Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
SKRÍNING LIEKOV
4.10.2017, BRATISLAVA
JANA STACHOVÁ
2
o Liečivá, príčina otráv a ich prejavy o Intoxikácie liečivami o Laboratórna diagnostika otráv o Skríning liekov
― imunochemické metódy (kvalitatívne, semikvantitatívne, kvantitatívne)
― izolácia liečiv a ich metabolitov frakčnou extrakciou (kyslá, alkalická, hydrolýza)
― základný skríning na neznáme lieky
― skríning na benzodiazepíny
― vyhodnocovanie - chromatografické metódy (TLC, GC-MS, HPLC)
OBSAH
3
Liečivá sú prostriedky, ktoré sa využívajú: o na ochranu zdravia
o liečenie a diagnostiku chorobných stavov
o na kontrolu fyziologických a patofyziologických procesov
LIEČIVÁ
4
Lieky sú najčastejšou príčinou otráv. Otravy liečivami tvoria až 45 % všetkých otráv.
o z hľadiska okolností intoxikácií liečivami býva príčinou nešťastná náhoda (58%), samovražda (27%), abúzus liečiv (3%) a profesionálna otrava (3%)
PRÍČINA OTRÁV
5
Charakter prejavov: 1. mierny – GIT dyskomfort, nauzea, mierne bolesti v rôznych lokalitách – brucho, hlava
2. stredne závažný – silné bolesti v oblasti GIT, hlavy, slabosť, búšenie srdca, kolapsový
stav, poruchy videnia, sluchu 3. závažný a život ohrozujúci – bezvedomie, areflexia, poruchy srdcového rytmu, krvácanie
a poškodenie krvotvorby, zlyhávanie hemodynamiky, obličiek, pečene, infekcia a iné.
PREJAVY OTRÁV
6
INTOXIKÁCIE LIEČIVAMI
V súčasnosti sa paleta liečiv spôsobujúcich intoxikácie oproti minulosti zmenila. Najčastejšie sa vyskytujú intoxikácie analgetikami (paracetamol), benzodiazepínmi (hypnotiká, anxiolytiká), antipsychotikami, antidepresívami, antiepileptikami, antihistaminikami.
7
LABORATÓRNA DIAGNOSTIKA OTRÁV
Cieľom laboratórneho toxikologického vyšetrenia je:
o potvrdiť alebo vylúčiť diagnózu otravy o zachytiť a identifikovať čo najširšie spektrum liekov
Je potrebné: o uvádzať dostupné anamnestické údaje, popis klinických príznakov, uvádzať dobu odberu
vzorky, liekovú terapiu pacienta, označiť predpokladanú škodlivinu o biologický materiál: moč, žalúdočný obsah, krv (napomáha posúdiť závažnosť otravy)
“zlatý štandard“ v klinickej toxikológii:
o imunochemické metódy (kvalitatívne, kvantitatívne) o chromatografické metódy (TLC, HPLC a GC/MS)
8
TOXIKOLOGICKÁ ŽIADANKA
9
Každá toxikologická analýza je samostatná vedecká práca.
SKRÍNING LIEKOV
10
SKRÍNING LIEKOV
Analýza sa začína jednoduchým skríningovým imunochemickým testom (na základe cut-off hodnoty, ktorú uvádza výrobca, sa hodnotia výsledky testu ako pozitívne alebo negatívne).
11
Imunochemické testy - rýchle orientačné záchytové testy, ktoré dávajú vstupnú informáciu v
urgentných stavoch pri podozrení na otravu liekmi.
Kvalitatívne testy:
o barbituráty
o tricyklické antidepresíva
o benzodiazepíny (moč, krv)
o tramal
Kvantitatívne testy – analyzátory
o CMIA (chemiluminiscenčná imunoanalýza na mikročasticiach)
o komerčné kity, ktoré sú štandardizované a validované výrobcom.
IMUNOCHEMICKÉ METÓDY KVALITATÍVNE
12
IMUNOCHEMICKÉ METÓDY KVANTITATÍVNE
U nás kvantitatívne stanovujeme v krvi hladiny:
o digoxínu
o kyseliny valproovej
o teofylínu
o fenobarbitalu
o fenytoínu
o karbamazepínu
Výhoda: rýchla dostupnosť výsledkov a vysoká citlivosť.
Architect i1000SR
13
IMUNOCHEMICKÉ METÓDY SEMIKVANTITATÍVNE
Stanovenie benzodiazepínov v sére semikvantitatívne:
o homogénna enzýmová imunoanalýza s využitím tekutých reagenčných roztokov
o analýza využíva špecifické protilátky so schopnosťou odhalenia väčšiny benzodiazepínov a ich metabolitov v sére
AU 5812
14
IZOLÁCIA LIEČIV A ICH METABOLITOV FRAKČNOU EXTRAKCIOU o zložitá a časovo náročná úprava vzorky
o dominantný dopad na konečné výsledky:
―zvolený postup extrakcie
―odstránenie balastných látok
―čistota výsledného extraktu
o Základný skríning na neznáme lieky pozostáva z kyslej a alkalickej extrakcie:
– 1. okyslenie moča alebo žalúdočného obsahu
– 2. extrakcia dietyléterom
– 3. spojenie oboch extraktov a odparenie do sucha
o kyslý éterový extrakt ExK - I. extrakčná frakcia:
―liečivá kyslého charakteru
―prvý podiel neutrálnych liečiv
15
IZOLÁCIA LIEČIV A ICH METABOLITOV FRAKČNOU EXTRAKCIOU
– 4. alkalizácia zvyšného močového (žalúdočného) extraktu
– 5. extrakcia dietyléterom
– 6. spojenie oboch extraktov a okyslenie
– 7. odparenie do sucha - alkalický extrakt ExA – II. extrakčná frakcia:
- zásadité liečivá - ďalší podiel neutrálnych liečiv
– 8. rozpustenie odparkov v etylacetáte
16
CHROMATOGRAFIA NA TENKEJ VRSTVE TLC
Separácia prítomných látok
o chromatografia na tenkej vrstve (TLC)
o plynová chromatografia s hmotnostným spektrometrom (GC-MS)
o TLC - najrozšírenejšia metóda pre svoju citlivosť, flexibilitu a stanovenie nízkych
koncentrácií látok
o stacionárna fáza – tenká vrstva silikagélu
o mobilná fáza - zmesi rozpúšťadiel o rôznych polaritách, často s prídavkom kyseliny alebo
amoniaku, aby sa potlačila ionizácia analytov, ktoré majú povahu slabých kyselín alebo
zásad.
17
o nanesenie biologického materiálu spolu so štandardnou zmesou látok na silikágel o štandardom pre kyslé látky je fenobarbital, pre alkalické a neutrálne látky AKFAD o deliaci proces prebieha v uzavretej chromatografickej komore (kyvete) v zmesi
rozpúšťadiel (etylester kyseliny octovej – etanol - amoniak) o vyhodnotenie fluorescencie v UV svetle (254 nm aj 356 nm)
CHROMATOGRAFIA NA TENKEJ VRSTVE TLC
18
ZÁKLADNÝ SKRÍNING NA LIEKY
o identifikácia liečiv - postrekom s detekčnými činidlami, zaradenie škvŕn do 5.tried:
― I. Marquisovo činidlo
― II. p – DMAB
― III. síran ceričitý
― IV. chlorid zlatitý
―V. Dragendorffovo činidlo / 50% kyselina sírová (zvýraznenie škvŕn)
o výsledkom je chromatogram, na ktorom sa hodnotí poloha látky voči štandardnej zmesi ako aj jej reaktívnosť (vznik farebnej škvrny v mieste rozdelenej látky).
19
SKRÍNING NA BENZODIAZEPÍNY
Hydrolýza H - tretia frakčná izolačná technika, ktorej cieľom je získať liečivá alebo metabolity vylučované vo forme konjugátov (benzodiazepínové deriváty) Pracovný postup: 1. zmes moča, vody a konc. HCl – var 2. po ochladení neutralizácia NaOH 3. extrakcia dietyléterom 4. spojenie extraktov a odparovanie do sucha – frakcia H
20
SKRÍNING NA BENZODIAZEPÍNY
5. rozpustenie odparku v etylacetáte ―na silufol nanesieme extrakt hydrolýzy a štandard DONL
(diazepam, oxazepam, nitrazepam lexaurin)
―vyvíjanie v chromatografickej komore (benzén-etylacetát)
―detekcia chromatogramu detekčným činidlom Breton-Marshall I, II
―vyhodnotenie chromatogramu vizuálne
―potvrdenie prítomnosti liečiva GC/MS
21
GC-MS
o GC-MS - nepostrádateľná technika v toxikológii
– veľká separačná účinnosť a citlivosť
– dobrá výpovedná schopnosť o štruktúre analyzovaných látok
– mobilnou fázou je nosný inertný plyn (hélium)
– stacionárna fáza – kolóna – delenie látok o Základný proces v MS – 5 etáp:
– prívod vzorky a jej splynenie
– ionizácia molekúl
– separácia vzniknutých iónov podľa hmotnostnej škály
– detekcia vzniknutých iónov
– registrácia vzniknutých spektier počítačom
22
GC-MS: ALKALICKÝ EXTRAKT
o Výsledkom separácie je chromatografický záznam. Na dôkaz neznámych látok používame hmotnostný detektor (MS). Na základe výšky píku vieme určiť množstvo lieku.
23
GC-MS: KYSLÝ EXTRAKT
o Automatické vyhľadávanie kandidátov toxickej látky zo širokej škály databázy liekov
24
GC-MS: HYDROLÝZA
o Data Analysis – Spectrum – Library Search Report
25
GC-MS: POROVNANIE S KNIŽNICOU
o Vlastné hmotnostné spektrum predstavuje čiarový graf, v ktorom výška každej čiary predstavuje početnosť príslušnej efektívnej hmoty.
26
GC-MS: POROVNANIE S KNIŽNICOU
o knižnice spektier: pomocou programového vybavenia počítača vieme porovnávať spektra štandardov v knižniciach s nameranými spektrami analyzovaných látok
27
PLYNOVÝ CHROMATOGRAF S DETEKTOROM HMOTNOSTNÉHO SPEKTRA o GC Agilent 6890N, MS Agilent 5793N, Injector 7683
28
VYHODNOTENIE GC-MS
Semikvantitatívne vyhodnotenie MS
0 – 100 000 stopy
100 000 – 500 000 +
500 000 – 1 000 000 ++
1 000 000 – 5 000 000 +++
5 000 000 – 10 000 000 ++++
> 10 000 000 masa
29
TABUĽKA NAJČASTEJŠÍCH INTOXIKÁCIÍ LIEKMI
Skupina liečiv Liečivo
Analgetiká Tramal, Metamizol
Antipyretiká Paracetamol, Salicylany
Antireumatiká Ibuprofén
Benzodiazepíny Diazepam, Oxazepam, Nitrazepam, Lexaurin,
Rivotril
Antidepresíva Citalopram, Venlafaxin, Quetiapin, Mirtazapin,
Sertralin, Trittico
Antihypertenzíva Bisoprolol
Tricyklické antidepresíva Dosulepin, Imipramin, Noveril, Doxepin,
Amitriptylín
30
o Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC, predtým označovaná ako vysokotlaková kvapalinová chromatografia) je chromatografická technika používaná na oddelenie, identifikáciu a kvantifikáciu každej zložky v zmesi.
o Stanovenie v sére: lamictal, tiopental
HPLC
31
„Veľakrát je najlepším liekom žiadny liek.“
Hippokratés
ZÁVER
32
ĎAKUJEM ZA POZORNOSŤ