Tesis completa Oscar

Universidad Tecnológica del Suroeste de Guanajuato Organismo Público Descentralizado del Estado de Guanajuato

REPORTE DE ESTADÍA

MAR BRAN S.A. DE C.V. PLANTA III

ELABORACION DE UN MANUAL PARA EL CONTROL DE

CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PARA OBTENER EL TÍTULO DE TÉCNICO SUPERIOR

UNIVERSITARIO EN PROCESOS AGROINDUSTRIALES

PRESENTA:

SOLIS PIZANO OSCAR URIEL

VALLE DE SANTIAGO, GTO. AGOSTO 2008

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Universidad Tecnológica del Suroeste de Guanajuato

Organismo Público Descentralizado del Estado de Guanajuato

REPORTE DE ESTADÍA

MAR BRAN S.A. DE C.V. PLANTA III

ELABORACION DE UN MANUAL PARA EL CONTROL DE CALIDAD EN EL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PARA OBTENER EL TÍTULO DE TÉCNICO SUPERIOR

UNIVERSITARIO EN PROCESOS AGROINDUSTRIALES

PRESENTA:

SOLIS PIZANO OSCAR URIEL

ASESOR EMPRESARIAL:

Lic. FRANSISCO GARCIA AGUAYO

ASESORES ACADÉMICOS:

Ing. FATIMA DEL CARMEN MOSQUEDA SERRANO

Ing. MIRIAM ESTELINA PÉREZ RIOS

GENERACIÓN 2006-2008



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MANUAL PARA EL CONTROL DE

CALIDAD EN EL

LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA



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i

DEDICATORIAS

Esta tesis es la suma de los esfuerzos realizados a lo largo de estos 2 años, no

solo de mi parte, sino también de ese equipo de personas que me apoyaron

durante toda mi preparación académica, por tal motivo me permito mencionar el

nombre de todas aquellas personas que creyeron en mí, por su apoyo y

dedicación:

Ángela González.

San Juana Montenegro.

Erika Geraldine Almanza Corrales.

Y a todas mis mascotas en especial al Asesino de Asesinos.

M. en C. Silvia Mendoza González.



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ii

AGRADECIMIENTOS

Señora Cristina Corrales Zamora y Señor Juan Almanza Alfaro.

Ing. Fátima del Carmen Mosqueda Serrano.

Lic. Isabel Pizano González.

Ing. Miriam Estelina Pérez Ríos

Lic. Francisco García Agûayo



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iii

i INDICE GENERAL

Sección Página

i. INDICE GENERAL .................................................................... iii

ii. RESUMEN ................................................................................... iv

iii. ABSTRACT ................................................................................ vi

I. INTRODUCCIÓN ........................................................................ 1

1.1 Antecedentes de la empresa ...................................................... 1

1.2 Justificación ................................................................................. 3

II REVISION DE LITERATURA................................................... 4

2.1 Sanidad ......................................................................................... 4

2.2 Actividades del Laboratorio........................................................ 12

III. OBJETIVOS ...............................................................................23

3.1 Generales......................................................................................23

3.2 Específicos ...................................................................................23

IV. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................24

4.1 Capacitación.................................................................................24

4.2 Investigación ................................................................................24

4.3 Elaboración del Manual ...............................................................24

V. RESULTADOS................................................................................... 25

VII. CONCLUSIONES....................................................................27

VIII. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................28

VIIII. ANEXOS .................................................................................29

Anexo 1 Manual para el Control de Calidad en el Laboratorio............30



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iv

ii. RESUMEN

El objetivo principal por el cual se decidió elaborar un Manual Para El Control

De Calidad En El Laboratorio De Microbiología, fue para mejorar la calidad en

las determinaciones microbiológicas realizadas en la empresa MAR BRAN S.

A. de C. V. PLANTA III, Esto se logro a partir de observar y analizar los

procedimientos empleados para dichas determinaciones, posteriormente se

realizo una investigación bibliográfica sobre las posibles mejoras y ajustes

pertinentes que se podrían emplear en el laboratorio de la empresa así mismo,

el manual se fracciono en 5 partes, las cuales se consideraron como los

puntos críticos a controlar:

a. Generalidades: En este punto se explica el marco teórico y el

objetivo del manual.

b. Personal: Aquí se describen las reglas que se deben seguir para

lograr el cumplimiento de un trabajo exitoso

c. Equipo: En este capitulo se determinan las condiciones de operación

y limpieza que deben seguir y cumplir los empleados para un optimo

aprovechamiento de los mismos.

d. Medios de Cultivo: Aquí se describen los controles cotidianos que se

deben tomar en cuenta para un mejor aprovechamiento de los

mismos, desde condiciones de almacenaje, controles de esterilidad,

pasando por pruebas de monitoreo de calidad del medio.

e. Sanitizantes: En esta parte se trata el tema de los factores que se

deben tomar en cuenta para la elección de un sanitizante, así como

las pruebas de calidad sugeridas para el monitoreo de su efectividad.



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v

iii. ABSTRACT

The principal aim by which a Manual was decided to elaborate For The Quality

control In The Laboratory Of Microbiology, it was to improve the quality in the

microbiological determinations realized in the company MAR BRAN S. A. de C. V.

PLANT III, This I manage from observing and to analyze the procedures used for

the above mentioned determinations, later I realize a bibliographical investigation

on the possible improvements and pertinent adjustments that might be used in the

laboratory of company likewise, the manual I divide in 5 parts(reports), which were

considered to be the critical points of controlling:

1. Generalities: In this point is explained the theoretical frame and the aim of the

manual.

2. Workers: Here there are described the rules that must follow to achieve the

fulfillment of a successful work

3. I equip: In this chapter there decide the conditions of operation and cleanliness

that they must follow(continue) and the personnel expire for an ideal utilization of

the same ones.

4. Means of Culture: Here there are described the daily controls that must be

taken in bill for a better utilization of the same ones, from conditions of storage,

controls of sterility, happening(passing) for tests(proves) of quality monitoring of

the way.

5. Disinfectants: In this part there treats itself the topic of the factors that must be

taken in bill for the election of a disinfectant , this way as the qualities tests(proves)

suggested for the monitoring of his efficiency.



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1

I. INTRODUCCIÓN

1.1. Antecedentes de la Empresa

MAR BRAN se fundó legalmente un 30 de abril de 1964 en la ciudad de Irapuato

Guanajuato. Los iniciadores de esta empresa fueron: El Sr. José Martínez de

México y el Sr. Othal Bran de Estados Unidos.

De allí el nombre Mar Bran.

Mar Bran inicio operaciones en proceso de la fresa y a final de la década de los 60

cambió al proceso de productos vegetales, ramo en el que se mantiene

actualmente.

Entre los productos que vende Mar Bran se encuentra: Brócoli, Zanahoria,

Calabaza Verde, Calabaza Amarilla, Coliflor, Chíncharo en Vaina, entre otros.

Los productos de Mar Bran en su gran mayoría se exportan a Estados Unidos

aunque también se tiene presencia en Japón, Canadá y la comunidad Europea.

Los directivos de Mar Bran están concientes de la necesidad de mantener a la

empresa competitiva y han definido en base a su propuesta de valor su estrategia

para lograrlo.

El factor humano es la piedra angular para lograr que el conocimiento y la

tecnología den como resultado en una competitividad superior, por ello Mar Bran

ha creado un programa de capacitación, adiestramiento y formación humana que

le da sustento a un proceso permanente de educación integral, que tiene como

objetivo un cambio personal para ser cada vez mas responsables en cualquier

área de la vida.



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2

1.1.1 Política de calidad

En su versión corta:

�Dar una completa satisfacción a nuestros clientes�

Mar Bran tiene dos tipos de clientes:

El cliente interno:

Se refiere a quien se le esta brindando un servicio dentro de la empresa buscando

su satisfacción con el trabajo realizado.

El cliente externo:

Es Mar Bran USA

1.1.2 Misión

El propósito de Mar Bran es su constante crecimiento y mejora continua como

empresa cuyo objetivo principal es crear riqueza para asi satisfacer:

1. A sus trabajadores

2. Accionistas

3. A sus clientes

4. A los requerimientos del medio ambiente y la comunidad

1.1.3 Visión

Ser una compañía consolidada, financieramente fuerte, líder en el mundo, la mejor

en su segmento de mercado. Una compañía de clase mundial formada de gente

responsable y competente que logre una explosión de éxito haciendo lo ordinario

de forma extraordinaria.



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1.1.4 Valores

Trabajo en equipo

Educación de sus trabajadores

Plena satisfacción de los usuarios

Darle sentido y valor al trabajo bien hecho

El compromiso en el logro de los objetivos

Resultados económicos de la organización

La capacidad de innovar y cambiar

1.2 Justificación

El presente proyecto se elaboro con la finalidad de poseer un mejor control en los

distintos factores que pudiesen repercutir directa o indirectamente en las

determinaciones y análisis realizados en el laboratorio de microbiología, además

de garantizar una mejor calidad y veracidad de los resultados obtenidos. Cabe

mencionar que dicho manual puede ser de gran utilidad durante las auditorias

internas y externas que se realizan continuamente a MAR BRAN S. A DE C. V

planta III.



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II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Sanidad

2.1.1 Historia

Históricamente, los microorganismos han sido vistos de manera negativa a causa

de su asociación con muchas enfermedades humanas. Sin embargo, los

microorganismos patológicos son un porcentaje minoritario dentro del total de

microorganismos, la mayoría de los cuales desempeñan papeles absolutamente

imprescindibles y que de no existir harían inviable la vida en la Tierra. Algunos

ejemplos son las bacterias que fijan nitrógeno atmosférico (posibilitando la vida de

los organismos vegetales), las bacterias del ciclo del carbono (indispensables para

reincorporar al suelo la materia orgánica) o la multitud de microorganismos que

viven de manera simbiótica en nuestro tubo digestivo, sin las cuales la digestión

no sería viable. Así pues, los "organismos superiores" (animales, plantas...) no

pueden vivir de no ser por las funciones desempeñadas por estos seres

microscópicos. Además, tienen amplias aplicaciones en el terreno industrial, como

las fermentaciones (p.e. para la producción de bebidas alcohólicas o productos

lácteos), la producción de antibióticos o la de otros productos de interés

farmacéutico o biotecnológico (hormonas, enzimas,...). Finalmente, cabe también

destacar el papel esencial que los microorganismos juegan en los laboratorios de

investigación biológica de todo el mundo como herramientas para la clonación de

genes y la producción de proteínas. (2000 ICMSF)

2.1.2 Importancia

Autoridades sanitarias en diferentes países del mundo consideran prioritario

establecer políticas de inocuidad en los alimentos de origen pecuario, mediante la

aplicación de sistemas que minimicen los riesgos de contaminación, desde las

unidades de producción hasta la transformación de la materia prima, para

disminuir la incidencia de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA´s) en la

población.



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5

Durante el procesamiento de los alimentos existen diferentes factores que pueden

ser causa de contaminación accidental o inducida, pueden ser físicos, químicos o

microbiológicos; la materia prima alimenticia, es un excelente medio de cultivo

para toda clase de microorganismos debido a la cantidad de nutrientes que posee,

además si cuenta con un pH cercano a la neutralidad; es por ello que, desde el

momento de la llegada del producto al consumidor, deben mantenerse una serie

de condiciones que impidan el crecimiento de microorganismos patógenos que

alteren las características organolépticas y apariencia del producto haciéndolo

inaceptable para su consumo y que pueda significar un riesgo para la salud del

consumidor.

En este sentido la Dirección General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y

Pesquera, del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria

(SENASICA) y el Consejo Mexicano de la Carne han elaborado el Manual de

Buenas Prácticas de Manufactura y Procedimiento Operacional de Sanitización

Estándar dirigido a la Industria Empacadora, con objeto de incorporar buenas

prácticas y obtener un producto con características sanitarias satisfactorias que no

generen daño a la salud del consumidor.

¿Qué entendemos por Higiene Alimentaria?

Según la Organización Mundial de la Salud, la higiene alimentaría comprende

todas las medidas necesarias para garantizar la inocuidad sanitaria de los

alimentos, manteniendo a la vez el resto de cualidades que les son propias, con

especial atención al contenido nutricional.

La Higiene de los alimentos abarca un amplio campo que incluye la cría,

alimentación, comercialización y sacrificio de los animales así como todos los

procesos sanitarios encaminados a prevenir que las bacterias de origen humano

lleguen a los alimentos.



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¿Qué factores intervienen en las alteraciones de tipo microbiológico?

Los microorganismos están presentes en el ambiente vital del hombre (agua,

suelo, aire, etc.), en el propio hombre y en todos los seres vivos, plantas o

animales. La contaminación de alimentos se produce desde cualquiera de estas

fuentes, más tarde las operaciones de procesado y distribución proporcionan

nuevas posibilidades de contaminación.

No todos los microorganismos que contaminan los alimentos crudos tienen la

misma importancia sanitaria, unos se denominan microorganismos alterantes,

responsables del deterioro y cambios en los caracteres sensoriales de los

alimentos y el resto corresponde a microorganismos patógenos o causantes de

infecciones e intoxicaciones alimentarías; a diferencia de los anteriores, los

alimentos que los contienen no presentan por lo general signos claros de

alteración, lo que permite el que puedan ser consumidos sin que la contaminación

sea evidente.

Evitar la contaminación de alimentos crudos resulta difícil, por lo que las medidas

prácticas deben dirigirse a inhibir o reducir el desarrollo de los microorganismos

contaminantes, asegurando así la calidad microbiológica de los productos

alimenticios. Al plantear la inhibición del crecimiento microbiano se debe

considerar que no toda contaminación tiene el mismo significado, las

características de cada alimento influyen en la multiplicación microbiológica,

mientras que unos alimentos se alteran con facilidad, otros con idénticas

condiciones, permanecen estables. También cabe destacar que cada grupo de

alimentos se altera por la acción de unos microorganismos específicos.

¿Qué factores, posibilitan o dificultan el crecimiento microbiano en los

alimentos?

Pueden agruparse en:



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Factores intrínsecos: se refieren a las propiedades físicas y a la composición

química del propio alimento: actividad de agua, pH, nutrientes, potencial de

oxidación y estructura del producto alimentario.

Factores extrínsecos: características del ambiente donde se almacena el

alimento: temperatura, humedad y tensión de oxígeno.

Tratamientos tecnológicos a que haya sido sometido el alimento, físicos o

químicos, modifican la microbiota inicial y repercuten también en la composición

del producto final. ( Press, 1997)

Factores implícitos: relaciones que se establecen entre los microorganismos

presentes en los alimentos.

De estos factores, la actividad de agua, el pH del alimento y la temperatura

ambiental tienen especial relevancia.

Actividad de agua (Aw) o proporción presente en un alimento: a valores

elevados de Aw (cociente que oscila entre 0 y 1) , superiores a 0,98, la mayoría de

los microorganismos encuentran condiciones óptimas de desarrollo. Por debajo de

0,87, se inhibe el desarrollo bacteriano y de la gran parte de las levaduras y

únicamente los mohos pueden proliferar.

Productos frescos como carnes, pescados, huevos, leche o frutas tienen actividad

de agua superiores a 0,970, lo que explica la corta vida útil de estos alimentos. El

bajo valor de este parámetro en harinas, legumbres o pasta italiana proporciona,

por el contrario, estabilidad en estos productos

Los alimentos presentan siempre microorganismos en su superficie o en su

interior. Estos microorganismos pueden ser, atendiendo a su origen, endógenos

(ya presentes en el interior de las estructuras del alimento donde pueden provocar



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http://www.saludalia.com/servlet/ServletConsultaDefinicion?idTermino=1241&Termino=PH+

http://www.saludalia.com/servlet/ServletConsultaDefinicion?idTermino=1004&Termino=Levaduras+


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zoonosis, enfermedades animales no transmisibles al hombre y enfermedades

vegetales no transmisibles al hombre) o exógenos (se incorporan al alimento

durante su manipulación y procesado); y, atendiendo a su relación con el

consumidor, pueden ser agentes patógenos o alterantes (saprófitos). Los agentes

endógenos o son inocuos (patógenos de plantas) o son eliminados en mataderos

(animales enfermos) o durante el procesado (pasteurización) (Press, 1997)

En cualquier caso, los alimentos son una vía importante de transmisión de

microorganismos que pueden causar infecciones e intoxicaciones que, en general

tienen un tiempo de incubación corto (de 2 a 10 horas) y suelen cursar con

síndromes gastrointestinales. Puesto que algunas de estas patologías tienen una

DMI (dosis mínima infectiva) muy baja es muy necesaria la higiene de los

alimentos y de los procesos de elaboración.

La incidencia real de las toxiinfecciones no está clara por que solo se declara un

10 % de estas enfermedades entre las que se encuentran salmonelosis, shigelosis

o disentería bacilar, gastroenteritis por Escherichia coli enteropatógeno, enteritis

causada por Yersinia enterocolitica, diarreas por Vibrio parahaemolyticus y por

otros vibrios próximos al V. cholerae, enteritis causadas por Campylobacter,

enteritis producidas por Bacillaceae, intoxicaciones alimentarias agudas como el

botulismo (intoxicación por Clostridium botulinum) y la intoxicación estafilocócica,

intoxicaciones alimentarias crónicas causadas por hongos, virosis transmitidas por

alimentos como la hepatitis de tipo A, enfermedades causadas por protozoos y

transmitidas por alimentos y enfermedades causadas por helmintos.

Aisladamente cada una de las patologías anteriores puede prevenirse mediante un

tratamiento adecuado del alimento; sin embargo hay que extremar este cuidado

cuando se trata de producción de alimentos o comidas a gran escala puesto que

en estas condiciones es más factible una contaminación que produce un elevado

número de víctimas. (Press, 1997)



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2.1.3 Puntos críticos: análisis y tratamiento

En la elaboración de un alimento se pueden identificar una serie de pasos en los

que puede producirse la contaminación del alimento por microorganismos o en los

que los microorganismos ya presentes en el alimento pueden multiplicarse con

mayor facilidad. Estos pasos del proceso se denominan puntos críticos y sobre

ellos hay que actual a la hora de mejorar las características microbiológicas del

alimento en cuestión.

Un producto tiene buena calidad microbiológica cuando sus cargas microbianas

son reducidas y constantes (esto es, no presentan variaciones estacionales o de

cualquier otro tipo de periodicidad que impiden que el producto sea homogéneo a

lo largo del tiempo).

Para lograr un aumento de la calidad microbiológica de un alimento lo que hay que

hacer es determinar en la Industria cuáles son los críticos del proceso y evitarlos

siguiendo un código estricto de Buenas Prácticas de Elaboración y Distribución del

alimento (BPE).

La prevención, por tanto, está en evitar manufacturar productos de baja calidad

microbiológica y no en comprobar la calidad microbiológica de los ya elaborados

(lo que, por otra parte, presenta una relación coste - beneficio muy baja por la gran

cantidad de muestras que es necesario analizar).

En el desarrollo de las BPE hay que hacer un análisis del riesgo consistente en

determinar el peligro para la salud humana de un factor patógeno presente en un

alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores infinitesimales

por medios tecnológicos. Este riesgo depende de la DMI (Dosis Mínima Infectiva)

del microorganismo y de los valores del mismo que se encuentren en el alimento;

asimismo hay que valorar la carga inicial de microorganismos en cada una de las

raciones del alimento, y el número de raciones o partes consumidas por la

población en un determinado tiempo. (Press, 1997)



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Los microbiólogos han hecho contribuciones fundamentales a la biología y

medicina, especialmente en los campos de la bioquímica, genética y biología

celular. Los microorganismos tienen muchas características que los hacen

organismos modelo ideales:

Son pequeños, por lo cual no consumen muchos recursos.

Algunos tienen tiempos de generación muy cortos (el tiempo necesario para

que una célula bacteriana se divida en dos en condiciones óptimas es de 30

minutos aprox. para E. coli y de 12 a 24 horas para Mycobacterium

tuberculosis).

Las células pueden sobrevivir fácilmente separadas de otras células.

Los eucariontes unicelulares se reproducen por división mitótica y los

procariontes mediante fisión binaria. Esto permite la propagación de

poblaciones clónicas genéticamente iguales.

Pueden permanecer congelados por grandes períodos de tiempo. Aún y

cuando el 90% de las células mueran en el proceso de congelación, existen

millones de células en cada mililitro de líquido corporal.

La extensiva caracterización de microbios ha permitido que éstos sean usados en

la industria como herramientas experimentales en diferentes ramas de la biología.

Los alimentos pueden ser vehículos potenciales para la Transmisión de diversos

microorganismos y de metabolitos de origen microbiano, muchos de los cuales

son patógenos para el hombre, motivo por el cual se hace indispensable disponer

de metodologías que permitan garantizar la inocuidad de los productos destinados

al consumo humano y animal. Esta metodología es proporcionada por la

Microbiología de los Alimentos, la cual entre otros aspectos, abarca dos campos

bien definidos: a) Salud Pública, cuando se usa para proteger al consumidor frente

a las enfermedades de origen microbiano y b) Conservación del Alimento, cuando



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se emplea en la prevención de las alteraciones de estos productos debidas a los

microorganismos.

Cuando es la salud del consumidor la que está expuesta a riesgo, la legislación

sobre la calidad microbiológica de los alimentos debería ser exigente y muy

severa. Por otro lado, las industrias de alimentos de cualquier origen, están

expuestas a sufrir grandes pérdidas económicas como consecuencia de la

descomposición de las materias primas y/o de los productos terminados, por

acción de diversos agentes microbianos.

En ambos casos, dichas industrias deberían cumplir con las normas

microbiológicas establecidas y si éstas no existen, adoptar prácticas adecuadas de

manipulación, fabricación y distribución, a fin de evitar en lo posible, brotes de

intoxicaciones alimentarías.

Las mismas les podrían acarrear graves repercusiones y responsabilidades que,

por su propia naturaleza, son difíciles de afrontar.

La delimitación de las áreas antes señaladas, determina tres situaciones

esenciales en Microbiología de los Alimentos: 1 ) los alimentos que contienen

microorganismos patógenos o niveles altos de toxinas microbianas capaces de

causar cuadros clínicos en el consumidor, por lo general no presentan signos de

alteración que contraindiquen su consumo; 2) generalmente, las medidas que se

toman para controlar el crecimiento de agentes patógenos, no son las mismas que

se emplean para evitar el desarrollo de los microorganismos causantes de las

alteraciones organolépticas del producto y 3) en otros casos, las medidas tomadas

para reducir o inhibir el crecimiento de microorganismos alterantes e infecciosos

de naturaleza bacteriana y micótica no sanean el alimento, por cuanto las mismas

no previenen la presencia de patógenos como virus, protozoos y helmintos, los

cuales aunque no se multipliquen en los alimentos, pueden conservar su poder

infectivo. Aún más, algunas toxinas provenientes de bacterias pueden resistir los



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tratamientos conducentes a la eliminación de microorganismos alterantes y

patógenos y en consecuencia, persistir en los alimentos. (Press, 1997)

Como se puede apreciar de lo expuesto anteriormente, la contaminación de los

alimentos es difícil de evitar. El verdadero peligro ocurre cuando las bacterias

patógenas logran multiplicarse en el alimento y causan trastornos en la salud del

consumidor. He aquí la responsabilidad del microbiólogo de alimentos, quien debe

detectar a tiempo la anomalía, identificar los agentes infecciosos y velar porque

ese producto no salga al mercado hasta tanto se tenga la seguridad de que está

apto para el consumo. Con este fin, debe llevarse un control periódico de la

población microbiana deseada en aquellos alimentos fermentados o madurados,

para distinguir entre microorganismos alterantes y la flora propia del aumento; así

mismo, es necesario controlar la influencia de ciertos factores, tales como los

ambientales, que pueden ser fuente de contaminación de los alimentos

En términos generales, puede decirse que se cuenta con suficientes

conocimientos científicos y tecnológicos para producir alimentos de excelente

calidad microbiológica pero, sin embargo, siguen apareciendo brotes de

infecciones e intoxicaciones alimentarías y los industriales continúan teniendo

pérdidas cuantiosas por la alteración microbiana de sus productos.

El problema parece residir, fundamentalmente, en que no se cumplen a cabalidad

las normas sanitarias establecidas para la manipulación de la materia prima con la

cual se elabora el alimento, y en que los industriales siguen considerando

erróneamente, que el control de la calidad microbiológica de sus productos, les

resulta muy dispendioso tanto en tiempo como económicamente. (Villalobos, 1987)

La calidad no se crea, elabora o fabrica en el departamento de calidad ni en un

laboratorio. No se introduce al producto mediante la inspección. El control de la

calidad de un alimento se efectúa en un laboratorio donde se verifica la inocuidad

del mismo para la salud humana o animal.



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Se realizan una serie de pruebas que califican la calidad física e higiénica por

medio de la presencia o ausencia de determinados microorganismos.

Calidad microbiológica de alimentos elaborados, no elaborados y crudos

La manipulación de los alimentos durante su etapa de elaboración y expendio es

una de las fuentes mas frecuentes de contaminación por microorganismos

patógenos que convierten a los mismos no aptos para el consumo humano, en

especial cuando es de consumo masivo, no tiene un proceso de cocción y las

condiciones de conservación no son las apropiadas, espacios no refrigerados.

(Pucciarelli, 2000 )

2.2 Actividades en laboratorio

El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras

secciones un trabajo de equipo. La actitud ante las prácticas seguras de cada

uno de los integrantes del departamento, determinan su propia seguridad, así, tu

seguridad es la seguridad de todos.

Por otra parte, el equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología es

parte fundamental en el esfuerzo de protección de los empleados en el ejercicio

de sus labores.

Las características especiales del trabajo en la sección de Microbiología, hacen

imperante un Manual que sirva de guía a los analistas en su trabajo diario. La

eficacia en la formación de los programas es seguridad para la calidad de los

análisis efectuados.

El propósito de este Manual es describir la metodología a seguir en un programa

de seguridad en microbiología y aseguramiento de calidad en las

determinaciones, tal que sea una guía para el trabajo seguro en el laboratorio

que envuelve microorganismos potencialmente peligrosos.



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14

Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las

personas involucradas tienen la obligación de conocer cuáles son las normas de

seguridad a seguir en el laboratorio de manera que el trabajo se realice con un

riesgo mínimo. (Marucci, 1995)

Es de esperar que el conjunto de microorganismos de las hortalizas cultivadas en

campo refleje el de los terrenos en los que se cultivan, aunque existen

excepciones, además de que la exposición del conjunto de los productos

vegetales al ambiente proporciona muchas oportunidades para la contaminación

por microorganismos.

(Jay, 2002)

En la actualidad, ya no basta que los alimentos no contengan gérmenes

patógenos para el consumidor, lo que se genera por supuesto, si no que se exige

reúnan una calidad bacteriológica determinada y que cumplan con las normas

microbiológicas establecidas, es necesario contar con técnicas adecuadas que

permitan determinar las especies y grupos de microorganismos presentes en

estos productos. (ICMSF, 2000)

Para cumplir con los objetivos de un criterio microbiológico deben considerarse loa

factores siguientes, tal como se establecen a continuación.

La evidencia de riesgo para la salud.

Microbiología de la materia prima.

El efecto del tratamiento en la microbiología del alimento.

La probabilidad y consecuencia de la contaminación microbiana o

crecimiento de los microorganismos durante las posteriores manipulaciones

y almacenamiento.

Tipo de consumidor sometido al riesgo. (ICMSF, 1999)

2.3 Principales Microorganismos Presentes en los Alimentos



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2.3.1 Listeria monocytogenes

Dominio: Bacteria

Filo: Firmicutes

Clase: Bacilli

Orden: Bacillales

Familia: Listeriaceae

Género: Listeria

Especie: L. monocytogenes

Listeria monocytogenes es un bacilo que responde positivamente a la tinción de

Gram, es aerobio, produce catalasa y no presenta cápsula ni espora. Es móvil a

25 ºC pero inmóvil a 37 ºC por inactivación del flagelo. Produce la fermentación

láctica y bacteriocinas (toxinas capaces de matar a otras bacterias).

Características

Se han aislado asociados a enfermedades en peces, aves y mamíferos. En el

hombre se trata de una enfermedad profesional (personas que trabajan con

animales) y también se transmite por alimentos, sobre todo leche y derivados

lácteos, también por el consumo de verduras consumidas en crudo sin antes

haberse desinfectado.

Puede provocar abortos, meningoencefalitis y meningitis especialmente en

neonatos, ancianos e inmunodeprimidos.

Bacteriemia en mujeres gestantes, inmunodeprimidos y neonatos (granulomatosis

infanto-séptica).



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Prevención

Es necesario un control exhaustivo en todas las fases. En las empresas

alimentarias se debe implantar un programa de autocontrol de los procesos según

el Sistema APPCC: - En la granja hay que controlar el ensilado para que acidifique

cuanto antes, porque en el medio ácido la bacteria se desarrolla muy mal. �

Almacenar la leche a menos de 4 ºC, para evitar el desarrollo microbiano. �

Durante el procesado de los alimentos se debe evitar la contaminación cruzada,

evitando que contacten los alimentos ya cocinados con los crudos. � El trabajador

que tenga síntomas de padecer la enfermedad debe abstenerse de manipular

alimentos. � Se deben cocinar los alimentos a temperaturas elevadas y durante el

tiempo suficiente. � Los vegetales se deben lavar y desinfectar si se van a

consumir crudos. � Es de suma importancia su control en la industria cárnica,

evitando contaminaciones cruzadas de la canal con materias fecales durante el

sacrificio de los animales. � La bacteria crece con relativa facilidad a temperaturas

bajas, por ello es importante que los equipos de refrigeración funcionen dentro de

unos rangos de temperatura menores de 4ºC.

2.3.2 Escherichia coli

E. coli es quizás el organismo procarionte más estudiado por el ser humano, se

trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales �

incluido el humano� y por ende en las aguas negras. Fue descrita por primera

vez en 1885 por Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la denominó

Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia

coli, en honor a su descubridor. Ésta y otras bacterias son necesarias para el

funcionamiento correcto del proceso digestivo. Además produce vitaminas B y K.

Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram, es anaerobio

facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas,

es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.



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Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y

biotecnología molecular.

Reino: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Gamma Proteobacteria

Orden: Enterobacteriales

Familia: Enterobacteriaceae

Género: Escherichia

Especie: E. coli

2.3.3 E. coli O157:H7

Artículo principal: Escherichia coli O157:H7

La Escherichia coli O157:H7 es una de cientos de cepas de la E. coli. Aunque la

mayoría de las cepas son inocuas y viven en los intestinos de los seres humanos y

animales saludables, esta cepa produce una potente toxina y puede ocasionar una

enfermedad grave.

La E. coli O157:H7 fue reconocida inicialmente como causa de enfermedad en

1982 durante un brote de diarrea aguda con sangre; el brote determinó que se

debía a hamburguesas contaminadas. Desde entonces, la mayoría de las

infecciones han provenido de comer carne de vacuno molida insuficientemente

cocinada. Robin Cook escribió un libro sobre el tema titulado Toxina

En 1996, cerca de Seattle se produjo un brote a causa de esta bacteria, que se

encontró en botellas de zumo de manzana de la marca Odwalla. Muchas

personas, entre ellas bebés y niños, murieron después de tomar este zumo. La



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18

bacteria entró en las botellas porque las manzanas que se exprimieron contenían

excrementos de venados de la zona y no hubo ningún tipo de pasteurización.

Se diferencia de las otras E. coli en que no fermenta el sorbitol, no crece a 44 °C y

no produce â-glucoronidasa. La combinación de letras y números en el nombre de

la bacteria se refiere a los marcadores antigénicos específicos que se encuentran

en su superficie y la distingue de otros tipos de E. coli:

El antígeno somático O, proveniente del lipopolisacárido de la pared celular;

El antígeno flagelar H, compuesto por 75 polisacáridos.

El grupo de riesgo comprende prácticamente a todas las personas

inmunocompetentes o no. Los niños menores de 5 años de edad con problemas

de alimentación, así como los ancianos son los más susceptibles de contraer

complicaciones graves.

2.3.4 E. coli enteropatogénica (ECEP)

Escherichia coli enteropatógena (ECEP) es el agente causal predominante de

diarrea en niños que viven en países en vía de desarrollo. ECEP interacciona con

las células epiteliales produciendo una lesión histopatológica característica

conocida como �adherencia / destrucción� o lesión A/E (attaching and effacing). En

la producción de la lesión A/E por ECEP, se observan cambios importantes en el

citoesqueleto de la célula hospedera, los cuales incluyen a la acumulación de

actina polimerizada formando una estructura parecida a una copa o pedestal. La

adherencia inicial está relacionada a la producción de la fimbria BFP (Bundle

Forming Pilus), el cual se requiere para la producción de diarrea por ECEP. La

expresión de la fimbria BFP de Escherichia coli Enteropatógena (ECEP),

codificada en el operón BFP, responde positiva o negativamente a señales

ambientales que pudieran encontrarse en el hospedero y determinar la adherencia

bacteriana a la superficie de las células del epitelio intestinal.



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19

La regulación coordinada de estos genes involucrados en la patogénesis es una

necesidad importante para la adaptación de las bacterias patógenas a los

diferentes ambientes encontrados dentro del hospedero durante la infección. La

expresión de los factores de virulencia de EPEC, en respuesta a señales

ambientales, podría involucrar una red compleja de interacciones entre

reguladores transcripcionales específicos y globales a través de un circuito

regulador iniciado con la activación del operones BFP y perABC (bfpTVW) por

PerA (BfpT), el cual podría estar detectando las señales del medio, actuando

como regulador maestro y PerC (bfpW) como segundo regulador al activar la

expresión del operón LEE1. Debido a la potencial importancia de PerA como factor

regulador para los determinantes de virulencia de EPEC, estamos interesados en

el estudio de los mecanismos moleculares de la función de PerA (BfpT) como

activador de su propia expresión y la del operón bfp. Este regulador podría poseer

dominios estructurales que estén involucrados en la unión a DNA, interacción con

la RNA polimerasa, interacción con otras proteínas reguladoras que actúen como

correguladores para inducir la expresión de los operones bfp y perABC (bfpTVW).

Mientras que la unión a DNA ha sido bien caracterizada en varios miembros de la

familia AraC/XylS, la activación transcripcional por proteínas de esta familia es

menos comprendida. Varios de los miembros de esta familia activan factores de

virulencia en patógenos bacterianos y por ende son interés como posibles blancos

de agentes antibacterianos CHPG.

2.3.5 E. coli enterotoxigénica (ECET)

Se parece mucho a V. cholerae, se adhiere a la mucosa del intestino delgado, no

la invade, y elabora toxinas que producen diarrea. No hay cambios histológicos en

las células de la mucosa y muy poca inflamación. Produce diarrea no

sanguinolenta en niños y adultos, sobre todo en países en vías de desarrollo,

aunque los desarrollados también se ven afectados.



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20

2.3.6 E. coli enteroinvasiva (ECEI)

Es inmóvil, no fermenta la lactosa. Invade el epitelio intestinal causando diarrea

sanguinolenta en niños y adultos. Libera el calcio en grandes cantidades

impidiendo la solidificación ósea, produciendo artritis y en algunos casos

arterioesclerosis.

2.3.7 E. coli enterohemorrágica o verotoxigénica (ECEH)

Produce verotoxinas que actúan en el colon. Sus síntomas son: primero colitis

hemorrágica, luego síndrome hemolítico ureico (lo anterior más infección del riñón,

posible entrada en coma y muerte), y por último, púrpura trombocitopénica

trombótica (lo de antes más infección del sistema nervioso central). Esta cepa no

fermenta sorbitol y posee un fago, donde se encuentran codificadas las

verotoxinas, también llamadas "Toxinas Shiga", no posee fimbria formadora de

mechones, en vez de esto posee una fimbria polar larga que usa para adherencia.

2.3.8 E. coli enteroagregativa (ECEA)

Los estudios realizados sobre la capacidad adherente de la E. coli a células

heterohaploides (HEp-2) muestran que, además de la adherencia localizada,

existen otros 2 mecanismos: uno llamado difuso, que se produce cuando las

bacterias se unen al citoplasma celular, y otro agregativo, que se forma cuando las

bacterias se acumulan en forma de empalizada tanto en la superficie celular como

en el vidrio de la preparación.

Estudios recientes han definido algunas características de estas cepas, como es el

fenómeno de la autoagregación, que está determinado por un plásmido de 55 a 65

mdaltons, que codifica para una fimbria de adherencia, un lipopolisacárido

uniforme y una nueva enterotoxina termoestable (TE) denominada toxina

enteroagregativa estable (TEAE). Se han detectado algunas cepas que elaboran

una segunda toxina termolábil antigénicamente relacionada con la hemolisina de



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21

E. coli, la cual puede causar necrosis de las microvellosidades, acortamiento de

las vellosidades intestinales e infiltración mononuclear de la submucosa.

La capacidad de las cepas de E. coli enteroagregativa (ECEAgg) para sobrevivir

largo tiempo en el intestino humano y la producción de una o más de las toxinas

descritas, pudiera explicar la persistencia de las diarreas por ellas producidas. Se

han aislado cepas de ECEAgg en niños con diarrea con sangre, aunque en la

actualidad se desconoce si existen diferentes cepas agregativas relacionadas con

diarreas persistentes u otras en relación con diarrea con sangre.

Estudios recientes muestran la existencia de una toxina que es capaz de producir

lesiones hemorrágicas severas cuando se inoculan ratas con la toxina purificada.

Esto pudiera apoyar la capacidad de cepas de ECEAgg para causar diarrea con

sangre en humanos. Estudios realizados en México identifican el 51 % de

pacientes con diarrea persistente como portadores de ECEAgg y sólo el 5 % en

niños asintomáticos CHPG.

2.3.9 E. coli Adherencia difusa (ECAD)

Se adhiere a la totalidad de la superficie de las células epiteliales y habitualmente

causa enfermedad en niños inmunológicamente no desarrollados o mal nutridos.

No se ha demostrado que pueda causar diarrea en niños mayores de un año de

edad ni en adultos.

2.3.10 Salmonella es un género de bacterias que pertenece a la familia

Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos,

con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula ni esporas. Son bacterias

móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H2S). Fermentan glucosa por poseer

una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa.

Es un agente zoonótico de distribución universal. Se transmite por contacto directo

o contaminación cruzada durante la manipulación, en el procesado de alimentos o

en el hogar, también por vía sexual.



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22

Algunas salmonellas son comunes en la piel de tortugas y de muchos reptiles, lo

cual puede ser importante cuando se manipulan a la vez este tipo de mascotas y

alimentos.

Reino: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Gamma Proteobacteria

Orden: Enterobacteriales

Familia: Enterobacteriaceae

Género: Salmonella

Epidemiología

La Salmonella recibe su nombre por Daniel Elmer Salmon, un patólogo veterinario

norteamericano, aunque fue su colega Theobald Smith (conocido por su trabajo

con anafiláxis) quien descubrió la bacteria por primera vez en 1885, aislándola de

cerdos con cólera. La salmonela entérica causada por Salmonella typhimurium,

con más de 2.000 cepas descritas, es de importancia en países en desarrollo,

donde su incidencia está en aumento, y en algunos países, la enfermedad es

endémica.

La salmonelosis es una enfermedad de transmisión alimentaria, en especial por

alimentos de origen animal y pueden aparecer en brotes en escuelas, guarderías,

restaurantes y residencias de ancianos. El período de incubación es por lo general

entre 12 a 36 horas, a veces hasta 6 y 48 horas. El único reservorio de la

Salmonella typhi es el hombre, de modo que se transmite de una persona a otra.

En el caso de la Salmonella, es necesaria una inoculación relativamente grande,

entre 10 a 100 millones de organismos, para provocar los síntomas en humanos

saludables, segÚn estudios hechos con voluntarios,al ser estas bacterias muy



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23

poco resistentes a los medios ácidos. Sin embargo, un pH estomacal

artificialmente elevado, poco ácido, reduce enormemente el número de

organismos necesario para provocar síntomas (de 10 a 100 órdenes de magnitud).

La fiebre paratifoidea tiene ciertas similaridades con la fiebre tifoidea, pero tiene un

curso más benigno. Las infecciones por S. Paratyphi A son comunes en África, la

paratifoidea B es más frecuente en Europa que se presenta como una

gastroenteritis severa y la paratifoidea C es una infección rara, generalmente vista

en el Extremo Oriente que se presenta como una septicemia. La salmonella habita

normalmente en la superficie de los huevos, la piel de tomates y de aquellos frutos

y verduras que tienen contacto con la tierra.



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24

III. OBJETIVOS

3.1 General

Elaborar un manual para el control de calidad en el laboratorio de microbiología

para Mar Bran Planta III.

4.2 Objetivos específicos

a) Adquirir conocimiento sobre las actividades y determinaciones que

se realizan diariamente en el laboratorio de microbiología.

b) Investigar teóricamente los distintos factores que intervienen en los

resultados de un análisis microbiológico

c) Realizar recopilación de información útil y aplicable a las condiciones

de laboratorio de microbiología de Mar Bran planta III



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25

IV. MATERIALES Y METODOS

Capacitación

Recibir curso de inducción en las áreas de proceso y control de calidad

por parte de la empresa MAR BRAN S. A. DE C. V., PLANTA III.

Conocer las actividades referentes a los métodos de análisis

microbiológicos aplicados en la empresa.

Verificar el funcionamiento de los equipos de laboratorio principales

utilizados para los análisis microbiológicos.

Investigación

Comparar los distintos Manuales de Laboratorio implementados en otras

empresas.

Conocer los puntos críticos de control (PCC) de los análisis

microbiológicos.

Definir los temas a incluir en el Manual del Laboratorio a partir de la

detección de los PCC.

Conocer el reglamento existente para acceso al laboratorio de

microbiología.

Conocer las normas aplicables a laboratorios y materiales usados en

microbiología.

Elaboración de Manual

Actualizar el reglamento existente conforme a las actividades que en él

se realizan

Redactar los capítulos del manual en base a las actividades de los

analistas y de los análisis realizados.



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26

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Se recibió capacitación dentro de la empresa referente a los procesos de

producción, seguridad e higiene, requisitos de HACCP y Control Microbiológico.

Las listas de asistencia a estos cursos de capacitación los mantiene la empresa

bajo su resguardo.

5.2 De los manuales consultados de otras empresas, se encontró coincidencia en

los siguientes puntos:

Requisitos del personal

Funcionamiento y control del Equipo de análisis usado en laboratorio

Control preventivo de los medios de cultivo

5.3 De la observación de las actividades realizadas en el Laboratorio de

Microbiología se encontraron los siguientes PCC:

Control de esterilidad tanto de medios como de equipo y superficies.

Equipo de protección personal de los involucrados en el laboratorio.

Calibración y operación de los equipos utilizados para análisis.

Aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura en cuanto a los análisis.

5.4 Los temas principales elegidos para la elaboración del Manual del Laboratorio

son:

Personal

Equipo del laboratorio

Medios de cultivo

Sanitizantes

5.5 En cuanto a las normas aplicables relacionadas con el laboratorio de

microbiología se encontraron las siguientes:



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27

Norma ISO/TS 11133-1:2000 y

ISO/TS 11133-2:2000.

Aseguramiento de calidad

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

ISO 17025 Aseguramiento de calidad

MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

5.6 Se actualizó el �Reglamento para el Control de Calidad en Laboratorio�

existente. El reglamento actualizado se encuentra incluido en al Manual elaborado.

5.7 Se elaboró el Manual para el Control de Calidad en el Laboratorio de

Microbiología, mismo que se encuentra como Anexo 1 del presente reporte de

estadía.



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28

VI. CONCLUSIONES

6.1 El Manual de Calidad elaborado es una herramienta útil para:

Capacitación para el personal de nuevo ingreso y activo del Laboratorio en

las Buenas Prácticas de Manufactura aplicadas a análisis.

Conocimiento de los controles aplicados dentro del laboratorio: Esterilidad,

selectividad y productividad de medios, caducidad de reactivos, eficacia de

los sanitizantes, contaminación cruzada y calibración de equipos.

Contar con un documento auditable en las revisiones de clientes y

organismos de calidad de los alimentos, así como para la acreditación del

Laboratorio ante organismos autorizados.

Consulta de metodología para selectividad y productividad de medios de

cultivo, así como de valoración de la eficacia de sanitizantes.

6.2 Es necesario que los medios de cultivos sólidos y líquidos empleados para la

realizar el ensayo sean evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y

reacciones características por medio de las pruebas cuantitativas, semi-

cuantitativas y cualitativas incluidas en el Manual para el Control de Calidad en el

Laboratorio de Microbiología.

6.3 Para el control de medios de cultivo se sugiere vigilar las recomendaciones

internacionales de organismos de acreditación basadas en la Normas

Internacionales mencionadas en 5.5 del presente reporte.

6.4 Es importante el uso de cultivos de referencia con adecuada trazabilidad.

6.5 Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de implementar la ISO 17025 y

acreditar el laboratorio es, la preparación, esterilización y evaluación de la calidad

de los medios de cultivo empleados para realizar el ensayo. Esto implica una

revisión de las prácticas cotidianas realizadas por el laboratorio y a su vez la



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29

seguridad que los medios de cultivos usados son adecuados para cada

determinación.

VII. BIBLIOGRAFÍA

Cuesta, Alicia I. 1995, Consultora Internacional de la FAO, Norma ISO

17025. Aseguramiento De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos.

HYGINOV, 2000, Manual de limpieza y desinfección, Editorial Acribia.

Jay, James M. 2002, Microbiología moderna de los alimentos, Editorial

Acribia, 4ta Edición.

Manual De Métodos Oficiales De Análisis, AOAC, 17th Edición.

ICMSF, 2000, Microbiología de los alimentos Vol. 1, Editorial Acribia, 2 da

Edición.

ICMSF, 1999, Microbiología de los alimentos Vol. 2, Editorial Acribia, 2 da

Edición.

Concejo mexicano de la carne, Manual de buenas prácticas de manufactura

y estandarización de operaciones de sanitizacion.

Press, Demian and N. Solomon. A.S.M, 1997 Manual of Industrial

Microbiology and Biotechnology, American Society for Microbiology.



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30

X. ANEXOS

ANEXO 1

Manual para el control de calidad en el laboratorio de

microbiología.



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1

INDICE GENERAL

Pág.

I GENERALIDADES 4

1.1 Marco Teórico 4

1.2 Objetivo 5

II PERSONAL 5

2.1 Reglamento de Seguridad 5

III EQUIPO 8

3.1 Autoclaves 8

3.1.1 Manual de operación de la autoclave 9

3.1.2 Como preparar la carga 10

3.1.3 Como cargar la autoclave 12

3.1.4 Descarga de la autoclave 13

3.1.5 Normas de seguridad para usar la autoclave 14

3.1.6 Limpieza y desinfección de la autoclave 15

3.2 Stomacher 15

3.3 Balanza Analítica 16

3.4 Incubadora 17



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2

3.5 Baño Maria 17

3.6 Cuenta Colonias 18

3.7 Mechero de bunsen 18

IV CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 19

4.1Requisitos de los medios de cultivo 19

4.2 Manejo de los medios de cultivo 20

4.3 Pruebas Básicas de Control de Calidad 20

4.3.1 Productividad 23

4.3.2 Selectividad 26

4.3.3 Registro de la evaluación de los medios de cultivo 27

4.3.4 Parámetros a tomar encuentra para obtener un

buen resultado 27

4.4 Control de Esterilidad 28

4.4.1 Registro y control de esterilidad 28

4.4.2 Control de pérdidas de volumen 29

4.4.3 Lavado de material esterilizado (de desecho) 29

4.5 Controles Diarios a Realizar 30

4.6 Criterios de Calidad de los Medios Preparados 30



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3

4.7 Fallas y Causas en la Preparación de Medios de Cultivo 30

4.8 Evaluación de la Eficiencia de los Medios de de Cultivo 32

V SANITIZANTES 33

5.1 Evaluación de Riesgos 33

5.2 Criterios para la elección de un Sanitizante 34

5.3 Técnicas de análisis: controles microbiológicos 34

5.4 Método de coeficiente de fenol mensual 35

VI ANEXOS 39



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4

INDICE DE TABLAS Pág.

TABLA 1Manual de operación de autoclave 9

TABLA 2 Como cargar la autoclave 12

TABLA 3Descarga de la autoclave 13

TABLA 4 Niveles de riesgo 33

TABLA 5 Criterios de elección del desinfectante 34

TABLA 6 U. F. C. permitidas en caja y superficie 35

TABLA 7 Coeficiente de fenol 38

TABLA 8 Coeficiente de fenol 39



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5

I GENERALIDADES

1.1MARCO TEÓRICO

El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras

secciones un trabajo de equipo. La actitud ante las prácticas seguras de cada

uno de los integrantes del departamento, determinan su propia seguridad, así, tu

seguridad es la seguridad de todos.

Por otra parte, el equipamiento y el diseño del Laboratorio de Microbiología es

parte fundamental en el esfuerzo de protección de los empleados en el ejercicio

de sus labores.

Las características especiales del trabajo en la sección de Microbiología, hacen

imperante un Manual que sirva de guía a los analistas en su trabajo diario. La

eficacia en la formación de los programas es seguridad para la calidad de los

análisis efectuados.

El propósito de este Manual es describir la metodología a seguir en un programa

de seguridad en microbiología y aseguramiento de calidad en las

determinaciones, tal que sea una guía para el trabajo seguro en el laboratorio

que envuelve microorganismos potencialmente peligrosos.

Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las

personas involucradas tienen la obligación de conocer cuáles son las normas de

seguridad a seguir en el laboratorio de manera que el trabajo se realice con un

riesgo mínimo.



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6

Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demian and N. Solomon. A.S.M Press, 1997, American Society

for Microbiology,

1.2 OBJETIVO

Garantizar la veracidad y seguridad de los resultados obtenidos en las distintas

determinaciones bacteriológicas realizadas por el laboratorio de microbiología de

MAR BRAN S. A. de C. V. planta III.

II PERSONAL

.

Todo el personal debe cumplir con las siguientes reglas de seguridad

2.1 Reglas de seguridad en el laboratorio

1. Está terminantemente prohibido fumar, comer, ingerir bebidas, manipular y

usar lentes de contacto y cosméticos en el laboratorio.

2. No se permitirá la presencia de personas ajenas al Laboratorio de

microbiología, ni salir del laboratorio una vez haya comenzado el análisis

bacteriológico, sin causa justificada.

3. Es OBLIGATORIO el uso de una bata de uso exclusivo para el laboratorio

mientras esté dentro de él, al salir del laboratorio deberá portar otra bata, la cual



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7

será únicamente para las áreas externas al laboratorio, esto con la finalidad de

prevenir contaminación y para protegerlo de algún tipo de accidente.

4. Se usarán gafas de seguridad cuando sea requerido.

5. Para su propia protección, la ropa deberá ser lo más encubridora posible.

No se permitirá la entrada al laboratorio de personas que no estén

apropiadamente vestidas. Bajo ningún concepto se permitirán personas en

pantalones o faldas cortas o blusas de manga corta. Tampoco se permitirán

camisas que presenten el abdomen descubierto. El calzado deberá ser cerrado.

No se permitirán sandalias, chanclas o zapatos de tacón alto.

6. Si posee el pelo largo deberá traerlo recogido con liga para minimizar

posibilidades de contaminación de muestras. No se deben usar pinzas, pasadores

u otros adornos para el pelo.

7. Será responsabilidad del analista leer con anterioridad los manuales de

operación y procedimientos del laboratorio para que se informe sobre el equipo y

sustancias que utilizarán durante la sesión de trabajo.

8. Antes de comenzar a trabajar, se debe lavar bien las manos y sanitizarlas

con una solución de alcohol etílico al 70%.

9. Deberá rotular e identificar todos los materiales o cultivos que utilice en los

análisis de laboratorio.

10. No forzar las pipetas al colocarles las perillas de succión. Y nunca pipetear

con la boca.

11. Deberá lavar a conciencia la cristalería que utilice. Deberá poner atención y

cuidado al manipular cristalería mojada. En el caso de materiales que se hallan



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8

roto o sufrido alguna fisura que represente riesgo significativo se deberá proceder

de acuerdo a la política del vidrio.

12. Queda prohibido jugar con las llaves de agua o gas. Deben abrirse sólo

cuando se vayan a usar.

13. Evite accidentes, siempre deberá proceder conforme a los manuales

establecidos.

14. Deberá conocer la ubicación de los equipos de seguridad tales como

extintores y botiquín de primeros auxilios. De igual forma deberá conocer la

ubicación de las salidas de emergencia.

15. En caso de fuego, terremoto, escape de gas u otra eventualidad, deberá

abandonar el laboratorio a la mayor brevedad posible, siguiendo las instrucciones

contra dichos siniestros.

16. Mantenga despejadas las áreas de trabajo sobre las mesas y los pasillos

entre estas. Trate de traer la menor cantidad posible de pertenencias al

laboratorio. Coloque sus pertenencias en un área designada o donde no estorben.

17. Al terminar su trabajo, limpie bien su área, usando desinfectante si ha

estado trabajando bacterias.

18. Antes de salir vuelva a lavarse las manos.

19. Una vez iniciado las labores dentro del laboratorio, deberá evitar tocarse

cualquier parte del cuerpo con las manos ya que estas están en contacto

constante con reactivos, muestras y otras sustancias y utensilios potencialmente

peligrosos.

20. Si presenta alguna condición de salud o impedimento que afecte su

desempeño en las actividades dentro del laboratorio, notifíquelo al departamento

de enfermería.

21. Se prohíbe la manipulación de equipo (autoclaves, hornos, incubadoras, baño

maría, parrillas de calentamiento, y otros equipos) sin la debida capacitación para

su uso.


for Microbiology,



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9

III.EQUIPO

3.1 AUTOCLAVES

Las autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de

seguridad, sistema de desconexión rápido y la purga del vapor jamás ha de

realizarse directamente al exterior. No debe usarse si no se conocen

perfectamente todos las funciones y su fundamento. Usar guantes especiales

para protegerse del calor.

No abrir jamás si el manómetro no está a "0 lb/in2" y la purga de vapor no ha sido

abierta

El uso de registros de presión y temperatura de cada proceso y la aplicación del

programa de mantenimiento garantizan un control en el funcionamiento del

autoclave.

El agua debe ser cambiada regularmente (una vez cada tercer día)

Jay, James M. Microbiología moderna de los alimentos, 4ta Edición Editorial. Acribia 2002.




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10

3.1.1 Manual De Operación De La Autoclave Vertical Modelo Felisa.

TABLA 1. Manual de operación de la autoclave vertical modelo Felisa.

Conectar el equipo a corriente 220v verificar su

termostato (A) esté apagado

Abrir la tapa y poner agua destilada, hasta la marca

indicada en el tubo de vidrio o hasta que se cubran

totalmente las resistencias.

Cerrar la tapa con las 6 mariposas y cerrar con un

apretón parejo a cada una de estas en forma de cruz.

Encender el equipo por medio del termostato en la

señal �máximo� observar que el foco piloto esté

encendido, inmediatamente después abrir la llave de

purga (se encuentra en la parte de arriba de la tapa

�Tornillo negro�) y dejar de 15 a 20 minutos�1� para

que salga el aire que se encuentra en el interior del

tanque o cámara de esterilizado.

Enseguida cerrar la llave de purga de vapor y dejar

que su presión llegue a 20 lb/in2, la válvula de

seguridad está calibrada a 20 lb/in2 (equivalente a

122°C aproximadamente) Después de 15 minutos a



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11

estas condiciones de operación, abrir la válvula de

purga de vapor para liberar la presión que se formó

en el interior del tanque. Cuando el manómetro

marque 0 lb/in2 abrir la autoclave girando las

mariposas de la tapa.

3.1.2Como Preparar la Carga

1. El tamaño y la densidad de los paquetes deberá ser tal que permita una

penetración uniforme y completa del vapor, con un apreciable margen de

seguridad, en un tiempo promedio de 15 minutos a una temperatura de 121°C

a 122°C (equivalente a 20 lb/in2 de presión)

2. Las dimensiones máximas de los paquetes no deberán exceder los 30 X 30 X

50 cm. y su peso máximo no debe sobrepasar de 25 Kg.

3. Los paquetes deberán envolverse de manera que queden con espacio

suficiente de manera que permitan una libre circulación del vapor en el centro

de los mismos.

4. La envoltura o cubierta protectora de los paquetes deberá proporcionar

protección contra la contaminación por contacto después de la esterilización.

5. En general la envoltura debe poseer características filtrantes, sin obstaculizar

el paso del vapor. No se recomienda la utilización de lona o lienzo para la

fabricación de las envolturas, ya que debido a la densidad de su tejido

dificultan el flujo de vapor.

6. El celofán es impermeable al vapor y no deberá utilizarse como envoltura de

los paquetes a ser esterilizados. Ciertos artículos de pequeño tamaño pueden

ser esterilizados en fundas de celofán, siempre y cuando éstas contengan

humedad en su interior.

7. Puede utilizarse papel, previa determinación de sus cualidades protectoras y

de impermeabilidad. Los paquetes grandes no deben envolverse en papel,

pues este podría volverse frágil, con el consiguiente peligro de contaminación.



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12

8. Existen varios métodos para asegurar los paquetes, no es recomendado el

uso de clips, alfileres y grapas pues pueden rasgar el envoltorio, y facilitar la

contaminación. Se recomienda asegurar los paquetes con cintas adhesivas.

9. A cada paquete se le debe colocar un pedazo de cinta testigo, identifíquelo

con la fecha (día, mes y año), así se tendrá la seguridad de que el material ya

ha pasado por el proceso de esterilización.

10. Recuerde que el testigo no le indica que el material está esterilizado, sino

que pasó por este proceso. El material no dura más de 3 días estéril, pasado

estos días se debe volver a esterilizar.

11. Las cintas adhesivas sensibles al vapor pueden ser utilizadas para armar los

paquetes e indicar que han sido sometidos a esterilización, mas no para

asegurar la esterilidad del contenido.

12. No incluya dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de

esterilización.

13. El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el

mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su

almacenamiento. Jay, James M. Microbiología moderna de los alimentos, 4ta Edición Editorial. Acribia 2002.




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13

3.1.3 Como Cargar La Autoclave

TABLA 2. Como Cargar la Autoclave

Acomode los bultos o paquetes de tal forma

que haya una libre circulación de vapor entre

ellos (no trate de llenar el autoclave hasta

sobrecargarlo).

Coloque de lado las botellas, frascos y

cualquier clase de recipiente no poroso de

material seco. Esto permite un pronto

desplazamiento del aire y un rápido contacto

del vapor con las superficies y su contenido.

También facilita el secado.

Esterilice los líquidos separándolos de otros

materiales o utensilios.



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14

Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse

con los recipientes destapados o en su defecto

dando media vuelta a la tapa o con tapón de

algodón

Si se van a colocar paquetes en varios niveles,

hágalo de forma cruzada hasta llenar la

cámara

3.1.4 Descarga del Autoclave

TABLA 3. Descarga del Autoclave

Verificar que el tiempo de esterilización haya

concluido.

Apague la autoclave, girando el termostato

hasta la posición de apagado

Abrir la válvula de drenado de vapor hasta que

el manómetro indique una

presión de "0 lb/in2".

Una ves indicado el valor 0 en el manómetro,

se prosigue a la apertura de la tapa del

autoclave en forma cruzada.



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15

Abrir la tapa en su totalidad y esperar a que se

disipe el vapor del interior de la cámara de

esterilizado

Extraer del interior el material esterilizado,

utilizando guantes de asbesto para evitar

quemaduras en las manos

Cerrar nuevamente la tapa del autoclave para

su uso posterior

3.1.5 Normas De Seguridad Al Usar El Autoclave

1. El lugar en donde el Autoclave permanece debe ser limpio, por el trabajo que

hace.

2. Realice el Mantenimiento preventivo indicadas en el formato MB-MO4.1, de

acuerdo a la periodicidad especificada. Antes de limpiarlo asegúrese que la

cámara esté fría.

3. Por ningún motivo deje solo al Autoclave cuando esté funcionando, siempre

vigílelo por cualquier problema.

4. No deje que personas ajenas al laboratorio y sin capacitación previa, manipulen

el Autoclave

5. Recuerde que el traslado del material de un lugar a otro puede dar lugar paso a

que sea contaminado nuevamente.

6. Cuando termina el ciclo de esterilización, al material se le da un tiempo de

presecado, esto con la finalidad de que salga el vapor en su totalidad.



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16

7. La mayoría de Autoclaves llevan un dispositivo que evita sobre presiones en la

cámara, éste se llama válvula de seguridad. Esta se dispara automáticamente,

cuando hay un exceso de presión en la cámara.

8. También el Autoclave lleva una caja de circuitos que es la que protege de

cualquier corto circuito que sucede en el sistema eléctrico del equipo, estos se

disparan automáticamente por cualquier problema que suceda.

9. Cuando el Autoclave esté funcionando siempre esté pendiente del manómetro,

porque es el que le indica las condiciones de operación en la cámara.

10. Si la cámara del esterilizador está construida de acero inoxidable, nunca use

limpiadores que contengan cloro. Se recomienda que el agua de alimentación del

tanque generador, sea por lo menos agua destilada.

11. Si se pasa el nivel del agua del generador, abra la válvula de drenaje hasta

que baje a su nivel normal, de otro modo al ebullir el agua, el Autoclave empezará

a sufrir movimientos y emitir ruidos.

3.1.6 Limpieza y Desinfección de la Autoclave

Primero se eliminan los restos de cristal, plástico, agar, y otros residuos, después

se lava con abundante agua y un detergente acuoso y a continuación se inicia la

desinfección. Hay que tener en cuenta que cualquier sustancia orgánica (agar,

restos de peptona y otras) es extraordinariamente bloqueante de la capacidad

oxidativa del hipoclorito sódico y de la capacidad de actuación de los iodóforos;

por ello, primero se debe limpiar primero y después desinfectar.

Desinfección se empleará un desinfectante preferentemente líquido. Los más

útiles en el laboratorio 1. Hipoclorito sódico. De elección para suelos, cerámica,

etc. No debe usarse en superficies metálicas.

2-Iodóforo. Se utiliza a la dilución indicada por el fabricante. 3-Productos

detergentes desinfectantes, (peróxido tamponado con surfactante), de fácil



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17

manejo, no corrosivo, no irritante, especialmente activo en presencia de materia

orgánica y que cambia de color cuando deja de ser activo.

La limpieza del autoclave debe reportarse en el formato MBACB-F22 Programa Maestro

De Limpieza

3.2 STOMACHER

Este es un equipo comúnmente utilizado para el mezclado de líquidos y muestras

para análisis microbiológicos y emulsiones etc.

Procedimiento de operación

1. Verifique el suministro de corriente eléctrica en el tablero principal,

ubicado al lado derecho de la puerta de entrada.

2. coloque la muestra 9con diluyente si lo requiere) no excede el

volumen de 400 ml y mínimo de 80 ml.

3. Abra la puerta de este equipo.

4. Inserte la bolsa con la muestra y cierre la puerta.

5. Cierre la puerta, procurando dejar una cuarta parte de la bolsa fuera.

6. Para encender el equipo presione el botón verde a posición de

POWER.

7. Coloque el tiempo en segundos (indefinido0, 30, 60, 120 segundos.

8. Para detener el funcionamiento del equipo presione STOP.

9. Las bolsas utilizadas en este proceso no son reciclables por lo que

pueden ser desechadas.

Para la limpieza de este equipo se debe consultar el formato MB-MO4.1 Instrucciones Para

Arranque Y Limpieza De Equipo y reportar los resultados en el formato MBACB-F22

Programa Maestro De Limpieza

3.3 BALANZA ANALÍTICA:



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18

1. Suba la pastilla correspondiente para este equipo ubicado en el tablero

principal, colocado a la izquierda de la entrada a laboratorio.

2. Conecte el equipo a corriente de 120 voltios.

3. Presione la tecla ON.

4. Espere que la lectura de la balanza se estabilice a 0.

5. Coloque el recipiente donde va a pesar su muestra.

6. Una vez estabilizado el peso del recipiente, tare con el botón ON/OFF, para que

únicamente la lectura corresponda a la muestra.

7. Concluida la operación, vuelva a presionar el botón ON/OFF para que la lectura

regrese a 0 y pueda pesar otra muestra.




Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demian and N. Solomon. A.S.M Press, 1997, American

Society for Microbiology Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demian and N. Solomon. A.S.M

Press, 1997, American Society for Microbiology

3.4 INCUBADORA

1. Conectar el equipo al tomacorriente.

2. Presionar el botón de encendido.

3. regular la temperatura con la perilla reguladora.

4. Verificar en la pantalla del equipo los grados centígrados que marca y ajustarlo

a los deseados.

5. Mantener encendida la incubadora durante el tiempo que señale la

determinación realizada.



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19

6. Cuando este en desuso, apagar y desconectar el equipo.




3.5 BAÑO MARIA:

1. Conectar equipo a toma corriente.

2. Verifique el nivel de agua del contenedor.

3. Coloque la muestra dentro del contenedor (Matraz Erlen Meyer).

4. Presione el botón ON-OFF.

5. Programe la temperatura que desee tenga el equipo con la perilla de ajuste.

6. Una vez terminados sus labores vuelva a girar la perilla hasta cero grados.

7. Apague el equipo presionando el interruptor.

8. Desconecte el equipo.




Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demian and N. Solomon. A.S.M Press, 1997, American

Society for Microbiology .

3.6 CUENTA COLONIAS:

1. Conectar el equipo a la corriente.

2. Colocar caja a analizar en la base del equipo.

3. Mover el botón a posición de encendido.

4. Ajustar la lupa para una visión mas clara.

5. Contar las colonias tomando en cuenta que cada recuadro de la base equivale a

una colonia.



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6. Una vez terminado el conteo, se apaga el equipo y se desconecta del toma

corriente.




3.7 MECHERO DE BUNSEN

1. Verificar que la manguera del mechero se encuentra en buenas condiciones

2. conectar la manguera del mechero a la toma de gas

3. verificar que la válvula de gas se encuentre abierta

4. encender el mechero con un encendedor

5. regular la flama con el anillo situado en la parte inferior del mechero

6. una vez terminado su uso, cerrar la válvula de gas y desconectar la manguera

7. el mechero de un espacio estéril de 10cm.


Arranque Y Limpieza De Equipo y reportar los resultados en el formato MBACB-F22 Programa

Maestro De Limpieza


for Microbiology



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21

IV CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Evaluación de la calidad de los medios de cultivo:

Norma ISO/TS 11133-2:2000

¡¡¡¡REQUISITO!!!!:

El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y

reactivos sea apropiada para los ensayos realizados.

Este es un punto crítico!

4.1 REQUISITOS DE LOS MEDIO DE CULTIVO

Provistos por el fabricante:

Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.

Cada lote recibido debe ir acompañado de evidencias del

cumplimiento de las especificaciones de calidad.

El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo

debe proveer información acerca de las especificaciones de calidad, como

mínimo debe incluir lo siguiente:

� Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier

suplemento.

� Fecha de vencimiento del medio.

� Condiciones de almacenamiento.

� Control de esterilidad.

� Control del crecimiento de los microorganismos de interés (target) y de

los microorganismos no deseados (no target) y criterios de

aceptabilidad.

� Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados.



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22

Fecha de emisión de las especificaciones Cuesta, Alicia I. Consultora Internacional de la

FAO. Aseguramiento De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos Norma ISO 17025

4.2 MANEJO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

4.2.1 El laboratorio debe registrar:

la fecha de recepción

la fecha de apertura del envase.

la fecha de caducidad

4.2.2 El Almacenamiento Debe Realizarse En Las Condiciones Apropiadas.

Envases: deben estar herméticamente cerrados. (especialmente medios

deshidratados)

No deben utilizarse medios deshidratados que presenten

apelmazamiento o un cambio de color.

4.2.3 Control De Calidad Del Agua Destilada

Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua

destilada que haya sido sometida a controles periódicos que aseguren su

calidad.

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y la absorción de agua

del exterior, así como la formación de agua dentro de la botella como

consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente, favorece el

crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes,

variaciones de pH y cambios en el color del medio. Además la exposición a la

luz puede llevar a importantes alteraciones en los constituyentes del medio de

cultivo.

1. Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en lugares frescos, a temperatura

ambiente y protegidos contra la humedad y la luz. La mayoría de los

suplementos se guardan en refrigeración. Utilizando condiciones de



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23

almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en polvo tienen una vida

útil de al menos 3 años. El material que ha sufrido cambios substanciales,

tales como hidratación, endurecimiento y cambio de color, deben descartarse.

2. Se debe mantener un registro de cada frasco de medio de cultivo

deshidratado, con el nombre del producto, nombre y número telefónico de la

casa proveedora, número de control del frasco, fecha de recibo, fecha de

expiración, número de lote y fecha en que se abrió el frasco.

3. El grado de disolución de un medio deshidratado, así como la eficacia del

mismo ya preparado, depende en gran medida del procedimiento empleado

en la rehidratación. Se recomienda utilizar agua recién destilada o

completamente desmineralizada y un erlen meyer con capacidad del doble del

medio que se quiere preparar. Si el medio va a distribuirse en tubos, debe

agitarse constantemente para asegurar una adecuada homogenización al

momento de servirlos.

4. Cuando se va a esterilizar, debe asegurarse en seguir las instrucciones de

tiempo, presión y temperatura para la obtención de medios de cultivo óptimos.

Una temperatura de 121 °C, presión de 15 libras y un tiempo de esterilización

de 15 minutos, son suficientes para la mayoría de los medios.

5. Si no se dispone de autoclave, es posible esterilizar en marmita de vapor

a 100 °C por 30 minutos. En tal caso la esterilización debe repetirse durante 3

días consecutivos.

6. El medio esterilizado debe ser enfriado a 45°-60°C en un baño maría,

para evitar la formación de agua de condensación. Al ser vertidos en las

placas Petri, evitar la formación de burbujas y coágulos. Durante el proceso de

servida, debe tomarse una muestra del medio para realizar el control de

calidad por esterilidad del ambiente y eficiencia del método de esterilización.

5. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea

de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar

su utilidad durante un periodo de tiempo. El almacenamiento a 4°C es el mejor

para la mayoría de los medios.



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http://www.monografias.com/trabajos11/veref/veref.shtml


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Los medios deben mantenerse preferiblemente en sitios oscuros, ya que la luz

puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecación se

aconseja que se guarden en bolsas plásticas bien cerradas. Los platos Petri

almacenados así, deben mantenerse con el fondo hacia arriba.

7. Dado que los medios almacenados en refrigeración, cuando pasan a

temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la

superficie, se recomienda poner los platos Petri en la incubadora a 35°C por 2

horas, colocándolos con el fondo hacia arriba para obtener una superficie

seca. Esto es particularmente importante para que el agua no afecte la

individualidad de las colonias en el aislamiento o en los casos de pruebas de

sensibilidad a los antibióticos en los que el exceso de agua puede afectar la

dilución de las colonias y por ende la lectura del halo de inhibición, cada lote

preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por

eficiencia o calidad, mediante la inoculación de microorganismos cuyo

comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas.

Puede utilizarse para ello cepas bacterianas domésticas o cepas control

comerciales (ATCC).Se debe guardar un libro de registro de los resultados

obtenidos.

8. Evite el congelamiento de los medios preparados.

9. Al colocar en la refrigeradora los medios preparados, debe colocar los

de más reciente preparación al fondo y los más viejos adelante.

10. Rotular todos los medios preparados, tanto en platos Petri como en

tubos, indicando además, la fecha de preparación y expiración.

4.3 PRUEBAS BASICAS DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE

CULTIVO PREPARADOS POR EL LABORATORIO

Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y

diluyentes preparados por el laboratorio tengan las características adecuadas

con respecto a:



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25

Recuperación o supervivencia de los microorganismos de

interés.(Productividad)

Inhibición o supresión de los microorganismos no

deseados.(Selectividad)

Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)

Propiedades físicas (por ejemplo, pH, volumen).

Sea estéril.

PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO según Norma ISO/TS 11133-2:2000, los resultados

obtenidos deben reportarse en el anexo 2

SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS:

Pruebas cuantitativas

Pruebas semi-cuantitativas

Pruebas cualitativas

4.3.1Productividad

Cuesta, Alicia I. Consultora Internacional de la FAO. Aseguramiento De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos

Norma ISO 17025

Definición:

Rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera

que desarrolle en el medio de cultivo.

Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para

evaluar la productividad

EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se

evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target o blanco.

En este caso se usan E. coli ATCC 25922,

S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633



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26

Para evaluar la productividad de los medios de cultivo sólido, semisólido o

líquidos ya preparados esterilizados, los mismos deben ser inoculados con un

microorganismo target apropiado o cultivo de trabajo.

Productividad: Pruebas cuantitativas

Para las pruebas cuantitativas la proporción de Productividad PR es definido

como sigue:

PR = Ns /No

Donde

Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar

(obtenido de uno o más placas)

No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de

referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser � 100 ufc.

Allí figuran:

Los microorganismos

Tiempo y temperatura de incubación

Criterios

Medio de referencia que debe usarse según el medio a evaluar.

PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que el medio de

cultivo sea conforme.

En general para que los medios no selectivos como el PCA sea conforme, el

PR debe ser � a 0,7.

Ejemplo:

Se desea evaluar la productividad del PCA.

El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA

1) Ns ( dil -6):140 ufc

No ( dil -6): :170 ufc



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PR = Ns /No

PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme

2) Ns ( dil -6):100 ufc

No ( dil -6): 230 ufc

PR = Ns /No

PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado

no es conforme en cuanto a su productividad.

Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos sólidos

Se inocula en forma de estrías diluciones del cultivo con ansa

calibrada de acuerdo a la figura o modelo.

Las placas inoculadas se incuban a temperatura y tiempo que

depende del medio de cultivo evaluado y se observa el crecimiento.

Se evalúa la productividad del medio teniendo en cuenta el valor de

cada estría con crecimiento.

Productividad: Pruebas cualitativas

Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de crecimiento.

Score para medios sólidos:

� 0 no hubo crecimiento

� 1 hubo crecimiento débil

� 2 hubo buen crecimiento.

Score para medios líquidos:

� 0 no hubo turbidez

� 1 hubo turbidez muy tenue

� 2 hubo buena turbidez



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Reportar resultados el formato del anexo 2 de este manual. Cuesta, Alicia I. Consultora Internacional de la FAO. Aseguramiento De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos

Norma ISO 17025

4.3.2 Selectividad

Definición:

La supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido

en el medio de cultivo.

Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target para

evaluar la selectividad

En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo

Caldo Lauril sulfato (LST)se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target.

En este caso las cepas target que se usan son

E.coli ATCC 25922, C.freundii ATCC 43864 y las cepas no target Enterococcus

faecalis ATCC 29212.

Evalúa reacciones características: gas y turbidez.

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar

El crecimiento de las cepas target

Hay que prestar atención también a la apariencia, tamaño y

morfología de las colonias (especificidad)

El crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o

completamente inhibido.

Para llevar a cabo la prueba de la selectividad,

el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan

con un microorganismo y nivel apropiado.

Se emplea una suspensión del microorganismo



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29

de no-target que contiene 104cfu a 106cfu por ml se inocula en la placa o en

el tubo de medio.

Reportar resultados en el formato del anexo 2 de este manual.

4.3.3 Registro Evaluación De Medios De Cultivo

La información a registrar es:

Medio de cultivo evaluado.

Nº ID o Nº lote de medio evaluado.

Fecha de realización del análisis.

Cepa usada (Género y especie del microorganismo y tipo y Nº de

colección).

Medio de referencia usado para evaluar la productividad.

Medio de referencia usado para evaluar la Selectividad.

Resultado de productividad (unidades).

Resultado de selectividad (unidades).

Medio de cultivo conforme (SI/NO)

Personal responsable.


Norma ISO 17025

4.3.4 Parámetros A Tener En Cuenta Para Obtener Un Buen Resultado.

Agua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte.

pH: la medida a 25 oC. pH +0.2. ajuste el pH con 1 M NaOH o 1M CLH

fundir en el agua hirviente volúmenes <500ml.

15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm.

Secado de placas estufa 25-55 oC (20 min.) o en flujo laminar.



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4.4 CONTROL DE ESTERILIDAD

De los medios de cultivo y diluyentes ¿Fue efectivo el proceso de esterilización

de los medios de cultivo y diluyentes?

PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo.

La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se

corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo.

Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del comienzo y

1% de las placas o tubos del final de verter o distribuir los medios o

diluyentes.

Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un lote de

medio de cultivo o diluyente en autoclave o se esteriliza por filtración.

4.4.1 Registro Control De Esterilidad De Medios De Cultivo Y Reactivos

Datos a registrar:

Fecha de realización del control

Medio de cultivo o diluyente

Indicación del proceso de esterilización (Ejemplo N º correlativo de

proceso en autoclave o filtración)

Tiempo de incubación (en horas)

Temperatura de incubación (º C)

Resultado

Conforme (SI o NO)

Firma del personal responsable de la realización del control.

Se debe registrar en el formato MBACB-F13, Cuesta, Alicia I. Consultora Internacional de la FAO.

Aseguramiento De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos Norma ISO 17025



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31

4.4.2 Control De Las Pérdidas De Volumen Durante La Esterilización:

Debe verificarse que no haya pérdidas significativas de volumen de los

diluyentes durante el proceso de esterilización en autoclave.

Este punto es especialmente importante en métodos cuantitativos.

El laboratorio debe tener:

Un procedimiento documentado.

Registro de datos obtenidos realizados en forma periódica.

El laboratorio determina el intervalo en el que se efectúan estos controles

Para la evaluación de la pérdida de volumen de los diluyentes:

Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo o frascos de

dilución.

Medir el peso o volumen antes y después del proceso de esterilización

en autoclave.

Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la inferencia estadística

Se debe registrar en el formato MBACB-F13

4.4.3 Lavado De Material

Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto lavado del material reciclable.

El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta tarea.

Pasos:

Descontaminación material de vidrio.

Enjuague y se lavado con agua caliente y jabón liquido neutro (diluido al

2%)



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32

Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un nº de veces con

agua destilada. Eliminar el detergente

El material se seca en estufa y se acondiciona para ser esterilizado

4.5 CONTROLES COTIDIANOS FRECUENTES A REALIZAR

pH

Revisar Anexo 3 de este manual.

Esterilidad

Capacidad de crecimiento y reacción

Estabilidad

4.6 CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

Rajadura en la superficie del medio (perdida de la fuerza gelificante

debido a que el medio posiblemente ya caduco)

Variaciones en el volumen del medio (evaporación del liquido a causa de

temperaturas altas de esterilización)

Cristales en el medio( cristalización de los nutrientes que contiene el

medio)

Presencia de burbujas(condiciones de esterilización no optimas

Presencia de coágulos(perdida total de la fuerza gelificante debido a

expiración de la caducidad)

Cambio de color normal(tiempos prolongados de esterilización)

Contaminación(por falla de la inhibición de microorganismos distintos a

los que se quieren contabilizar)

4.7 FALLAS Y CAUSAS EN LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO:

Valor de pH incorrecto:

Medir el pH por encima de los 25°C.



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33

Sobrecalentamiento en la esterilización, vuelta a fundir o calentamiento

prolongado a 50°C.

Solución incompleta del medio.

Mala calidad del agua.

Recipiente mal lavado o con residuos químicos.

Mala conservación del medio deshidratado o vencido.


Norma ISO 17025

Turbidez o precipitación:

Mala calidad del agua (agua utilizada no estéril)

Sobrecalentamiento(temperaturas de esterilización por encima de la

optima)

pH incorrecto debido a la carencia de suplementos.

Solución incompleta.

Oscurecimiento:

Sobrecalentamiento.

Solución incompleta.

Alteración del pH.

Gel blando:

Bajo porcentaje de agar en el medio.

Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.

Sobrecalentamiento.

Mala homogenización del medio.

Exceso de agua.



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34

Crecimiento bacteriano pobre:

Exceso de calentamiento.

Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.

Alteración en el pH.

4.8 EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

PREPARADOS:

MEDIO DE CULTIVO ORGANISMO CONTROL REACCION ESPERADA

TSI E. coli ácido/ácido.

EMB E. coli Brillo metálico

SS agar Salmonella sp Crece. Colonias claras con H2S

SS agar E. coli No crece.


Norma ISO 17025



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35

V SANITIZANTES

Desinfección:

Es el conjunto de operaciones que se tienen como objetivo la reducción

temporal del número total de microorganismos y la destrucción de los

patógenos y alterantes; sin embargo, la esterilización busca la obtención

definitiva de un medio exento de gérmenes.

5.1 Evaluación de Riesgos

Se debe evaluar el riesgo que representa cada área del laboratorio para

verificar la concentración, tipo y frecuencia con la que se realizara la

desinfección.

Para esta se ha elaborado la tabla de análisis de riesgo que se presenta a

continuación

TABLA 4. Muestra los niveles de riesgo definido y permisible.

HYGINOV, Manual de limpieza y desinfección, Editorial Acribia 2000.

NIVEL RIESGO

0 Nulo

1 Mínimo

2 Medio

3 Severo

4 Muy alto



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36

Tabla 5. Muestra los criterios de elección de un desinfectante


5.3 Técnicas De Análisis: Controles Microbiológicos

Las técnicas de análisis microbiológicos deben ser las mismas que las

efectuadas al alimento que se es procesado dentro de la planta los cuales

deben de realizarse semanalmente.

Cuenta total

Coliformes

E. Coli

ESPECTRO

Desarrollo

de la

actividad en Características

bacterias

presencia de

materia

orgánica principales

Molécula Gram. + Gram. - Esporas

Mohos

Levaduras virus

pH de

actividad

o agua dura

Amonios

cuaternarios + +/- - + - Indiferente Si

Tensioactivo

espumante no

autorizado en

lechería

Aldehídos + + + + + Acido No Tóxicos

agua oxigenada +/- +/- - - -

Neutro o

acido Si

Ácido peracético + + + + + Acido Si Puede ser corrosivo

Cloro + + + + + Alcalino Si Corrosivo

Yodo + + + + + Acido Si Mancha

Tensioactivos

anfóteros + + - + - Variable No

Alcoholes + + - + - Neutro No Inactivo puro

Mercuriales + +/- - + - Si Tóxico

Biguanidas + + - - - Indiferente Débil



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37

Listeria

Salmonella

Estafilococos

Los resultados obtenidos de los análisis efectuados deben compararse con la

tabla siguiente, así mismo, la empresa deberá discutir los resultados de dicha

comparación para así lograr dar un limite aceptable en cada área del proceso

de forma individual, además se deben reportar los resultados en el formato

MBACB-F03COA Análisis De Laboratorio, asi mismo en el formato MBACB-

F07 Reporte Semanal

TABLA 6. Muestra las U. F. C. permitidas Caja y por Superficie.

RIESGO U. F. C. / PLACA

(5cm*5cm)

U. F. C POR

CENTIMETRO

CUADRADO

4 �5 �0.2

3 �10 �0.2

2 �50 �2

1 �125 �5


5.4 Método De Coeficiente De Fenol Manual De Métodos Oficiales De Análisis, AOAC, 17th Edición.

Método Oficial 955.11

Probando desinfectantes contra salmonella typhy

Aplicable a desinfectantes con agua

A. Medio de cultivo:

a. Caldo nutritivo

b. Caldo sintético



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38

c. Agar Nutritivo:

d. Medio de subcultivo:

e. Caldo nutritivo, tioglicolato USP XX medio

f. caldo LETHEEN,

B. Aparatos y Reactivos:

a) Materiales de laboratorio previamente esterilizados(pipetas

graduadas y volumétricas, vasos de precipitados y erlen

mayer tubos de ensaye, Etc.)

b) Baño Maria.

c) Organismo de prueba: Salmonella tify

d) Transfer loop(asa de platino)

e) Solución Stok de Fenol

f) Solución de Bromuro de Potasio

C. Técnica de Operación:

Hacer 1% de la sustancia de dilución de reserva para ser probada, en un

cilindro de vidrio tapado, hacer diluciones finales, de 1% de la solución de

reserva, directamente a los tubos de ensayo y remover todo el exceso ≥5ml,

del 5% de la solución de fenol de reserva, diluir mas lejos para hacer 1-90 y 1-

100 diluciones y colocar en tubos de medicación, colocar en estos tubos, 5ml

de solución de desinfectante y de fenol y tubos conteniendo cultivo de prueba a

cada una de las diluciones en baño maría a 20ºC y dejar por 5 min. Agregar

.5ml de cultivo de prueba a cada una de las diluciones a intervalos de tiempo,

correspondientes al intervalo en el cual las transferencias deben ser hechas,

sembrar con pipeta graduada.

Al inocular los tubos de ensayo, sostenerlos en forma inclinada después de

remover del baño María, insertar la pipeta justo encima de la superficie del

desinfectante y correr el cultivo sin que la punta toque el desinfectante,

después de agregar el cultivo, agite gentilmente y con cuidado para asegurar

la dispersión de la bacteria, pasar por el baño 5min los tubos después de



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sembrar el primer tubo, transferir una alicuota de la mezcla de cultivo y

desinfectante diluido del tubo de ensaye correspondiente al tubo de subcultivo

con un ángulo de 60º y retirar de manera que este paralelo con la superficie del

liquido. Después transferir del segundo tubo, al segundo de subcultivo y

continuar con el proceso para cada una de las diluciones, 5min después de

haber hecho la primera transferencia, iniciar el segundo periodo de

transferencias por un periodo de 10min y finalmente en 15 min.

Gentilmente agitar los tubos, antes de tomar cada transferencia, esterilizar el

asa a rojo vivo sobre la flama de un mechero de bunsen, esto cada vez que se

transfiera (antes y después) Incubar los subcultivos por 48hrs a 37ºC, leer

resultados y cada 3 días revisar en microscopio.

C. Cálculos:

Expresar los resultados en términos del coeficiente de fenol o dilución mas alta

matando al organismo de la prueba en 10min pero no en 5min, cualquiera que

refleje mas exactamente el valor germicida del desinfectante. El numero del

coeficiente de fenol se obtiene dividiendo el valor numérico de la mejor dilución

o desinfectante capaz de matar la salmonella tify en 10min pero no en 5min,

por la mejor dilución del fenol, mostrando los mismos resultados. La siguiente

tabla muestra como calcular el coeficiente de fenol:

Tabla 7

Coeficiente de Fenol= 350/90=3.89 Manual De Métodos Oficiales De Análisis, AOAC, 17th

Edición.

Desinfectante(X)

DILUCIÓN 5min 10min 15min

1-300 0 0 0

1-325 + 0 0

1-350 + 0 0

1-375 + + 0

1-400 + + +

FENOL

1-90 + 0 0

1-100 + + +



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Si ninguna dilución o desinfectante muestra crecimiento en 5 min. y mata en

10min, estimar la dilución hipotética solo cuando ninguna de las tres diluciones

consecutivas muestren los siguientes resultados; primero: no crecimiento en

5min, segundo: crecimiento en 5 y 10 pero no en 15min. O crecimiento en 5, 10

y 15. Ver la siguiente tabla:

Tabla 8

DESINFECTANTE (X)

DILUCION 5 MIN 10 MIN 15 MIN

1-300 0 0 0

1-350 + + 0

1-400 + + +

FENOL

1-90 0 0 0

1-100 + + 0

Coeficiente de Fenol= 325 / 95= 3.42 Manual De Métodos Oficiales De Análisis, AOAC, 17th Edición.



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ANEXOS

ANEXO 2: Registro Evaluación De Medios De Cultivo

Medio de

cultivo

evaluado.

Fecha de

realización

del análisis.

Cepa usada

(Género,

especie del

microorganis

mo, tipo y Nº

de colección).

Medio de

referencia

usado para

evaluar la

productividad.

Medio de

referencia

usado para

evaluar la

Selectividad.

Resultado

de

productivid

ad (ufc).

Resultado

de

selectivida

d (ufc).

Típicas

No típicas

Medio de

cultivo

conforme

(SI/NO)



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ANEXO 3: TABLA DE pH OPTIMO

ANEXO 4: ASPECTOS A REVISAR EN EL Laboratorio De Microbiología.

MEDIO DE CULTIVO pH OPTIMO DEL MEDIO YA PREPARADO

Violet Red Bile Agar 7.4 ± 0.2

Peptona de Caseína 6.5 � 7.5

Agar Papa Dextrosa 5.6 ± 0.2

Caldo Verde Brillante Bilis 7.2 ± 0.2

Agar Salmonella Shigella 7.0 ± 0.2

Caldo Selenito de Sodio 7.0 ± 0.2

Agar Triptosa 7.2 ± 0.2

Caldo Tetrationato 6.5 � 7.0

Caldo Lauril Sulfato 6.8 ± 0.2

Agar Cuenta Estándar 7.0 ± 0.2



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ASPECTO A REVISAR SI NO OBSERVACIONES

1 LABORATORIO

Señalización adecuada

Manual de bioseguridad disponible

El equipo de laboratorio está señalizado

El lugar es de fácil limpieza

Los estantes están asegurados

Las superficies de trabajo son impermeables y resistentes

La iluminación es adecuada.

Hay espacio disponible para el almacenamiento en buenas condiciones.

El acceso está limitado y restringido al personal autorizado.

Hay señalización «Riesgo biológico» en la puerta del laboratorio.

Los contenidos de la señal son adecuados al lugar.

La señal es legible y no está deteriorada.

La puerta del laboratorio se mantiene cerrada durante los análisis.

Los cables están en buen estado y sin pérdida de su aislamiento.

Hay suficientes enchufes para los equipos evitando el uso de adaptadores.

Las bases de toma de corriente están correctamente ubicadas.

Las tomas de corrientes próximas a zonas húmedas son de seguridad.

Hay EPI disponibles (guantes, batas, gafas, etc.)

Hay equipos de protección respiratoria.

Las batas, guantes y otros EPI solo se usan en el laboratorio.

Hay lavamanos dentro del laboratorio.

El riesgo de reflujo en el suministro de agua está controlado.

Los sistemas de suministro de agua destilada están en buenas condiciones.

El espacio de trabajo está libre de obstáculos u objetos.

Hay material absorbente limpio en las superficies de trabajo, en caso de

derrames

Las lámparas de iluminación tiene rejillas de protección.

Se requiere al personal que lea y siga las instrucciones sobre prácticas y

procedimientos del laboratorio.

Disponen de desinfectantes específicos para el laboratorio en uso.

Se esterilizan los residuos antes de desecharlos

Se esteriliza y sanitiza todo el material a utiliza antes de su uso.

Se realiza la descontaminación diaria de las superficies de trabajo, antes y

después de cada proceso.

Se hace un uso apropiado de los contenedores de residuos.

Los contenedores se llenan solo hasta el nivel recomendado.

Los contenedores están adecuadamente señalizados y cerrados.

Se procede a la descontaminación adecuada de cultivos y de otros residuos

antes de su eliminación.

Las neveras son exclusivas para las muestras.

Hay señalización externa sobre el uso del congelador.



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ANEXO 5: BIBLIOGRAFIA

Cuesta, Alicia I. Consultora Internacional de la FAO. Aseguramiento

De Calidad Medios De Cultivo Y Reactivos Norma ISO 17025

HYGINOV, Manual de limpieza y desinfección, Editorial Acribia

2000.

Jay, James M. Microbiología moderna de los alimentos, 4ta Edición

Editorial. Acribia 2002.


Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Demian and N.

Solomon. A.S.M Press, 1997, American Society for Microbiology,



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Tesis completa Oscar