1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LẦM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LƢU ANH TÚ

SÁN LÁ PHỔI PARAGONIMUS HETEROTREMUS VÀ

PARAGONIMUS WESTERMANI Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI,

PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH

Chuyên ngành: Ký sinh trùng học

Mã số: 62.42.01.05

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2018

2

Luận án được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Phạm Ngọc Doanh

2. TS. Bùi Khánh Linh

Ngƣời phản biện 1:

Ngƣời phản biện 2:

Ngƣời phản biện 3:

Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Học Viện

Họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ

Vào hồi ..... giờ, ngày ..... tháng ...... năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thƣ viện Quốc gia

- Thƣ viện Học viện Khoa học và công nghệ

3

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus gây bệnh SLP có

ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người và động vật. Nguyên nhân

nhiễm bệnh do ăn phải metacercaria ở vật chủ trung gian thứ hai

(VCTG 2) hoặc sán non từ vật chủ chứa. Triệu chứng bệnh SLP dễ bị

chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh phổi khác, gây khó khăn

cho chẩn đoán và trị bệnh (Blair et al., 1999).

Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong

hơn 20 năm qua (Cao Văn Viên và cs., 1994; Nguyễn Văn Đề và cs.,

1998-2003; Doanh et al., 2005-2013). Đến nay, 7 loài SLP đã được

phát hiện (Doanh et al., 2013), trong số đó có loài P. heterotremus

phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài P. westermani phổ biến ở các

tỉnh Bắc Trung Bộ, cả 2 loài gây bệnh cho người. Nhiều vấn đề về 2

loài SLP này chưa được nghiên cứu. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề

tài nghiên cứu “Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và

chẩn đoán miễn dịch”.

2. Mục tiêu của đề tài:

Mục tiêu chung của đề tài là hiểu biết về hai loài SLP

P. heterotremus và P. westermani, cung cấp cơ sở khoa học cho việc

chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng

đồng.

Với các mục tiêu cụ thể như sau:

1. Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu

metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở

cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị.

4

2. Xác định được sự đa dạng hình hình thái metacercaria và đa dạng

di truyền phân tử của hai loài P. heterotremus và P. westermani.

3. Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài

P. heterotremus và P. westermani.

4. Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP

tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời.

3. Nội dung nghiên cứu

3.1. Xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt nhất để thu

metacercaria và điều tra tình hình nhiễm metacercaria ở cua

suối tại Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị.

3.2. Nghiên cứu đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử

của loài P. heterotremus và P. westermani.

3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài sán lá phổi.

- Xác định vật chủ trung gian 1 và vật chủ chính ngoài tự nhiên.

- Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vật chủ chứa.

- Nghiên cứu sức sống của metacercaria.

3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi

- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA.

- Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng.

- Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau.

4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1. Ý nghĩa khoa học: Đề tài cung cấp các thông tin khoa học về

hình thái metacercaria, di truyền phân tử và một số đặc điểm sinh

học của 2 loài P. heterotremus và P. westermani ở Việt Nam.

4.2. Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài cung cấp cơ sở khoa học khuyến cáo

phòng tránh nhiễm bệnh SLP và thiết lập được phản ứng dot-ELISA

5

chẩn đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa, góp phần bảo vệ sức khỏe

cộng đồng.

5. Những đóng góp mới của đề tài

5.1. Phát hiện metacercaria P. heterotremus ở miền Trung và

P. westermani ở miền Bắc. Mô tả sự đa dạng hình thái

metacercaria của 2 loài SLP này.

5.2. Phân tích đa dạng di truyền của P. heterotremus và

P. westermani. Xác định P. westermani ở Việt Nam là dạng 2n.

5.3. Xác định chính xác VCTG 1 và ấu trùng cercaria của 2 loài SLP

nghiên cứu. Ngoài ra, xác định VCTG 1 của loài P. proliferus.

5.4. Xác định vật chủ chính ngoài tự nhiên của SLP ở Da Krong là

mèo rừng (Prionailurus bengalensis).

5.5. Xác định chó nhà không bị nhiễm P. westermani. Mèo nhà bị

nhiễm P. westermani với mức độ mẫn cảm thấp hơn so với

P. heterotremus.

5.6. Xác định chuột đóng vai trò là vật chủ chứa trong vòng đời của

loài P. heterotremus và P. westermani ở Việt Nam.

5.7. Sức sống của metacercaria SLP không chỉ phụ thuộc vào dung

dịch nuôi, nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào mật độ metacercaria.

5.8. Thiết lập được kỹ thuật dot-ELISA, xác định được thời gian thực

hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau có thể áp dụng để chẩn

đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa.

6. Cấu trúc luận án

Luận án gồm 111 trang, mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 21 trang,

đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết quả

nghiên cứu và thảo luận 54 trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, đóng góp

mới và danh mục công trình công bố 2 trang, tài liệu tham khảo 13 trang.

Luận văn có 21 bảng, 56 hình ảnh và biểu đồ, 132 tài liệu tham khảo.

6

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về sán lá phổi

Đến nay, hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô

tả. Vòng đời phát triển của SLP cần 3 đến 4 vật chủ. Vật chủ chính là

thú hoang và động vật nuôi, đặc biệt là họ mèo và chó. VCTG 1 là ốc

nước ngọt. VCTG 2 là cua và một số loài tôm nước ngọt (Blair et al.,

1999). Vật chủ chứa (Paratenic host) là động vật ăn cua.

Các phương pháp chẩn đoán bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký

sinh trùng học, huyết thanh học/miễn dịch học, chẩn đoán hình ảnh

và các phương pháp phân tử.

1.2. Tình hình nghiên cứu về hai loài Paragonimus heterotremus

và Paragonimus westermani trên thế giới

1.2.1. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus

Loài P. heterotremus phân bố ở các nước Nam Á, Đông Nam Á,

phía Nam Trung Quốc, và gây bệnh cho người ở các vùng phân bố

này. VCTG 1 là ốc thuộc họ Assimineidae và Pomatiopsidae. VCTG

2 là 6 loài cua thuộc họ Potamidae. Vật chủ chính là mèo và sóc ở

Thái Lan, động vật thí nghiệm là chó, mèo, chuột và thỏ. Chuột đóng

vai trò vật chủ chứa của loài P. heterotremus (Blair et al. 1999).

1.2.2. Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani

Paragonimus westermani phân bố rộng ở châu Á, rất đa dạng về

hình thái, di truyền phân tử, sinh học. P. westermani chủ yếu có 2

dạng triploid (3n) và diploid (2n). Vòng đời cần 3-4 loài vật chủ.

VCTG 1 là ốc thuộc giống Brotia và Semisulcospirus. VCTG 2 là 8

loài tôm và 40 loài cua. Vật chủ chính là nhiều loài động vật có vú.

Sự mẫn cảm của động vật với P. westermani khác nhau rõ rệt giữa

các quần thể địa lý. Đáng chú ý, người bị nhiễm loài P. westermani

7

chỉ giới hạn ở Đông Á và Philiipines. Vật chủ chứa ngoài tự nhiên là

lợn, lợn rừng, hươu (Blair et al. 1999; Yoshida et al. 2016).

1.3. Tình hình nghiên cứu sán lá phổi ở Việt Nam

Bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu từ năm 1994, sau đó phát

hiện bệnh SLP ở 10 tỉnh phía Bắc. Đến nay, 7 loài SLP được phát

hiện ở các tỉnh miền Bắc và Trung. Trong số đó, 3 loài (P.

heterotemus, P. westermani và P. skrjabini) có khả năng gây bệnh

cho người. Loài P. skrjabini mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa

với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P. heterotremus phổ biến ở miền Bắc; loài

P. westermani phổ biến ở miền Trung (Doanh et al. 2013). Nhiều vấn

đề về 2 loài P. heterotremus và P. westermani chưa được làm sáng tỏ

(Doanh et al., 2013). Hơn nữa, các ca bệnh SLP mới vẫn được tiếp

tục phát hiện. Vì vậy, cần có những nghiên cứu chẩn đoán nhanh,

đơn giản có thể chẩn đoán ở thực địa để trị bệnh kịp thời, góp phần

bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Đề tài sẽ giải quyết những vấn đề này.

CHƢƠNG 2

ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:

SLP P. heterotremus và P. westermani.

2.1.2. Địa điểm nghiên cứu

- Xã Lương Sơn (huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai) và An Lạc

(huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái) - nơi có tỷ lệ nhiễm metacercaria của

P. heterotremus cao và 4 xã thuộc huyện Quảng Trị là: Hướng Sơn

và Tân Thành (huyện Hướng Hóa), và xã Da Krong và Tà Long

(huyện Da Krong) - là nơi có tỷ lệ nhiễm P. westermani ở vật chủ

trung gian 2 rất cao.

2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ 10/2014 đến 10/2017

8

2.2. Phƣơng pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm

Metacercaria ở VCTG2 là chỉ thị nhanh và chính xác nhất để

xác định vùng phân bố của SLP. Vì vậy, tại các điểm nghiên cứu, đề

tài xét nghiệm cua suối trước để xác định các địa điểm có tỷ lệ nhiễm

metacercaria của 2 loài P. heterotremus và P. westermani cao nhất

để tiếp tục điều tra xác định vật chủ chính, VCTG 1 ngoài tự nhiên.

Kết hợp cả phương pháp định loại hình thái và phân tử để định danh

cả loài SLP cũng như vật chủ chính và VCTG 1 của SLP. Đồng thời

thu metacercaria để sử dụng cho các nội dung nghiên cứu khác về

hình thái, di truyền và sinh học.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Xét nghiệm cua thu metacercaria của SLP

Xác định thời gian lắng cặn của phương pháp giã lọc cua:

Lấy một cá thể cua suối bắt ở vùng không nhiễm SLP. Loại bỏ mai

cua, dùng chày giã nhuyễn trong cối giã cua.

Đếm 50 metacercaria của loài P. westermani nhỏ vào cối cua

đã giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước, khuấy đều và lọc qua lưới lọc

kích thước 1 x 1 mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml. Để lắng trong

thời gian thử nghiệm, sau đó gạn ½ phần dung dịch phía trên sang

một cốc khác. Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn. Tiến hành

gạn-lọc đến khi phần cặn trong có thể xem dưới kính hiển vi soi nổi.

Thử nghiệm thời gian lắng cặn giữa các lần lọc là: 3 phút, 2 phút và

1 phút bằng cách dùng đồng hồ bấm giờ. Thí nghiệm với mỗi thời

gian lắng cặn lặp lại 3 lần. Đem phần cặn cuối cùng kiểm tra dưới

kính hiển vi soi nổi tìm metacercaria SLP.

9

Thời gian lắng cặn thích hợp nhất là thời gian ngắn nhất vẫn

thu lại đủ 50 metacercariae ở phần cặn của lần lọc cuối cùng. Làm

tương tự như vậy với metacercaria của loài P. heterotremus.

- So sánh 2 phương pháp giã-lọc cua và ép cua giữa 2 tấm kính về

thời gian xét nghiệm và số lượng metacercaria thu được.

2.3.2. Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi

Bắt cua ở các khe suối, mỗi địa điểm xét nghiệm ít nhất 50

con cua suối. Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua

ở Việt Nam theo Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải, 2012.

Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt nhất đã được xác định,

từ đó xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm.

2.3.3. Nghiên cứu hình thái metacercaria: dựa vào hình dạng, kích

thước và độ dày vỏ. Định loại theo Doanh et al., 2013.

2.3.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử SLP

Chọn gen nghiên cứu: đối với loài P. heterotremus chọn

đoạn chèn ITS2 và gen ty thể CO1, đối với loài P. westermani chọn

đoạn chèn ITS2 và gen 16S, vì gen này có thể phân biệt dạng 2n hay

3n của loài P. westermani.

Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR để nhân

bản trình tự đích với cặp mồi lựa chọn, tinh khiết sản phẩm PCR, đọc

trình tự trực tiếp. So sánh trình tự thu được và vẽ cây phát sinh chủng

loại bằng phần mềm MEGA6.

2.3.5. Gây nhiễm cho vật chủ chứa và vật chủ chính:

Gây nhiễm 2 loài SLP cho 10 cá thể chuột nhắt trắng với số

lượng 50 metacercaria/chuột. Sau 1-2 tháng, mổ khám chuột thí

nghiệm thu sán non, gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà.

10

Gây nhiễm loài P. westermani cho 4 chó và 8 mèo nhà với số

lượng 30-50 metacercaria/vật chủ. Theo dõi động vật thí nghiệm,

định kỳ xét nghiệm phân để tìm trứng sán bằng phương pháp gạn lọc,

xác định thời gian phát triển của sán ở động vật.

2.3.6. Nghiên cứu hình thái SLP trưởng thành: Làm tiêu bản cố

định bằng cách nhuộm carmine alumine. Đo vẽ kích thước sán và các

cơ quan (giác bụng, giác miệng, tinh hoàn, buồng trứng).

2.3.7. Xác định vật chủ tự nhiên của loài SLP

- Xác định VCTG 1: Thu các loài ốc ở nơi cua nhiễm

metaceracria cao, định tên loài ốc theo Đặng Ngọc Thanh và cs,

2006. Sheding và ép ốc giữa 2 tấm kính để thu cercaria của SLP,

định loài cercaria bằng phân tích trình tự ITS2. Vật chủ ốc bị nhiễm

ấu trùng SLP được thẩm định lại bằng phân tích trình tự gen CO1.

- Xác định vật chủ chính: Xét nghiệm phân chó nhà và phân động

vật hoang tìm trứng SLP. Mẫu trứng sẽ được định loài bằng phân

tích trình tự ITS2. Những mẫu phân vật chủ có trứng SLP được định

loài vật chủ qua phân tích trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thể.

2.3.8. Nghiên cứu sức sống của metacercaria:

- Metacercaria của mỗi loài được nuôi trong nước sinh lý, ở các

điều kiện nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ phòng và 4oC ở các mật độ 5,

50, 100, 200 metacercaria/ 2ml. Định kỳ quan sát dưới kính hiển vi

soi nổi để xác định sự thoát nang và sự sống của metacercaria.

2.3.9. Thiết lập phản ứng dot-ELISA

- Kháng nguyên chất tiết của P. heterotremus và P. westermani.

- 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm SLP, 30 mẫu bệnh nhân

nhiễm sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, lao phổi và huyết thanh người

bình thường được sử dụng để kiểm tra mức độ phản ứng chéo.

11

- Kỹ thuật dot-ELISA theo Ito and Sato 1990. Thử phản ứng ở

các nồng độ kháng nguyên, nhiệt độ, thời gian khác nhau để đưa ra

điều kiện tối ưu nhất.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu: bằng phần mềm Excell, SPSS.

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác định phƣơng pháp xét nghiệm cua để thu

metacercaria và tình hình nhiễm metacercaria ở cua suối

3.1.1 Phương pháp xét nghiệm cua tìm ấu trùng SLP

3.1.1.1. Xác định thời gian lắng cặn củ p ư n p áp -lọc cua.

Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian metacercaria lắng hết

xuống đáy của loài P. westermani là sau 2 phút, loài P. heterotremus

là 3 phút. Metacercaria của loài P. heterotremus nhỏ nhất so với các

loài SLP khác (Doanh et al., 2015), vì vậy với phương pháp giã-lọc

cua thời gian lắng giữa các lần lọc 3 phút là thích hợp.

3.1.1.2. o án p ư n p áp n ệm cua

Thời gian xét nghiệm một cá thể cua bằng phương pháp ép giữa

hai tấm kính hết 76-85 phút (TB 80,3 phút , nhanh hơn so với

phương pháp giã-lọc cua mất 33-38 phút (TB 35,3 phút (P<0,005).

Từ 10 cá thể cua thu ở Yên Bái, phương pháp giã-lọc cua thu

được 902 metacercaria, nhiều hơn so với phương pháp ép cua thu

được 252 metacercaria (P<0,001).

3.1.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria SLP ở cua suối

Tại các điểm nghiên cứu đã thu được 3 loài cua suối: loài

Indochinamon tannanti ở tỉnh Yên Bái và Lào Cai, và 02 loài

Vietopotamon aluoiense và Donopotamon haii ở tỉnh Quảng Trị.

12

Cả 3 loài cua suối đều bị nhiễm ấu trùng SLP. Tỷ lệ và cường độ

nhiễm được trình bày ở bảng 3.4.

Bảng 3.4 . Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối Địa điểm nghiên cứu Loài

cua

Số xét

nghiệm

(con)

Số con

nhiễm

(%)

Cƣờng độ

nhiễm (nang

sán/cua) Tỉnh Huyện Xã

Lào Cai

Bảo Yên

Lương Sơn

I. tannanti 70 58 (82,8) 4-504 (63,8)

Yên

Bái

Lục

Yên

An Lạc I. tannanti 130 91 (70,0) 1-362 (19,7)

Quảng

Trị

Da

Krong

Da

Krong

V. aluoiense 50 39 (78,0) 1-78 (10,1)

Tà Long V. aluoiense 50 48 (96,0) 12-608 (80,0)

Hướng

Hóa

Hướng

Sơn

V. aluoiense 50 50 (100,0) 8-500 (140,8)

Tân Thanh

V. aluoiense

50

5 (10,0) 1-6 (3,4)

D. haii 50 6 (12,0) 1-3 (2,2)

Ở Quảng Trị tìm thấy metacercaria của 4 loài SLP

(P. westermani, P. bangkokensis, P. proliferus và P. heterotremus),

trong đó tỷ lệ nhiễm P. westermani cao nhất. Tại 2 xã (An Lạc và

Lương Sơn ở 2 tỉnh miền Bắc phát hiện metacercaria của 4 loài SLP

P. heterotremus, P. vietnamensis, P. westermani và P. bangkokensis,

trong đó tỷ lệ nhiễm P. heterotremus cao nhất (bảng 3.5).

Bảng 3.5. Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối Địa

điểm

Loài cua Tỷ lệ (%) và cƣờng độ nhiễm (metacercaria/cua) của các loài

P.

vietnamensis

P.

heterotremus

P.

bangkokensis

P.

westermani

P.

proliferus

Lương

Sơn

I. tannanti 8,6

(1-4)

82,8

(4-504)

An Lạc I. tannanti 6,0

(1-2)

69,2

(1-360)

1,5

(2-2)

13,8

(1-33)

Da

Krong

V.

aluoiense

4,0

(1-2)

6,0

(1-2)

78,0

(1-78)

Tà

Long

V.

aluoiense

8,0

(1-4)

96,0

(12-608)

Hướng

Sơn

V.

aluoiense

4,0

(1-3)

100,0

7-500

4,0

(1)

Tân

Thanh

V.

aluoiense

2,0

(1)

10,0

(1-5)

D. haii 12,0

(1-3)

Ghi chú: số trong ngoặc đ n là d o độn cườn độ nhiễm

13

3.2. Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử

3.2.1. Loài Paragonimus westermani

Metacercaria P. westermani thu từ Yên Bái tương đối đồng đều

về hình thái. Metacercaria từ tỉnh Quảng Trị khác nhau về hình dạng

và kích thước (P<0,001), được chia thành 5 dạng (hình 3.5 a-e).

Hình 3.5. P. westermani metacercaria thu từ cua suối tại Quảng Trị.

Trình tự ITS2 của P. westermani ở Việt Nam khác nhau 1-2

(0,2-0,4%) vị trí nucleotid, làm thành 1 nhóm (hình 3.6). Trình tự

16S của các mẫu thu tại Quảng Trị và Yên Bái khác nhau 1,1-1,4%,

làm thành 2 nhóm trong cùng 1 nhánh (hình 3.7). Các trình tự

P. westermani của Việt Nam đều thuộc dạng 2n.

3.2.2. Loài Paragonimus heterotremus

Metacercaria của P. heterotremus thu ở Yên Bái và Lào Cai có sự

đa dạng về kích thước (hình 3.8). Ở Quảng Trị mới thu được 2

metacercaria có hình oval, kích thước 226-252 x 218-236 µm.

Hình 3.8. Metacercaria P. heterotremus

thu từ Yên Bái và Lào Cai

Phân tích phân tử cho thấy 2 mẫu P. heterotremus từ Quảng Trị

hoàn toàn tương đồng (100%) nhau về trình tự ITS2 và CO1 và

tương đồng cao với các mẫu thu từ miền Bắc (hình 3.10; 3.11).

14

Hình 3.6. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần

thể P. westermani dựa trên trình tự ITS2 được xây

dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood.

Hình 3.7. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các quần

thể P. westermani dựa trên trình tự gen 16S được xây

dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood.

15

Hình 3.10. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các

quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự ITS2.

Hình 3.11. Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các

quần thể P. heterotremus dựa trên trình tự CO1.

16

3.3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani

3.3.1. Vật chủ trung gian thứ nhất

Cercaria thuộc nhóm microcercaria đặc trưng của giống SLP

tìm thấy ở các loài ốc nhỏ (4 mm) thuộc phân họ Triculinae ở Lào

Cai, Yên Bái và ở Hướng Sơn (Quảng Trị), và loài ốc có kích thước

lớn (4 cm) thuộc giống Sulcospira ở Quảng Trị.

Phân tích trình tự CO1 xác định mẫu ốc lớn ở Quảng Trị xác

định là loài Sulcospira quangtriensis. Trình tự CO1 của các mẫu ốc

nhỏ có độ tương đồng cao nhất (90-91%) với loài Gammatricula

fujiansis (AF213342). Mẫu ốc nhỏ ở Yên Bái và Lào Cai hoàn toàn

tương đồng với nhau, khác với trình tự mẫu ốc ở Quảng Trị 12,6%.

Khoảng cách giữa các loài thuộc giống Gammatricula dao động từ

6,4%-12,5%. Vì vậy, có thể khẳng định mẫu ốc nhỏ ở Quảng Trị

khác loài với mẫu ốc thu từ Yên Bái và Lào Cai. Trên cây phát sinh

chủng loại, chúng làm thành các nhánh khác nhau gần với giống

Gammatricula và Tricula, nhưng với giá trị bootrap rất thấp. Vì vậy,

để xác định chính xác vị trí phân loại của các loài ốc này cần kết hợp

phân tích hinh thái và giải phẫu thực hiện bởi các nhà nhuyễn thể

học. Hiện tại chúng tôi tạm để loài ốc ở Lào Cai và Yên Bái là

Triculinae gen sp.1 và ở Quảng Trị là Triculinae gen sp.2.

Trình tự ITS2 của ấu trùng thu từ ốc Triculinae gen sp.1 tại

Lào Cai và Yên Bái hoàn toàn tương đồng (100%) với loài

P. heterotremus, từ ốc Triculinae gen sp.2 ở Hướng Sơn tương đồng

(100%) với loài P. proliferus và từ ốc S. quangtriensis tương đồng

(100%) với loài P. westermani.

17

Đặc đ ểm hình thái ấu trùng SLP trong ốc vật chủ trung gian

Cercaria của 3 loài SLP rất giống nhau về hình dạng và kích

thước (P>0,05). Redia con của 3 loài cũng có kích thước tương tự

nhau (P>0,05). Tuy nhiên, chúng có thể phân biệt với nhau bởi chiều

dài ruột và số lượng cercaria trong mỗi redia. Redia của

P. westermani có ruột dài bằng 70% cơ thể, 2 loài còn lại có ruột

ngắn bằng 20% chiều dài cơ thể (P<0,001). Loài P. heterotremus có

10-12 cercaria nhiều hơn so với loài P. proliferus chứa 4-5

cercaria/redia (hình 3.20).

Hình 3.20. Cercaria (trên) và

redia (dưới) của các loài SLP

a. P. heterotremus;

b. P. proliferus;

c. P. westermani

Tỷ lệ nhiễm ấu trùng SLP ở ốc

Ốc Triculinae gen sp.1 ở Lào Cai và Yên Bái bị nhiễm ấu

trùng SLP với tỷ lệ tương ứng là 1,0 và 0,3%.

Tại Hướng Sơn, Quảng Trị ốc Triculinae gen sp.2 có tỷ lệ rất

thấp 0,02%, ốc S. quangtriensis bắt ở suối lớn không bị nhiễm ấu

trùng SLP, ốc ở khe suối nhỏ bị nhiễm với tỷ lệ 1,0%.

18

Vật chủ trung gian thứ nhất của 3 loài sán lá phổi tóm tắt ở

hình 3.21.

Hình 3.21. Ốc vật chủ trung gian của các loài SLP

a. Triculinae gen sp.1 VCTG 1 của P. heterotremus;

b. Triculinae gen sp.2 VCTG 1 của P. proliferus;

c. Sulcospira quangtriensis VCTG 1 của P. westermani

3.3.2. Vật chủ chính ngoài tự nhiên của sán lá phổi

Xét nghiệm 30 mẫu phân chó nhà tại 2 xã Hướng Sơn và Da

Krong đều âm tính. Xét nghiệm 120 mẫu phân động vật hoang ở Khu

bảo tồn thiên nhiên Da Krong thấy trứng SLP ở 7 mẫu phân. Phân

tích trình tự ITS2 đã xác định chúng thuộc loài P. westermani (3

mẫu), P. heterotremus (2 mẫu) và P. skrjabini (2 mẫu). Các mẫu

phân dương tính với trứng SLP được phân tích trình tự D-Loop đã

xác định tất cả là của mèo rừng, Prionailurus bengalensis.

3.3.3. Sự phát triển của SLP ở vật chủ chứa và vật chủ chính

3.3.3.1. Sự phát triển của P. westermani ở VCC và vật chủ chứa

Gây nhiễm cho chuột nhắt trắng đã thu được sán non ở cơ và

gan của tất cả chuột thí nghiệm. Tỷ lệ phát triển từ 25-75%, trong đó

19

sán thu được ở cơ chiếm tỷ lệ 65,3% và ở gan là 34,7%. Sán non ở

cơ và gan chỉ hơi lớn hơn so với metacercaria khi mới thoát khỏi

nang (hình 3.28).

Gây nhiễm cho động vật nuôi cho thấy sán không phát triển ở

chó nhà. Ngược lại, tất cả m o đều bị nhiễm. Đa số sán chưa trưởng

thành, tỷ lệ sán trưởng thành thấp. Thời gian thải trứng từ 140-145

ngày sau gây nhiễm (bảng 3.14).

Bảng 3.14. Kết quả gây nhiễm P. westermani cho động vật nuôi

Động vật

thí

nghiệm

Mầm bệnh

gây nhiễm

Thải

trứng

sau N

(ngày

Mổ khám

sau N

(ngày

Số sán thu được ở Tỷ lệ

phát

triển

(%)

Phổi Xoang

màng

phổi

Chó 1 50 mc - 150 0 0 0

Chó 2 50 mc - 200 0 0 0

Chó 3 50 mc - 200 0 0 0

Chó 4 50 mc - 200 0 0 0

M o 1 50 mc - 40 17 0 34,0

M o 2 50 mc - 45 18 0 36,0

M o 3 50 mc - 90 8 0 16,0

M o 4 30 mc - 120 4 0 13,3

M o 5 50 mc - 150 2 20 44,0

M o 6 30 mc 145 170 12 (2*) 7 54,3

M o 7 47 sán non 140 180 18 (5*) 5 48,9

M o 8 30 sán non - 100 13 0 43,3

Số cá thể sán trưởng thành; mc: metacercaria; N: gây nhiễm

Nghiên cứu hình thái thấy túi nhận tinh chứa đầy tinh trùng,

khẳng định P. westermani ở Việt Nam thuộc dạng 2n, phù hợp với

kết quả phân tích phân tử. Kích thước của sán thu từ phổi và xoang

màng phổi của m o thí nghiệm dao động lớn (hình 3.28 .

20

Hình 3.28 . Sự phát triển

của SLP P. westermani ở

động vật thí nghiệm

a. Metacercaria mới thoát khỏi nang

sán; b. Sán non thu từ cơ chuột bạch

sau 30 ngày; c. Sán trưởng thành thu từ

phổi m o nhà sau 180 ngày; d. Sán

chưa trưởng thành thu từ phổi m o nhà

sau 180 ngày.

3.3.3.2. Gây nhiễm chuyển tiếp sán non P. heterotremus từ vật chủ

chứa cho vật chủ chính.

Mổ khám chuột nhắt trắng cho thấy sán ở cơ chưa phát triển gì

thêm so với metacercaria mới thoát khỏi nang, kích thước 650-940 x

300-480 µm. Sán non ở gan có kích thước (2,2-4,5 x 1,2-2,4 mm) lớn

hơn so với sán ở cơ (hình 3.31). Gây nhiễm chuyển tiếp cho 2 mèo

thí nghiệm cho thấy m o ăn sán non thu từ gan chuột không bị nhiễm

SLP, ngược lại m o ăn sán non thu từ cơ chuột bị nhiễm SLP, tỷ lệ

phát triển đến trưởng thành là 45%.

Hình 3.31. Khác nhau về kích thước sán non thu ở cơ (a và gan (b

21

3.3.4. Sức sống của metacercaria SLP

Ở nhiệt độ phòng thí nghiệm metacercaria sống được tối đa 15-

17 ngày, số lượng metacercaria thoát khỏi nang và chết nhiều nhất

vào ngày thứ 7-8, chiếm tỷ lệ 32-33,3% (hình 3.34).

Hình 3.34. Sức sống của metacercaria ở điều kiện nhiệt độ phòng

(25-30oC trong nước muối sinh lý

Ở tủ lạnh 4oC với mật độ metacercaria khác nhau (5, 50, 100

và 200 metacercaria/2 ml) cho thấy metacercaria có thể sống tới 12

tháng phụ thuộc vào mật độ metacercaria. Ở mật độ metacercaria

thấp (5 metacercaria/2 ml) thời gian sống kéo dài hơn so với các mật

độ cao hơn (P<0,005). Với mật độ 200 metacercaria/2 ml tỷ lệ

metacercaria thoát nang và chết nhiều sau 2 tháng và chỉ sống tới 7-8

tháng. Ở mật độ 50 và 100 metacercaria/2 ml thì metacercaria có thể

sống tới 10-11 tháng, tỷ lệ thoát nang và chết nhiều vào tháng thứ 6-

7 (hình 3.35 và 3.36). Không có sự khác biệt về sức sống của

metacercaria của 2 loài P. westermani và P. heterotremus (P>0,05).

22

Hình 3.35. Sức sống của P. westermani metacercaria theo thời gian

bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau

Hình 3.36. Sức sống của P. heterotremus metacercaria theo thời gian

bảo quản ở 4oC ở các mật độ khác nhau

3.4. Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP

3.4.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng

Phản ứng hoạt động rất tốt. Các ô nhỏ huyết thanh đối chứng

đều hiện màu rất rõ. Ở các bệnh nhân nhiễm SLP P. heterotremus

hiện màu đậm ở ô nhỏ kháng nguyên P. heterotremus và hơi nhạt

hơn ở ô nhỏ kháng nguyên P. westermani. Trong khi huyết thanh

23

người bình thường, bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ,

lao phổi đều âm tính, trừ 01 mẫu huyết thanh bệnh nhân sán lá gan

lớn dương tính, tuy nhiên màu nhạt hơn so với huyết thanh bệnh

nhân nhiễm SLP P. heterotremus (hình 3.38).

Hình 3.38. Kết quả phản ứng dot-ELISA với huyết thanh

Kết quả tính toán cho thấy độ nhạy của phản ứng là 100%, độ

đặc hiệu của phản ứng là 95%, giá trị tiên đoán dương tính là 96,7%

và giá trị tiên đoán âm tính là 100% (bảng 3.18).

Bảng 3.18. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA

Dot-ELISA

Huyết thanh

Số mẫu

kiểm tra

Kết quả xét nghiệm dot-ELISA

Số mẫu

dương tính

Số mẫu

âm tính

Tổng

số

Nhiễm SLP 30 30 0 30

Không nhiễm SLP 30 1 29 30

Tổng số 31 29

Độ nhạy (%) 30/(30 + 0) x 100 = 100

Độ đặc hiệu (%) 29/(29+ 1) x 100 = 96,7

Giá trị tiên đoán dương tính (% 30/ (30 + 1) = 96,7

Giá trị tiên đoán âm tính (% 29/(29 + 0) = 100

24

3.4.2. Xác định nồng độ kháng nguyên

Ở nồng độ KN 0.25 mg/ml, các mẫu đều có màu nhạt, khó phát

hiện. Ngược lại, ở nồng độ 1mg/ml và 0.5mg/ml các mẫu đều hiện

màu. Nồng độ 0.5 mg/ml có màu hơi nhạt hơn nồng độ 1 mg/ml,

nhưng có thể quan sát rõ. Như vậy, có thể sử dụng nồng độ kháng

nguyên 0.5 mg/ml, giảm ½ so với các công bố trước.

3.4.3. Thời gian phản ứng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Thời gian phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ (bảng 1.19). Thời

gian thực hiện phản ứng dot-ELISA tại thực địa có thể từ 51 phút ở

điêu kiện 37oC, tương đương với nhiệt độ mùa h , đến 3 giờ 26 phút

ở nhiệt độ 10oC hoặc 4 giờ 21 phút ở 4

oC, tương đương với nhiệt độ

mùa đông.

Như vậy, kỹ thuật dot-ELISA có thể đọc kết quả bằng mắt

thường, không cần máy đọc quang phổ, có thể thực hiện ở ngay tại

thực địa, không cần tủ ấm, thậm chí vào những ngày mùa đông lạnh

khoảng 4oC, thời gian thực hiện trong 4 giờ 21 phút, bệnh nhân có

thể chờ kết quả và được cấp thuốc điều trị trong ngày.

Bảng 3.19. Thời gian phản ứng ELISA ở các nhiệt độ khác nhau

Nhiệt

độ

Thời gian (phút) ủ với

Huyết

thanh

Conjugate Rửa Hiện

màu

Tổng thời

gian

37oC 20 20 6 5 51 (0h51’

20oC 60 60 6 5 131 (2h11’

10oC 90 90 6 10 206 (3h26’

4oC 120 120 6 15 261 (4h21’

25

KẾT LUẬN

1. Phƣơng pháp xét nghiệm cua và tình hình nhiễm metacercaria

sán lá phổi ở cua suối

- Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian để lắng giữa các lần lọc

3 phút là thích hợp để thu metacercaria của SLP. Phương pháp

giã lọc-cua dễ thu metacercaria và chính xác hơn so với phương

pháp ép cua.

- Tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ở cua suối tại xã Lương Sơn

(Lào Cai) là 82,8% và 4-504 metacercariae/cua, ở xã An Lạc

(Yên Bái) là 70,0% và 1-362 metacercariae/cua. Ở tỉnh Quảng

Trị, tỷ lệ và cường độ nhiễm ở xã Tà Long là 96,0% và 12-608

metacercaria/cua; ở xã Da Krong là 78,0% và 1-78

metacercaria/cua, ở xã Hướng Sơn là 100% và 7-500

metacercariae/cua, ở xã Tân Thanh là 10,0-12,0% và 1-6

metacercariae/cua.

- Cua suối ở Lào Cai và Yên Bái bị nhiễm 4 loài SLP, cua suối ở

Quảng Trị bị nhiễm 4 loài SLP. Trong số đó, tỷ lệ nhiễm

P. heterotremus cao nhất ở Lào Cai và Yên Bái, tỷ lệ nhiễm

P. westermani cao nhất ở Quảng Trị.

2. Đa dạng hình thái và di truyền của P. heterotremus và

P. westermani

- Metacercaria của 2 loài SLP đều đa dạng về hình thái và kích

thước, nhưng có sự tương đồng cao về di truyền phân tử.

- Phân tích phân tử và hình thái xác định P. westermani ở Việt

Nam thuộc nhóm 2n.

3. Một số đặc điểm sinh học của Paragonimus heterotremus và

Paragonimus westermani

26

- VCTG 1 của loài P. heterotremus là ốc Triculinae gen sp.1, của

loài P. westermani là ốc S. quangtriensis, và của loài

P. proliferus là Triculinae gen sp.2.

- Cercaria của 3 loài SLP giống nhau về hình thái, tuy nhiên có

thể phân biệt qua chiều dài ruột và số lượng cercaria của redia.

- Vật chủ chính tự nhiên của loài P. westermani là mèo rừng

(Prionailurus bengalensis). Mèo rừng ở Da Krong bị nhiễm 3

loài SLP P. westermani, P. heterotremus và P. skrjabini.

- Trong gây nhiễm thực nghiệm, chó nhà không bị nhiễm loài

P. westermani. Mèo nhà bị nhiễm loài SLP này với tỷ lệ trưởng

thành thấp và thời gian phát triển dài hơn 4 tháng.

- Chuột đóng vai trò vật chủ chứa trong vòng đời phát triển của 2

loài P. heterotremus và P. westermani. Sán non ở cơ có kích

thước tương tự như metacercaria và có thể phát triển đến trưởng

thành ở vật chủ chính, sán non ở gan có kích thước lớn hơn,

không phát triển đến trưởng thành ở vật chủ chính.

- Sức sống của metacercaria SLP phụ thuộc vào dung dịch nuôi,

nhiệt độ và mật độ metacercaria. Ở điều kiện nước muối sinh lý,

ở nhiệt độ 4oC có thể sống tới 12 tháng. Mật độ metacercaria

càng thấp thì metacercaria càng sống lâu hơn.

4. Kỹ thuật dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi

- Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA với kháng

nguyên chất tiết của SLP là 100% và 96,7%.

- Nồng độ kháng nguyên thấp nhất có thể sử dụng là 0,5mg/ml.

- Thời gian ủ với huyết thanh, kháng thể 2 và thời gian hiện màu

phụ thuộc vào nhiệt độ. Nhiệt độ càng thấp thì cần thời gian lâu

hơn. Tổng thời gian của phản ứng có thể từ 51 phút (37oC đến

4h21 phút (4oC).

0

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

1. Lƣu Anh Tú, Hoàng Văn Hiền, Bùi Khánh Linh, Phạm Ngọc

Doanh, 2017. So sánh phương pháp ép và giã-lọc cua tìm ấu

trùng sán lá phổi. Hội nghị Sinh thái và tài nguyên sinh vật lần

thứ 7, tr.2000-2004.

2. Lƣu Anh Tú, Phạm Ngọc Doanh, Hoàng Văn Hiền, Đỗ Trung

Dũng, Nguyễn Thị Hợp, 2016. Sự phát triển và khả năng gây

bệnh của loài sán lá phổi Paragonimus westermani ở động vật thí

nghiệm. Tạp chí Sinh học, 38(2):133-139.

3. Doanh PN, Hien HV, Tu LA, Nonaka N, Horii Y, Nawa Y.,

2016. Molecular identification of the trematode Paragonimus in

faecal samples from the wild cat Prionailurus bengalensis in the

Da Krong Nature Reserve, Vietnam. Journal of Helminthology

90(6):658-662.

4. Doanh PN, Tu LA, Bui TD, Loan TH, Nonaka N, Horii Y, Blair

D, Nawa Y., 2016. Molecular and morphological variation

of Paragonimus westermani in Vietnam with records of new

second intermediate crab hosts and a new locality in a northern

province. Parasitology 143(12):1639-46.