TECHNIKY PCR
PCR - polymerase chain reaction
-polymerázová řetězová reakce
Outline
Molekulárně-biologický úvod, DNA struktura, replikace, DNA polymeráza
Princip procesu PCR
Optimalizace PCR
Typy PCR
Aplikace PCR a využití v praxi
Komponenty nukleových kyselin
http://ntri.tamuk.edu/cell/nucleic.html
Nukleotid DNAdeoxyguanosid monofosfát (dGMP)
“Koncept párování bazí je striktně konzervativní“
From Dr. John C. Perez, Professor and Director of the Natural Toxins Research Initiative, Texas A&M http://ntri.tamuk.edu/cell/dna.html
Cytosine Guanine
Deoxyribosa a fosfát dávají DNA řetězci směr
konce dsDNA nejsou stejné
jednotlivé řetězce duplexu jsou k sobě komplementární
DNA rětězce duplexu mohou být denaturována a znovu spojena
OH
HO
T A
G
T A
C
G C
5’ end 3’ end
5’ end3’ end
1
23
45
Tm (melting temperature) je teplota při které je dsDNA z poloviny denaturována
Singer, M., and P. Berg. 1991. Genes and Genomes. University Science Books, Mill Valley, CA. p. 49
Tm je závislá na: složení bazí rozpouštědle
iontové sílepH
délce DNA
DNA replikace in vivo vyžaduje několik enzymů
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/collaboration.html
separace řetězců syntéza krátkých
RNA primerů syntéza dvou
nových DNA helixů
podílí se enzymy:DNA primáza helikázaDNA polymerázaDNA ligáza SSB-proteiny
Vlastnosti DNA polymerázy
1. POLYMERÁZOVÁ AKTIVITA
Replikace probíhá vždy ve směru od 5´na 3´konec
Nový nukleotid je přidáván tedy vždy na 3´OH konec.
2. 3'-5' exonukleázová aktivita -opravná funkce “proofreading”
3. 5´exonukleázová aktivita - odštěpuje RNA primer
DNA replikace in vitro vyžaduje pouze jeden enzym
1957 Arthur Kornberg dokázal existenci DNA polymerázy - DNA polymerase I
in vitro polymeráza vyžaduje pouze:4 deoxynukleotidy trifosfátydsDNA templátprimer - ssDNA nebo RNA s volnou 3'-OH
DNA Polymeráza
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
5’ 3’
3’ 5’
TTGAGAAAGGAATAAGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG3’ 5’
5’ 3’Forward primer
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
5’ 3’
3’ 5’
DNA POL
dNTPs
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
5’ 3’
3’ 5’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC TCTTTAGCTCATATACG
3’ 5’
5’ 3’
Reverse primer
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGCAACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
5’ 3’
3’ 5’
dNTPs
DNA POL
GCATATACTCGATTTCT5’ 3’
Syntéza obou řetězců specifické dsDNA in vitro
PCR: Co to je?
Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA
Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika)
The idea
Ghobind Khorana 1971
Kary Mullis 1983
poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce
Řetězová reakce vychází z DNA replikace
Spočívá v opakování cyklů denaturace (separace dsDNA), navázání primerů a elongace primerů (syntéza nového vlákna DNA) pomocí změn teploty
potřeba silného enzymu (polymerázy) který je schopen pracovat při vysokých teplotách
Polymeráza izolovaná z termofilní bacterie (Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus) zkr. TAQ, PFU Polymeráza
Jak funguje PCR
PCR komponenty
Templátová DNA
vzorek k amplifikaci
Primery
krátké specifické úseky DNA zaručující specifitu amplifikace
dATP, dTTP, dCTP, dGTP
volné stavební jednotky DNA
Thermostabilní DNA polymeráza (e.g., Taq, Pfu) Pufr a soli (KCl, MgCl2)
Proces PCR
Application
Velký nadbytek primeru, dNTPs a Taq POL k DNA templátu
Proces
Problémy:
PCR je velmi citlivá na kontaminace
Častý problém - nespecifická amplifikace
Polymeráza pracuje i při nízských teplotách (e.g., během nastavování reakce)
“Hot start” PCR je řešení
Amplifikace je často možná i pro ne zcela známou sekvenci primerů např. DNA jiného biologického druhu
“Degenerované primery” (multiple verze s různými bázemi v klíčové pozici: …gacgt, …gacga, …gacgg, …gacgc)
“Touchdown PCR” s vyšší přesností v prvních cyklech
Maximální velikost produktu +/-5000 bazí pro standardní PCR: Long PCR kits mohou amplifikovat až 35 kbazí
Navrhování primerů
Primery by měly být 20-25 bazí dlouhé
Nutná znalost alespoň části sekvence amplifikované DNA
3’ konec primeru je důležitý: vhodné aby zde byla G nebo C báze
Procentuální zastoupení G + C by mělo být 50-60% - ovlivňuje Tm (teplota kdy se váže primer na templát)
Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2
Primery v jedné reakci by měli mít srovnatelné Tm
Vyvarovat se repetitivním sekvencím
Vyvarovat se komplementaritě uvnitř či mezi primery
Navrhování primerů
Příklad navržení primerů:
Konvence: DNA se vždy zapisuje ve směru od 5´ku 3´konci
Cílová sekvence: (priming místo podtrženo):
5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTCCACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAGCTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTTAAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’
Forward Primer: 5’ATG GAT GAG AAA TGC TTG TG3’
Reverse Primer: 5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’
Praktické provedení PCR
PCR se provádí v termocyklerech
kovový blok z ušlechtilého kovusnadné programovánívyhřívané víko
Praktické provedení PCR
objem v mikrozkumavce: 25-100 ųL
složení:
• Templátová DNA 1-1000ng
• Primery 10 -20 pmols
• 10mM Tris-CL pH 9.0, 50 mM KCl
• MgCl2 0.5 -3.0 mM
• 50 ųM každého nukleotidu dATP, dGTP, dTTP, dCTP
• 2 jednotky Taq polymerázy
Praktické provedení PCR
Počáteční denaturace 94oC 3-5 min
denaturace 94oC 30 sec
annealing ~55oC 30 sec
prodlužování 72oC 1min/kilobáze
počet cyklů 25-35 x
Praktické provedení PCR
agarozováelektroforéza
PCR Optimalizace
Složka Nízká specificita
Vysoká specificita
AnnealingTeplota - Tm
MgCl2
KCl
Enzym, Primer
pH nespecificky
Formamid
Nespecifická amplifikace
Základní typy PCR
RT PCR (reverse transcriptase PCR)
vlastní PCR předchází syntéza cDNA z mRNA pomocí RT
jako primer slouží GSP (gene specific primer) oligo dTrandom hexamer primer
hledání nových genů tvorba cDNA knihoven hledání mutací zjišťování síly exprese různých genů
vychází z RT-PCR
používá se k hledání celé sekvence nového genu
nutná alespoň částečná znalost sekvence hledaného genu
vhodné pro klonování genů a jeho následnou funkční expresi (GMO)
RACE PCR (rapid amplification of cDNA ends)
inverzní PCR Amplifikace neznámých segmentů DNA
asymetrická PCR sekvenace DNA, příprava hybridizačních sond
amplifikuje pouze jeden řetězec dsDNA
SEKVENCOVÁNÍ DNA•automatické sekvenátory využívající asymetrické PCR•jednozkumavková reakce•PCR s jedním primerem a dideoxyribonukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP)•dideoxyribonukleotidy značené 4 fluorescenčními markery•velice citlivé elektroforetické rozdělení v kapiláře•fluorometr s automatickým vyhodnocením
multiplex PCR více amplifikací v jedné
zkumavce
lékařská diagnostika
nested PCR 2 po sobě jdoucí PCR
zvyšování specificity PCR
long PCR amplifikace dlouhých úseků, polymerázové kokteily –
např. Klenowův fragment + Pfu polymeráza
Pwo polymeráza z Pyroccocus woesei
DNA polymeráza 5´-3´exonukleázováaktivita
3´-5´exonukleázováaktivita
délkaproduktu
f rekvence chyby
Taq + 3 kb 8.0 x 10-6
Pfu + 3 kb 1.3 x 10-6
Pwo + 3 kb 5.3 x 10-7
long PCR koktej l + + 20 kb 2.0 x 10-6
in situ RT PCR lokalizace translace a exprese
genů
real time PCR slouží k přesné kvantifikaci amplifikovaného produktu
využití fluorescence interkalačních barviv (etBr)
fluorometr je součástí termocykleru
Aplikace PCR a využití v praxi
DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ
1. detekce virových a bakteriálních onemocnění
Aplikace PCR a využití v praxi
DIAGNOSTIKA V MEDICÍNĚ
2. detekce geneticky vrozených chorob (mutace DNA)
- AS PCR alelicky specifická PCRprimer navžen tak, že mutace odpovídá konci primeru
fragmety DNA s nespárovanými konci se pohybují v elektrickém poli pomaleji
- Real time PCRpomocí fluorescenční sondy odpovídající mutaci
Např. detekce cystické fibrózy, choroba je podmíněná třínukleotidovou delecív genu CFTR cystic fibrosis transmembrane regulator
Aplikace PCR a využití v praxi
KRIMINALISTIKAVNRT – variable number of tandem repeat – vyskytují se na různých lokusech chromozomů a v populací kolísají mezi jedinci v počtu opakování mezi 4-40x např. GTGTGTGT
Aplikace PCR a využití v praxi
ANALÝZA POTRAVIN molekulárně-genetické zhodnocení surovin živočišného a rostlinného
původu, které byly vyprodukovány klasickým pěstováním (chovem) nebo s použitím genového inženýrství
průkaz falšování potravin druhovou záměnou (rostlinného i živočišného původu)
identifikace mikroorganismů kontaminující potraviny nebo geneticky změněných mikroorganismů používaných jako startovací nebo ochranné kultury v produkci potravin.
skot ovce prase koza TEST
EVOLUČNÍ BIOLOGIEORNITOLOGIE