Regeneración in vitro de tres variedades de Crisantemo

(Dendranthema grandiflora) vía organogénesis y

embriogénesis somática

HodsonHodson, E., , E., CancinoCancino, G. , G. ForeroForero a.a.Unidad de BiotecnologUnidad de Biotecnologíía Vegetal a Vegetal

IINTRODUCCINTRODUCCIÓÓNN

Colombia es el segundo exportador mundial de

flores frescas de corte

4211 Toneladas anuales

Valor estimado

US$11.513.470

La floricultura en Colombia genera en forma directa e indirecta 163.300 empleos

Países importadores de flores Colombianas

El 98% de la producción total de flores se exporta

Crisantemo (Dendrathema grandiflora)

Esta especie presenta una alta demanda en el

exterior y es ampliamente cultivada a

nivel interno

Puccinia horiana

La producción de crisantemo se ve seriamente afectada por el ataque de hongos patogenos,

requiere de grandes cantidades de fungicidas, lo cual incrementa los costos a nivel económico y ecológico

La evaluación de sistemas de

regeneración in vitro de plantas de crisantemo vía organogénesis o

embriogénesissomática, constituye un

primer paso para la transformación genética

a b c

White albatross Escapade Yellow albatross

a b c

White albatross Escapade Yellow albatross

Objetivo: Evaluar la respuesta de regeneración in vitro, a partir de discos de hoja vía organogénesis y

embriogénesis somática de tres variedades de crisantemo (Dendrathema grandiflora) cultivadas en Colombia

a b c

White albatross Escapade Yellow albatross

MMateriales ateriales yyMMéétodostodos

Establecimiento y propagación de

segmentos nodaleslas tres variedades de

D. grandiflora

40REPETICIONES

13.324.8316TRATAMIENTOS

3REPLICAS

8.873.224.441.61

00

BAP (µM)

ANA (µM)

OORGANOGRGANOGééNESISNESIS

Medio de cultivo: Murshige & Skoog (1962)

IIndividualizacindividualizacióón, n, enraizamientoenraizamiento y y endurecimentoendurecimentode las plantas de las plantas regeneradasregeneradas

Individualización y Enraizamiento

Medio de cultivo Murashige & Skoog (1962)

Condiciones durante el Endurecimiento:

Cámara húmeda

Sustrato : turba

Organogénesis

212.26

70

-4.52

40REPETICIONES

-3.39

15TRATAMIENTOS

3REPLICAS

141.12

Tiempos de exposición(días)

2,4-D (µM)

EEmbriogmbriogéénesisnesis somsomáática tica

Medio de cultivo: Mum B (May & Trigiano, 1991; Urban et al, 1994)

IIndividualizacindividualizacióón y n y endurecimentoendurecimentode las plantas de las plantas regeneradasregeneradas

Individualización: Medio de cultivo Mum B

Condiciones durante el endurecimiento:

Cámara Húmeda

Sustrato : turba

Embriogénesis somática

RResultados y esultados y DDiscusiiscusióón n

El medio Murashige & Skoog (MS) y las condiciones de incubación establecidas son adecuados para

el establecimiento y multiplicación de los segmentos nodalesde las tres variedades en estudio

Wambagu et al., 1981; Dabin et al., 1983; Kushal, 1994;Khan et al., 1994; Haq et al., 1999

RRegeneraciegeneracióón n viaviaOOrganogrganogéénesisnesis

Variedad White Albatross

12 DDS 14 DDS (29X) 20 DDS (29X)

40 DDS

Estado individualización

Planta enraizada

FFrecuencias de regeneracirecuencias de regeneracióón de brotes n de brotes

• Se requiere de un balance de BAP y ANA para obtener una regeneración exitosa en D. grandifloraLedger et al., 1991 Arbos, 1992; Courtney-Gutterson et al., 1993; Renou et al., 1993;

Khan et al., 1994; Kushai et al., 1994; Seiichi et al., 1995; Roxas et al., 1996; Sangwan et al., 1998

• La variación de los niveles exógenos de citoquininas en plantas, puede causar incrementos en las concentraciones de auxinas endógenas y a su vez las auxinas controlan los niveles endógenos

de citoquininas activas (Coenen & Lomas et al., 1997)

EEscapadescapade

Frecuencia de regeneración de brotes: 73 %Número promedio de brotes por explante: 4.9

ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)

WWhitehite AAlbatrosslbatross

ANA 4.83 µM + BAP 13.32 µM (T16)Frecuencia de regeneración de brotes: 62.5%

Número promedio de brotes por explante: 14.45

YYellowellow AAlbatrosslbatross

ANA 4.83 µM y BAP 4.44 µM (T14)Frecuencia de regeneración de brotes: 57.3%

Número promedio de brotes por explante: 3.58

La capacidad de regeneración de brotes de crisantemo vía organogénesis es dependiente de la

variedad

Protoplastos (Sauvadet et al., 1990)Pétalos florales (Malure et al., 1991)

Embriones somáticos (May and Trigiano et al., 1991)Discos de hoja (Sherman et al., 1998)

Perdida del potencial de regeneración en algunas especies, por acumulación masiva de poliaminas

causada por el estrés generado durante el cultivo in vitro del tejido vegetal

(Aribaud, et al., 1994; Martín et al., 1997)

IIndividualizacindividualizacióón y n y EEnraizamientonraizamiento

El medio con MS sales completas, sin reguladores de crecimiento, favorece la elongación y el enraizamiento de

los brotes, en contraste con lo requerido por otras variedades

Hill 1968, Langhans 1972, Kaul et al. 1990, Tian et al. 1993, Rout et al. 1996, Sherman et al. 1998

97

100

97

92

87

90

Endurecimiento(%)

Yellow albatross

White albatross

Escapade

Variedad Enraizamiento(%)

Frecuencias de enraizamiento y endurecimiento

EEmbriogmbriogéénesisnesis somsomáática tica

Variedad Escapade Vista estereoscópica 93.5 X

Mum B + 2,4-D 2.26 µM

La composición del medio de cultivo Mum Bfavoreció la respuesta embriogénica

La interacción adecuada de citoquinina - auxina estimula estados tempranos de diferenciación celular

La citoquinina incrementa la sensibilidad del tejido al estimulo de la auxina y este incremento de sensibilidad

favorece la desdiferenciación celular

Ambos reguladores participan en la dinámica del ciclo celular, importante en el proceso de diferenciación y

posterior desarrollo de embriones somáticos (Aloni, 1995).

21

14

21

Tiempo de exposición

(días)

T9

T8

T9

T

Yellow albatross

White albatross

Escapade

Variedad

2.26

2.26

2.26

Concentración2,4-DµM

Inducción embriones: Tratamientos mas efectivos

1

1.4

2

NúmeroBr/Exp

5.3

5.7

51.14

Brotes(%)

T9

T8

T9

T

Yellow albatross

White albatross

Escapade

Variedad

8472.03

8676.4

8969.4

Plantas completas

(%)

Masas Pro-embrionicas

(%)

Formación de masas pre-embrionicasy desarrollo de brotes

• Efecto positivo del 2,4-D sobre la inducción de embriogénesis somática en las tres variedades

evaluadas (Bhattacharya et al., 1990; Fujii & Shimizu, 1990)

• La adicción exógena de auxinas (2-4D) puede producir un aumento sustancial de los niveles de

AIA endógenos(Pasternak et al. 2003)

• La maduración y germinación de los embriones,ocurren sin adición de auxinas

(Sherman et al., 1998 )

EEndurecimiento ndurecimiento De las plantas regeneradas De las plantas regeneradas

Es posible endurecer y transferir exitosamente a

suelo las plantas de la tres variedades en estudiopropagadas in vitro,

utilizando cámara húmeda y sustrato turba

Plantas obtenidas víaVariedad

97

100

97

Organogénesis Embriogénesis

100

80

90

Endurecimiento(%)

Yellow albatross

White albatross

Escapade

Frecuencias de enraizamiento y endurecimiento

• Alta capacidad morfogenética en los segmentos nodales de D.grandiflora

• El medio MS con ANA 4.83 µM y BAP 4.44-13.32 µM, permite regeneración de plantas vía

organogénesis de D.grandiflora.• Hay elongación y enraizamiento espontáneo de

brotes obtenidos vía organogénesis en medio MS sin reguladores de crecimiento

CConclusionesonclusiones regeneraciregeneracióón n D. grandifloraOrganogénesis

• El 2,4-D (2.26 µM) favorece la inducción de embriones somáticos a partir de discos foliares de

las tres variedades de D.grandiflora

• El medio de cultivo Mum B sin reguladorespermite la germinación de los embriones

somáticos y el desarrollo de brotes

CConclusionesonclusiones regeneraciregeneracióón n D. grandifloraEmbriogénesis

Entidades financiadoras