Thực Hành Công Nghệ Enzyme -Protein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

TH CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME GVHD: ThS. Lê Thanh Hải

CHUYÊN NGÀNH: Công Nghệ Sinh Học Ứng Dụng

NIÊN KHÓA: 2012 – 2015

SVTH: Nhóm 3 (C8UD1)

Huỳnh Thị Mai Thảo

Bùi Thị Bích Thủy

Phạm Thị Kim Ngân

Lâm Văn Trí

Lê Phước Thiện

Nguyễn Thị Hoàng Yến

Thành Phố Hồ Chí Minh

Tháng 10/2014

MỤC LỤC

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)............................................................................3

1/ Nguyên tắc................................................................................................3

2/ Thực hành................................................................................................3

2.1. Nguyên liệu và hóa chất.......................................................................3

2.2. Dụng cụ và thiết bị...............................................................................4

2.3. Tiến hành...........................................................................................4

2.4. Kết quả..............................................................................................5

BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE.................................................................................7

1/ Nguyên tắc...............................................................................................7

2/ Thực hành...............................................................................................7

2.1. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................7


2.3. Tiến hành...........................................................................................7

2.4. Kết quả..............................................................................................8

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN..........................10

1/ Nguyên tắc.............................................................................................10

2/ Thực hành.............................................................................................10

1.1. Nguyên liệu và hóa chất......................................................................10

1.2. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................10

1.3. Tiến hành.........................................................................................11

1.4. Kết quả..............................................................................................11

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC VÔ CƠ........13

1/ Nguyên tắc..............................................................................................13

2/ Thực hành...............................................................................................13

2.1. Nguyên liệu và hóa chất........................................................................13


2.3. Tiến hành..........................................................................................14

2.4. Kết quả.............................................................................................14

BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME.............................................................17

1/ Nguyên tắc.............................................................................................17

2/ Thực hành.............................................................................................17

GV: ThS. Lê Thanh Hải 2



2.2. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................18

2.3. Tiến hành.........................................................................................18

2.4. Kết quả.............................................................................................18

BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM....................21

1/ Nguyên tắc.............................................................................................21

2/ Thực hành.............................................................................................21


2.2. Dụng cụ và thiết bị..............................................................................22

2.3. Tiến hành.........................................................................................22

2.4. Kết quả............................................................................................23

BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE....................................25

1/ Nguyên tắc.............................................................................................25

2/ Thực hành.............................................................................................25


2.2. Dụng cụ...........................................................................................25

2.3. Tiến hành.........................................................................................26

2.4. Tính kết quả.....................................................................................27

PHẦN TỰ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ TỐI THÍCH CỦA ENZYME ASCOBATOXIDASE.......................................................................................29

1/ Nguyên tắc...............................................................................................29

2/ Thực hành...............................................................................................29

2.1. Nguyên liệu và hoá chất.........................................................................29

2.2. Dụng cụ.............................................................................................29

2.3. Tiến hành...........................................................................................30

2.4. Cách tính kết quả:................................................................................31

BÀI 8: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE.........................34

1/ Nguyên tắc.............................................................................................34

2/ Thực hành.............................................................................................34

2.1. Nguyên liệu và hoá chất......................................................................34

2.2. Dụng cụ...........................................................................................35

2.3. Tiến hành.........................................................................................35

2.4. Cách tính kết quả:..............................................................................36



MỤC LỤC HÌNH Hình 1.1 Dung dịch Ph 9,2 (bên trái), pH 7,0 (phải)......................................6Hình 1.2: Bình mẫu, bình pH 9,2 và bình kiểm chứng (từ trái sang phải) sau quá trình chuẩn độ bằng dung dịch NaOH ...................................................7Hình 2.1: Ống 1 (phải, Biure), Ống 2 (trái, albumin)...................................10Hình 3.1 Thí nghiệm điểm đẳng điện của casein từ trái sang phải (1,2,3,4, và 5)...........................................................................................................14Hình 4.1: Ống 1,2,3,4 (từ trái sang phải) sau quá trình làm nguội 30 phút 17Hình 5.1: Ống 1,2,3 và 4 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm..........21Hình 6.1: Ống 1,2 và 3 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.............26Hình7.1: Kết quả sau chuẩn độ của đối chứng và mẫu...............................30Hình 8.1: Trước chuẩn độ và sau chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N................35Hình 9.1: Trước chuẩn độ và sau chuẩn độ................................................39

MỤC LỤC BẢNG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện của casein................13Bảng 4.1 Bảng kết quả thí nghiệm so sánh tác dụng xúc tác của enzyme với xúc tác vô cơ.........................................................................................16Bảng 5.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme...20Bảng 6.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính của enzym amylase....................................................25Bảng 7.1: Cách tiến hành thí nghiệm.........................................................32Bảng 8.1: Nhiệt độ và hoạt độ của Acid Ascobatoxidase sau quá trình thí nghiệm.......................................................................................................33Bảng 8.2: pH và hoạt độ của enzyme ascobatoxidase sau quá trình thí nghiệm.......................................................................................................34



BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)

1/ Nguyên tắc

Các aldehyde dễ kết hợp với nhóm amin. Khi cho formaldehyde tác dụng với acid

amin, nhóm amin bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylen amino acid. Hợp

chất tạo thành có tính acid mạnh hơn acid amin tự do, các nhóm carboxyl của chúng

dễ dàng định phân bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amin của các

acid amin có trong dung dịch.

2/ Thực hành2.1. Nguyên liệu và hóa chất

- Nước mắm : 1ml

- Dung dịch NaOH 0,05N : 100ml

- Dung dịch HCl 0,05N : 30ml

- Formol trung tính : 10ml

- Bromthymol blue 0,04% : 20ml

- Phenolphtalein 0,5% : 20ml

- Dung dịch đệm phosphate pH = 7 : 50ml

Dung dich A: 27,8 g Na2HPO4 hoà tan trong 1000ml

Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 .7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong

1000ml

Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ

lệ sau: Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nước vừa đủ 200ml.

Dung dịch đệm phosphate pH = 9,2 : 50ml

(Hòa tan 456g kali hydro phosphate ngậm 3 phân tử nước (K2HPO4.3H2O) trong 1000ml nước cất).



2.2. Dụng cụ và thiết bị - Bình định mức 100ml : 1 bình

- Pipette 1ml : 2

- Pipette 10ml : 2

- Erlen 100ml : 6 bình

- Burette 25ml : 1

- Becher 100ml : 4 cái

2.3. Tiến hành Chuẩn bị thang màu có pH 7 và pH 9,2

Lấy 2 erlen 100ml:

- Cho vào bình thứ nhất: 20ml dung dịch có pH 7,0 và 5 giọt bromthymol blue 0,04% có màu xanh lục nhạt

- Cho vào bình thứ hai: 20ml dung dịch có pH 9,2; 5 giọt bromthymol blue 0,04% và 3 giọt phenolphtalein 0,5% có màu tím xanh (màu xanh ánh tím)

Màu của các dung dịch trên giữ trong bình kín có thể bền trong nửa tháng.

Hình 1.1 Dung dịch Ph 9,2 (bên trái), pH 7,0 (phải)



Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm :

Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein có thể định lượng nitơ bằng phương

pháp chuẩn độ formol. Do nước mắm có màu tối cần phải pha thật loãng mới có thể so

màu của chất chỉ thị.

Lấy 1ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức thành

100ml, lắc đều.

Lấy vào bình erlen có cùng dung tích với 2 bình màu chuẩn 20ml dịch mẫu pha loãng

từ bình định mức, thêm 5 giọt bromthymol blue. Nếu dung dịch có màu xanh dương thì

thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0,05N; nếu dung dịch có màu vàng thì thêm từng giọt

NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0.

Thêm 3 giọt phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính rồi chuẩn độ bằng NaOH

0,05N cho đến khi hỗn hợp có màu ứng với màu của dung dịch trong bình 2 có pH 9,2.

Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước

cất.

Hình 1.2: Bình mẫu, bình pH 9,2 và bình kiểm chứng (từ trái sang phải) sau quá trình chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,05N



2.4. Kết quả Số gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:

x=(2.4−0,334 ) x 1x 0,0007 x100 x1000

20 x 1=¿ 7,231(g)

Trong đó:

x: lượng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm

a: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm

b: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn

V: số ml nước mắm cho vào bình định mức

0,0007: số gram nitơ với 1ml NaOH 0,05N



BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE1/ Nguyên tắc

Đây là phản ứng thường dùng để phát hiện liên kết peptide (-CO-NH-). Phản ứng

xảy ra đối với các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên. Phản ứng này dùng để

định lượng protein bằng cách lập đồ thị chuẩn với các dung dịch protein chuẩn có

nồng độ xác định nhờ kỹ thuật so màu. Nồng độ protein tối thiểu để định lượng

chính xác là 10mg/ml.

Tùy thuộc vào gốc R mà màu phản ứng có thể là màu xanh tím, tím hoặc hồng.

2/ Thực hành

2.1. Nguyên liệu và hóa chất

- Dung dịch CuSO4 1% : 20ml

- Dung dịch NaOH 10% : 20ml

- Ure : 2 – 3g

- Dung dịch lòng trắng trứng 1% : 40ml

2.2. Dụng cụ và thiết bị

- Ống nghiệm : 04 ống

- Pipette 1ml : 02 pipette


- Becher 50ml : 03 cốc

2.3. Tiến hành

Lấy ống nghiệm khô, sạch cho vài tinh thể ure, đun nhẹ tới nóng chảy, khô cứng tạo

thành biure khi có NH3 bay hơi, nhận biết bằng mùi hoặc thử bằng giấy quỳ đo pH.

Để nguội thêm vào 2 ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều cho tan hết và thêm 2 – 3



giọt dung dịch CuSO4 1%. Lấy ống nghiệm thứ hai cho 1ml dung dịch lòng trắng

trứng, 1ml dung dịch NaOH 10%, thêm 2 – 3 giọt CuSO4 1%, lắc đều. có

màu tím

2.4. Kết quả Chụp hình, ghi màu và viết phương trình phản ứng của 2 phản ứng trên.

Hình 2.1: Ống 1 (phải, Biure), Ống 2 (trái, albumin)

Ở ống 1 (BIURE): Khi đun ure trên ngọn lửa đèn cồn thì ta thấy tinh thể ure tan,

bay hơi một ít rồi kết tinh lại (khí NH3 bay hơi). Nhưng sau đó khi cho 1-2ml dung

dịch NaOH 10% vào thì ta thấy tinh thể ure tan ra tạo thành dung dịch lỏng không

màu. Khi lắc rồi cho thêm dung dich CuSO4 1% vào thì dung dịch hóa màu hồng

nhạt.

Acide cianuric nhỏ NaOH 10%

Urea đun NH3 (bay hơi) cianuric được trung hòa)

Biure (2 phân tử Ure kết hợp tạo thành) làm xuất hiện liên kết

peptide (-CO-NH-). Trong môi trường kiềm Biure +CuSO4 cho phức muối Cu có

màu tím hồng



Ống 2: Trong dung dich lòng trắng trứng (Albumin) cũng có liên lết peptide nên

cũng có phản ứng Biure tạo phức hợp muối Cu với polypeptide có màu tím xanh.

Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide trong phân tử protein phản ứng với

CuSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc mà tím đỏ. Tùy theo độ dài của mạch

peptide mà màu của phức sẽ biến thiên từ xanh tím đến tím đỏ.



BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN

1/ Nguyên tắc

Các phân tử protein là các polymer có tính điện ly lưỡng cực. Trong dung dịch, khi

pH thay đổi nó phân ly tạo thành các nhóm tích điện dương và các nhóm tích điện

âm khác nhau. Đối với mỗi protein sẽ có một giá trị pH xác định mà tại đó tổng số

điện tích âm bằng tổng số điện tích dương, khi đó phân tử protein trung hòa về điện,

pH đó gọi là điểm đẳng điện của protein. Tại điểm đẳng điện, dung dịch protein

không bền, dễ bị kết tủa.

2/ Thực hành


- Dung dịch acid acetic (CH3COONa) 0,1N : 200ml

- Dung dịch natri acetate (CH3COONa) 0,1N : 50ml

- Dung dịch casein 0,4%: Cân 0,4g casein cho vào becher 100ml và thêm 20ml

dung dịch CH3COONa 0,1N. Đặt lên nồi cách thủy đun nóng để hòa tan hoàn toàn.

Chuyển sang bình định mức 100ml và định mức tới 100ml bằng dung dịch

CH3COONa 0,1N.

- Nước cất : 50ml




- Bình định mức 100ml : 01 bình


- Nồi cách thủy : 01 cái



1.3. Tiến hành

Lấy dung dịch CH3COOH 0,1N và nước vào 5 ống nghiệm theo thứ tự như bảng

sau:

Lắc đều, sau đó thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch casein và theo dõi sự biến đổi của

chúng trong mỗi ống nghiệm.

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện của casein

1.4. Kết quảỞ ống nghiệm có nhiều kết tủa nhất là điểm đẳng điện của Casein

Chụp hình và ghi lại kết quả xác định pH đẳng điện của Casein



Hình 3.1 Thí nghiệm điểm đẳng điện của casein từ trái sang phải (1,2,3,4, và 5).

Mức độ kết tủa

Ống 1: Kết tủa nhất

Ống 2: Kết tủa hết

Ống 3: Kết tủa nhiều

Ống 4: Kết tủa nhiều nhất

Ống 5: Kết tủa trung bình

Kết luận: Vậy điểm đẳng điện của protein Casein là ở pH = 4,1.



BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC VÔ CƠ

1/ Nguyên tắc Chất xúc tác là chất làm cho phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng không bị tiêu hao

trong quá trình phản ứng. Enzyme là các chất xúc tác của các hệ thống sinh học.

Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác

tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làm

tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều kiện

nhiệt độ và pH ôn hòa.

2/ Thực hành

2.1. Nguyên liệu và hóa chất - Enzyme amylase : 50ml

- Dung dịch HCl 1% : 50ml


- Dung dịch hồ tinh bột 10% : 50ml

2.2. Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm : 04 ống


- Nồi đun cách thủy : 01 cái

- Tủ ấm : 01 cái




2.3. Tiến hành Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 10%. Sau đó thêm

vào:

- Ống thứ nhất : 10ml nước cất

- Ống thứ hai : 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ ba : 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư : 10ml dung dịch HCl 1%

Sau đó đặt các ống nghiệp thứ nhất và thứ hai ở nhiệt độ phòng, ống thứ ba vào tủ

ấm 600C. Đặt ống thứ tư vào nồi cách thủy đang sôi. Sau 10 phút lấy các ống

nghiệm ra, cho vào mỗi ống 5ml thuốc thử Lugol. Đặt cả 4 ống vào nồi cách thủy

trong 2 phút. Lấy ra làm nguội vàquan sát hiện tượng trong các ống nghiệm.

2.4. Kết quả Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 4.1 Bảng kết quả thí nghiệm so sánh tác dụng xúc tác của enzyme với xúc tác vô cơ



Hình 4.1: Ống 1,2,3,4 (từ trái sang phải) sau quá trình làm nguội 30 phút

Nhận xét phản ứng Lugol:

Ống 1: Cho ra phức xanh có màu đậm nhất.

Ống 2: Cho ra phức có màu xám nhạt có sự phân cách rõ ràng (lớp dưới màu trắng

đục).

Ống 3: Cho ra phức có màu xám.

Ống 4: Cho ra phức xám trong có sự phân cách (lớp dưới màu trắng trong).

Giải thích

Ở ống 1: Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành

phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI). Do cấu tạo dạng mạch xoắn

có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường, khi có

tác dụng nhiệt độ thì mất màu do iod tách ra khỏi tinh bột ở trạng thái tự do dẫn đến

I2 thăng hoa làm mất màu xanh, làm lạnh có màu xanh trở lại là do còn một số iod

bàm trên thành ống nghiệm hấp thu trên phân tử tinh bột làm màu xanh xuất hiện

trở lại.

Ở ống 2,3:

Thủy phân Tinh bột + Lugol (iod, KI) cho màu xanh

Tinh bột (Glucose, Maltose, Maltodextrin, Acrodextrin) + Lugol

Amylase Amylodextrin + Lugol cho màu tím

Erythrodextrin + Lugol cho màu tím đỏ

Ở ống 4: Ở 100oC Tinh bột sẽ bị thủy phân bởi HCl. Sau đó lượng tinh bột còn dư

tiếp tục phản ứng với Lugol cho ra phức có màu xanh.

Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điều

kiện ôn hòa, không đòi hỏi nhiệt độ cao (Enzyme xúc tác vô cơ Amylase) nhưng tốc

độ phản ứng vẫn mạnh hơn so với Enzyme xúc tác hữu cơ (HCl) phải cần ở nhiệt

độ thích hợp thì phản ứng mới xảy ra.



BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME

1/ Nguyên tắc

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất

định. Enzyme có tính đặc hiệu rất cao. Tính chất đặc hiệu của enzyme cho thấy sự

khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác. Mỗi loại enzyme chỉ có

khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều chất nhất định theo một kiểu

phản ứng nhất định. Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiện ở một số kiểu đặc

hiệu sau:

Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển

hóa nhất định trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng

chuyển bị, phản ứng thủy phân…

Đặc hiệu kiểu cơ chất: có 3 kiểu đặc hiệu cơ chất

- Đặc hiệu tuyệt đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một cơ chất nhất định

- Đặc hiệu tương đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một kiểu liên kết hóa học

nhất định

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một dạng

đồng phân quang học của cơ chất (cis hoặc trans)

2/ Thực hành


- Enzyme amylase : 5ml





- Casin 2% : 20ml




- Nồi đun cách thủy : 01 cái

- Tủ ấm : 01 cái


2.3. Tiến hành

Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, sau đó thêm vào:

- Ống thứ nhất: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ hai: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

- Ống thứ ba: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

Lắc đều và để vào tủ ấm ở 600C trong 15 phút. Lấy ra, cho vào ống nghiệm thứ nhất và thứ hai mỗi ống 02 giọt thuốc thử Lugol.Cho ống thứ ba và thứ tư mỗi ống 02 giọt thuốc thử Folin.

2.4. Kết quả Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:Bảng 5.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme



Nhận xét về tính đặc hiệu của Enzyme.

Hình 5.1: Ống 1,2,3 và 4 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.

Giải thích:

Ống 1: : Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành

phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI). Do cấu tạo dạng mạch xoắn

có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường.

Enzyme amylase Glucose

Tinh bột Maltose

Thủy phân Maltotetrose



Dextrin phân tử thấp

Enzyme amylase thủy phân liên kết α-1,4-glycoside của tinh bột thành các dextrin

lớn đến nhỏ, cuối cùng là glucose.

Ống 2: Enzyme bromelin không tác dụng với tinh bột. Sở dĩ thí nghiệm có màu

xanh là do (tinh bột + Lugol (iod, KI)) cho màu xanh đặc trưng.

Ống 3: Enzyme amylase không thủy phân Casein.

Ống 4: Enzyme bromelin thủy phân cơ chất casein. Quá trình thủy phân sơ bộ sẽ

cho ra Polypeptide và acid amin.



BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM

1/ Nguyên tắc

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa

enzyme. Các chất hoạt hóa có thể là những anion, các ion kim loại (từ ô thứ 11 đến

ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn), các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Các

chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khả

năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng

phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme.

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứng

enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme những không bị enzyme làm thay đổi tính chất

hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt

động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả

protein.

- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ

chất. Chúng thường là chất kiềm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với

trung tâm hoạt động của enzyme và chiếm lấy vị trí của cơ chất trong trung tâm

hoạt động.

- Chất kìm hãm không cạnh tranh: những chất này không chiếm trung tâm hoạt

động của enzyme mà liên kết với vị trí ngoài trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu

trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc

tác.

2/ Thực hành


- Enzyme amylase : 50ml



- Dung dịch NaBr 0,5% : 50ml

- Dung dịch CuSO4 0,5% : 50ml



- Thuốc thử Lugol : 50ml

- Thuốc thử Fehling : 50ml





- Bể điều nhiệt : 01 thiết bị


2.3. Tiến hành

Cho vào 03 ống nghiệm mỗi ống 5ml dung dịch hồ tinh bột 1%, sau đó cho vào:

- Ống thứ nhất: 10ml nước cất

- Ống thứ hai: 10ml dung dịch NaBr 0,5%

- Ống thứ ba: 10ml dung dịch CuSO4 0,5%

Sau đó cho vào cả ba ống mỗi ống 10ml dung dịch enzyme amylase. Lắc đều và để

vào tủ ấm ở 370C trong 15 phút. Lấy ra, cho vào mỗi ống 2 giọt thuốc thử Lugol,

lắc đều.



Tiếp tục cho vào mỗi ống 2ml dung dịch Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi

trong 2 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng.

2.4. Kết quả

Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 6.1 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính của enzym amylase

Nhận xét về tác dụng của chất hoạt hóa và chất kiềm hãm đến hoạt tính của enzyme amylase.



Hình 6.1: Ống 1,2 và 3 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.

Nhận xét: Ống 1: Xuất hiện màu xanh nhạt nhất => tốc độ hoạt hóa của chất hoạt hóa yếu

vì nước cất không phải là chất kìm hãm hay kích thích cho quá trình thủy phân tinh

bột.

Ống 2: Xuất hiện màu xanh trung bình =>dung dịch NaBr có tác dụng kích thích

cho phản ứng thủy phân ở mức độ trung bình.

Ống 3: Xuất hiện màu xanh đậm nhất =>dung dịch CuSO4 có tác dụng kìm hãm

làm phản ứng thủy phân chậm lại.



BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE

1/ Nguyên tắc

Lipase là enzym thuộc nhóm thủy phân, phân nhóm esterase – xúc tác phản ứng

thủy giải các nối ester giữa glycerine và các acid béo trong glyceride.

Nhờ hoạt động của lipase, các acid béo được giải phóng làm tăng độ chua của môi

trường phản ứng. Lượng acid đó sẽ được chuẩn độ bằng kiềm và chỉ số hoạt độ của

enzym sẽ là lượng kiềm cần để trung hòa các acid béo mới được hình thành.

2/ Thực hành


- Tuỵ tạng động vật : 4g

- Sữa tươi : 100ml

- KOH 0,1N : 100ml

- Cồn 96% : 50ml

- Phenolphtalein 1% : 15ml

- Hỗn hợp nước h glycerin : 40ml (tỷ lệ 3 nước : 1glycerin)

- H2SO4 0,1N chuẩn : 100ml

- Vải màn : 1

- Giấy lọc : 4

- Phễu lọc

2.2. Dụng cụ

- Erlen 100ml : 7



- Bể điều nhiệt : 1

- Buret 25ml : 1

- Bercher 100ml : 4

- Pipet 5ml : 2

- Pipet 10ml : 2

- Cối sứ : 1

- Bếp điện : 1

2.3. Tiến hành

Chuẩn bị chế phẩm lipase từ tuỵ tạng động vật: Cân 1g tụy tạng động vật, cho vào

cối nghiền 5ml hỗn hợp nước – glycerin (tỷ lệ 3:1), nghiền kỹ từ 3 – 5 phút. Sau đó,

lại cho thêm 5ml hỗn hợp nước – glycerin và nghiền tiếp 1 h2 phút. Lọc vắt hỗn

hợp qua vải màn, sau đó lọc lại qua giấy lọc, thu dịch lipase để làm thí nghiệm

Xác định hoạt tính của enzyme lipase:

Lấy 02 erlen 100ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi

- Erlen 1 (erlen thí nghiệm): cho vào 2 ml lipase, lắc đều, đặt vào bể điều nhiệt ở

370C – 400C trong 1 giờ

- Erlen 2 (erlen đối chứng): đun sôi sữa trong bình, sau đó cho ngay 2ml lipase vào

và đun sôi tiếp 5 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Sau đó đặt vào bể điều nhiệt ở

370C – 400C trong 1 giờ. Sau 1 giờ lấy erlen ra, thêm vào mỗi bình 8ml cồn 96%,

vài giọt phenolphtalein, chuẩn độ cả hai erlen bằng KOH 0,1N.

Tiến hành thí nghiệm 2 lần. Lấy kết quả là giá trị trung bình của 2 lần thí nghiệm



Cách xác định hệ số hiệu chỉnh k:

- Chuẩn độ 10ml dung dịch KOH 0,1N bằng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn, thuốc

thử màu là phenolphtalein cho đến khi dung dịch vừa mất màu hồng thì dừng lại

- Xác định lượng H2SO4 0,1N chuẩn cần dùng

- Tiến hành thí nghiệm 3 lần. Lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm

2.4. Tính kết quả

Hệ số hiệu chỉnh k được tính như sau:

- Tính nồng độ KOH thực tế:

- Hệ số hiệu chỉnh k:

Trong đó:

CKOHt : Nồng độ dung dịch KOH thực tế

VKOHt : Thể tích dung dịch KOH thực tế

CKOHp : Nồng độ dung dịch KOH pha

VKOHp : Thể tích dung dịch KOH pha

Hoạt độ lipase: được biểu thị bằng số ml KOH đã dùng để chuẩn độ acid béo tạo

thành từ sự thủy phân lipid có trong 1 lít sữa và được tính theo công thức sau:



X= (V1 - V2) x k x 100/3

X= (3,3- 2,6) x 1 x 100/3 = 23,3333 UI

Trong đó:

X : Hoạt độ của enzyme lipase (UI)

V1 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen thí nghiệm (erlen 1)

V2 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen đối chứng (erlen 2)

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH (k = 1).

Hình7.1: Kết quả sau chuẩn độ của đối chứng và mẫu.



PHẦN TỰ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ TỐI THÍCH CỦA ENZYME ASCOBATOXIDASE

1/ Nguyên tắc Ascobatoxidase là enzym thuộc lớp oxi hoá khử (oxireductase) có nhiều trong các

loại rau quả

tươi và nhiều nhất ở lớp vỏ quả. Enzym này oxi hoá acid ascorbic thành acid

dehydroascorbic.

Trong thành phần của enzym này có sự hiện diện của ion Cu2+.

2/ Thực hành

2.1. Nguyên liệu và hoá chất - Dưa chuột : 100g

- Dung dịch đệm photphat 0,15M pH7 : 200ml

- Acid ascorbic (nồng độ 1mg/ml) : 100ml

- Dung dịch KI 10% : 150ml



- Dung dịch KIO3 0,01N : 250ml

- Dung dịch Na2S2O3 0,01N : 1000ml

- Cách pha dung dịch đệm phosphate pH 7:

o Dung dich A: 289 g NaH2PO4 hoà tan trong 80ml

o Dung dịch B: 8,53g Na2HPO4.12H2O pha trong 120 ml.

o Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ

lệ sau: Dung dich A: 80ml + dung dich B: 120ml.

2.2. Dụng cụ - Cối sứ : 1

- Becher 50ml : 2

- Becher 100ml : 2



- Erlen 100ml : 3

- Bình định mức 50ml : 2

- Erlen 250ml : 4

- Buret 25 ml : 1

- Pipet 5ml : 2

- Pipet 10ml : 2

- Giấy lọc : 4

- Phễu lọc : 2

2.3. Tiến hành Chiết t á ch enzym ascobatoxidase: Cân 30g dưa chuột (bỏ hạt) cho vào cối sứ,

nghiền với 10 – 15ml dung dịch đệm phosphat 0,15M pH 7. Dịch chiết được cho

vào bình định mức 50ml và thêm dung dịch đệm đến vạch định mức. Lắc đều nhiều

lần và để yên trong 1 giờ. Lọc thu dịch lọc. Dịch lọc là chế phẩm enzym

ascobatoxidase.

Khảo s á t nhiệt độ tối thích enzym ascobatoxidase:

Bảng 7.1: Cách tiến hành thí nghiệm


Mẫu

(Bình

erlen)

Đối

chứng

(Đun

sôi)

Nhiệt

độ

(0C)

Acid

ascorbic

(ml)

KI

10%

(ml)

HCl

5%

(ml)

Hồ tinh

bột

(giọt)

KIO3

0,01N

(ml)

1 1 300C 10 5 10 10 10

2 2 400C 10 5 10 10 10

3 3 450C 10 5 10 10 10

4 4 500C 10 5 10 10 10

5 5 600C 10 5 10 10 10


Lắc đều, để yên 5 phút rồi chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N đến khi mất

màu xanh.

Xác định hệ số hiệu chỉnh của Na2S2O30,01N bằng dung dịch KIO3 0,01N

chuẩn (tương tự như cách xác định hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH 0,1N)

2.4. Cách tính kết quả: Hoạt tính của enzym ascobatoxidase được hiển thị bằng số mg acid ascorbic bị oxi

hoá dưới tác động của enzym có trong 1g nguyên liệu trong thời gian 1 phút.

Hoạt tính của enzym được tính theo công thức:

Trong đó

X : Hoạt độ của enzyme ascorbatoxidase (UI)

V1 : Thể tích Na2S2O3dùng ở erlen thí nghiệm

V2 : Thể tích Na2S2O3dùng ở erlen đối chứng

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O30,01N

0,088 : Số mg acid ascorbic tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O30,01N

m : Khối lượng nguyên liệu để chiết enzym (g)

t : Thời gian phản ứng (phút) 0C

Bảng 8.1: Nhiệt độ và hoạt độ của Acid Ascobatoxidase sau quá trình thí nghiệm.

Nhiệt độ (0C) 30 40 45 50 60

Hoạt độ (UI) 65 85 100 95 60



30 35 40 45 50 55 600

20

40

60

80

100

120

OPTIMUM TEMPERATURE

TEMPERATURE 0C

ACT

IVIT

Y (U

/mL)

Đồ thị biểu diễn nhiệt độ tối thích của Enzyme Ascobatoxidase là ở nhiệt độ (450C)

Bảng 8.2: pH và hoạt độ của enzyme ascobatoxidase sau quá trình thí nghiệm

Ph 4 6 7 8 9

Hoạt độ 5 85 55 25 5



4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 90

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

OPTIMUM pH

pH

RELA

TIVE

ACT

IVIT

Y (%

)

Đồ thị biểu diễn pH tối thích của Enzyme Ascobatoxidase là ở pH= 6.

Hình 8.1: Trước chuẩn độ và sau chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N.



BÀI 8: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE

1/ Nguyên tắc

Ascobatoxidase là enzym thuộc lớp oxi hoá khử (oxireductase) có nhiều trong các

loại rau quả tươi và nhiều nhất ở lớp vỏ quả. Enzym này oxi hoá acid ascorbic

thành acid dehydroascorbic. Trong thành phần của enzym này có sự hiện diện của

ion Cu2+.

2/ Thực hành

2.1. Nguyên liệu và hoá chất

- Dưa chuột : 100g

- Dung dịch đệm photphat 0,15M pH7 : 150ml

- Acid ascorbic (nồng độ 1mg/ml) : 100ml

- Dung dịch KI 10% : 50ml



- Dung dịch KIO3 0,01N : 150ml

- Dung dịch Na2S2O3 0,01N : 100ml

- Cách pha dung dịch đệm phosphate pH 7:

o Dung dich A: 27,8 g NaH2PO4 hoà tan trong 1000ml

o Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 .7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong

1000ml

o Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ



lệ sau: Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nước vừa đủ 200ml.

2.2. Dụng cụ

- Cối sứ : 1

- Becher 50ml : 2

- Becher 100ml : 2

- Erlen 100ml : 3

- Bình định mức 50ml : 2

- Erlen 250ml : 4

- Buret 25 ml : 1

- Pipet 5ml : 2

- Pipet 10ml : 2

- Giấy lọc : 4

- Phễu lọc : 2

2.3. Tiến hành

Chiết tách enzym ascobatoxidase: Cân 30g dưa chuột (bỏ hạt) cho vào cối sứ,

nghiền với 10 – 15ml dung dịch đệm phosphat 0,15M pH 7. Dịch chiết được cho

vào bình định mức 50ml và thêm dung dịch đệm đến vạch định mức. Lắc đều nhiều

lần và để yên trong 1 giờ. Lọc thu dịch lọc. Dịch lọc là chế phẩm enzym

ascobatoxidase.

Khảo sát hoạt tính enzym ascobatoxidase



- Hút 10 ml dung dịch enzym cho vào becher 100ml. Sau đó cho thêm 10ml dung

dịch acid ascorbic. Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút. Tiếp theo đun sôi trực

tiếp trên bếp để ngừng phản ứng, rồi cho vào bình định mức 50 ml và làm đầy bằng

nước cất.

- Lấy 10ml dịch trong bên trên cho vào erlen 250ml, thêm 5ml dung dịch KI 10%,

10 ml dung dịch HCl 5%, 10 giọt hồ tinh bột 1% và 10 ml dung dịch KIO3 0,01N.

Lắc đều, để yên 5 phút rồi chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N đến khi mất

màu xanh.

- Làm một mẫu đối chứng tương tự như trên với 10ml dung dịch enzym đã được

đun sôi trong 2 phút và làm lạnh.

- Tiến hành thí nghiệm 2 lần. Kết quả là giá trị trung bình

Xác định hệ số hiệu chỉnh của Na2S2O3 0,01N bằng dung dịch KIO3 0,01N chuẩn

(tương tự như cách xác định hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH 0,1N)

2.4. Cách tính kết quả:

Hoạt tính của enzym ascobatoxidase được hiển thị bằng số mg acid ascorbic bị oxi

hoá dưới tác động của enzym có trong 1g nguyên liệu trong thời gian 1 phút.

Hoạt tính của enzym được tính theo công thức:

X=(58,6−52 ) x1 x0.088

1 x1=0.58UI

Trong đó

X : Hoạt độ của enzyme ascorbatoxidase (UI)



V1 : Thể tích Na2S2O3 dùng ở erlen thí nghiệm

V2 : Thể tích Na2S2O3 dùng ở erlen đối chứng

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N

0,088 : Số mg acid ascorbic tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N

m : Khối lượng nguyên liệu để chiết enzym (g)

t : Thời gian phản ứng (phút)

Hình 9.1: Trước chuẩn độ và sau chuẩn độ


Documents

Thực Hành Công Nghệ Enzyme -Protein