4-6 sati u prikladnim posudama koje nisu

čvrsto zatvorene (prozračivanje). Skupi kolhicin može se zamijeniti sintetičkim spojem 1-

37

monobromnaftalenom: materijal stoji u zasićenoj otopini 12-15 sati na 4oC. OPREZ! Kolhicin

i 1-monobromnaftalen su otrovi!

6.3.2 Fiksacija

Svrha fiksacije je u tome da se stanica sačuva tako da bude što sličnija živoj stanici.

Najčešće se koristi mješavina alkohola i octene kiseline tzv. aceto-alkohol ili Carnoy.

Fiksativ: Apsolutni alkohol Ledena octena kiselina Kloroform

Aceto-alkohol 3 volumna dijela 1 volumni dio -

Carnoy 6 volumnih dijelova 1 volumni dio 3 volumna dijela

6.3.3 Pohranjivanje materijala

Ponekad je materijal dostupan samo povremeno pa ga treba pohraniti i sačuvati. Životinjski

materijal obično se čuva u fiksativu dok je biljni materijal bolje prebaciti nakon 6-24 sata iz

fiksativa u sljedeću mješavinu: ledena octena kiselina, 70% alkohol i 50% glicerol u

volumnim omjerima 3:6:3.

6.3.4 Bojanje i preparacija. Za bojanje aceto-bojama najčešće se koriste boje karmin i

orcein koje se pripremaju kao 1-2% otopina u 45% octenoj kiselini.

6.4 Zadaci:

Proučiti i nacrtati sve faze mitoze. Savladati citološku tehniku „gnječenja“.

Pomoću svjetlosnog mikroskopa promatrajte različite faze mitoze u stanicama korjenovog

vrška luka (Allium cepa 2n = 16), zatim nacrtajte po jednu stanicu u svakoj od faza.

Usporedite sa slikom 6.6. Pogledajte i trajne preparate mitoze u stanicama korjenovog vrška

luka.

Uputa: 1. Lukovice luka postavite iznad posudice s vodom tako da dio luka s korjenčićima

bude uronjen u vodu. Kroz nekoliko dana će izrasti novi korjenčići. 2. Pomoću pincete

otkinite vrhove korijena dugačke oko 1 cm. Stavite ih u epruvetu s malo aceto-boje i lagano

grijte provlačeći epruvetu kroz plamen sve dok se ne pojave prvi mjehurići. OPREZ! Boja ne

smije kipjeti, pazite da se ne ozlijedite vrućom bojom. 3. Na predmetno stakalce kapnite kap

boje i stavite korjenčić. Iglicom otkinite sam vršak korjenčića (oko 1 mm), a ostatak odbacite.

Zaobljenim drškom iglice tuckajte po preparatu da se raspadne u manje komadiće. Poklopite

pokrovnim stakalcem pazeći da ne uđe zrak. 4. Preko pokrovnice položite dva, tri sloja filter

papira i snažno pritisnite jagodicom prsta (squash) preparat, tako da se stanice rasporede u

jednom sloju.

Naziv objekta: Allium cepa L. - luk

38

Sadržaj preparata: macerat tretiranog vrha korijena u raznim fazama diobe stanica Vrsta preparata: trajni preparat Sredstvo uklapanja: euparal Boja preparata: ljubičasto obojenje (Feulgen)

Slika 6.6. Mitoza u stanicama korijenovog vrška luka (Allium cepa) kako se vidi svjetlosnim mikroskopom (1).

39

Vježba 7. MEJOZA

U prirodi postoje mnogi primjeri nespolnog razmnožavanja. Jednostanični organizmi se

razmnožavaju binarnim cijepanjem. Mnoge biljke mogu se razmnožavati vegetativno, hidra

se razmnožava pupanjem, kod nekih guštera prisutne su samo ženske jedinke, a mnogi

morski organizmi se jednostavno podijele na pola i nadoknade polovinu tijela koja nedostaje.

Takvi oblici nespolnog razmnožavanja daju potomstvo koje je genetički istovjetno

roditeljskom organizmu. Spolno razmnožavanje, s druge pak strane, zahtijeva miješanje

genetičkog materijala dvaju organizama da bi se na kraju proizvelo genetički različito

potomstvo. Potomci se dakle, u slučaju spolnog razmnožavanja razlikuju, kako međusobno

tako i od svojih roditelja. S obzirom da takav način razmnožavanja dominira u prirodi, očito je

da ima prednosti nad nespolnim načinom razmnožavanja. Čak se neki organizmi, koji se

inače razmnožavaju nespolno, povremeno upuštaju u spolnu reprodukciju i stvaraju nove

kombinacije gena. Spolno razmnožavanje evolucijski ima prednost jer se stvaranjem novih

kombinacija gena povećava mogućnost da će barem jedan dio potomstva preživjeti

nepredvidljive promjene u okolini.

Dva su događaja ključna za spolni način razmnožavanja: stapanje spolnih rasplodnih stanica

(gameta) prilikom oplodnje i mejoza. Mejoza je specijalna vrsta stanične diobe kojom se broj

kromosoma reducira na pola, a rezultat toga je stvaranje haploidnih stanica, gameta.

Sve tjelesne (somatske) stanice su diploidne (2n) i razvile su se mitotskim diobama iz zigote.

Zigota je nastala stapanjem dviju haploidnih spolnih stanica (n), gameta. U diploidnoj je

jezgri svaki kromosom - autosom zastupljen dva puta. Takve članove para nazivamo

homologni kromosomi (homolozi). Jedan član para se nasljeđuje od oca, a drugi od majke.

Iznimka su spolni kromosomi X i Y koji određuju spol. Diploidne stanice žena imaju dva X

kromosoma, a muškaraca po jedan X i Y. Tako su, zapravo, 46 kromosoma u ljudskim

stanicama dvije skupine od po 23 kromosoma, jedna skupina naslijeđena od oca, a druga od

majke. Gamete kod čovjeka (spermiji i jajašca) nastaju isključivo u jajnicima i testisima

mejozom.

7.1 Stadiji mejoze

Prije mejoze (kao i prije mitoze) udvostručuju se kromosomi, nakon čega slijede dvije

uzastopne stanične diobe nazvane mejoza I i mejoza II. U tim diobama stvaraju se četiri

stanice, svaka s haploidnim (n) brojem kromosoma (za razliku od mitoze gdje se stvaraju

dvije stanice s diploidnim (2n) brojem kromosoma). Mejoza se prema tome sastoji od dvije

diobe jezgre prije čega se genetički materijal samo jednom udvostruči. Mejozu I dijelimo na

profazu I - unutar koje se razlikuju leptoten, zigoten, pahiten, diploten i dijakineza (slika7.3),

metafazu I, anafazu I, telofazu I (slika 7.4), a mejozu II na profazu II, metafazu II, anafazu II

i telofazu II (slika 7.6).

40

7.1.1 Profaza I

Profaza I je u odnosu na profazu mitoze posebno produžena. Nakon što se kromosomi

udvostruče u S fazi, sestrinske kromatide ostaju međusobno povezane, a svaki tako

udvostručeni kromosom sparuje se sa svojim homologom i tvori bivalent, strukturu od četiri

kromatide. Takvo sparivanje ne postoji u mitozi i vrlo je važno jer dovodi kromatide u položaj

koji omogućuje genetičku rekombinaciju, proces u kojem se izmjenjuje genetički materijal

majčinog s genetičkim materijalom očevog kromosoma. Mjesto gdje se događa genetička

rekombinacija nesestrinskih kromatida naziva se kijazma (slika 7.1).

U leptotenu se kromosomi kondenziraju (spiraliziraju) i izgledaju poput klupka vrlo tankih,

dugih niti. Svaki kromosom građen je od dvije kromatide. Jače obojena mjesta (jače

spiralizirana) zovu se kromomere.

U zigotenu započinje sparivanje (sinapsa) homologa. Između dva para sestrinskih

kromatida stvara se sinaptički kompleks, komplicirana struktura koja pomaže u sparivanju

homologa (slika 7.2). Sinaptički kompleks se ne može vidjeti svjetlosnim mikroskopom.

očeve

sestrinske

kromatide

majčine

sestrinske

kromatide

interfaza

leptoten

zigoten

pahiten

diploten iza kojeg

slijedi dijakineza

kromatida 1

kromatida 2

kromatida 3

kromatida 4

Slika 7.2 Stvaranje i razgradnja sinapse u bivalentu tijekom profaze I (1).

U pahitenu je završeno sparivanje homologa te spareni homolozi čine bivalente. Pahiten

obično traje duže vrijeme (nekoliko dana) i tada se izmjenjuje genetički materijal između

nesestrinskih kromatida homologa u bivalentu. Sparivanje homologa omogućuje genetičku

A

B C DE F

fe

dcba

Slika 7.1 Bivalent u diplotenu s jednom kijazmom. Neki geni označeni su slovima. Između jedne kromatide majčinog i jedne kromatide očevog kromosoma dogodila se genetička rekombinacija (engl. crossing-over").

41

rekombinaciju, prilikom čega se dijelovi majčinske kromatide mogu izmjenjivati s

odgovarajućim dijelom homologne očeve kromatide. Ovaj genetički događaj ne možemo

direktno vidjeti, a naziva se “crossing-over” (engl.). Morfološka manifestacija “crossing-

overa" koju vidimo pod mikroskopom naziva se kijazma (citološki pojam).

U stadiju diplotena dolazi do razgradnje sinaptičkog kompleksa, a veza između homologa

popušta. Međutim, homolozi se drže zajedno zahvaljujući kijazmama. Kijazme su mjesta na

kojima su dva homologa fizički povezana (slika 7.1). Kromosomi se još jače kondenziraju i

kijazme se mogu vidjeti po prvi put (slika 7.3).

Slika 7.3 Stadiji profaze prve mejotske diobe (2).

Tijekom dijakineze kromosomi postaju još deblji i kraći. Može se opaziti da je bivalent

sastavljen od četiri kromatide. Sestrinske kromatide se drže zajedno na položaju

centromera, dok su nesestrinske kromatide (majčina i očeva) povezane na mjestu kijazme,

koja se sada vidi (slika 7.3).

7.1.2 Metafaza I.

U metafazi I bivalenti se nasumično poredaju u ekvatorijalnu ravninu. Kinetohori homologa

okrenuti su prema suprotnim polovima, a kijazme se nalaze u ekvatorijalnoj ravnini (slika 7.4

i 7.5a). Tijekom metafaze I dolazi, dakle, do dodatne preraspodjele genetičkog materijala.

Bivalenti se nasumično poredaju u ekvatorijalnu ravninu pa tako svaka gameta dobiva

različitu kombinaciju majčinih i očevih kromosoma. Samo tim procesom jedna jedinka može

proizvesti 2n genetički različitih gameta, gdje je “n” haploidan broj kromosoma.

42

Slika 7.4 Slike i shematski prikaz mejoze I (4)

7.1.3 Anafaza I.

Tijekom anafaze I homolozi (svaki se sastoji od dvije sestrinske kromatide) putuju prema

suprotnim polovima i vuku za sobom kromatide koje “vise” slobodno prema ekvatoru (slika

7.4 i 7.5a). Kijazme se pomiču sve više prema krajevima kromosoma i terminaliziraju.

anafaza I

hijazma

metafaza I

kinetohori

sestrinskih

kromatida

djeluju kao

jedan

metafaza II

anafaza II

kinetohori

sestrinskih

kromatida

okrenuti su

prema suprotnim

polovima

(a) (b)

Slika 7.5 Shematski prikaz kromosoma u mejozi I (a) i mejozi II (b) (1). 7.1.4 Telofaza I.

43

U telofazi I kromosomi se despiraliziraju. Svaka novonastala jezgra sadrži polovičan broj

kromosoma. Jezgre su genetički različite, zbog toga što se dogodio “crossing-over”, ali i zbog

nasumične raspodjele (orijentacije) bivalenata u metafazi I. Obično se istovremeno događa i

citokineza. Kod nekih vrsta slijedi interkineza u kojoj se stvaraju jezgrina ovojnica i jezgrica. U

drugim vrstama odmah kreće priprema za mejozu II koja je nalik mitozi (slika 7.4).

7.1.5 Profaza II

Profaza II počinje ponovnim skraćivanjem kromosoma, koji se sastoje od dviju kromatida

spojenih centromerom. Prema tome, od anafaze I oni se strukturno nisu promijenili, a

mijenjao se samo stupanj spiralizacije. Pojavljuje se diobeno vreteno i kromosomi putuju

prema ekvatorijalnoj ravnini (slika 7.6).

Slika 7.6 Slike i shematski prikaz mejoze II (4)

7.1.6 Metafaza II

U metafazi II, nakon potpunog formiranja diobenog vretena, kromosomi se centromerima

smjeste u ekvatorijalnu ravninu (slika 7.6). Kinetohori sestrinskih kromatida usmjereni su

prema suprotnim polovima (slika 7.5b).

7.1.7 Anafaza II.

44

Centromeri sestrinskih kromatida se konačno razdvajaju u anafazi II (slika 7.6) i sestrinske

kromatide putuju prema polovima kao zasebni kromosomi (slika 7.5b).

7.1.8 Telofaza II i citokineza

Slijede telofaza II i citokineza. Počinju se stvarati jezgrine ovojnice, a citoplazma se dijeli.

Nastaju četiri jezgre svaka s polovičnim brojem kromosoma koje se u genetičkom smislu

razlikuju kako međusobno, tako i s obzirom na roditeljsku stanicu (slika 7.6).

7.2 Zadaci:

Promatrajte stadije mejoze u spolnoj žlijezdi skakavca. Nacrtajte i označite sve stadije

mejoze koje možete uočiti.

7.3 Pitanja:

1. Navedite sve razlike koje znate između mejoze i mitoze.

2. Ako je diploidan broj kromosoma nekog organizma 2n = 8, koliko različitih gameta može

nastati ako se uzme u obzir samo nasumična raspodjela bivalenata tijekom metafaze I?

Koji još događaj tijekom mejoze pridonosi genetičkoj raznolikosti gameta?

3. Broj molekula DNA u G1 fazi staničnog ciklusa je 20.

Koliko molekula DNA ima u :

• metafazi I,

• metafazi mitoze,

• anafazi II ako pretpostavimo da se u mejozi I dogodila citokineza,

• u gametama,

• u zigoti nakon oplodnje?

Koliko ima, u toj istoj stanici:

• bivalenata u profazi I,

• hijazmi u diplotenu, ako se u pahitenu dogodilo 6 “crossing-overa”,

• mogućih kombinacija kromosoma u gametama ako se uzima u obzir samo

nasumična raspodjela bivalenata tijekom metafaze I?

45

Vježba 8. JEZGRA U INTERFAZI, POLITENSKI KROMOSOMI

Kromosomi u interfazi su previše tanki da bi ih se moglo pojedinačno razabrati svjetlosnim

mikroskopom i izgledaju kao da su jednoliko raspršeni po jezgri. Jezgra, ipak, ima unutarnju

strukturu kojom se organizira genetički materijal i odjeljuju jezgrine funkcije u za to određena

područja (slika 8.1). Najistaknutija struktura unutar jezgre je jezgrica. To je mjesto

prepisivanja rRNA gena, sinteze rRNA te sklapanja ribosomskih podjedinica. Osim toga,

kromosomi su organizirani tako da čine funkcionalne domene što igra važnu ulogu u

regulaciji ekspresije gena.

eukromatin

jezgrica

jezgrinaovojnica

jezgrina

pora

heterokromatin

Slika 8.1 EM slika jezgre u interfazi. Mogu se

razlikovati svijetla područja eukromatina i

tamna područja heterokromatina (1).

DNA eukariotskih stanica čvrsto je vezana na male bazične proteine (histone) koji u

staničnoj jezgri pravilno pakiraju DNA. Kompleks eukariotske DNA i proteina zove se

kromatin.

Stupanj kondenzacije kromatina mijenja se tijekom životnog ciklusa stanice i povezan je s

kontrolom ekspresije gena (transkripcije). Dio kromatina koji tijekom interfaze ostaje jako

kondenziran i transkripcijski je uvijek neaktivan naziva se heterokromatin. U tipičnoj

interfaznoj jezgri oko 10% kromatina složeno je u heterokromatin koji se gledajući

elektronskim mikroskopom obično boji tamno (slika 8.1). Ostatak kromatina je svijetliji i

naziva se eukromatin. Postoje dva oblika eukromatina: aktivan, koji je najmanje

kondenziran i transkripcijski je aktivan te inaktivan, koji je manje kondenziran od

heterokromatina ali je više kondenziran od aktivnog eukromatina. Inaktivni eukromatin u

određenom tipu stanica može biti neaktivan, dok je u nekom drugom tipu stanica aktivan.

46

8.1 Politenski kromosomi

U nekim specijaliziranim vrstama stanica moguće je promatrati kromosome svjetlosnim

mikroskopom čak i kada se jezgra nalazi u interfazi. Najpoznatiji primjer su politenski ili

divovski kromosomi u žlijezdama slinovnicama ličinki dvokrilaca (slika 8.3) koje, iako rjeđe,

nalazimo i u biljnim stanicama nekih leguminoza.

Najviše se proučavaju politenski kromosomi u žlijezdama slinovnicama ličinki vinske mušice

Drosophila melanogaster. Neke stanice ličinke narastu do ogromnih razmjera jer se u

njima događaju uzastopni ciklusi sinteze DNA bez stanične diobe. Takve stanice mogu imati

i do nekoliko tisuća puta veći sadržaj DNA nego ostale stanice. U stanicama žlijezda

slinovnica ličinke svaki od četiri kromosoma se replicira desetak puta bez odvajanja

kromatida (endomitoza), tako da više od tisuću (210=1024) identičnih lanaca DNA ostaje

zajedno i tvori jedan veliki politenski kromosom.

Na kromosomu se mogu vidjeti naizmjenične tamne i svijetle pruge (slika 8.3). Tamne pruge

predstavljaju jače kondenzirana područja kromatina i nazivaju se kromomerne ploče jer

nastaju gomilanjem kromomera. Tamne i svijetle poprečne pruge vrlo su grub odraz

linearnog poretka gena na kromosomu. Područja koja su transkripcijski najaktivnija vide se

kao zadebljanja na kromosomima, slabije su obojana i nazivaju se kromosomska

zadebljanja (engl. puffs). Glavni čimbenik koji kontrolira aktivnost gena na politenskim

kromosomima Drosophile je steroidni hormon ekdison (hormon presvlačenja). Njegova

koncentracija se periodički mijenja tijekom razvoja ličinke i potiče aktivnost različitih gena,

ovisno o trenutnim potrebama ličinke. Tijekom razvoja ličinke nova zadebljanja se stvaraju, a

Slika 8.2 Model pakiranja kromatina. Crtež prikazuje glavne stupnjeve smatanja kromatina (1).

47

stara nestaju. Divovski kromosomi prisutni su u stanici u haploidnom broju jer su homolozi

spareni (somatsko sparivanje homolognih kromosoma). Takva četiri kromosoma međusobno

su povezana zajedno u području centromera, stvarajući strukturu koja se naziva

kromocentar.

normalni mitotički

kromosomi u

istom povećanju

područje gdje su

dva homologna

kromosoma

odvojena

desni krak

kromosoma 3

lijevi krak

kromosoma 3

desni krak

kromosoma 2

lijevi krak

kromosoma 2

X kromosom

kromosom 4

kromocentar (koji

je podijeljen na

dva dijela uslijed

gnječenja)

Slika 8.3 Slika divovskih (politenskih) kromosoma iz stanice žlijezde slinovnice vinske mušice (Drosophila melanogaster) (1).

zadebljanje - puff

(mjesto intenzivne

transkripcije gena)

kromomerna ploča

(a) (b)

10 µm

Slika 8.4 Politenski kromosom. a) Svjetlosno-mikroskopska snimka dijela politenskog kromosoma mušice Drosophila melanogaster (1) b) Crtež politenskog kromosoma i kromosomskog zadebljanja.

48

8.2 Životni ciklus vinske mušice

Vinska mušica ima kratak životni ciklus, lako se i jeftino uzgaja i stvara veliki broj potomaka. Ima

mali broj kromosoma (tri para autosoma i par spolnih kromosoma, 2n = 8), a u žlijezdama

slinovnicama ličinki pojavljuju se politenski kromosomi. To su sve razlozi zbog kojih je vinska

mušica nezamjenjiv model u genetičkim istraživanjima.

U prirodi se Drosophila najčešće nalazi oko sočnog, zrelog voća. U laboratoriju se može uzgajati

na relativno jednostavnim hranidbenim podlogama. Optimalna temperatura za rast je 25°C. Kod

ove temperature životni ciklus mušice traje dva tjedna, dok je pri temperaturi od 18°C on

dvostruko dulji. Životni ciklus joj se, dakle, može ubrzati uzgojem na višoj, odnosno usporiti

uzgojem na nižoj temperaturi. Drosophila ima kompletnu preobrazbu i prolazi kroz četiri stadija

razvitka: jaje, ličinka, kukuljica i odrasla mušica.

antena

oko

toraks

krilo

noga abdomen

glava

haltere

(a) (b)

Slika 8.5 Vinska mušica, Drosophila melanogaster. (a) Slika odrasle jedinke divljeg tipa i (b) crtež (1).

Mušica divljeg tipa ima duga ticala, normalna ravna krila duža od tijela, duge noge, sivo

dlakavo tijelo i crvene oči (slika 8.5). Ženke se po nekim vanjskim osobinama razlikuju od

mužjaka. One su veće, imaju zašiljen zadak s naizmjeničnim svjetlijim i tamnijim pojasevima,

nemaju češalj za kopulaciju i imaju vanjsko genitalno polje s leglicom. Mužjaci, koji su manji

od ženke, imaju zaobljen zadak s posljednjim pojasevima zatka spojenima u tamno polje,

imaju češljeve za kopulaciju na prvom paru nogu i kopulatorne organe između dva genitalna

nabora.

Tablica 8.1 Životni ciklus vinske mušice kod 25°°°°C.

Dan Razvojni stadij 0 položeno jaje 1 izlazak iz jajeta 2 prvo presvlačenje (veličina ličinke ≈1 mm, kreću se po hranidbenom mediju) 3 drugo presvlačenje (veličina ličinke ≈3 mm, kreću se po mediju) 4 treće presvlačenje (veličina ličinke ≈5 mm, stadij u kojem se promatraju politenski

kromosomi, ličinke se kreću po stijenkama posude za uzgoj i počinju se pričvršćivati za stijenku)

5 početak kukuljičenja 10 izlazak iz kukuljice, odrasla mušica

49

8.3 Zadaci:

1. Uspavajte nekoliko vinskih mušica kloroformom. Pod lupom pokušajte razlikovati mužjaka

od ženke. Navedite koje sve razlike vidite.

2. Iz posudice za uzgoj odaberite što veću ličinku vinske mušice. Na predmetnici, pod lupom,

iglicom pritisnite glavu ličinke, a pincetom uhvatite stražnji dio ličinke. Povucite kako biste

odvojili glaveni dio ličinke, a ostatak tijela bacite. Žlijezde slinovnice pričvršćene su uz

ždrijelo, a prepoznaju se po svjetlucavom, staklastom izgledu i velikim stanicama. Na

izolirane žlijezde kapnite kap boje i pričekajte nekoliko minuta da se stanice dovoljno oboje.

Isperite boju razrijeđenom bojom, pokrijte pokrovnicom i gnječite ("squash" tehnika)

kuckanjem po stakalcu (okomito!). Pri tome ispadnu jezgre iz stanica, a kromosomi se

rašire.

Pažljivo potražite pod slabim povećanjem divovske kromosome iz stanica žlijezda slinovnica.

Nacrtajte kako ih vidite pod slabim povećanjem, a zatim pod imerzijom nacrtajte dio

kromosoma na kojem se nalazi zadebljanje.

Naziv objekta: Drosophila melanogaster - vinska mušica Sadržaj preparata: stanice žlijezde slinovnice s divovskim kromosomima Vrsta preparata: privremeni Boja preparata: obojan karminom (ili orceinom)

8.4 Pitanja:

• Koja je biološka uloga politenskih kromosoma?

50

Vježba 9. OBLICI I GRAĐA KROMOSOMA

Različite stanice jednog organizma te različiti organizmi iste vrste imaju jednak broj i

morfološki izgled kromosoma.

Morfologija kromosoma određena je položajem centromera (naziva se još i primarna

konstrikcija ili primarno suženje), koji dijeli kromosom na duži (q) i kraći (p) krak. Tako se

prema položaju centromera razlikuju metacentrični (M, kod kojih je centromer u sredini, a

oba kraka su jednake duljine), submetacentrični (centromer je malo odmaknut od sredine),

akrocentrični (centromer je smješten još više prema kraju) i telocentrični (centromer je

smješten na samom kraju pa kromosom ima samo jedan krak) kromosomi. Uz centromer,

neki kromosomi imaju i sekundarno suženje - sekundarnu konstrikciju ili nukleolarni

organizator, koji je najčešće smješten blizu kraja kromosoma. U tom slučaju preostali dio

kromosoma čini strukturu sličnu satelitu, a takvi kromosomi se nazivaju satelitski

kromosomi (slika 9.1).

Broj i oblik kromosoma čovjeka je dugi niz godina bio predmet znanstvenih istraživanja, sve

dok 1956. godine Tjio i Levan nisu ustanovili da somatske stanice čovjeka imaju 46

kromosoma, i to 22 para autosoma i jedan par spolnih kromosoma (XX ili XY). Prvu

opće prihvaćenu klasifikaciju ljudskih kromosoma predložila je skupina citogenetičara u

Denveru 1960. godine, a osnovni kriterij je bila veličina kromosoma i položaj centromera.

Kromosomi čovjeka su svrstani prema veličini (brojevi od 1 za najveći do 22 za najmanji

kromosom) i istovremeno u skupine (od A do G) prema položaju centromera kao što

prikazuje tablica 9.1. Za spolne kromosome zadržala se klasična oznaka X i Y.

Analiza kromosoma značajna je za utvrđivanje pojedinih vrsta i proučavanje njihovih

srodstvenih odnosa, a u slučaju čovjeka za utvrđivanje određenih bolesti. Informacije o

genetičkom materijalu mogu se dobiti citogenetičkom analizom kromosoma, spolnog

kromatina te raznim metodama molekularne genetike.

Tablica 9.1 Klasifikacija ljudskih kromosoma prema veličini i položaju centromera.

Slika 9.1. Oblici kromosoma prema položaju centromera.

a) metacentričan b) submetacentričan c) akrocentričan d) telocentričan e) satelitski

51

Skupina redni broj kromosoma

položaj centromera satelit

A 1 - 3 M - B 4, 5 SM -

C 6 - 12 X SM -

D 13 - 15 A + E 16 - 18 SM - F 19, 20 M -

G 21, 22 Y A

+ -

Svako odstupanje od za vrstu karakterističnog broja ili morfološkog izgleda kromosoma je

kromosomski poremećaj (aberacija). Poremećaji imaju štetne posljedice na

funkcionalnost stanice te na rast i razvoj čitavog organizma.

Razlikujemo prirođene i stečene poremećaje. Prirođeni poremećaji prisutni su već u zigoti,

ili nastaju tijekom prvih dioba zigote i nalaze se u svim, ili u gotovo svim stanicama

organizma. Uzrokuju niz malformacijskih sindroma (poput Downovog ili Turnerovog

sindroma). Stečeni poremećaji nastaju lokalno tijekom života (na primjer u stanicama

tumora).

Po tipu, poremećaji mogu biti numerički, što je svako odstupanje od normalnog diploidnog

(2n) broja kromosoma poput poliploidije (3n, 4n…) ili aneuploidije (2n+1, 2n+2, 2n-1…) te

strukturni, koji su posljedica kromosomskih lomova i grešaka pri spajanju odlomljenih

fragmenata (delecije, inverzije, duplikacije, translokacije…).

Klasična citogenetika ispituje morfologiju prometafaznih i metafaznih kromosoma, dakle,

kromosoma u stanicama koje se dijele. Analiziraju se stanice različitog podrijetla, no za

rutinsku analizu kariotipa koriste se lako dostupni limfociti iz periferne krvi. Razlikuju se dvije

metode obrade stanica; stanice se mogu analizirati direktno, bez prethodne kulture stanica,

ili indirektno, kada se koristi kratkotrajna stanična kultura radi povećanja broja stanica u diobi

ili indukcije stanične diobe. U daljnjoj obradi stanice se tretiraju otopinom nekog citostatika

poput kolhicina. Kolhicin priječi stvaranje diobenog vretena što omogućuje nakupljanje

stanica u metafazi. Osim toga, kromosomi se ne nakupljaju u ekvatorijalnoj ravnini, već

ostaju raštrkani po stanici, što olakšava analizu morfologije, određivanje broja kromosoma i

identifikaciju homolognih parova.

Stanice limfocita tretirane kolhicinom prebacuju se u hipoosmotsku otopinu, nakapaju na

predmetno staklo, fiksiraju i ovisno o potrebama ispitivanja, boje nekom od metoda za

identifikaciju kromosoma ili kromosomskih segmenata (bojanje Giemsa bojom, Q, R i G

metode pruganja i slično). Preparati se analiziraju svjetlosnim mikroskopom, pronalaze se

metafaze određenih kvaliteta (tzv. kariotipovi) i fotografiraju. Kariotip je, dakle, skup svih

kromosoma u jednoj stanici. Iz kariotipa se, potom, izrezuju pojedinačni kromosomi i slažu u

kariogram (slika 9.2). Kariogram je poredak homolognih kromosoma po veličini. Postoji i

52

shematsko prikazivanje kromosoma da bi se jasnije uočile karakteristike i razlike između

kromosoma, a koje se naziva idiogram.

(a)

(b)

(c)

Slika 9.2 Kariotip, kariogram i idiogram. (a) Ljudski kariogram. Kromosomi su poredani prema Denverskoj konvenciji u sedam grupa, ovisno o veličini i centromernom indeksu. U umetku su metafazni kromosomi iz limfocita. (b) Kariotip i idiogram mitoze u peludnim zrncima Pars quadrifoliae, n=10. (c) Kariotip i idiogram Vahlodea atropurpureae, n=7. Strelice u (b) i (c) označavaju područja nukleolarnog organizatora.

9.1 Zadaci:

1. Promatrajte razmaz leukocita iz kulture tretirane kolhicinom. Nacrtajte kromosome iz

jedne stanice.

Naziv objekta: Homo sapiens - čovjek Sadržaj preparata: razmaz leukocita iz kulture tretirane kolhicinom Vrsta preparata: polutrajni Boja preparata: ljubičasto obojenje (Feulgen)

2. Iz fotografije kariotipa čovjeka nacrtajte kariogram na paus papiru. Pronađite homologne

kromosome i poredajte ih prema Denverskoj konvenciji u skupine. Kromosomi su obojani G-

metodom pruganja. Usporedite pruge kromosoma na fotografiji s prugama sa slike 9.3.

53

Slika 9.3 Raspored pruga na ljudskim kromosomima nakon G-metode pruganja prema Pariškoj konferenciji iz 1971. godine.

54

LITERATURA:

1. Alberts, B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson, J.D. Molecular biology of the

cell, treće izdanje, Garland publishing, New York & London, 2002.

2. Cooper, G.M., Hausman, R.E. Stanica: molekularni pristup, treće izdanje, Medicinska

naklada, Zagreb, 2004.

3. Campbell, N.A. Biology, treće izdanje, The Benjamin/Cummings Publishing Comp.,

Redwood City, 1993.

4. http://sun.menloschool.org/~cweaver/cells/c/cell_membrane/

5. www.biology.iupui.edu