Testiranje toksičnosti

Doc. Dr. sc. Domagoj Đikić Zavod za animalnu fiziologiju

Prirodoslovno matematički fakultet Sveučilište u Zagrebu

Farmakološka istraživanja Toksikološka istraživanja

Farmakološki i terapeutski učinci novih lijekova

Određivanje terapeutske (TD) odnosno učinkovite (efektivne ED) doze Biotrasnformacija Farmakodinamika Farmakokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski)

Regulatorna toksikologija

Određivanje toksične doze (LD50, IC50, LC50) Biotransformacija Toksikodinamika Toksikokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski) Procjena otrovnosti

Procjena rizika ksenobiotika

Klinička toksikologija

Toksikologija hrane

Toksičnost industrijskih kemikalija

Agrokemikalije

Ekotoksikologija

Indutrijske kemikalije i onečišćenje okoliša Ostala toksikološka istraživanja (kozmetička toksikologija i sl.)

Sigurnost lijekova i otrovnost novih i starih lijekova, (poklapa se sa područjem toksikologije)

Petina svih životinja u pokusima u svjetu koristi za testiranje toksičnosti Oko milijun životinja godišnje upotrebljava se u testiranju toksičnosti

Industry

Contract animal testing for pharmaceuticals, agricultural products, food additives, industrial and consumer chemicals.

Number of locations United Kingdom, United States, Japan

Key people Brian Cass, managing director

Employees 1,600

Website Huntingdon Life Sciences

INVERESK RESEARCH INTERNATIONAL LTD.

Podaci o toksičnosti sakupljaju se iz nekoliko izvora

Toksikološki podaci: -Konstantna reevaluacija starih podataka - Evaluacija novih proizvoda

SAD - EPA

U Europi -donose se novi standardi za testiranje kemikalija, OECD Toksikološko testiranje ksenobiotika -„Nove kemikalije“ , 10 kg/godišnje, -„Stare kemikalije (u upotrebi do 1981) Od 2003. g. REACH (Registration, Evaluation and Authorisation of Chemicals) program propisuje da se sve kemikalije moraju testirati

http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-4-health-effects_20745788

EU - OECD

Dvije glavne vrste toksikoloških pokusa in vivo 1.TOKSIKOKINETIKA , ADME,

TOKSIKODINAMIKA

2.Testovi toksičnosti

Raspodjela toksikanta u organizmu.

PLAN TOKSIKOKINETIČKOG POKUSA

Faze metabolizma toksina i ksenobiotika

Reakcije Faze I. : - Oksidacije - Redukcije - Hidrolize

Reakcije Faze II: - Konjugacije

- Glukuronidom - Glutationom - PAPS

Reakcije 1. faze CITOKROMSKE: • Aromatske hidroksilacije • Alifatske hiroksilacije • N – dealkiliranje • O – dealkiliranje • S – dealkiliranje • Okisdativne deaminacije • Dehalogeniranje • N – oksidacija • S - oksidacija

NECITOKROMSKE: • Hidrolize • Redukcije • Oksidacije

Izbor načina aplikacije ovisi o

1. putevima prolaska ksenobiotika kroz tijelo

2. biotransformaciji

3. eliminaciji

s. c.- subkutano; i. m.– intramuskularno; i. v. – intravenski; i.p. – intraperitonealno; prilagođeno iz: Principles of Biochemical Toxicology (Timbrell, 2000.)

Izbor soja za toksikološki pokus

Akutna toksičnost

Vrsta životinje Štakor se preporučuje za inhalacijsku i dermalnu toksičnost, za dermalne testove preferiraju se zečevi kao i za testove iritacija oka (Draizeov test, primjenjuje se od 1944); osim glodavaca vrlo rijetko se koriste ostale životinje

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja 5-10 za srođene sojeve, 10 ili više za nesrođene sojeve

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka koja se aplicira jednokratno ako je aplikacija intraperitonealna, oralna, subkutana, intradermalna, intramuskularna; Za inhalacijsku aplikaciju izloženost minimum 4 sata a za dermalnu izloženost vrijeme izlaganja je do 24 sata (do analize)

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

Do 24 sata od aplicirane doze, iznimno do 48 sati ako se istražuje eliminacija neke kemikalije

RAZVRSTAVANJE TVARI PREMA OTROVNOSTI

Zamjenski testovi za oralni LD50 na sisavcima (EPA i OCD prihvatile): --Maximum tolerated dose (MTD) , posebice u farmakologiji i na ne glodavačkim modelima --Up and down procedure (doza, 48 h.............up/down- ½ log doze novoj životinji) --Acute Class method (OECD TG 423) 5, 50, 300 and 2000 mg/kg bw. --Fixed Oral dose for acute toxicity

-Za Dermalnu toksičnost:

-Murine local lymph node assay (LLNA) for skin sensitization -Corrositex® in vitro membrane barrier skin corrosivity test -EpiDerm™ in vitro human skin model skin corrosivity test -EpiSkin™ in vitro human skin model skin corrosivity test -Rat TER in vitro skin corrosivity test

Acute Class method

-Za inhalacijsku toksičnost i iritabilnost oka nema pouzdanih i odobrenih

zamjena

-Kozmetički preparati i kozmetika, za razliku od drugih kemikalija i lijekova nije propisana u skupinama tvari koje se testiraju prema OECD standardima

Subkronična toksičnost Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori a rjeđe miševi; zečevi uglavnom za

dermalnu toksičnost;

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja Minimum 10 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

28 dana ili 90 dana, ovisno o vrsti životinje

Kronična toksičnost Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori, miševi i psi, pokusi se moraju

provoditi na minimalno dvije vrste kako bi se kompenzirale razlike u fiziologiji

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci Broj životinja Minimum 20 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene

sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas, svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

12-24 mjeseci, ovisno o vrsti životinje, za aditive u hrani minimalno 24 mjeseca do tri godine

PLAN POKUSA SUBKRONIČNE, KRONIČNE TOSKIČNOSTI I KANCEROGENOSTI

Završne točke u standardnim toksikološkim istraživanjima Smrtnost ili preživljenje Kliničko praćenje (težina tijela, veličina tumora, apetit, promjene u ponašanju i dr.) Klinički parametri (biokemija krvi, hematologija, poremećaji u zgrušavanju, analiza urina, i dr) Patološki parametri (patohistološke analize) Procjena toksičnosti na staničnoj razini (genotoksičnost, citotoksičnost i dr.) U studijama kancerogeneze ---pojavnost tumora

Analiza strukturnih aberacija kromosoma

Izmjene sestrinskih kromatida (SCE)

Mikronukleus test

Komet test

ZAMJENSKI I POTPORNI TESTOVI TESTIRANJU KANCEROGENOSTI - TESTOVI GENOTOKSIČNOSTI

• Mikronukleus test u uvjetima in vivo – ANEUGENI POTENCIJAL, do 48h nakon izlaganja

na stanicama koštane srži (polikromatski i normokromatski eritrociti) i retikulocitima sisavaca

Izrada preparata (agaroza + uzorak pune krvi)

Liza staničnih struktura; pH 10

Denaturacija i elektroforeza; pH 13

Bojenje preparata fluorescencijskom bojom (etidij bromid)

Mikroskopska analiza preparata i mjerenje kometa

Neutralizacija; pH 7,5

• COMET Assay, do 24h nakon izlaganja, KLASTOGENI

IMUNOTOKSIČNOST

IMMUNOTOXICITY FLOWCHART

REPRODUKTIVNA TOKSIČNOST

POSTOJE I KOMBINACIJE PROTOKOLA Npr. RAZVOJNA IMUNOTOKSIČNOST ILI

NEUROTKSIČNOST

NEKI PROPISANI TESTOVI JOŠ SE STANDARDIZIRAJU

ZA GLODAVCE I SISAVCE Pr. ENDOKRINI DISRUPTORI

NANOTOKSIKOLOGIJA

NOVO REGISTRIRANA ILI SINTETIZIRANA TVAR MORA PROĆI NIZ PARALELNIH TESTOVA U TAKOZVANOM VEZANOM

STUPNJEVITOM TESTIRANJU

(TIERED APPROACH)

Što sa podacima ??

Internetski izvori koji reevaluiraju i obavještavaju o Zamjenskim testovima

toksičnosti

DIRECTIVE 2010/63 EU

Mouse Strains

Hvala na pozornosti