TDE_RenatoMeneguelo

7/24/2019 TDE_RenatoMeneguelo

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EFEITOS ANTIPROLIFERATIVOS E APOPTTICOS DA

FOSFOETANOLAMINA SINTTICA NO MELANOMA B16F10.

RENATO MENEGUELO

Dissertao de mestrado apresentada ao Programa de Ps

Graduao Interunidades em Bioengenharia Escola de

Engenharia de So Carlos / Faculdade de Medicina de

Ribeiro Preto / Instituto de Qumica de So Carlos da

Universidade de So Paulo como parte dos requisitos para a

obteno do ttulo de mestre em Bioengenharia.

rea de Concentrao: Bioengenharia

Orientador: Prof. Dr. Gilberto Orivaldo Chierice

So Carlos,

2007.


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AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTETRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO,PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha catalogrfica preparada pela Seo de Tratamentoda Informao do Servio de Biblioteca EESC/USP

Meneguel o, Renat oM541e Ef ei t os ant i pr ol i f er at i vos e apopt t i cos da

f osf oet anol ami na si ntt i ca no mel anoma B16F10 / Renat oMeneguel o ; or i ent ador Gi l ber t o Or i val do Chi er i ce. - So

Car l os, 2007.

Di sser t ao ( Mest r ado- Progr ama de Ps- Gr aduaoI nteruni dades em Bi oengenhar i a. r ea de Concent r ao:Bi oengenhar i a) - Escol a de Engenhar i a de So Car l os,Facul dade de Medi ci na de Ri bei r o Pret o e I nst i t ut o deQu mi ca de So Car l os da Uni versi dade de So Paul o, 2007.

1. Fr macos. 2. Fosf oet anol ami na si nt t i ca.3. Mel anoma ani mal . 4. Metst ase neopl si ca. 5. Cncer .I . T t ul o.


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AGRADECIMENTOS:

"Quando todos pensam da mesma maneira, porque nenhum pensa grande coisa."

Walter Junior

Em primeiro lugar gostaria de agradecer do fundo do corao aquele queacreditou em um sonho, por mais louco que parecesse por mais inatingvel quefosse um visionrio, SR. NELSON CIANFLONE in memr ia, de onde estivernos vendo, sei que est muito feliz por nossa conquista.......

A meus pais Reinaldo e Ana Mariaque me ensinaram que o estudo tudo.

Meu irmo Sandro, Ivonee o pequeno Oto .

A minha esposa luz da minha vida Vivianne Paternostro Santa Rosa, minhafilhinha querida Anna Clara, minha outra beb que chegou este ms parailuminar ainda mais nossas vidas Geovanna,a nosso brao direito Lurilene,haja pacincia.

Ao grande amigo, professor, mestre, que me acolheu em seu laboratrio sempedir nada em troca, acreditou em minhas maluquices, e acrescentou muitasoutras, foram quase trs anos de uma troca gratificante de experincias, ondeaprendi que devemos defender nossos pontos de vista para podermos ampliarnosso horizonte acadmico. Sei que obrigado muito pouco Prof. DR.Durvanei Augusto Maria. Agradeo a Deus o dia em que voc me deu umvoto de confiana, voc sabe que foi o nico. Muito Obrigado.

Amigo!! Agora Prof. Marcos Vinicius de Almeida, s nos sabemos como foidifcil, quantas vezes passou por nossas cabeas o pensamento em desistir,sem seu exemplo eu no teria conseguido.

Prof. Dr. Salvador Claro Neto obrigado pela pacincia em nossas longasdiscusses, cheguei at vocs sem base alguma do que falava hojeamadurecido, posso discutir de igual com muita gente.

Ao amigo Toninho, sem ele no teramos o material para estudo...

Dr. Sandra Vasconcellos Al-Asfour por toda a parte qumica que estdesenvolvendo.

Ao pessoal do Butant, um obrigado muito especial, Ricardo e Iaraeu toro

muito por vocs, tambm ao Rogrio, Danilo, Fernanda, Kamila, Norma eTiago.

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E principalmente aquele que foi os meus dois braos neste trabalho Adilson Kleber Ferreira, ns somos uma grande equipe...

Minha sempre amiga Janete Ferreira Rodrigues, obrigado pela pacincia,

voc vai para o cu com certeza.

Aquele que me mostrou um formidvel mundo novo de possibilidades, queacreditou em minha capacidade, que me escolheu, para mim foi muito maisque um orientador, me conduziu como se cuida de um filho. Prof. Dr. GilbertoOrivaldo Chierice.A mente mais brilhante que conheci em minha vida, souuma pessoa de muita sorte.

Certa vez uma senhora me procurou desesperada para saber se eupoderia ajudar seu esposo que tem cncer cerebral, onde os mdicosafirmaram que ele j estava em estado terminal e que a nica coisa a serfeito era amor de famlia, eu lhe disse: Senhora no sei se posso ajudarmuito, pois o que fazemos pesquisa. Respondeu-me ela: Dr. qualquerdvida que o senhor me colocar na cabea ser melhor do que a certezaque tenho; que daqui trs meses no terei mais meu marido. Abraou-me e chorou.Essas pessoas que mostram o valor real do trabalho que realizamos nabusca da cura para esta doena que mutila tantas famlias. No podemosparar....

No se preocupe com o futuro, cante, no se sinta culpado por no saber o quefazer da vida...As pessoas mais interessantes que conheo no sabiam aos vinte e dois o quequeriam fazer da vida, alguns dos quarentes mais interessantes que conheo

no sabem...As suas escolhas tem sempre metade de chances de dar certo, assim pratodo mundo...Desfrute de seu corpo, dedique-se a conhecer os seus paisimpossvel prever quando eles tero ido embora de vez, seja legal com seusirmos eles sero a melhor fonte com o seu passado e, possivelmente quemvai mesmo te apoiar no futuro...Entenda que Amigos vo e vem, mas, nunca abra mo dos poucos ebons...aceite certas verdades inescapveis, respeite os mais velhos, voctambm vai envelhecer....acredite....Esforce-se de verdade para diminuir as distncias geogrficas e destinos devida, por que quanto mais velho voc ficar, mais vai precisar das pessoas que

conheceu quando jovem, aceite certas verdades inescapveis, respeite os maisvelhos, voc tambm vai envelhecer.

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Lista de Abreviaes:

1 %: Porcentagem.

2 MTT: Mtodo Colorimtrico.

3 IC 50 %: Concentrao Inibitria 50%.

4 ug: micrograma.

5 ml: mililitro.

6 CDKs: Quinases Dependentes de Ciclinas.

7 G1: Fase do ciclo celular.

8 S: Fase do ciclo celular.

9 G2: Fase do ciclo celular.

10 M: Fase do ciclo celular.

11 CDKIs: Inibidores de Quinase Dependente de Ciclinas.

12 P15, P16, P21, P53,...: Protenas especfica de ativao.

13 ATP: Aenosina Trifosfato.

14 FO: Fosforilao Oxidativa.

15 DNA: cido Desoxirribonuclico.

16 GTP: Glutamina Trifosfato.

17 mvolts: milivolts.

18 Bcl2: mediador qumico.

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19 Apaf-1: Protena de ativao.

20 Bcl-xl: Protena antiapopttica.

21 Iaps: Protena de inibio de apoptose.

22 PEA: Fosfoetanolamina.

23 EA: Etanolamina.

24 AMD: Adenosina Monofosfato.

25 ADP: Adenosina Difosfato.

26 Li: Ltio.

27 SNC: Sistema Nervoso Central.

28 mM: Milimol.

29 - cm: Centmetro quadrado.

30 DMSO: Dimetil Sulfxido.

31 NCI: National Institute of Cncer.

32 mg: Miligrama.

33 nm: Nanmetro.

34 ul: Microlitro.

35 um: Micromolar.

36 ul: Microlitro.

37 mm: milmetro.

38 g: grama.

39 g/l: gramas por litro.

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40 Ht: Hematcrito.

41 EDTA: Anticoagulante.

42 PHT: Fitohemaglutinina.

43 SFB: Soro Fetal Bovino.

44 Ts: Durao da fase S.

45 Tpot: Tempo de Duplicao Potncial.

46 RPM: Rotaes por Minuto.

47 mg/ml: Miligramas por Mililitro.

48 mg/kg: Miligramas por Kilograma.

49 Hb: Hemoglobina.

50 OMS: Organizao Mundial de Sade.

51 Qt: Quimioterapia.

52 MDR: Resistncia a mltiplas drogas.

53 T/C:Tratado por Controle.

54 Gm CSF: Fator estimulador de colnias do tipo granulcito-moncito.

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Lista de Figuras:

Figura 1 Determinao da atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica

em clulas de melanoma B16F10, avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT, as

barras do histograma representam a porcentagem relativa em cada

concentrao das clulas viveis e mortas.

Figura 2 Curva de regresso linear e concentrao inibitria 50% (IC50%) da

atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma

B16F10, avaliada pelo mtodo colorimtrico MTT.

Figura 3 Avaliao da resposta linfoproliferativa de linfcitos T normais, aps

96 horas de cultura com fosfoetanolamina sinttica e com o mitgenofitohemaglutinina (PHA). A porcentagem da capacidade proliferativa foi

calculada comparando-se a resposta basal (ausncia de mitgeno) e o controle

na presena de PHA e 10% e 1% de soro fetal bovino (SFB).

Figura 4 Determinao da distribuio das populaes de clulas tumorais

dos tumores dorsais melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados

com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes fases do ciclo

celular obtidos por citometria de fluxo.

Figura 5 - Determinao da distribuio das populaes de clulas tumorais

dos tumores dorsais melanoma dos animais do grupo controle (A) e tratados

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com 1.65 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes fases do ciclo

celular obtidos por citometria de fluxo.

Figura 6 - Anlise comparativa da distribuio das populaes celulares nas

fases do ciclo celular dos tumores tratados com 6.6 mg de fosfoetanolamina (A)

e tratados com o quimioterpico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo.

Figura 7 - Anlise comparativa da distribuio das populaes celulares nas

fases do ciclo celular dos tumores tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina

(A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B), obtidos por citometria de fluxo.

Figura 8 - Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais melanoma do grupo

tratado com 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica, aps 20 dias. Observa-se

massa tumoral no pigmentada, com raras reas de irrigao (*) e formao de

cpsula fibrtica (&).

Figura 9 Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais melanoma do grupo

controle que recebeu soluo salina, aps 20 dias. Observa-se extensa massa

tumoral nodular, com grandes reas de irrigao (#), necrose (*) e ulcerao

(&).

Figura 10 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais melanoma do grupo

tratado com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica, aps 20 dias. Observa-se

pequena massa tumoral amorfa (&) ou pequenos pontos de aplicao no local

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da implantao das clulas tumorais (#), com ausncia de irrigao vascular

(* @).

Figura 11 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais melanoma do grupo

tratado com o quimioterpico Taxol 3.7 uM, aps 20 dias. Observa-se

volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa rea de irrigao,

neoangiognese (*) e metstases ganglionares satlites (# @).

Figura 12 Aspecto macroscpico das leses metastticas presentes nos

parnquimas heptico (&) e pulmonar (*) do grupo controle e dos animais com

o quimioterpico comercial Taxol 3.7 uM (#) aps 20 dias. Observa-se

acentuado grau de anemia nos animais do grupo controle em relao aos

animais tratados.

Figura 13 Avaliao da rea tumoral dorsal dos animais portadores de

melanoma B16F10 durante o tratamento com fosfoetanolamina sinttica nas

concentraes de 9.9, 6.6 e 1.65 mg, durante 20 dias de tratamento. Os

animais tratados com fosfoetanolamina sinttica apresentaram uma reduo

significativa na carga tumoral de 78%, 87% e 89%, nas respectivas doses 1.65,

6.6 e 9.9 mg.

Figura 14 Anlise do nmero de metstases internas obtidas aps a

necropsia dos grupos de animais tratados com 9.9, 6.6 e 1.65 mg de

fosfoetanolamina sinttica e grupo controle.

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Figura 15 Avaliao do crescimento da massa tumoral dorsal do melanoma

B16F10 implantado em camundongos e tratados com os quimioterpicos

combinados Taxol (Paclitaxel) nas concentraes de 3.75 e 7mg/Kg e o

Etoposideo (Vipeside) nas concentraes de 2.5 e 5 mg/Kg.

Figura 16 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais B16F10 do grupo

controle. Observam-se clulas tumorais em diviso celular (A), pigmentos

melnicos (B), vasos sanguneos neoformados, irregulares (C), clulas e debris

celulares pincticos (D) e reas de hemorragia intra-tumoral (E).

Figura 17 Aspectos histopatolgicos das leses metastticas dos

parnquimas heptico e pulmonar. Observa-se ndulo metasttico heptico

(A), vasos neoformados (B) e reas hemorrgicas (C) de leses metastticas

do pulmo.

Figura 18 Aspectos histopatolgicos dos tumores melanoma dorsais tratados

com 1.65 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica. Observa-se extensa rea de

necrose intra-tumoral (A), infiltrado inflamatrio intra-tumoral (B e C).

Figura 19 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais corados pelo mtodo

citoqumico Picrosirius, evidenciando-se raras reas com presena de fibras de

colgeno deflagradas em vermelho ao redor dos vasos sanguneos (A) e no

interior do estroma tumoral (B), do grupo controle, que receberam soluo

salina.

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Figura 20 Aspectos histopatolgicos dos tumores melanoma dorsais tratados

com 6.6 mg/ml de fosfoetanolamina sinttica. Observa-se extensa rea de

necrose intra-tumoral (A), clulas apoptticas (B) e vasos neoformados (C).


citoqumico Picrosirius, evidenciando-se moderadas reas com presena de

fibras de colgeno em vermelho das leses primrias, tratadas com 1.65 mg/ml

de fosfoetanolamina sinttica.


citoqumico Picrosirius, evidenciando-se extensas reas com presena de

fibras de colgeno em vermelho das leses primrias, tratadas com 6.6mg/ml

de fosfoetanolamina sinttica.

Figura 23 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo controle

corados pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observam-se, nas setas vasos

sanguneos neoformados irregulares e distribudos no interior da massa

tumoral.

Figura 24 Aspecto histopatolgico dos tumores dorsais do grupo de animais

tratados com fosfoetanolamina sinttica 1.65 mg/ml (A) e 6.6 mg/ml, corados

pelo mtodo histoqumico de Verloff. Observa-se nas setas pequena rede de

vasos sanguneos neoformados irregulares e distribudos no interior da massa

tumoral, os quais apresentaram pequeno dimetro.

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Figura 25 Anlise do nmero de glbulos vermelhos dos animais portadores

de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina

sinttica.

Figura 26 Anlise do hematcrito (Ht) dos animais portadores de melanoma

B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina sinttica.

Figura 27 Anlise quantitativa da hemoglobina (Hb) dos animais portadores

de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com fosfoetanolamina

sinttica.

Figura 29 Anlise quantitativa do nmero de leuccitos dos animais

portadores de melanoma B16F10, grupos controle e tratados com

fosfoetanolamina sinttica.

LISTA DE TABELAS:

Tabela 1.Anlises das fases do ciclo celular obtidas por citometria de fluxo das

clulas de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados com 6.6 e 1.65

mg/ml de fosfoetanolamina sinttica e com o quimioterpico Taxol.

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Resumo:

MENEGUELO, R.(2007).EFEITOS ANTIPROLIFERATIVOS E

APOPTTICOS DA FOSFOETANOLAMINA SINTTICA NO MELANOMA

B16F10. 106 f. Dissertao (Mestrado) Programa de Ps-graduao da

Interunidades em Bioengenharia (EESC/FMRP/IQSC), Universidade de So

Paulo, So Carlos, 2007.

A fosfoetanolamina sinttica uma molcula fosforilada artificialmente, com

sntese indita realizada pela primeira vez pelo nosso grupo, diferindo-se das

molculas atuais pelo seu nvel de absoro de aproximadamente 90%, com

diversas propriedades antiinflamatrias e apoptticas. O objetivo principal

desse estudo e avaliar os efeitos antitumorais in vitro e in vivo da

fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma B16F10 implantados em

camundongos Balb-c. Foram utilizados grupos de 60 camundongos Balb-c,

fmeas com aproximadamente 20g, tratados com gua e rao ad libidum. A

atividade citotxica do composto foi testada em linhagens tumorais pelo

mtodo colorimtrico MTT, e determinada concentrao inibitria (IC50%),

sua toxicidade foi tambm testada em linfcitos T normais, em ensaios de

proliferao celular, estimulados por mitgeno. Os animais portadores de

tumores foram tratados aps o 14 dia do implante tumoral com soluo

aquosa (i.p) de fosfoetanolamina sinttica e o grupo controle recebeu soluo

salina, e foram avaliados os seguintes parmetros: volume tumoral, rea e

nmero de metstases em rgos internos. Foi tambm realizada a

comparao da fosofetanolamina sinttica em relao aos quimioterpicos

comerciais Taxol e Etoposideo separados nas diferentes fases do ciclo celular.

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Os resultados do tratamento com a fosfoetanolamina sinttica in vitro

mostraram que o composto induz citotoxicidade seletiva para as clulas

tumorais com IC 50% de 1.69ug/ml sem afetar a capacidade proliferativa de

clulas normais. Os animais portadores de tumores dorsais de melanoma

B16F10 apresentaram significativa reduo carga tumoral, mostrando inibio

da capacidade de crescimento e a metastatizao. A avaliao hematolgica

no demonstrou alteraes relevantes aps a administrao da

fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal nos animais portadores de

melanoma. Conclui-se que a fosfoetanolamina sinttica diminuiu

significativamente o tamanho de tumores de forma seletiva, sem alteraes em

clulas normais, com vantagem em relao aos quimioterpicos comerciais,

pois a mesma no apresentou os terrveis efeitos colaterias dos mesmos.

Neste trabalho ficou evidente a capacidade inibitria da fosfoetanolamina

sinttica na inibio da progresso e disseminao das clulas tumorais.

Palavras chaves: frmaco, fosfoetanolamina sinttica, melanoma, metstases,

fosfolipideos, cncer.

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Summary:

MENEGUELO, R.(2007). EFECTS ANTIPROLIFERATION AND APOPTOTIC

OF THE SYNTHETIC PHOSPHOETHANOLAMINE IN MELANOMA B16F10.106 f. Dissertao (Mestrado) Programa de Ps-graduao da Interunidades

em Bioengenharia (EESC/FMRP/IQSC), Universidade de So Paulo, So

Carlos, 2007.

The synthetic phosphoethanolamine is a phosphorilad artificially

molecule, with unknown synthesis carried through for the first time for our

group, differing itself from current molecules for its level of absorption of

approximately 90%, with diverse anti-inflammatory and apoptotic as properties.

The main objective of this study and to evaluate the anti tumor effect in vitro

and in vivo of the synthetic phosphoethanolamine in cells of melanoma

B16F10 implanted in mice Balb-c. Groups of 60 Balb-c mice had been used,

females with approximately 20g, treated with water and ration ad libidum. The

cytotoxic activity of the composition was tested in lives tumor or normal cells for

colorimetric method MTT, and determined to the inhibitory concentration

(IC50%) its toxicid also it was tested in normal linphocytes T, in assays of

cellular proliferation, stimulated for mitogen. The bearing animals of tumors had

been dealt with after 14 day the tumor inoculation with watery solution (i.p) of

synthetic phosphoethanolamine and the group control received solution saline,

and had been evaluated the following parameters: tumor volume, area and

number of metastases in internal agencies. Also the comparison of the synthetic

phosphoethanolamine in relation to the convencionaly treatment with

quimioterapics separate Taxol and Etoposideo in the different phases of the

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cellular cycle was carried through. The results of the treatment with the

synthetic phosphoethanolamine in vitro had shows that the composition

induces selective citotoxicity for the tumor cells with IC 50% of 1.69ug/ml

without affecting the proliferative capacity of normal cells. The bearing animals

of dorsal tumors of melanoma B16F10 had presented significant reduction

tumor load, showing to inhibition of the capacity of growth and the

metastatization. The hematological evaluation did not show alterations the

administration of the synthetic phosphoethanolamine by the intraperitoneal way

in the bearing animals of melanoma. The synthetic phosphoethanolamine

significantly reduced the size of tumors of selective form, without alterations in

normal cells; with advantage in relation to the commercial quimioterapics

therefore the same one did not present the terrible collaterals effect of the same

ones. In this work it was evident the inhibitory capacity of the synthetic

phosphoethanolamine in the inhibition of the progression and dissemination of

the tumor cells.

Key words: drougs, synthetic phosphoethanolamine, melanoma, phospholipids,

cancer.

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SUMRIO:

1 INTRODUO:

1.1 Pele.............................................................................................................1

1.2 Cncer.......................................................................................................3

1.3 Etiologia......................................................................................................3

1.4 Tumorignese e Melanoma........................................................................5

1.5 Epidemiologia do Melanoma Cutneo........................................................8

1.6 Aspectos Clnicos do Melanoma...............................................................10

1.7 Citotoxicidade: morte celular apoptose e necrose.................................11

1.8 Apoptose...................................................................................................13

1.9 Aletraes Ultraestruturais Mitocondriais.................................................14

1.10 Apoptose mediado pela via mitocndrial................................................16

1.11 Fosfoetanolamina...................................................................................17

2 OBJETIVOS:

3 MATERIAIS E MTODOS:

3.1 Linhagens celulares tumorais e clulas normais......................................24

3.2 Determinao da atividade citotxica pelo mtodo colorimtrico MTT.....24

3.3 Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo........................25

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3.4 Determinao do contedo de DNA por citometria de fluxo....................25

3.5 Determinao das fases do ciclo celular por citometia de fluxo...............26

3.6 Implantao de clulas tumorais..............................................................27

3.7 Animais e delineamento experimental......................................................27

3.8 Diviso dos grupos experimentais............................................................28

3.9 Observao do crescimento tumoral........................................................28

3.10 Contagem e quantificao dos glbulos vermelhos, hemoglobina,

hematcrito, leuccitos e plaquetas...................................................................29

3.11 Anlises hematolgicas..........................................................................31

3.12 Anlises histopatolgicas........................................................................31

3.13 Preparo das amostras para anlises histoqumicas: Picrosirius red e

Van Gienson-Verlof............................................................................................32

4 RESULTADOS:

4.1 Avaliao da atividade citotxica in vitroda fosfoetanolamina sinttica

em linhagens celulares......................................................................................35

4.2 Anlise das fases do ciclo celular por citometria de fluxo.........................39

4.3 Anlise dos parmetros tumorais dos camundongos portadores de

melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica............................48

4.4 Avaliao histopatolgica dos tumores dorsais e leses metastticas dos

grupos tratados com fosfoetanolamina sinttica e controle...............................60

4.5 Avaliao dos parmetros hematolgicos dos animais portadores de

melanoma B16F10 tratados e no tratados com fosfoetanolamina sinttica....75

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5 DISCUSSO:........................................................................................82

6 CONCLUSES:....................................................................................93

7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................96.

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Introduo

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1- INTRODUO:

1.1 - Pele:

A pele constituda por dois principais componentes, a derme e a

epiderme. A derme basicamente constituda por tecido conectivo formando

por fibras de colgeno, elsticas e reticulares, ricamente irrigadas por vasos

sanguneos e linfticos, alm de conter estruturas originalmente derivadas da

epiderme, que so as glndulas sebceas e sudorparas, folculos pilosos e

pelos. A derme possui terminaes nervosas de medeiam s sensaes de

tato, calor, frio e dor, entre nervos do sistema nervoso autnomo simptico que

regulam a atividade das glndulas sudorparas e arterola1.

Em contraste, a epiderme uma fina camada (0,1 a 0,15 milmetros de

espessura) desprovida de vasos sanguneos e terminaes nervosas.

composta por duas populaes distintas de clulas, clulas epiteliais ou

queratincitos (tambm conhecidas como clulas de Malpighi, que

compreendem cerca de 95% da epiderme) e pelas clulas pigmentares ou

melancitos. A epiderme encontra-se dividida em 4 camadas ou estratos:

Estrato basal (camada basal ou estrato germinativo):

constitudo por uma camada nica de clulas colunares que

delineia a superfcie da derme. Os melancitos constituemcerca de 10% das clulas presentes nessa camada, e a

melanina freqentemente encontrada nos queratincitos

basais.

Estrato espinhoso: constitudo por varias camadas espessas de

clulas polidricas irregulares cobertas por estruturas

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semelhantes a pequenos espinhos ou projees, formando uma

espcie de ponte com as clulas adjacentes.

Estrato granuloso: consiste em inmeras camadas de clulas

irregulares e polidricas, cujo o citoplasma contem grnulos de

queratihialina (que aparentemente contribuem para a formao

da queratina); como esses grnulos crescem em tamanho e

numero, o ncleo da clula gradualmente se degenera

culminando na morte da mesma.

Estrato crneo: composto por um numero varivel de camadas

de clulas queratinizadas mortas, prximas umas das

outras2, 3,4.

Os melancitos so clulas altamente especializadas que produzem e

exportam melanina, um heteropolmero cuja estrutura precisa at hoje

desconhecida. Em mamferos, esto presentes na camada basal da epiderme,

nos folculos pilosos, na derme, na retina e ris. Na pele, os melanossomos

(organelas que contm melanina produzida nos melancitos so transferidas

para os queratincitos vizinhos por um mecanismo ainda no totalmente

esclarecido, mas que parece envolver a fagocitose da ponta dos processos

dendriticos dos melancitos pelos queratincitos)5, 6,7.

Por serem altamente diferenciados, os melancitos apresentam baixa

atividade mittica in vitro e in vivo estas clulas necessitam de uma

combinao de fatores de crescimento e agentes que elevem a atividade das

protenas quinase A e C, para manter uma taxa tima de proliferao8, 9,10.

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1.2 - Cncer:

Cncer o nome dado a uma patologia com mais de 100 subdivises

que tm em comum o crescimento desordenado (maligno) de clulas que

invadem os tecidos e rgos, podendo espalhar-se (metstase) para outras

regies do corpo. A maioria dos cnceres origina-se de uma nica clula

alterada. O cncer o resultado de uma srie de alteraes que controlam

o crescimento e o comportamento celular. Dividindo-se rapidamente, estas

clulas tendem a ser muito agressivas e incontrolveis, determinando a

formao de tumores (acmulo de clulas cancerosas) ou neoplasias

malignas. Por outro lado, um tumor benigno significa simplesmente uma

massa localizada de clulas que se multiplicam vagarosamente e se

assemelham ao seu tecido original, raramente constituindo risco de vida. As

clulas cancerosas mostram uma variedade de caractersticas e

propriedades notveis11.

As clulas malignas possuem traos morfolgicos que as distinguem,

incluindo um ncleo maior, mitocndrias pouco funcionais, alteraes ultra

estruturais do citoesqueleto, variao na diferena de potencial

transmembrana, maior produo de energia anaerbia, entre outras12.

1.3 - Etio logia:

As causas de cncer so variadas, podendo ser externas ou internas ao

organismo, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas

relacionam-se ao meio ambiente e aos hbitos ou costumes prprios de um

ambiente social e cultural. As causas internas so, na maioria das vezes,

geneticamente pr-determinadas, esto ligadas capacidade do organismo de

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27/134

se defender das agresses externas. Esses fatores causais podem interagir de

vrias formas, aumentando a probabilidade de transformaes malignas nas

clulas normais.

De todos os casos, 80% a 90% dos cnceres esto associados a fatores

ambientais. Alguns desses fatores so bem conhecidos: o cigarro, exposio

excessiva ao sol, alguns vrus. O envelhecimento traz mudanas nas clulas

que aumentam a sua suscetibilidade transformao maligna, porem o

surgimento do cncer depende da intensidade e durao da exposio das

clulas aos agentes causadores do cncer13, 14.

As alteraes so principalmente observadas dentro dos cromossomos

das clulas cancerosas, bem como das clulas transformadas em

cancerosas. As clulas normais mantm seus cromossomos diplides

direcionados ao crescimento e diviso celular, tanto in vivoquanto in vitro.

Em contraste, as clulas cancerosas freqentemente tm aberraes

cromossmicas, uma condio patolgica conhecida por aneuploidia. Assim, os

cromossomos diplides de uma clula normal podem sofrer leses, porm,

antes que a clula sofra uma transformao em clula cancerosa, ocorre

ativao de protenas especficas da clula que causam a sua eliminao, num

processo conhecido por apoptose15.

Entretanto a clula cancerosa freqentemente falha na estimulao da

apoptose, e dessa forma seus cromossomos se desorganizam com mais

intensidade.

As mais notveis alteraes morfolgicas que ocorrem no citoplasma de

uma clula cancerosa envolvem o citoesqueleto. Enquanto uma clula normal

contm organizada rede de microtbulos, microfilamentos, e filamentos

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seus respectivos pontos de controle permitem que a clula complete seu ciclo

normal, replicando-se sem dar origem a clulas anormais. A diviso celular

normal positivamente regulada ou estimulada atravs de vias sinalizadoras.

Estas vias respondem a fatores extracelulares, os quais agem atravs de uma

seqncia de protenas por exemplo: receptores protena G protena-

quinase fatores de transcrio. A progresso pelo ciclo celular a seguir, em

parte, controlada, por uma srie de protenas chamadas quinases

dependentes de ciclinas (CDKs), particularmente nas transies de fases,

tanto de G1 para S quanto de G2 para M19. Os nveis de ciclinas oscilam

durante as fases do ciclo, determinando o momento apropriado de sua ligao

com CDKs. Este grupo de enzimas, por sua vez, fosforila a progresso de uma

fase a outra do ciclo celular. Por outro lado, um grupo de inibidores do ciclo

atua impedindo ou regulando negativamente as vias sinalizadoras de tal

progresso no ciclo de diviso celular. semelhana dos fatores estimuladores

que levam produo de ciclinas/CDKs, os reguladores negativos ativaro

inibidores dos CDKs: os CDKIs19.

Podemos distinguir duas famlias de CDKIs, de acordo com seu

mecanismo de ao, homologia e CDK alvo:

1) o grupo do p21, p27 e p57.

2) o grupo do p15, p16, p18 e p1919.

Anormalidades tanto nos genes estimuladores de diviso celular

(chamados de oncogenes), como nos protetores ou bloqueadores do ciclo

celular (chamados de genes supressores tumorais), podem conferir a uma

clula vantagens de crescimento e desenvolvimento sobre as clulas normais.

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Cada uma das protenas envolvidas no ciclo celular codificada por um gene.

Mutaes nestes genes podem levar desregulao do ciclo celular.

Os genes que atuam de forma positiva, induzindo ou estimulando a

progresso do ciclo, so chamados proto-oncogenes, pois ao sofrerem

mutaes se tornaro oncogenes, cuja ao permitir ganho de funo clula

mutante. Ao contrrio, as protenas envolvidas no controle negativo do ciclo

celular so codificadas pelos assim chamados genes supressores tumorais.

Mutaes neste grupo de genes se manifestaro pela sua falta de ao, mas o

efeito final ser similar: perda dos mecanismos controladores do ciclo celular

normal17. J se sabe h muito tempo que expresso imprpria de fatores de

crescimento ou de seus receptores contribui para o desenvolvimento de

neoplasias. Mais recentemente, demonstrou-se que hiper-expresso da

ciclina D1 induz progresso de hiperplasia a carcinomas em camundongos.

Amplificaes da ciclina D1 tambm foram encontradas em tumores primrios

e linhagens celulares tumorais19. No ser humano, medidas indiretas baseadas

na prevalncia de tumores em diferentes faixas etrias, permitem inferir que

so necessrias cerca de cinco a seis mutaes sucessivas para que uma

clula se torne maligna e agressiva18.

Os mecanismos pelos quais os melancitos tornam-se malignos in vivo

ainda pouco conhecido; no entanto, a ativao e inativao de oncogenes

dominantes e recessivos esto envolvidos no processo tumoral. Sabe-se que

as clulas neoplsicas apresentam profunda anormalidade quando interagem

com seu micro ambiente, as transformaes malignas so provavelmente

tambm alteraes gnicas que codificam fatores de crescimento e/ou seus

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receptores, o que confere autonomia de sinais proliferativos positivos,

independente do meio extracelular.

Outra evidncia que suporta a idia do envolvimento de pr-disposio

gentica e o fato que 10% dos pacientes portadores de melanoma possuem

histrico familiar da doena (pelo menos um parente tambm desenvolveu o

tumor)20.

1.5 - Epidemiologia do Melanoma Cutneo:

Os melancitos so clulas dendrticas originrias da crista neural, que

migram durante o desenvolvimento embrionrio para a epiderme e cuja

principal funo a sntese e transferncia dos grnulos de melanina para os

queratincitos circunvizinhos28. Em parte, o tipo de grnulo de melanina

sintetizado pelo melancito, o qual pode ser composto por eumelanina

(pigmento marrom ou preto), feomelanina (pigmento amarelo ou vermelho) ou

uma mistura de ambos, que ir determinar a colorao da pele.A quantidade

de melancitos presentes na epiderme varia segundo a regio anatmica,

sendo cabea e antebrao as regies com maior densidade dessas clulas26.

Estmulos externos tais como a radiao ultravioleta, podem induzir

proliferao dos melancitos. Em indivduos expostos radiao solar,

observa-se um aumento da sua quantidade em regies do corpo mais

expostas21.

As mudanas proliferativas no sistema melanoctico, da menos para a

mais agressiva, so classificadas como:

1 - nevo melanoctico benigno;

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2 - nevo displsico;

3 - melanoma de crescimento radial;

4 - melanoma de crescimento vertical;

5 - melanoma metasttico.28

Tanto o nevo melanoctico benigno quanto o displsico so

considerados marcadores para o melanoma, e sua presena aumenta o risco

de desenvolv-lo57, 21, 24, 28. Considera-se o nevo displsico como uma leso

precursora do melanoma15. De fato, em estudos clnicos de seguimento de

leses cutneas, observou-se a evoluo do nevo displsico para melanoma24.

O melanoma corresponde ao estgio final da carcinognese

melanoctica, no qual a instabilidade gentica das clulas iniciadas leva a um

aumento da sua capacidade proliferativa e de invaso15. Seu processo de

progresso aumenta em agressividade, passando pelas fases de crescimento

radial, vertical e no final, a metasttica24.

O melanoma cutneo classificado em quatro grupos clnico-

histolgicos:

1 - melanoma em lentigo maligno;

2 - melanoma disseminativo superficial;

3 - melanoma nodular;

4 - melanoma acral lentiginoso.

O primeiro subtipo corresponde a 5% dos melanomas em caucasianos,

e mais freqentemente diagnosticado em mulheres, indivduos com idade

superior a 60 anos e em reas anatmicas mais intensamente expostas ao sol.

O subtipo mais comum em indivduos de pele clara o disseminativo

superficial, correspondendo a 70% dos melanomas diagnosticados. A

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localizao anatmica predominante varia em funo da idade, ocorrendo nos

indivduos mais jovens em reas menos expostas ao sol (costas, braos,

ombro, perna e coxa) e entre os mais velhos nas mais expostas (cabea e

pescoo)25. O subtipo nodular o segundo mais comum entre caucasianos, e

corresponde entre 10 - 12% dos melanomas diagnosticados28. Similarmente ao

disseminativo superficial, a sua distribuio anatmica varia com a idade25. O

subtipo mais raro o melanoma acral lentiginoso24. Esse mais comum entre

negros e as reas anatmicas predominantes so as palmas, solas e leito

ungueal23, 25.

O prognstico para melanoma melhor para os subtipos; lentigo

maligno e disseminativo superficial. O pior prognstico est associado idade

superior a 60 anos, gnero masculino, leses localizadas no tronco, tumores de

maior espessura, e padro scio econmico mais baixo8, 27, 28,31.

1.6 - Aspectos Clnicos do Melanoma:

O tumor apresenta, na maioria das vezes, duas fases distintas:

1 - fase inicial ou de crescimento radial, no qual a leso ainda plana,

pequena e possui comportamento mais benigno,

2 - fase de crescimento vertical, com pior prognstico, apresentando

clulas malignas profundamente localizadas na derme reticular ou mesmo

invadindo o subcutneo.

A impresso clnica de que aproximadamente metade dos melanomas

surgem em associao com nevos preexistentes.

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Sinais precoces em um nevo que podem sugerir malignidade incluem

variaes de cor, prurido, aumento do tamanho, irregularidade das bordas e

desenvolvimento de satelitose ulcerao e sangramento que so sinais

tardios29, 30.

Uma recente proposta divide as leses de pele em trs classes:

A - Classe I representa o nevo precursor;

B - Classe II so leses intermediaras nas quais as clulas

melanocticas encontram-se confinadas a epiderme ou em micro invases naderme e representada pelos melanomas in situ ou melanomas invasivos;

C - Classe III compreende os melanomas tumorignicos.

Assim como em qualquer sistema neoplsico, o melanoma pode

eventualmente escapar de etapas durante seu desenvolvimento, isto ,

aparecer mesmo na ausncia de leses intermediarias, alternativamente o

melanoma pode surgir da transformao maligna de clulas precursoras32.

1.7 - Citotoxidade: morte celular-apoptose e necrose:

Fatores como estresse oxidativo, anxia, isquemia e uma grande

variedade de substancias txica so capazes de causar danos severos,

culminando na morte celular o que pode ocorrer pelo processo conhecido por

apoptose ou por outro extremo denominado necrose. Estudos demonstram que

clulas cancergenas tm uma peculiaridade em comum em relao

produo de energia, onde a via preferencial de produo de coenzimas

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reduzidas (ATPs), a gliclise anaerbica que contra pem a fosforilao

oxidativa33.

A fosforilao oxidativa mitocndrial o meio mais comum e eficaz de

produo de ATP pelas clulas, atravs da via do ciclo de Krebs, onde produz

a maior parte energia que ser disponibilizada para os vrios compartimentos

celulares, em quantidades diferentes para cada organela. Sabemos que a

fosforilao oxidativa (FO) produz 17 vezes mais ATPs em relao gliclise

anaerbia. O ponto em comum e focado por ns esta relacionado na teoria de

Cabtree.Que existe inibio da FO que ocorre quando se estimula a gliclise

anaerbia, este efeito e observado somente em clulas tumorais e leveduras. A

FO fornece energia para o citoplasma e a gliclise anaerbia para o ncleo

celular, em clulas cancergenas temos uma diminuio de ATPs no citosol

conseqentemente aumento da funo glicoltica que produzir energia para o

ncleo celular gerando conseqncias para o hospedeiro, como diviso celular

perptua33

As clulas cancergenas apresentam grande variedade de estgios de

diferenciao, indo de clulas altamente diferenciadas, semelhantes a clula

original com gliclise anaerbia prxima do normal e uma baixa taxa de

crescimento, at clulas altamente indiferenciadas com alta gliclise anaerbia

e rpida velocidade de crescimento. A perda de ATPs pelo ncleo das clulas

malignas fazem com que haja um impedimento de algumas funes celulares

primordiais, como, transcrio e replicao de DNA, diminuindo a proliferao

celular e iniciando os mecanismos de apoptose. Em alguns tipos celulares a

deciso de morrer por apoptose ou necrose determinada pela quantidade de

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ATPs presente na clula, de modo que a necrose acontece quando a

quantidade de coenzimas limitante34, 35.

1.8 - Apoptose:

O termo apoptose e usado nos casos de morte celular quando, a clula

diminui seu volume, apresenta alteraes em sua superfcie como a

externalizao de fosfatidilserina (que se liga com alta afinidade a protena

anexina V), alteraes nucleares tpicas como condensao e marginalizao

da cromatina, alm da quebra do DNA em pequenos fragmentos36.

Com respeito aos mecanismos intracelulares que participam da

apoptose, estes processos podem ter incio com a ativao de um receptor

especfico ou por alteraes nas mitoncndrias, sendo que ambos levam ao

vazamento do citocromo c dessa organela e a ativao de caspases, famlia de

sistenas proteases que coordenam e atuam como efetores da apoptose,

promovendo a hidrlise de protenas e DNA, alteraes do citoesqueleto,

dentre outros processos apoptoticos37.

A resistncia a apoptose uma caracterstica das clulas cancergenas.

O conceito de que a apoptose pode influenciar o fentipo maligno de uma

clula foi primeiramente mencionado em 197236. Contudo, a importncia do

processo na patognese do cncer permaneceu sob investigao por quase

duas dcadas, at que evidencias de genes reguladores da apoptose no

processo de tumorignese comeassem a sugir. Sabe-se, que em grande

parte as terapias existentes contra os diversos tipos de cncer eliminam as

clulas malignas atravs da induo de apoptose, de modo que, alteraes na

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regulao deste tipo de morte celular podem tornar o tumor mais resistente ao

tratamento, assim especulasse que um desequilibrio das protenas reguladoras

do processo apopttico possa contribuir a resistncia do melanoma maligno ao

tratamento. As bases moleculares para a resistncia a apoptose em melanoma

ainda no so bem compreendidas, alteraes nas diversas etapas do

programa da morte celular, tem sido descritos, variando desde a ineficincia da

sinalizao extracelular, ativao de caspase 8 at o desbalano na expresso

de protenas pr e anti apopttica37.

1.9 Al teraes Ultraestuturais Mitocondr iais:

Mitocndria uma organela citoplasmtica que est envolvida nos

processos primordiais de respirao celular a qual pertence maquinaria

celular, sendo tambm uma das mais importantes organelas celulares. A

mitocndria abastecida pela clula que a hospeda por substncias orgnicas

como oxignio e glicose, as quais processam e convertem em energia na forma

de ATP, e fornece para a clula hospedeira. Tendo como funo a produo de

coenzimas reduzidas pela cadeia de fosforilao oxidativa, funo essa

essencial para as clulas de mamferos. So responsveis pela produo de

grande parte dos compostos fosfatados de alta energia (ATP, GTP, creatina

fosfato) e tambm participam da gerao de calor celular, controle das

concentraes de clcio citosolicos, regulao da morte celular, gerao e

detoxificao de radicais livres e espcies reativas de oxignio.

Existe uma intima relao entre o potencial trasmembrana mitocondrial

(Deltpsi-m), e proliferao celular onde a queda do potencial trasmembrana a

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nveis inferiores a -15mvolts, desencadeia um mecanismo de sntese de DNA

nuclear dependente de glicolise e conseqente mitose, os valores normais dos

potencias trasmembranas devem permanecer em torno de -20mvolts

-90mvolts, dependendo do tipo celular, e sendo mantidos estes valores atravs

da FO38.

A alterao ultraestrutural da cadeia de transporte de eltrons como uma

das explicaes para diminuio do processo respiratrio, uma seqncia de

enzimas respiratria que se localizam na membrana interna mitocondrial esto

cobertas por lipdeos para isolar o transporte de eltrons da fase aquosa e

evitar um curto-circuito.

O sistema efetor-mecno-qumico responsvel pelo inchao e contrao

da mitocndria onde est intimamente ligado a cadeia respiratria, e sua

seqncia de acoplamento responsvel pela FO, este sistema pode sofrer

leso devido alteraes metablicas dos cidos graxos, fosfolipdios e

colesterol, componentes estes da membrana interna da mitocndria. Uma vez

que a perda da habilidade do inchao-contrao mitocondrial parece ser um

fator constante de todas as mitocndrias tumorais possvel que a maioria dos

tumores apresente leso da camada lipdica isolante.

Em relao as mitocndria podemos seguir os seguintes passos, um

carcinogeno lesa a membrana mitocondrial, provoca escape de eltrons que

alimenta a gerao de radicais livres que vo lesar o DNA, ocorrendo ento a

fase de iniciao do cncer38. A leso da mitocndria diminui a FO que faz

surgir o predomnio das gliclise anaerbia que gera a proliferao celular

maligna. O sistema mitocondrial defeituoso existente nas clulas cancerosas

pode ser melhorado e o fenmeno sendo reversvel do ponto de vista estrutural

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e funcional com a mudana do metabolismo anaerbio para o aerbio (FO),

promovendo diferenciao de clula maligna em clula no tumoral33.

A regio lesada da membrana mitocondrial interna pode ser susceptvel

a reparo porque o impedimento respiratrio in vitro, substancialmente

diminudo ou abolido pela adio de lipdeos totais, obtidos de mitocndrias

normais38.

1.10 - Apoptose mediado pela via mitocondr ial:

A via mitocondrial envolve membros pr-apoptticos da famlia Bcl-2,

mais precisamente, elementos da sub-famlia BH3 estas protenas, que incluem

a Bid, Bim, Harakiri, Noxa, entre outras, possuem apenas um dos domnio (o

BH 3) caractersticos da famlia Bcl-2. Em resposta a um estmulo, que

compromete outro conjunto de membros pr apoptticos, a sub-famlia da Bax,

que inclui a Bax, Bak e, provavelmente, a Bok, que normalmente se encontram

fracamente associados membrana externa da mitocndria, prevalecendo

majoritariamente no citosol. A interao entre protenas das subfamlias BH3 e

Bax leva oligomerizao dos elementos do ltimo grupo, seguido de insero

na membrana externa da mitocndria. Estas molculas passam, ento, a

constituir canais de sada de protenas intermembranares desde a mitocndria

at ao citoplasma, incluindo o citocromo c e o factor indutor da apoptose. O

citocromo c, uma vez liberado, ativa uma protena citoplasmtica designada de

Apaf-1, a qual recruta e ativa a pr-caspase-9, constituindo um complexo

proteico denominado de apoptossoma. A caspase-9, na sua funo de

caspase iniciadora, ir requerer e ativar a caspase-3, executora, a qual

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degradar protenas importantes para a viabilidade celular, e tambm, outras

caspases. As protenas Bcl-2 e Bcl-XL, membros anti-apoptticos da famlia

Bcl-2, bloqueiam a morte celular por prevenirem a liberao das protenas

intermembranares da mitocndria. No entanto, uma vez ultrapassada a fase de

morte celular que envolve, as protenas anti-apoptticas, deixam de ter

qualquer efeito na inibio da apoptose. As protenas pr-apoptticas e as anti-

apoptticas pertencentes famlia Bcl-2, podem inter atuar entre si atravs dos

domnios de homologia BH, formando homo e heterodmeros e regular, assim,

reciprocamente, as suas funes. Por outro lado, a funo das caspases

executoras tambm pode ser modulada por outro tipo de protenas, as IAPs

(inhibitor of apoptosis proteins), que podem ligar caspase 9 e inibir sua

atividade de protease, bloqueando a este nvel o processo apopttico. Contudo,

tambm a atividade destas protenas podem ser reguladas por outra protena

de nome duplo Smac/DIABLO, a qual, juntamente com o citocromo c,

liberada do espao intermembranar da mitocndria durante a apoptose. A

Smac/DIABLO associa-se s IAPs e inibe sua ao, permitindo a ativao da

caspase 9 a partir do complexo Apaf-1, e consequentemente, favorecendo a

apoptose40, 41,42.

1.11 - Fosfoetanolamina:

A fosfoetanolamina (PEA) foi isolada em 1936 por OUTHOUSE, (um

monoster cujo grupo R corresponde a NH2-CH2-CH2-), de tumores malignos

bovinos, fornecendo a primeira comprovao da existncia deste composto no

estado livre na natureza43

. Aps seus trabalhos, outros pesquisadores

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encontraram a fosfoetanolamina em intestinos de ratos e em tecidos cerebrais

de bovinos 44,45.

Por estarem presentes em tecidos orgnicos, surgiu um especial

interesse cientfico nos compostos fosforilados, com o objetivo de se elucidar o

papel bioqumico destas substncias. Assim, vrios trabalhos enfocaram os

diferentes comportamentos qumicos dos fosfolipdios, fosfoprotenas e outras

classes de organofosforados 45.

Os aspectos da interao entre steres fosfricos, como a lecitina, a

cefalina e a serina, com ons metlicos como sdio e potssio. Sugeriram, na

poca, um papel bioqumico destas substncias, no controle do equilbrio entre

os eletrlitos nos organismos vivos. Desde ento, o interesse na interao

fosfolipdeos-metais tem aumentado e outros trabalhos abrangendo

complexaes com outros ctions metlicos foram publicados, como o exemplo

do estudo onde foram medidas as constantes de estabilidade dos complexos

formados entre adenosina mono, di e trifosfato (AMP, ADP e ATP) com clcio.

Tais complexaes so de grande importncia na formao das lipoprotenas,

transporte de ctions e outros processos bioqumicos46, 47, 48.

Verificou-se existir uma interao especfica e atpica entre a

fosfatidilserina e o ction Li(I), resultando na cristalizao de um complexo

cristalino. Como o ltio costuma ser usado na terapia de doenas manaco-

depressivas, esses autores sugeriram que esta interao representaria

provavelmente um papel na ao farmacolgica do ltio49. Com relao ao

equilbrio de dissociao da fosfoetanolamina, preocupados em manter um

rigor para clculo termodinmico, surpreendentemente ignoraram o desvio

ocorrido do pK da forma protonada e a forma livre da protonao. Esse estudo

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do comportamento da FO gerou interesse de verificar se outros aminocidos

apresentariam tambm tal fenmeno de dimerizao, j que possuem a mesma

estrutura50.

A fosfoetanolamina orgnica e a etanolamina (EA) esto presentes no

crebro normal em grandes quantidades e sua concentrao tambm se

encontra aumentada em vrios tipos de tumores, onde este aumento pode ser

da ordem de at 10 vezes51. Essas aminasesto envolvidas no metabolismo

dos fosfolpides e so precursoras da fosfatidiletanolamina e da fosfatidilcolina,

dois dos quatro fosfolpides que compe a membrana celular52. Foi

demonstrado por vrios pesquisadores que a PEA e a EA so liberadas por

despolarizao em algumas circunstncias, embora no se saiba qual o

verdadeiro significado fisiolgico desta constatao, discute-se ainda quais as

reais interaes eletroqumicas envolvidas na dimerizao do composto

fosfoetanolamina noorganismo52, 53.

As funes precisas da PEA e da EA ainda so desconhecidas. No

coelho a PEA liberada do hipocampus aps despolarizao com potssio,

glutamato ou metil-aspartato. A liberao de PEA est sempre associada com

o aumento da concentrao de taurina. A interao entre taurina e PEA foi

confirmada quando se mostrou que a taurina exgena e os bloqueadores da

recaptao de taurina aumentam os nveis de PEA. O metil-aspartato induz a

liberao de taurina e PEA dos locais dendrosomticos, mas no nos

sinaptosomticos54.

A EA se converte em PEA no sistema nervoso sob a ao da

etanolamina-kinase. No prximo passo, atravs da via de Kennedy, forma-se a

fosfatidiletanolamina, um dos quatro fosfolpides componentes da membrana

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celular55. Uma segunda via envolve o clcio estimulando a incorporao de

serina, etanolamina e colina nos fosfolpides endgenos j existentes, em

reaes que no precisam de ATP 56. A colina uma trimetil-etanolamina e se

transforma por acetilao em acetilcolina.

Estudos recentes indicam que muitas patologias de SNC e tumores

inespecficos, tm causa provvel na deficincia de fosfoetanolamina. Em

pacientes com doena de Alzheimer confirmadas neuropatologicamente, foram

dosados a fosfoetanolamina nas regies de predileo da doena. Os dados

foram comparados com crebros normais da mesma idade. Constataram que

com diferenas estatisticamente significantes, quando comparados com

crebros normais da mesma idade, os nveis de fosfoetanolamina se

encontravam 64% reduzidos no cortex temporal (rea 21 de Brodmann), 48%

no cortex frontal (rea 9 de Brodmann) e 40% no hipocampus57.

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Objetivo

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2 - Objetivos:

O objetivo principal deste trabalho foi avaliar os efeitos anti-tumorais e

anti-proliferativos in vitroe in vivoda fosfoetanolamina sinttica em clulas

normais e linhagens de clulas tumorais de Melanoma Murino B16F10. Foram

avaliados os seguintes aspectos na inibio do crescimento e disseminao

das clulas tumorais em animais portadores de melanoma:

A determinao das concentraes inibitrias (IC50%) e

toxicidade nas linhagens tumorais e clulas normais por ensaios

colorimtricos (MTT);

Analisar as modificaes na distribuio das clulas tumorais nas

fases do ciclo celular por citometria de fluxo e as propores de

clulas mortas por necrose e ou apoptose;

Avaliar in vivo os efeitos anti-tumorais nos camundongos

portadores de melanoma B16F10 e as comparaes com os

quimioterpicos comerciais Taxol e Etoposideo;

Avaliar as alteraes histopatolgicas e histoqumicas da matriz

extracelular e dos vasos sanguneos dos tumores nos animais

tratados com diferentes concentraes da fosfoetanolamina

sinttica

Determinar as alteraes hematolgicas (leuccitos, eritrcitos e

plaquetas) nos animais portadores de melanoma submetidos ao

tratamento com fosfoetanolamina sinttica.

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Materiais e Mtodos

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3 - Materiais e Mtodos:

3.1 - Linhagens celulares tumorais e clulas normais.

A linhagem tumoral de melanoma murino B16F10 foi gentilmente cedida

pelo Instituto de Pesquisa para o Cncer Ludwig, Genebra, Sua. As clulas

sero cultivadas em frascos de cultura de 75 cm em meio de cultura

(RPMI - 1640), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de

L-glutamina e antibiticos. Antes das clulas atingirem confluncia, as clulas

sero subcultivadas para ampliao e congelamento (meio completo contendo

10% de dimetil-sulfxido), e mantidas em nitrognio lquido. As suspenses

celulares utilizadas para a implantao no flanco dorsal dos animais sero

obtidas aps o tratamento dos frascos de cultura com Tripsina 0,2% por 5

minutos e inativao com 10% de soro fetal bovino. As clulas desprendidas

sero centrifugadas duas vezes, ressuspensas em meio de cultura e a

concentrao celular ajustada por contagem em cmera de Mallassez.

3.2 - Determinao da ativ idade citotxica pelo mtodo co lor imtr ico MTT.

A viabilidade celular das linhagens celulares tumorais e normais foram

tratadas com as diferentes concentraes de fosfoetanolamina sinttica e

avaliadas pelo mtodo colorimtrico do MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)2,5-

diphenil tetrazolium bromide)58. Este mtodo baseado na reduo do MTT a

Formazan pelas clulas vivas. A determinao da sensibilidade das diferentes

doses foi otimizada de acordo com as normas estabelecidas pelo Instituto

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Nacional de Cncer, USA (NCI). Foi determinada a atividade citotxica das

suspenses das linhagens celulares e das clulas tumorais in vivo, retiradas

cirurgicamente e em condies estreis, incubadas em placas de 96 orifcios.

Foram adicionados 10 ml de MTT (5mg/ml) s clulas, incubadas por 3 horas

em estufa contendo 5% de C02 a 37C. Aps este perodo, o meio foi removido

e acrescentado 100 ml de dimetilsulfoxido (DMSO) para dissolver os cristais de

Formazan formados e precipitados. A quantificao da absorbncia foi feita em

leitor de ELISA em comprimento de onda de 540 nm (TiterTek Multiskan)59,71.

3.3 - Anlise das fases do ciclo celular por c itometria de fluxo.

A citometria de fluxo aplicada no estudo do ciclo celular registra os

parmetros cinticos da populao celular, revelando o ndice de DNA,

aploidia, a frao de proliferao celular, e a porcentagem de clulas

encontradas nas fases G0/G1, S e G2/M, indicando parmetros uni ou

multivariveis, prognsticos e possveis rumos teraputicos. A anlise da

porcentagem de clulas fornece o percentual de clulas que esto sintetizando

DNA (labeling index), da durao da fase S (Ts) e do tempo de duplicao

potencial (Tpot).

3.4 - Determinao do contedo de DNA por Citometr ia de Fluxo.

Alquotas das suspenses das clulas normais e tumorais tratadas e no

tratadas, foram imediatamente congeladas em tampo citrato (2mM), sucrose

47


49/134

25 mM e 0,05% dimetil sulfxido (DMSO), e mantidas em nitrognio lquido at

o momento de sua utilizao.

Aps o descongelamento das amostras em banho de gelo, as clulas

foram digeridas com 375 ml de tripsina 0,03 g/l (Sigma) por 10 minutos

temperatura ambiente e neutralizada com o inibidor de tripsina 0,5 g/l (Sigma),

ribonuclease A 0,1 g/l (Sigma) e espermina 1,2 g/l (Sigma). As amostras foram

transferidas para tubos de citometria de fluxo e a quantidade de clulas nas

diferentes fases do ciclo, nveis de apoptose (Sub-G1) e contedo de DNA na

fase S, que sero obtidos pela anlise em Software Mod-fit.

3.5 - Determinao das fases do cic lo celular por Citometria de Fluxo:

As suspenses celulares (106/ml) normais dos tumores dorsais e ou

metstases foram centrifugadas duas vezes a 3000 rpm com soluo PBS e

ressuspensas em 200 ml soluo de iodeto de propidium (20 mg/ml), contendo

20 ml Triton X-100 e 4 mg RNAse-A, por trinta minutos, temperatura

ambiente, protegidas da luz. Aps este perodo as amostras foram transferidas

para tubos de citometria, e as imagens adquiridas sero capturadas em

citmetro de Fluxo (Scalibur-Becton e DicKson) e analizadas em Software Cell-

Quest. As fases do ciclo celular pr e ps-mitticas (G0-G1, fase S e G2-M)

sero analisadas em software Modi-fit

48


50/134

3.6 - Implantao das clulas tumorais:

Os camundongos foram injetados subcutaneamente no dorso com

5x104 clulas tumorais de melanoma murino B16F10. Aps o dcimo quarto

dia do implante tumoral, os tumores dorsais foram medidos com o auxlio de

um paqumetro. Os tumores em mdia apresentaram dimetro mdio de 0,5

cm, foi iniciado o tratamento com a fosfoetanolamina sinttica nas diferentes

concentraes descritas anteriormente, injetados pela via intraperitoneal.

Como grupo controle os animais receberam soluo salina pelas

mesmas vias de tratamento. Aps o 20 dia do tratamento, os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical, e em seguida, realizados a necropsia,

os tumores dorsais analisados, leses internas macroscpicas identificadas,

medidas e fotodocumentadas. Amostras dos tumores dos diferentes grupos de

tratamento e grupo controle, no tratado, foram processadas para as das

anlises do contedo de DNA, ciclo celular e anatomopatolgico.

3.7 - Animais e Delineamento Experimental:

Utilizaremos 40 camundongos da linhagem Balb c, fmeas e machos,

com aproximadamente 25g, idade aproximada de 6 a 8 semanas, dieta e gua

ad libitum, dos quais sero divididos em 4 grupos distintos a seguir:

49


51/134

3.8 - Os grupos experimentais foram compostos por:

Grupo A 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas

tumorais pela via subcutnea, aps o 14 dia do implante os animais foram

tratados com fosfoetanolamina sinttica pela via intraperitoneal com a

concentrao de 0, 033g/ml em 100ul;

Grupo B 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas




Grupo C 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas




Grupo D 10 camundongos Balb c, inoculados com 5x104 clulas

tumorais pela via intraperitoneal, aps o 14 dia do implante os animais foram

tratados com soluo salina pela via intraperitoneal;

3.9 - Observao do crescimento tumoral:

Aps a injeo de clulas B16F10, o crescimento tumoral foi medido e

fotodocumentado, diariamente com o auxlio de um paqumetro para medies

longitudinais e transversais do tumor (duas medidas). Foram calculados a rea

e o volume mdio do tumor, atravs das seguintes frmulas:

50


52/134

A=R2 e V= 4/3R3onde:

A=rea, R= raio, V= volume.

Os animais foram sacrificados a cada etapa de tratamento,

necropsiados e os ndulos tumorais macroscpicos presentes nos rgos

internos foram contados e medidos.

3.10 - Contagem e quantificao dos glbulos vermelhos, hemoglobina,

hematcrito, leuccitos e plaquetas:

Glbulos Vermelhos: alquotas de 10l do sangue de cada grupo

experimental e controle foram diludas 1:1000 em soluo salina 0,9% e 0,01%

paraformoldedo para a anlise do nmero total de glbulos vermelhos. A

contagem foi realizada em cmera de Malassez, e o nmero de clulas ser

expresso em 109/ml.

Hematcrito: a determinao do hematcrito (Ht) foi realizada pela coleta

do sangue em microcapilar de 10ul heparinizado selado em uma das

extremidades com fogo no bico de Bunsen. O capilar foi colocado em

microcentrfuga com a extremidade fechada voltada para o crculo externo e

centrifugada a 11.000 rpm durante 5 minutos. Os resultados foram expressos

aps a anlise comparativa da relao do sedimento rico em glbulos

vermelhos e o plasma, em tabela de referncia padro.

Hemoglobina: a determinao do teor de hemoglobina foi coletada 200ul

de sangue do plexo venoso retro orbital em tubos microcapilares contendo

como anticoagulante o EDTA. Utilizando-se o mtodo da

51


53/134

cianometa-hemoglobina, com leitura em espectrofotmetro 540nm, foram

analisadas as concentraes de hemoglobina.

Plaquetas: a contagem de plaquetas foi realizada em cmara de

Neubauer, utilizando como diluente a soluo de oxalato de amnio a 1%

(lquido de Brecker). Tambm foram realizados esfregaos sanguneos, dos

diferentes grupos de animais tratados e grupo controle para a avaliao da

morfologia e do dimetro plaquetrio mdio. Foram tambm avaliados

aspectos citolgicos, como a presena de macro ou micro plaquetas, que so

mais funcionais que as plaquetas normais e indicam regenerao da medula

ssea e a presena de agregados plaquetrios indicativos de alteraes

txicas promovidas pelos compostos como tambm alguma alterao

morfolgica celular.

Leuccitos: uma alquota de 10l do sangue de cada grupo experimental

e controle foram diludos em 90l de soluo de Turk (azul de metileno 0,5%

em 30% de cido actico glacial) para a anlise do nmero total de glbulos

brancos. A contagem foi realizada em cmera de Malassez, e o nmero de

clulas foi expresso em 106/ml. O sangue total dos camundongos portadores

de melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica durante 20 dias

e grupo controle que recebeu soluo salina, foram coletados pela puno do

plexo venoso retro-orbital com o auxlio de um microcapilar de 10ul

heparinizado. Parte desse material foi utilizado para a confeco do esfregao

sanguneo.

52


54/134

3.11 - Anlises Hematolgicas:

A anlise dos nmeros globais de glbulos vermelhos e leuccitos

constitui em um importante exame de auxlio diagnstico para doenas

hematolgicas, sistmicas e aes farmacolgicas ou teraputicas.

Rotineiramente indicado para avaliao de anemias, neoplasias sistmicas,

reaes infecciosas e inflamatrias, acompanhamento de terapias

medicamentosas e avaliao de distrbios plaquetrios. Fornecem dados para

classificao das anemias de acordo com alteraes na forma, tamanho, cor e

estrutura das hemcias e conseqente direcionamento diagnstico e

teraputico, orienta na diferenciao entre infeces virticas e bacterianas,

parasitoses, inflamaes, intoxicaes, interaes medicamentosas e

neoplasias atravs das contagens globais e diferenciao de leuccitos e

avaliao morfolgica dos mesmos.

As lminas para as anlises diferenciais dos leuccitos foram fixadas em

metanol puro por cinco minutos, em seguida coradas em soluo de Giemsa

por quinze minutos, lavadas em gua corrente e secas temperatura

ambiente. Aps a secagem das lminas foi realizada a contagem diferencial de

glbulos brancos em microscopia ptica com aumento de 1000x em leo de

imerso.

3.12 - Anlises histopatolgicas:

Foram retirados pequenos fragmentos de aproximadamente 0.2cm2 dos

rgos (corao, pulmo, fgado, bao, pncreas e rins), dos animais tratados

53


55/134

e controles, pesados e fixados por 24 horas em tampo formalina, tamponado

com o ph = 7.4 para a realizao de anlises histopatolgicas, tambm como

de seus tumores e metstases, para serem corados de diversas maneiras

possibilitando uma melhor visualizao das manifestaes ocorridas no

microambiente celular, como diferenciao celular, neoformao vascular,

apoptose, necrose, regenerao tecidual, hemorragias entre outros.

3.13 - Preparo das amostras paras anlises histoqumicas Picrosirius-

Red e Van Gienson-Verhoff :

Aps perodo de fixao de 24 horas, utilizando-se lmina histolgica

sobre tbua de macroscopia foram retiradas duas amostras retangulares.

Todas as amostras foram acondicionadas em cpsula histolgica e colocadas

no autotcnico (Leica modelo RM 2145) para processamento overnight,

sendo desidratadas em concentraes crescentes de lcool etlico a 70, 80 e

90%. Posteriormente, foram diafanizadas em xilol contendo misturas

seqencialmente concentradas de parafina durante 12 horas. Realizada

incluso em parafina quente (Leica modelo EG 1160), os blocos foram

microtomizados (Leica modelo RM 2145) em cortes de 5m e dispostos em

lmina de vidro de 75 x 25 mm, realizando-se dois nveis de corte para cada

rea de estudo e a seguir as lminas foram corados pelos mtodos

citoqumicos de Picrosirius Red, para fibras de colgeno e Van Gienson

Verhoff para as fibras elsticas e vasos.

Os cortes histolgicos (3m) dos tumores dos grupos tratados com

fosfoetanolamina sinttica e controles que receberam soluo salina foram

54


56/134

fixados em tampo contendo 3% paraformaldedo, 0,2% de glutaraldedo e

0,1% triton X-100 em tampo fosfato de sdio pH= 7.4.

O colgeno, por ser uma protena bsica, provavelmente interage com

os grupos sulfnicos do corante Vermelho Srio a 0,1%, e em pH baixo, com os

grupos amino da lisina e da hidroxilisina e os grupos guanidina da arginina. A

colorao pelo mtodo do Picrosirius faz com que grande quantidade de

molculas do Sirius Red, de carter cido e alongado, disponha-se

paralelamente s molculas do colgeno, o que provoca aumento considervel

da birrefringncia das fibras que contm colgeno quando observadas luz

polarizada. Assim, o mtodo da colorao com Picrosirius associado

microscopia de polarizao um mtodo histoqumico especfico para

deteco de estruturas compostas de molculas de colgeno orientadas60, 61, 62,

63,64.

55


57/134

Resultados

56


58/134

4.1 - Avaliao da atividade citotxica in vitro da fosfoetanolamina

sinttica em linhagens celulares:

Aps 24 horas de cultura, fase de crescimento exponencial das clulas

de melanoma B16F10 foram plaqueadas em microplacas de 96 orifcios e

adicionadas s diferentes concentraes do composto diludo em meio de

cultura. O tratamento com a fosfetanolamina sinttica, em culturas celulares de

melanoma murino B16F10, mostrou efeito adverso sobre a toxicidade deste

composto, tempo e dose dependentes (Figura -1). A viabilidade celular aps

24 horas de tratamento nas concentraes de 6 mg 0.005 mg da

fosfoetanolamina sinttica mostrou que este composto apresenta alta

citotoxicidade em clulas tumorais somente nas altas concentraes

analisadas (6 a 1.5mg/ml), porm nas outras concentraes testadas no

foram observados efeitos deletrios significantes (menor 0.75mg/ml). Nessas

condies foi determinada a concentrao inibitria 50% a partir da curva de

regresso linear, nosso resultado para as clulas de melanoma foi de 2.3

mg/ml (Figura 2).

A fosfoetanolamina sinttica no inibe a resposta proliferativa

inespecfica de linfcitos T normais mantidos em cultura por 96 horas e

ativados pelo mitgeno PHA (fitohemaglutinina) (Figura - 3).

57


59/134

6000 3000 1500 750 325 162 81 40 20 10 5 2.5

0

20

40

60

80

100

120

Mortas

Vivas

Concentrao (ug/ml) fosfoetanolamina

(%)CelulasB

16F10

Figura 1 Determinao da atividade citotxica da

fosfoetanolamina sinttica em clulas de melanoma B16F10, avaliada pelo

mtodo colorimtrico MTT, as barras do histograma representam a

porcentagem relativa em cada concentrao de clulas viveis e mortas.

58


60/134

0

1020

30

40

50

6070

80

0 2000 4000 6000 8000

(%) Inibio

Clula Tumoral B16F10

IC % = 2.3m /ml

Concentrao da Fosfoetanolamina Sinttica (10-6/mL)

Figura 2 Curva de regresso linear e concentrao inibitria 50%

(IC50%) da atividade citotxica da fosfoetanolamina sinttica em clulas

de melanoma B16F10, avaliada pelo mtodo color imtrico MTT.

59


61/134

o 10%SF 25ug 125ug 6ug 3ug 1.5ug 0.75ug 0.37ug 0.15ug 0.075ug o 1% SF0

50

100

150

Concentracao Fitohemaglutinina (ug/ml)

(%

)Atividad

eProliferativa

Figura 3 Avaliao da resposta linfoproliferativa de linfcitos T

normais, aps 96 horas de cultura com fosfoetanolamina sinttica e com

o mitgeno fitohemaglutinina (PHA). A porcentagem da capacidade

proliferativa foi calculada comparando-se a resposta basal (ausncia de

mitgeno) e o controle na presena de PHA 10% e 1% de soro fetal

bovino (SFB).

60


62/134

4.2 - Anlise das fases do ciclo celular por ci tometria de fluxo:

Os animais portadores de melanoma B16F10 tratados durante 20

dias consecutivos com fosfoetanolamina sinttica, apresentaram

aumento significativo na taxa de sobrevida nas concentraes variando

de 9.9 mg at 1.65 mg em comparao ao grupo controle. Aps a

necrpsia destes grupos de animais portadores de tumor dorsal ou

metstases pulmonares e do grupo controle que recebeu soluo salina,

foram avaliadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo e

determinadas a porcentagem das clulas nas seguintes fases: sub G1

ou apoptticas que apresentam DNA fragmentado, G0/G1 clulas

quiescentes, Fase S em sntese de DNA e G2/M em mitose.

Nossos resultados mostraram que as clulas tumorais B16F10

obtidas do tumor dorsal do grupo controle apresentam 6.9% 3.4 em

apoptose (sub-G1), 25.6% 4.8 clulas quiescente (G0/G1) e em grande

proporo com capacidade proliferativa 51.3%3.0 na fase (G2/M). Os

animais tratados com 9.9 mg apresentaram significante aumento na taxa

de mortalidade e seus tumores significativas reas de necrose.

Os tumores dos animais tratados com a concentrao de 6.6 mg

apresentaram aumento extremamente significante na proporo de

clulas em apoptose, sub G1 (12.8% 4.4) em comparao ao grupo

controle no tratado. Tambm foram observadas diminuies

significantes (p


63/134

ao grupo controle (23.1% 4.6). A proporo de clulas com capacidade

proliferativa (G2/M) valor significativamente menor (P


64/134

Apo Co G0/G1 Co S - Co G2/M - Co0

5

10

15

20

25

3035

40

45

50

55

Fases do Ciclo Celular

(%)PopulaoTumoral

A

Apoptose G0/G1 S G2/M0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5


(%)P

opu

la

o

Tumora

l

***

***

***

***

B

Figura - 4 Determinao da distribuio das populaes de clulas

tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e

tratados com 6.6 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes

fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo.

* Anlise estatstica One-Way Analise of Variance ANOVA (p signif icativo p


65/134

Os tumores do grupo de animais tratados com a concentrao de 1.65

mg apresentaram aumento significante na proporo de clulas em apoptose

(17.5% 2.3) em comparao ao grupo controle no tratado (6.8% 3.4).

Quando comparadas s concentraes de 6.6 e 1.65 mg de fosfoetanolamina

sinttica os nveis de apoptose no tiveram diferenas significantes. As

propores de clulas quiescentes diminuram significantemente (p=0.0015) no

grupo de clulas tratadas com fosfoetanolamina sinttica (12.7 % 4.06) em

relao ao controle (25.6% 4.8). A capacidade de sntese (fase S) diminuiu

significativamente (P


66/134

Apo Co G0/G1 Co S - Co G2/M - Co0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55


(%)PopulaoTum

oral

A

Apoptose G0/G1 S G2/M0

5

10

15

20


(%)Popu

laoTumoral ***

***

*

***

B

Figura - 5 Determinao da distribuio das populaes de clulas

tumorais dorsais de melanoma dos animais do grupo controle (A) e

tratados com 1.65 mg de fosfoetanolamina sinttica (B) nas diferentes

fases do ciclo celular obtidos por citometria de fluxo.

* Anlise estatst ica One-Way Analise of Variance ANOVA (p signifi cativo p


67/134

Anlises comparativas entre os tratamentos com a fosfoetanolamina

sinttica nas concentraes de 6.6 e 1.65 mg com o quimioterpico Taxol na

concentrao de 3.7uM, especfico de ltima gerao responsvel pela inibio

de protenas envolvidas na dimerizao de microtbulos durante a diviso

celular, nas fases G2/M; mostraram que em todas as fases do ciclo a

fosfoetanolamina sinttica na concentrao de 6.6 mg diminui

significativamente a capacidade de proliferao celular e um indutor

importante de clulas em apoptose com a mesma eficcia teraputica, porm

sem apresentar catastrficos efeitos colaterais. Na concentrao de 1.65 mg

de fosfoetanolamina sinttica a eficcia de inibio das fases quiescentes, S e

proliferativa G2/M mostrou-se dependente da dose administrada no tratamento.

Os dados e as anlises estatsticas esto apresentados nas figuras 6 e 7.

66


68/134

Apoptose G0/G1 S G2/M0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5


(%)PopulaoTumoral

A


5

1 0

1 5

2 0

F a s e s d o C i c l o C e l u l a r

7uM B

Figura - 6 Anlise comparativa da distribuio das populaes

celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 6.6 mg de

fosfoetanolamina sinttica (A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B),

obtidos por citometria de fluxo.

(%)Tum

T

3.

a

xol

orB16F10+

67


69/134


5

10

15

20


(%)PopulaoTumora

l

A


5

10

15

20

F a s e s d o C i c l o C e l u l a r

(%)TumorB16F10+Taxol3.7uM

B

Figura - 7 Anlise comparativa da distribuio das populaes

celulares nas fases do ciclo celular dos tumores tratados com 1.65 mg de

fosfoetanolamina sinttica (A) e tratados com o quimioterpico Taxol (B),

obtidos por citometria de fluxo.

68


70/134

Tabela - Anlises das fases do ciclo celular obtidas por citometria

de fluxo das clulas de melanoma B16F10 dos grupos: controle, tratados

com 6.6 e 1.65 mg/mL de fosfoetanolamina sinttica e com o

quimioterpico Taxol.

Linhagem B16F10

/ Tratamento

Sub-G1

(%)

G0/G1

(%)

S

(%)

G2/M

(%)

Controle6.9 3.4 25.6 4.8

23.1 4.6 51.3 3.0

Fosfoetanolamina

6.6mg/mL

(0.0468uM)

(80 x)

12.8 4.4 2.9 0.9 1.49 0.28 2.1 0.89

Fosfoetanolamina

1.65mg/mL

(0.0117uM)

(320 x)

17.5 2.3 12.7 4.1

4.9 1.2 11.9 2.2

Taxol (3.75 uM) 15.4 8.7 2.6 1.6 0.61 0.43 1.38 0.7

Valores expressos em mdia (x) e desvio padro (d.p.)

69


71/134

4.3 - Anlise dos parmetros tumorais dos camundongos portadores de

Melanoma B16F10 tratados com fosfoetanolamina sinttica:

Aps o 14 dia da implantao de 5x104 clulas tumorais na regio

dorsal, 100% dos animais apresentavam tumores dorsais prximos aos locais

de inoculao apresentando em mdia volume de 0.10 0.05cm3.Os animais

de todos os grupos de experimentao tratados e controle foram pesados e

realizados a medio (comprimento x largura), dos tumores diariamente com o

auxilio do paqumetro, e fotodocumentados.

Os animais foram observados diariamente e aps 20 dias de tratamento

com fosfoetalonamina sinttica administrada pela via intraperitoneal, com as

seguintes concentraes (9.9, 6.6 e 1.65 mg), e foram sacrificado por

deslocamento cervical, necropsiados e os tumores dorsais e as metstases

presentes nos rgos internos, (corao, pulmo, fgado, rins, bao), pesados

e fixados por 24 horas em tampo formalina, tamponado com o pH 7,4 para a

realizao de anlises histopatolgicas.

Macroscopicamente os tumores dos animais tratados com 1.65 mg de

fosfoetanolamina sinttica apresentavam-se como massas nodulares dorsais

no pigmentadas, no ulceradas e com raras reas de irrigao ou

neoangiognese, tambm foi observada a formao de tecido encapsulado

caracterstico de fibrose, a massa no se apresentava aderida superfcie

interna do animal, caractersticas de tumores benignos. Por outro lado, o grupo

controle apresentava tumores dorsais pigmentados e necrose, com extensas

reas de ulcerao, extremamente irrigada e ocupando um volume expressivo

em relao superfcie corprea total do animal (Figuras 8 e 9).

70


72/134

*

&

GrupoFosfoetanolamina (1.65mg)

Figura 8 Aspecto macroscpico dos tumores dorsais de

melanoma do grupo tratado com 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica,

aps 20 dias. Observa-se massa tumoral no pigmentada, com raras

reas de irrigao (*) e formao de cpsula fibrt ica (&).

71


73/134

Gru o Controle

&

*

#

Figura 9 Aspectos macroscpicos dos tumores dorsais de

melanoma do grupo controle que recebeu soluo salina, aps 20 dias.

Observa-se extensa massa tumoral nodular, com grandes reas de

irrigao (#), necrose (*) e ulcerao (&).

72


74/134

Os tumores melanoma B16F10 dos animais tratados com 6.6 mg de

fosfoetanolamina sinttica apresentaram pequenas massas tumorais amorfas

ou um pequeno ponto de aplicao na rea onde foi inoculado s clulas,

ausncia de metstases internas, ausncia de neoangiognese. No foi

observada perda de peso significativo ou alteraes comportamentais

importantes pela utilizao do composto (Figura - 10).

73


75/134

#

@&

*


melanoma do grupo tratado com 6.6mg de fosfoetanolamina sinttica,

aps 20 dias. Observa-se pequena massa tumoral amorfa (&) ou

pequenos pontos de aplicao no local da implantao das clulas

tumorais (#), com ausncia de irr igao vascular (* @).

74


76/134

@#

*

&


melanoma do grupo tratado com o quimioterpico Taxol 3.7uM, aps 20

dias. Observa-se volumosa massa pigmentada dorsal (&) com extensa

rea de irr igao, neoangiognese (*) e metstases gangl ionares satlites

(# @).

75


77/134

Fgado Pulmo

Rim

Fgado

&

*

#

Figura 12 Aspecto macroscpico das leses metastticas

presentes nos parnquimas heptico (&) e pulmonar (*) do grupo controle

e dos animais com o quimioterpico comercial Taxol 3.7 uM (#) aps 20

dias. Observa-se acentuado grau de anemia dos animais do grupo

controle em relao aos animais tratados.

76


78/134

A curva de crescimento tumoral foi avaliada pela medio dos seguintes

parmetros tumorais: incidncia, taxa de sobrevida, rea tumoral e nmero de

metstases internas. Os animais portadores de melanoma B16F10 e tratados

com a concentrao de 9.9mg apresentaram reduo significativa da massa

tumoral de 89% em comparao ao grupo controle no tratado. Este grupo de

animais apresentou pequenas massas tumorais, porm a taxa de mortalidade

no curso do tratamento foi grande, possivelmente pela interao do composto

com o microambiente tumoral, o que levaria possivelmente a liberao de

substncias ou produtos da degradao celular com potencial citotxico

(horror citotxico), figura 13.

Nas concentraes de 6.6 e 1.65mg de fosfoetanolamina sinttica

observa

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