Title of Module · разтвори, но могат да се изследват и твърди вещества и газове. ... В аналитичната химия, техниката

IO3 - Обучителен материал за бизнес с растения

Модул No. 3

“Осигуряване на качеството на крайния продукт

(Медицински растения)”

Този проект е финансиран с подкрепата на Европейската комисия. Тази публикация отразява само възгледите на автора и Комисията не носи отговорност за какво се използва съдържащата се в нея информация.

2 Осигуряване на качеството на крайния продукт (Медицински растения)

Раздел 4: Лабораторни техники

Резюме

Този раздел предлага поглед върху лабораторните техники, използвани за поддържане на

най-високо ниво на контрол на качеството. В него се обяснява подробно концепцията на

всички тези техники и се доказва, че пробата на растенията е безопасна за употреба и не

съдържа токсични химикали и т.н. Тези техники също помагат при измерването на

чистотата и също така да се открият всички съставки в проба.

Дескриптори на резултата от обучението

До края на курса, обучаваният трябва да може да:

1. Обяснява различните лабораторни техники

2. Обяснява какво е ДНК техника

3. Взема решение коя техника е най-добра за пробата, която има.

Общи и трансферни умения

1. Обяснява различните ДНК и лабораторни техники

2. Работи самостоятелно

3. Организира задачи



Методите за контрол на качеството на билковите лекарства включват аналитична

проверка чрез хроматографски и спектроскопски техники. Те включват TLC, HPLC, GC,

ултравиолетови лъчи (UV), инфрачервена трансформация на Фурие (FT-IR), атомна

абсорбционна спектроскопия (AAS), флуориметрия, близка инфрачервена светлина (NIR) и

спектрофотометър. HPLC анализите включват записването на хроматограмите, времето на

задържане на всеки отделен пик и абсорбционните спектри с различни подвижни фази.

Аналогично, газовотечната хроматография (GLC) се използва за генериране на профили на

летливи масла и фиксирани масла от билкови лекарства. Освен това, скорошните подходи

за прилагане на типична хроматография и спектрометрия като газова хроматография-

масспектрометрия (GC-MS), детекция на капилярна електрофореза-диодна матрица

(CEDAD), високоефективна течна хроматография - тънкослойна хроматография (HPTLC) и

високоефективна течна хроматография масспектроскопия (HPLC-MS), може да осигури

допълнителна спектрална информация, която ще бъде много полезна за качествения

анализ и дори за он-лайн структурното изясняване (4, 19, 20, 21).

Съществуват множество ДНК техники, които се използват като допълнение към методите

и техниките на класическата ботаника за идентификация на растенията, включително

RAPD, RFLP, ARMS, CAPS, AFLP, ISSR, хибридизация и микрочипове (22). Неотдавнашно

технологично развитие е доказване на автентичността на лечебните растения чрез ДНК

баркод. Този метод се основава на откриването на променливи места в рибозомалната

ДНК чрез анализ на вътрешни транскрибирани интергенни участъци (IТS). ДНК баркодът

осигурява мощен инструмент за удостоверяване на автентичността на растенията и е

изключително подходящ за качествен контрол на лечебните растения. Изследванията,

които понастоящем се провеждат в тази област, се съсредоточават върху въпроса колко и

кои ДНК фрагменти са необходими за оптималната дискриминация на различните видове.

По-долу е представено всяко от горепосочените техники и начините, по които те

предлагат качествено осигуряване на крайния продукт.



ХРОМАТОГРАФСКИ / СПЕКТРОСКОПИЧНИ ТЕХНИКИ

ТLC (Тънкослойна хроматография): Тънкослойната хроматография (TLC) е хроматографска

техника и се използва за отделяне на нелетливи смеси (23). Тя използва лист от стъкло,

пластмасово или алуминиево фолио, който е покрит с адсорбиращ материал (силикагел

или алуминиев оксид) и това се нарича стационарна фаза. След това пробата се полага

върху плочата и подвижната фаза (разтворител или смес от разтворители) се изтегля от

плаката чрез капилярно действие. Сместа се отделя поради факта, че различни фракции

могат да се придвижат на TLC плака с различни скорости (24). Важно е да се знае, че

мобилната и стационарната фаза имат различни свойства и мобилната фаза може също да

бъде смес и това дава възможност на всеки химик за финни настройки спряма свойствата

на мобилната фаза. В резултат на това, може да се използва при извършване на качествен

контрол на смеси от екстракти от лечебни растения и техните крайни продукти, като това

е относително лесен метод за разделяне на смеси.

Разделяне на черно мастило върху плоча с TLC

HPLC: Високоефективна течна хроматография е лабораторна техника, използвана за

анализ на смеси и благодарение на която се постига отделянето, идентифицирането и

количественото определяне на всеки компонент. Тази техника използва помпи за

преминаване на течен разтворител под налягане, съдържащ пробата, през колона пълна с

твърд адсорбентен материал. Известно е, че всеки компонент, който съществува в

пробата, взаимодейства различно с адсорбционния материал, който се използва всеки

път и по този начин съществуват различни скорости на потока за различните компоненти

и това води до отделяне на компонентите, (25). С тази техника ученият има пълен контрол

над оперативните параметри като скоростта на потока на подвижната фаза, буферния

контрол на подвижната фаза, температурата на колоната в пещта и др. Освен това,

софтуерът за HPLC е в състояние да отчита точни и верни резултати въз основа на площта



на връхните точки. Това може да помогне за осигуряване на качеството на лечебните

растения чрез идентифициране на елементите в смес и да разделянето им в зависимост

от качеството.

HPLC

GC: Газовата хроматография (GC) е хроматографска техника, използвана за разделяне и

анализиране на съединения, които могат да бъдат изпарени. Типичните употреби на GC

включват тестване на чистотата на дадено вещество (например нашите крайни продукти

от лечебни растения) или разделяне на различните компоненти на сместа (могат да се

определят и относителните количества на такива компоненти, полезна способност, когато

трябва определяне на чужди вещества в смес). В някои ситуации GC може да помогне за

идентифицирането на съединение. GC може да се използва за получаване на чисти

съединения от смес (26, 27). Газовата хроматография е подобна на колонната

хроматография по отношение на нейните принципи, но има няколко разлики. Първо,

процесът на разделяне на съединенията в смес се извършва между течна неподвижна

фаза и газообразна подвижна фаза, докато при колонна хроматография стационарната

фаза е твърдо вещество и подвижната фаза е течна. (Оттук и пълното наименование на

процедурата е "Газова-течна хроматография", отнасяща се съответно до подвижните и

стационарни фази.) Второ, колоната, през която преминава газовата фаза, се намира в

пещ, където температурата на газа може да бъде контролирана, докато колонната

хроматография няма такъв температурен контрол (26).

Ултравиолетова видима спектроскопия: Ултравиолетова видима спектроскопия или

ултравиолетова видима спектрофотометрия (UV-Vis или UV / Vis) е техника, която дава

резултати в спектъра на ултравиолетови лъчи. Това означава, че тя използва светлина във



видимите и съседни спектри. Поглъщането или отразяването във видимия диапазон може

директно да повлияе на цвета на съответните химикали. В тази област на

електромагнитния спектър атомите и молекулите претърпяват електронни преходи.

Абсорбционната спектроскопия е допълваща към флуоресцентната спектроскопия, тъй

като флуоресценцията се използва за преминаване от възбудено състояние към основно

състояние, докато абсорбционните мерки преминават от основното състояние към

възбудено състояние (28). UV / Vis спектроскопия може да бъде използвана за

количествено определяне на различни аналити, например, силно конюгирани органични

съединения и биологични макромолекули. Спектроскопичният анализ се извършва в

разтвори, но могат да се изследват и твърди вещества и газове.

Beckman DU640 UV/Vis спектрофотометър.

Трансформираща инфрачервена спектроскопия на Фурие: трансформиращата

инфрачервена спектроскопия на Фурие (FTIR) е техника, която се използва за получаване

на инфрачервен спектър на абсорбция или емисия на твърдо вещество, течност или газ.

Фактът, че спектрометър FTIR събира едновременно данни с висока спектрална

разделителна способност в широк спектрален диапазон, дава значително предимство

пред дисперсионен спектрометър, който измерва интензитета на тесен диапазон от

дължини на вълните наведнъж. Целта на всяка техника, свързана с абсорбционната

спектроскопия, е да се измери колко добре пробата абсорбира светлината при всяка

дължина на вълната. Това може да стане чрез излъчване на монохромен лъч в проба,

измерване на абсорбцията на светлината и след това да се повторят тези стъпки за всяка

различна дължина на вълната.

Трансформиращата инфрачервена спектроскопия на Фурие може да се използва за

получаване на резултати по по-малко интуитивен начин. Вместо да излъчва монохромен



светлинен лъч в пробата, тази техника осветява лъча, съдържащ много честоти на

светлина наведнъж, и измерва колко от този лъч се абсорбира от пробата. След това

лъчът може да бъде модифициран, за да съдържа различни комбинации от честоти, като

дава втора точка за данни. Този процес се повтаря многократно. След това компютърът

взема всички тези данни и работи назад, за да направи заключение за абсорбцията при

всяка дължина на вълната (29).

AAS: Атомната абсорбционна спектроскопия (AAS) се отнася до спектроаналитичен метод,

който се използва за количествено определяне на много химически елементи чрез

използване на абсорбцията на светлина от свободни атоми, които съществуват в газовото

състояние. В аналитичната химия, техниката се използва за определяне на

концентрацията на даден елемент (наречен аналит) в пробата, която трябва да се

анализира. AAS е в състояние да определи над 70 различни елемента, съществуващи в

разтвор или директно във всяка твърда проба, която се използва във фармакологията,

биофизиката и токсикологичните изследвания. AAS се използва широко в областта на

химията, при анализа на биологични флуиди, тъкани като кръв, слюнка и др. Използва се

и при анализа на крайния лекарствен продукт по отношение на количеството на

катализатора, което остава в него (30).

Инструмент за пламъчна атомна абсорбционна спектроскопия

Инфрачервена спектроскопия: NIRS е спектроскопичен метод, който използва близката

инфрачервена област на електромагнитния спектър (700 nm до 2500 nm). Типичните

приложения включват диагностика и изследвания. Съществуват и множество приложения

в други области, като фармацевтичния, хранителния и агрохимичния контрол на



качеството, нещо, което ни интересува. NIRS се прилага широко в селското стопанство за

определяне на качеството на плодовете, зеленчуците, яйцата и млечните продукти, кафе,

чай и подправки. Чрез използването на NIRS можем да определим количествено

съставите на тези продукти по надежден, бърз, евтин и неразрушителен начин (31). Затова

е много важно да използваме NIRS за определяне на качеството на нашите крайни

продукти и смеси от крайни продукти по отношение на лечебните растения.

Спектрофотометър: Спектрофотометърът се използва за измерване на пропускливостта

или отразяването на разтвори и други форми на вещество, като прозрачни или

непрозрачни твърди вещества, полирано стъкло или газове. Безцветните биохимикали

могат да бъдат превърнати и да бъдат оцветени, за да бъдат подходящи за реакции, които

образуват хромогенни съединения и след това да извършат колориметричен анализ (32).

Спектрофотометрията е често използвана техника за важни измервания, включително

тези на ензимните активности, определянето на протеиновите концентрации и

определянето на ензимните кинетични константи. В крайна сметка, когато използваме

спектрофотометър, ние сме в състояние да определим веществата, присъстващи в

целевата проба, и колко точно има, чрез изчисления на наблюдаваните дължини на

вълните, което е полезно, когато целта е правенето на смес от лечебни растения или

екстракт.

GC - MS: Газовата хроматография - масспектрометрия (GC - MS) е аналитичен метод, който

комбинира характеристиките на газова хроматография и масспектрометрия за

идентифициране на различни вещества в рамките на дадена проба (33). От многото

приложения на GC-MS, някои включват откриване на лекарства, анализ на околната среда

и идентифициране на неизвестни проби (полезни, когато изследваме проба от неизвестно

растение или смес). Още по-интересно е, че GC-MS може да идентифицира

микроелементи в материали, за които се смята, че са се разпаднали отвъд

идентификацията чрез анализ и откриване дори на най-малките количества от дадено

вещество. Машината GC-MS се състои от два основни блока: газов хроматограф и

масспектрометър. Що се отнася до техниката, тя използва капилярна колона, която зависи

от размерите на колоната (дължина, диаметър, дебелина на филма), както и фазовите

свойства (например 5% фенил полисилоксан). Разделянето на молекулите, докато пробата

преминава през дължината на колоната, ще се случи поради различните химични

свойства, които различните молекули в дадена смес имат. Също така, относителният им

афинитет към стационарната фаза на колоната е фактор за отделянето. Колоната задържа

молекулите и след това те се отделят по различно време (нарича се време на задържане).

Това позволява на масовия спектрометър да улови, отклони и открие йонизираните

молекули поотделно.



GC-MS инструмент

CEDAD: Капилярната електрофореза (CE) е метод, който се извършва в капиляри и в

микрофлуидни и нано-флуидни канали. Терминът детекция на диодна матрица (DAD),

когато се използва в капилярна електрофореза (СЕ), може ефективно да предложи

подобни предимства, както при HPLC, по отношение на откриването на единична

дължина на вълната. С оптимизирана оптична система DAD дава чувствителност,

сравнима с тази на единични или променливи детектори за дължина на вълната (34).

CEDAD е полезно, когато човек се нуждае от отделяне на елементи от смес, за да ги

идентифицира, както в нашия случай, разделянето на смеси от различни елементи.

HPTCL: Високоефективната тънкослойна хроматография е форма на тънкослойна

хроматография, която се подобрява с редица подобрения, за да се увеличи

разделителната способност и по този начин да се позволи по-точни измервания (35).

Процедурата започва с помощта на плоча, в която се намират пробите, след това се

зарежда с първия разтворител. Плочата трябва да се завърти на 90 ° и след това да се

разтвари с втори разтворител.

HPLC-MS: Течната хроматография-масспектрометрия (LC-MS) се отнася до техника,

използвана от аналитични химици и може да комбинира способностите за физична

сепарация на течната хроматография с масовия анализ на масспектрометрията (MS).

Системи, които свързват MS и хроматография, са много популярни в химическия анализ,



защото индивидуалните възможности на всяка техника се подобряват синергично.

Предимството от използването на HPLC - MS е, че докато течната хроматография разделя

смесите с множество компоненти, масспектрометрията може да осигури структурната

идентичност на всеки отделен компонент както с висока молекулна специфичност, така и

чувствителност при откриване. Това е техника, която обикновено се нарича "тандемна

техника" и може да се използва за анализ на биохимични, органични и неорганични

съединения, които често срещаме в сложни проби от екологичен и биологичен произход.

Поради това LC-MS може да се прилага в широк спектър от области, включително

биотехнологии, мониторинг на околната среда, фармацевтична и агрохимическа

промишленост, което е от особен интерес, особено когато става въпрос за лечебни

растения (36, 37). В допълнение към устройствата за течна хроматография и

масспектрометрия, LC-MS система може да съдържа интерфейс, който може ефикасно да

прехвърли отделените компоненти от LC колоната в източника на йонни маси (37, 38). LC-

MS често се използва при разработването на лекарства, тъй като позволява бързо

потвърждаване на молекулната маса и структурна идентификация на изследваното

лекарство. Тези характеристики ускоряват процеса на генериране, тестване и валидиране

на откритие, започвайки от широка гама от продукти с потенциално приложение. LC-MS

може да се приложи като техника за разработване на лекарства и особено за скрининг на

лекарства in vivo, идентификация на метаболитите, идентификация на примесите,

количествена биоанализа и контрол на качеството (39).



ДНК ТЕХНИКИ

RAPD: RAPD означава "Случайно намножаване на полиморфната ДНК" (40) и е вид PCR

реакция, но амплифицираните ДНК сегменти са случайни и не са специфични. Основният

принцип на техниката е създаването на няколко произволни и къси праймери (8-12

нуклеотида), последвани от PCR, използвайки геномната ДНК и надявайки се, че някои

фрагменти ще се копират. Получените шаблони могат да бъдат изолирани и от тази

реакция можем да получим полу-уникален профил. Не се изисква познаване на ДНК

последователността на целевия геном, тъй като праймерите ще се свързват някъде в

последователността, но не е сигурно точно къде. RAPD е евтин, но мощен метод за

разпознаване и идентифициране на много бактериални видове. Може да се използва,

когато трябва да проучим почвата за създаване на лекарствени вещества и трябва да бъде

освободена от бактерии. Идентифицирането на различните щамове може да доведе до

най-добрата стратегия за тяхното премахване.

RAPD техника



RFLP: В молекулярната биология RFLP е техника, която използва вариациите, които

съществуват в хомоложните последователности на ДНК. При извършване на RFLP анализ,

пробата от ДНК трябва да бъде срязана на сегменти (разградена) чрез известни

рестрикционни ензими. След това, тези сегменти се разделят според тяхната дължина,

като се използва гел електрофореза. Тази техника е полезна, когато искаме да

илюстрираме разликата между определени проби от ДНК и да ги групираме според

моделите на рестрикция. RFLP анализът е основан от години за ранните методи за

генетично типиранее, полезен при идентифицирането на проби, често извлечени от места

на престъпления и т.н., но също и от екологични проби. Това помага при

идентифицирането на някои редки растения и техните странични продукти.

RFLP техника

ARMS: Амплификационната рефрактерна мутационна система (ARMS) е прост метод,

използван за откриване на мутации, наречени SNPs (единични нуклеотидни

полиморфизми) или много малки делеции. Техническият принцип се основава на

използването на специфични за последователността PCR праймери, които позволяват

амплификация на ДНК само когато целевият алел се съдържа в пробата. След завършване

на ARMS реакцията, наличието или отсъствието на PCR продукт е показателно за

наличието или отсъствието на целевия алел. Това може да помогне за идентифицирането

на мутирали щамове бактерии от гъбички, които могат да присъстват в крайния продукт и

също да бъдат полезни (например бактерията Bifidus Actiregularis).



CAPS: Крайна амплифицирана полиморфна последователност или CAPS метод е техника в

молекулярната биология за анализ на генетични маркери. Това е допълнение или

разширение на RFLP метода, като се използва полимеразна верижна реакция (PCR) за по-

бърз анализ на резултатите. Подобно на RFLP, CAPS също така се възползва от факта, че

различията в отделните индивиди могат да предложат нови сайтове за ограничаване на

ензимите или да премахнат съществуващите такива. Тогава тези разлики могат да бъдат

открити и анализирани. В CAPS метода, PCR амплификацията се фокусира предимно върху

промененото рестрикционно място и продуктите се разграждат с рестрикционния ензим.

Когато се извършва електрофореза с агароза или акриламидна гел, разградените PCR

продукти ще дадат отличителни профили.

AFLP: AFLP-PCR или просто AFLP е базирана на PCR техника, която се използва в

генетичните изследвания и в генното инженерство. Методът е прост и използва

рестрикционни ензими, за да се разгради ДНК и след това, специфични адаптери са

лигирани към лепливи краища, които ензимите са създали. Малка група от тези

фрагменти се подбира и намножава. Изборът се основава на използването на праймери,

които са комплементарни на адапторната последователност, последователността на

мястото на рестрикция и няколко нуклеотида във фрагментите на мястото на

рестрикцията. След амплификацията фрагментите могат да се разделят и след това да се

визуализират върху полиакриламидни гелове. Получените резултати се споменават като

полиморфизми на присъствие - отсъствие (41). Технологията AFLP има способността

едновременно да открива различни полиморфизми в различни геномни области. Тя също

е много чувствителна и възпроизводима. Всичко това, прави AFLP подходящ инструмент

за идентифициране на генетичните вариации в различни щамове на растения, животни,

гъби и др.

ISSR - PCR: ISSR (за повтаряне на прости последователности) е общ термин за геномната

област между микросателитните локуси. Допълнителните последователности към два

съседни микросателити се използват като PCR праймери, така че променливата област

между тях се амплифицира. За да се предотврати прекомерната репликация на дълги ДНК

секвенции, има ограничение за циклите на амплификация по време на този тип PCR. Това

е полезно, тъй като получените нишки на ДНК обикновено ще бъдат кратки, но с различна

дължина. Трябва да се обърне внимание на факта, че тази техника не е в състояние да

отличи индивидите, тъй като един МСС може да бъде запазен или неконсервативен

регион.



ДНК баркод: ДНК баркод е метод на таксономия и използва кратък генетичен маркер в

организма и неговата ДНК, за да го идентифицира и след това да го категоризира като

принадлежащ към определен вид (42). Филогенезата е различна, защото тук основната

цел е да се идентифицира неизвестна извадка от гледна точка на предходна

класификация (43). Въпреки че баркодовете понякога се използват в опит да се

идентифицират неизвестни видове (44), полезността на баркод на ДНК за тези цели е

обект на дебати (45). Най-известният често използван кодиращ регион за животни е

фрагмент от приблизително 600 bp и принадлежи към митохондриалния ген цитохромна

оксидаза I (COI). Това е различно при гъби, където се използва част от вътрешен

транскрибиран интервал 2 (ITS2) между rRNA гените и отново в растения, където се

използват множество региони.

Прилагането на ДНК баркод включва идентифициране на листата на растенията, дори

когато не са налице цветя или плодове, идентифициране на ларви на насекоми,

идентифициране на диетата на животно въз основа на съдържанието му в стомаха или

изпражнения (46) и идентифициране на продуктите в търговията (например билкови

добавки, дърво или кожи и други части от животните) (43). Добре характеризираният и

стандартизиран локус за ДНК баркод е оптимален. Той също така трябва да присъства в

интересните таксони, лесно последователни (47), достатъчно къси (48) и да осигуряват

големи интерспецифични, отколкото вътрешноспецифични вариации (49). За растенията,

това е конкатенацията на rbcL и matK хлоропластните гени (47, 50). Те осигуряват слаба

разделителна способност за земните растения (51, 52) и е направена покана за оценка на

регионите, които биха могли да допълнят rbcL и matK (52). За гъби, вътрешният

транскрибиран интервал (ITS) (53). Kress et al. (43) предполагат, че използването на

секвенцията COI "не е подходяща за повечето видове растения поради много по-бавна

скорост на развитие на ген на цитохром c оксидаза I при висши растения, отколкото при

животни". След това се провеждат серия от експерименти, за да се намери по-подходящ

регион от генома за използване в баркод на ДНК на цъфтящи растения (или по-голямата

група земни растения) (48). Едно от предложенията за 2005 г. е ядрената вътрешна

транскриптираща дистрибуторна област и пластидният trnH-psbA интергенен spacer; (43)

други изследователи препоръчват други региони като matK (48).

През 2009 г. голяма група от изследователи на ДНК баркод предложиха следните два

хлоропластични гени (rbcL и matK) да се използват като баркод за растенията (47).

Прибавянето на региона ITS2 се наложи за да се осигури по-добра междумерна

разделителна способност (54). Търсенето на най-добрите ДНК баркодове за растенията

продължава с последното предложение, че регионът ycf1, принадлежащ към

хлоропласта, може да бъде подходящ (51).



Литература

4. WHO (2005) Global Atlas of Traditional, Complementary and Alternative Medicine,

World Health Organisation, Geneva

19. Ong, E. S. (2002) J. Sep. Sci., 25, 825–831.

20. Liang, Y. Z., Xie, P., and Chan, K. (2004) J. Chromatogr. B, 812, 53–70.

21. Nikam, P. H., Kareparamban, K., Jadhav, A., et al. (2012) J. Appl. Pharma. Sci., 2, 38–44.

22. . Heubl G (2010) New aspects of DNA-based authentication of Chinese medicinal plants

by molecular biological techniques. Planta Med 76: 1963-1974.

23. Harry W. Lewis & Christopher J. Moody (13 Jun 1989). Experimental Organic Chemistry:

Principles and Practice (Illustrated ed.). WileyBlackwell. pp. 159–173.

24. A.I. Vogel; A.R. Tatchell; B.S. Furnis; A.J. Hannaford & P.W.G. Smith. Vogel's Textbook of

Practical Organic Chemistry (5th ed.).

25. Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C. (2004).

"Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using

3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and

production working under current good manufacturing practice". Journal of

Chromatography

26. Pavia, Donald L., Gary M. Lampman, George S. Kritz, Randall G. Engel (2006).

Introduction to Organic Laboratory Techniques (4th Ed.). Thomson Brooks/Cole. pp. 797–

817.

27. Linde AG. "Gas Chromatography". Retrieved 11 March 2012.

28. Skoog, Douglas A.; Holler, F. James; Crouch, Stanley R. (2007). Principles of Instrumental

Analysis (6th ed.). Belmont, CA: Thomson Brooks/Cole. pp. 169–173

29. Griffiths, P.; de Hasseth, J.A. (18 May 2007). Fourier Transform Infrared Spectrometry

30. "Robert Bunsen and Gustav Kirchhoff". Chemical Heritage Foundation. Retrieved 2014-

07-29.

31. Burns, Donald; Ciurczak, Emil, eds. (2007). Handbook of Near-Infrared Analysis, Third

Edition (Practical Spectroscopy). pp. 349–369

32. Ninfa, Alexander J.; Ballou, David P.; Benore, Marilee (2010). Fundamental Laboratory

Approaches for Biochemistry and Biotechnology (2nd ed.). p. 65

33. O. David Sparkman; Zelda Penton; Fulton G. Kitson (17 May 2011). Gas Chromatography

and Mass Spectrometry: A Practical Guide. Academic Press.



34. Graham Kemp, Capillary electrophoresis: a versatile family of analytical techniques

Archived April 27, 2006, at the Wayback Machine. Biotechnology and Applied Biochemistry

(1998) 27, (9–17)

35. Nurok, David (1989). "Strategies for optimizing the mobile phase in planar

chromatography". Chemical Reviews. 89 (2): 363–375. doi:10.1021/cr00092a007

36. Chaimbault, Patrick (2014-01-01). Jacob, Claus; Kirsch, Gilbert; Slusarenko, Alan;

Winyard, Paul G.; Burkholz, Torsten, eds. Recent Advances in Redox Active Plant and

Microbial Products. Springer Netherlands. pp. 31–94. doi:10.1007/978-94-017-8953-0_3

37. Dass, Chhabil (2007-01-01). Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. John

Wiley & Sons, Inc. pp. 151–194. doi:10.1002/9780470118498.ch5. ISBN 9780470118498.

38. Pitt, James J (2017-03-12). "Principles and Applications of Liquid Chromatography-Mass

Spectrometry in Clinical Biochemistry". The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1): 19–34. ISSN

0159-8090

39. Lee, Mike S.; Kerns, Edward H. (1999). "LC/MS applications in drug development". Mass

Spectrometry Reviews. 18 (3–4): 187–279. doi:10.1002/(SICI)1098-

2787(1999)18:3/4<187::AID-MAS2>3.0.CO;2-K

40. rDNA: Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD)". www.rvc.ac.uk. Retrieved

2016-06-03.

41. Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. (November 1995). "AFLP: a new technique for DNA

fingerprinting". Nucleic Acids Res. 23 (21): 4407–14. doi:10.1093/nar/23.21.4407

42. Paul DN Hebert, et al. (2003). "Biological identifications through DNA barcodes".

Proceedings of the Royal Society B. 270: 313–321.

43. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (June 2005). "Use of DNA

barcodes to identify flowering plants". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23): 8369–74.

44. Koch, H. (2010). "Combining morphology and DNA barcoding resolves the taxonomy of

Western Malagasy Liotrigona Moure, 1961"

45. Seberg O, Petersen G. (2009). Stout, Jane Catherine, ed. "How Many Loci Does it Take to

DNA Barcode a Crocus?". PLoS ONE. 4 (2): e4598.

46. Eeva M Soininen, et al. (2009). "Analysing diet of small herbivores: the efficiency of DNA

barcoding coupled with high-throughput pyrosequencing for deciphering the composition

of complex plant mixtures". Frontiers in Zoology. 6: 16. doi:10.1186/1742-9994-6-16

47. Chase, Mark W.; Soltis, Douglas E.; Olmstead, Richard G.; Morgan, David; Les, Donald H.;

Mishler, Brent D.; Duvall, Melvin R.; Price, Robert A.; Hills, Harold G.; Qiu, Yin-Long; Kron,

Kathleen A.; Rettig, Jeffrey H.; Conti, Elena; Palmer, Jeffrey D.; Manhart, James R.; Sytsma,



Kenneth J.; Michaels, Helen J.; Kress, W. John; Karol, Kenneth G.; Clark, W. Dennis; Hedren,

Mikael; Gaut, Brandon S.; Jansen, Robert K.; Kim, Ki-Joong; Wimpee, Charles F.; Smith,

James F.; Furnier, Glenn R.; Strauss, Steven H.; Xiang, Qui-Yun; Plunkett, Gregory M.; Soltis,

Pamela S.; Swensen, Susan M.; Williams, Stephen E.; Gadek, Paul A.; Quinn, Christopher J.;

Eguiarte, Luis E.; Golenberg, Edward; Learn, Gerald H.; Graham, Sean W.; Barrett, Spencer C.

H.; Dayanandan, Selvadurai; Albert, Victor A. (1993). "Phylogenetics of Seed Plants: An

Analysis of Nucleotide Sequences from the Plastid Gene rbcL". Annals of the Missouri

Botanical Garden

48. Kress WJ, Erickson DL (2008). "DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics".

PNAS. 105 (8): 2761–2762. doi:10.1073/pnas.0800476105

49. Renaud Lahaye; et al. (2008-02-26). "DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots".

Proc Natl Acad Sci USA. 105 (8): 2923–2928.

50. Hollingsworth, P. M.; Forrest, L. L.; Spouge, J. L.; Hajibabaei, M.; Ratnasingham, S.; van

der Bank, M.; Chase, M. W.; Cowan, R. S.; Erickson, D. L.; Fazekas, A. J.; Graham, S. W.;

James, K. E.; Kim, K.-J.; Kress, W. J.; Schneider, H.; van AlphenStahl, J.; Barrett, S. C.H.; van

den Berg, C.; Bogarin, D.; Burgess, K. S.; Cameron, K. M.; Carine, M.; Chacon, J.; Clark, A.;

Clarkson, J. J.; Conrad, F.; Devey, D. S.; Ford, C. S.; Hedderson, T. A.J.; Hollingsworth, M. L.;

Husband, B. C.; Kelly, L. J.; Kesanakurti, P. R.; Kim, J. S.; Kim, Y.-D.; Lahaye, R.; Lee, H.-L.;

Long, D. G.; Madrinan, S.; Maurin, O.; Meusnier, I.; Newmaster, S. G.; Park, C.-W.; Percy, D.

M.; Petersen, G.; Richardson, J. E.; Salazar, G. A.; Savolainen, V.; Seberg, O.; Wilkinson, M. J.;

Yi, D.-K.; Little, D. P. (2009). "A DNA barcode for land plants". Proceedings of the National

Academy of Sciences. 106 (31): 12794–12797

51. Dong, W.; Xu, C.; Li, C.; Sun, J.; Zuo, Y.; Shi, S.; Cheng, T.; Guo, J.; Zhou, S. (2015), "ycf1,

the most promising plastid DNA barcode of land plants", Scientific Reports, 5: 8348

52. China Plant, B.O.L.G.; Li, D.-Z.; Gao, L.-M.; Li, H.-T.; Wang, H.; Ge, X.-J.; Liu, J.-Q.; Chen,

Z.-D.; Zhou, S.-L.; Chen, S.-L.; Yang, J.-B.; Fu, C.-X.; Zeng, C.-X.; Yan, H.-F.; Zhu, Y.-J.; Sun, Y.-

S.; Chen, S.-Y.; Zhao, L.; Wang, K.; Yang, T.; Duan, G.-W. (2011), "Comparative analysis of a

large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the

core barcode for seed plants", Proceedings of the National Academy of Sciences, 108 (49):

19641–19646, doi:10.1073/pnas.1104551108

53. Fungal Barcoding Consortium (February 24, 2012). "Nuclear ribosomal internal

transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi". PNAS. 109

(16): 6241–6246. doi:10.1073/pnas.1117018109

54. Chen, S.; Yao, H.; Han, J.; Liu, C.; Song, J.; Shi, L.; Zhu, Y.; Ma, X.; Gao, T.; Pang, X.; Luo, K.;

Li, Y.; Li, X.; Jia, X.; Lin, Y.; Leon, C. (2010), "Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA

Barcode for Identifying Medicinal Plant Species", PLoS ONE, 5 (1): e8613



55. ISO 9000:2005, Clause 3.2.11

56. "Quality Assurance vs Quality Control - Learning Resources

57. The Marketing Accountability Standards Board (MASB) endorses this definition as part

of its ongoing Common Language in Marketing Project

Documents

Title of Module · разтвори, но могат да се изследват и твърди вещества и газове. ... В аналитичната химия, техниката