TÜRK FARMAKOLOJİ DERNEĞİ

XVI. FARMAKOLOJİ EĞİTİM SEMPOZYUMU

GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDE KULLANILAN

FARMAKOLOJİK METODLAR

18 MAYIS 2009 ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ

AYDIN

XVI. Farmakoloji Eğitim Sempozyumları Programı

GASTROİNTESTİNAL SİSTEMDE KULLANILAN FARMAKOLOJİK METODLAR

18 Mayıs 2009 Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Aydın

TOPLANTI PROGRAMI

09.00 – Kayıt

09.30 – Açılış konuşmaları

10.00 – Gastrointestinal Sistem: in vitro çalışmalar

Prof. Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR

11.00 – Kahve arası

11.30 – Gastrointestinal Motilite Ölçüm Yöntemleri

Prof. Dr. Berrak YEĞEN

12.30 – Öğle yemeği

14.00 – Ülser Modelleri

Doç.Dr. Halis SÜLEYMAN

15.00 – Kahve arası

15.30 – Deneysel Kolit Modelleri

Yrd.Doç.Dr. Turhan DOST

16.30 – Tartışma ve Kapanış

Gastrointestinal Sistem Düz kaslarında İn Vitro Farmakolojik Araştırmalar

Prof. Dr. Kansu BÜYÜKAFŞAR

Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı

Bu derlemede gastrointestinal sisteme ait çeşitli doku ve organlarla ilgili farmakolojik çalışma esasları, protokolleri ve ölçüm yöntemleri konusunda bilgiler toplanmıştır. Özofagustan anal sfinktere kadar olan gastrointestinal sistem dokuları ele alınacaktır. Ancak sayfa sayısı çok artacağı için her bir gastrointestinal segmente ait özellikler detaylı olarak verilmeyecektir, onun yerine sadece ilgili dokunun temel özellikleri ve kısa deneysel protokollerle beraber ölçme ve değerlendirme konuları hakkında kısa bilgiler verilecektir.

Gastrointestinal düz kas preparatlarıyla yapılacak in vitro organ banyosu çalışmalarında, klasik izole organ-banyosu çalışma kuralları uygulanır. Örneğin, sabit sıcaklıkta deneylerin yapılması gerekmektedir. Bu amaçla bugün daha çok sabit sıcaklık aralığı oluşturan dolaşımlı su banyoları kullanılmaktadır. Sıcakkanlı türlerin dokuları için bu sıcaklık genellikle 37 0C’dir, ancak bazen dokunun spontan yanıtlarını ya da farmakolojik ajanlara verdiği cevapları stabilize etmek için daha düşük sıcaklıklar da (örneğin duodenum dokusunda bazen 35 0C’nin seçilmesi gibi) tercih edilebilir. Dokunun içinde bulunduğu ortamın pH’sı 7.4 olmalıdır. Bunun için uygun tamponlar (bikarbonat gibi) ve gaz karışımları (genellikle % 95 O2+ % 5 CO2) kullanılmalıdır. Transdüsır olarak genellikle izometrik transdüsırlar kullanılabildiği gibi izotonik veya oksotonik transdüsırlar da kullanılabilir. Diğer taraftan dokuya uygulanacak en uygun ön gerimin tespiti de önemlidir. Bu amaçla öncelikle üzerinde deney yapılacak dokuda esaslı kasılma oluşturan bir ajan seçilir (genellikle yüksek K+ kullanılır ancak karbakol

veya metakolin gibi kolinerjik agonistler veya prostaglandin F2 gibi prostanoidler de uygulanabilir).

Optimum tansiyon tespiti şu şekilde yapılır: Organ banyosunda asılmış dokuya belli bir ön yük uygulanır (örneğin 0.2 g). Bunu takiben dokuya maksimum kasılma oluşturan bir ajan tek doz halinde uygulanır. Maksimum kasılma elde edildikten ve doku taze fizyolojik solüsyonla yıkandıktan sonra dokunun ön gerimi basamaklı olarak artırılır (örneğin 0.2 gramdan 0.3 grama getirilir) sonra yine aynı ajan aynı konsantrasyonda uygulanır. Maksimum kasılma elde edildikten ve doku yıkandıktan sonra bu kez ön gerim bir basamak daha artırılır (örneğin 0.4 g). Bu işlem, aynı ajanla en yüksek maksimum kasılmanın elde edildiği ön gerim saptanıncaya kadar sürdürülür. Optimum tansiyon (örneğin 0.7 g) bulunduktan sonra aynı tür ve seks ve aynı/benzer ağırlıktaki deney hayvanlarından elde edilen aynı boyutlardaki preparatlara bu ön gerim uygulanır ve aynı/benzer şartlarda deneyler sürdürülür. Dokuların dengelenmesi için belli bir istirahat süresine izin verilmelidir. Bu süre, dokudan dokuya fark etmekle beraber ortalama 1 saat civarındadır. İstirahat esnasında doku atık ve artıklarının uzaklaştırılması ve dokunun elastikiyetinin sağlanması için ortalama her 15 dakikada bir banyo içeriği taze fizyolojik sıvıyla yer değiştirilmelidir. Doz-cevap yanıtları, kümülatif olarak ajanların logaritmik (10-x, 3x10-x, 10-x+1, 3x10-x+1, 10-x+2, 3x10-x-2... M), aritmetik (1, 2, 4, 8, 16 Hz) ya da onar onar (10-x, 10-

x+1, 10-x+2, 10-x+3, … M gibi) uygulanmasıyla elde edilebildiği gibi bireysel olarak her bir konsantrasyonun uygulanmasıyla da elde edilebilir. Test edilecek ajanlar ve onların çözücülerinin banyo hacminin en fazla % 1 oranında uygulanmasına özen gösterilmelidir. Örneğin 10 ml’lik bir organ banyosuna verilecek çözücü/ajan en fazla 0.1 ml hacim içinde uygulanmalıdır. Diğer taraftan kümülatif doz-cevap çalışmalarında uygulanan toplam hacım, banyo hacminin % 5’ini aşmamalıdır.

Özofagus: Bu organın başlıca fonksiyonu besinlerin ağızdan mideye taşınmasıdır. Bu taşıma işine aracılık eden 2 temel peristaltik hareket vardır. Bunlar primer ve sekonder peristaltik dalgalardır. Primer peristaltik hareket, yutmanın özofageal safhasında farenksten başlayıp özofagusa yayılan peristaltik dalganın basit bir devamıyken, sekonder dalga besinin özofagus çeperinde oluşturduğu distansiyonla (gerilme) tetiklenir. Özofagusun 3 fonksiyonel bölgesi bulunmaktadır; bunlar 1) Üst özofagus bölgesi, 2) Özofagus gövdesi ve 3) Alt özofageal sfinkter.

i. Üst özofagus: Üst özofageal dokunun fonksiyonlarının araştırılmasında kurbağanın üst özofagus sirküler şeritleri kullanılabilir. Bu preparat, ön kastırılmayı takiben elektriksel uyarı ile çok karekteristik tekrarlanabilen gevşemeler oluşturur. Bu gevşemeden tamamen sorumlu mediyatör, nitrik oksiddir (NO) çünkü nitrik oksid sentaz inhibitörü olan NG-nitro-L-arginin, elektriksel uyarı ile elde edilen gevşemeleri ortadan kaldırır; ayrıca ilave kasılmalar da oluşturur (Şekil 1).

Şekil 1. Kurbağa üst özofagus sirküler şeritlerinde elektriksel uyarıyla oluşturulan nitrik oksid aracılı gevşemeler (Büyükafşar, 1994).

Özofagus gövdesi: Özofagus gövdesinde peristaltik kasılmalara aracılık eden iki farklı kas yapısı görev almaktadır. Oranları türden türe değişmek üzere, özofagusun üst bölgelerinde dokunun fonksiyonel ve anatomik yapısının daha ziyade çizgili kas tabakası oluştururken, alt bölgelerde düz kas yapısı hakimdir. Yutmanın istemli olarak başlatılmasıyla devreye giren çizgili kaslar, bolusun (gıda vs) aşağı doğru hareketini başlatır. Bunu takiben özofageal düz kasların da devreye girmesiyle yukarıdan yayılan peristaltik hareketler, alt özofagus sfinkterine kadar ulaşır. Özofagus düz kasında barsak düz kaslarından farklı olarak spontan peristaltik aktiviteler görülmez. Özofagusun elektriksel uyarı (kare puls) ile uyarılması ya da balon distansiyonu ile gerilmesi peristaltik hareketleri tetikler ve bu hareketler atropine kısmen duyarlıdır; dolayısıyla kolinerjik sinir stimülasyonu bu cevaplara kısmen aracılık etmektedir. Diğer taraftan, uyarı kesildikten sonra “off” kasılmalar da görülmektedir. Bu cevaplara olasılıkla taşikininerjik mediyatörler (P maddesi, nörokinin, bombezin gibi) katkı sağlamaktadır. Ayrıca çok sayıda nörotransmiter, ko-transmiter ve mediyatör, özofagus peristaltik yanıtlarını düzenleyebilmektedir. Sıçan özofagus tunica muscularis mukoza preparatı 5-HT4 reseptör özelliklerinin araştırılması için tavsiye edilmektedir çünkü bu reseptör bakımından zengindir;

serotoninin belirgin gevşeme yanıtlarına aracılık eder. Ayrıca -adrenoseptörlerin özellikleri de bu dokuda araştırılabilir.

Özofagus dokusu, anesteziklerin ve çeşitli peptidlerin, KCl veya kolinerjik ajanlarla oluşturulan kasılmalar üzerindeki etkilerinin araştırılması için de kullanılabilir.

ii. Alt özofageal sfinkter: Alt özofagus sfinkteri tonik olarak kapalı durumdadır. Yukarıdan gelen ve özofagus duvarı boyunca yayılan peristaltik dalga, alt özofagus sfinkterinde inhibisyon oluşturarak sfinkterin gevşemesini ve besinin mideye geçişini sağlar. Tonik kasılmadan sorumlu mekanizma, daha ziyade sempatik sinir stimülasyonu iken, gevşemeden sorumlu mekanizma, nitrerjik ara nöronlardan kısa yarılanma ömrüne sahip NO’in salıverilmesidir. Alt özofagus sfinkteri ile farmakolojik ilaç araştırmaları, esasen bu sfinkterdeki bozuklukla karekterize hastalıkların (akalazya, gastroözofageal reflü gibi) patofizyolojisinin aydınlatılması ve uygun tedavi rejimlerinin seçilmesi amacıyla yapılır. Ayrıca, moleküler düzeyde reseptörler, nörotransmiterler ve sinyal ileti mekanizmaları konuları da araştırılabilir.

Şekil 2. Sıçan alt özofagus sfinkter sirküler şeritlerinde elektriksel uyarı (40 V, 1 ms, 1 s, 0.1 Hz) ile oluşturulan fazik kasılmaların proton pompa inhibitörü omeprazol tarafından baskılanması (üst panel). Aynı dokunun spontan kasılmalarına lansoprazolün etkisi (alt panel). Lansoprazol, hem kasılmanın frekansını hem de amplitüdünü azaltırken, bazal tonusu da düşürmektedir (Yurtsever ve ark., 2007).

Mide: Kemirgen türlerinde mide düz kasının farmakolojik/fizyolojik araştırmalarında büyük ölçüde midenin fundus bölgesi kullanılır. Ancak uygun türlerin korpus ve antrum bölgeleri ile de deneysel çalışmalar yapılmaktadır. Kemirgen türlerinde gastrik fundus bölgesi, farklı renk (sedef rengi gibi) ve görüntüsü (miğfer gibi) ile kolaylıkla ayırt edilir. Bu bölge izole edilerek hem longitüdinal hem de sirküler şeritler haline getirilebilir ve böylece düz kas kontraktil mekanizmaları, nörotransmiter salıverilmesi, süperfüzyon deneyleri ve gastrik asid salıverilmesi gibi pek çok konuda araştırmalar yapılabilir. Gastrik fundusla çalışırken deney hayvanının bir gece önceden aç bırakılmasına dikkat edilmelidir. Bu düz kas yanıtların optimum bir şekilde elde edilmesi için gereklidir. Gastrik fundus preparatlarında esasen düz kas tabakası dışında bir de mukoza tabakası bulunmaktadır. Bu tabaka, küçük türlerde (fare, sıçan gibi) genellikle intakt bırakılır; dokunun gösterdiği mekanik yanıtlardan hemen tamamen düz kas tabakası sorumludur. Bazı türlerden elde edilen gastrik fundus preparatlarında bazen mukoza şişebilir, dökülebilir ya da organ banyosu ortamına çeşitli maddeler salgılayabilir veya dokunun kalınlığını çok artırıp preparasyonda güçlük çıkartabilir ve ayrıca dokunun reaktivitesini bozabilir. Bu bakımdan bazı türlerde (özellikle kobay ve tavşandan daha büyük türlerde örneğin kedi, köpek, koyun, sığır ve insan gibi) mukoza cerrahi makas yardımıyla mekanik olarak disseke edilip uzaklaştırılabilir. Mide fundusunun sirküler ve longitüdinal preparatında asetilkolin, histamin, serotonin, kolesistokinin, KCl, P maddesi ve nörokininler gibi taşikininler, BaCl2 ve prostaglandinlerin kastırıcı etkilerinin yanısıra papaverin, izoprenalin, adrenalin, opioid peptidler, Ca2+ kanal blokörleri, NO donörleri ve gastrik fundal düz kasında kasılma oluşturan fizyolojik stimulusların antagonistlerinin inhibitör ya da gevşetici etkileri araştırılabilir. İzole organ banyosunda ayrıca

elektriksel uyarı cevapları da değerlendirilebilir. Elektriksel uyarıyla oluşan cevaplarda (kasılma ya da gevşeme) nöronların katkısını anlamak için Na+ kanal blokörü tetrodotoksin (TTX, ortalama 10-6 M) genellikle yeterli olmaktadır. TTX ile cevaplar ortadan kalkarsa bu cevabın nörojenik olduğunu gösterebilir. Bunun yanı sıra radyoaktif işaretli prekürsörler (örneğin 3H-kolin gibi) ile inkübe edilerek kolinerjik sinir stimülasyonunu takiben nörotransmiter asetilkolin sentez ve salıverilme hızı ve derecesi ölçülebilir.

Pilor sfinkteri: İn vitro ya da in situ olarak mide boşalma süresini ölçmek ya da duodenal reflü konusunu araştırmak ya da sirküler düz kası gelişmiş bir doku üzerinde çalışılmak istendiğinde kullanılır. Pilorik sfinter dokusunda alt özofagus sfinkterinde yapılan deneylere benzer farmakolojik araştırmalar yapılabilir.

Duodenum: Duodenum düz kasında nörojenik ve myojenik doku cevapları, hormonların, otakoidlerin ve ilaçların bu yanıtlar üzerindeki olası etkileri ve bunların mekanizmaları araştırılabilir. Diğer taraftan pek çok gastrointestinal düz kas preparatında olduğu gibi duodenal düz kasta da kasılma-gevşeme mekanizmalarının detayları hem fonksiyonel organ banyo çalışmalarıyla hem de moleküler yöntemler kullanılarak incelenebilir.

Safra Kesesi: Safra kesesinin kasılması esas olarak safra asid ve tuzlarının duodenuma transferini sağlar. Karaciğer tarafından üretilen safra asid/tuzlarının salıverilmesinde safra kesesi ve koledok kanalının basınçları ile Oddi Sfinkterinin tonusu belirleyici olmaktadır. Safra kesesi kontraksiyonlarına aracılık eden pek çok sayıda mediyatör bulunmaktadır. Başlıcalar asetilkolin ve kolesistokinindir.

Ayrıca, endotelin-1, nörokininler, -agonistler, histamin ve serotonin de kasılmalar oluşturabilmektedir. Oddi sfinkterinin kasılma ve gevşeme mekanizmaları da araştırılabilir. Burada etkili olabilen nörotransmiterler, asetilkolin, taşikininler, nitrik oksid, vazoaktif intestinal peptid (VIP), hipofiz adenilat siklaz aktive edici peptid (PACAP), kalsitonin ile ilişkili peptid (CGRP) ve serotonindir.

Jejunum: Barsağın duodenumdan sonra gelen segmenti olup çeşitli türlerden izole edilen jejunum dokusunda aşağıda ileum segmenti için bahsedilen şekilde deneyler dizayn edilebilir.

İleum: İleum dokusunda elektriksel uyarıyla oluşturulabilecek kasılma ve gevşemelerin doğası araştırılabilir. Ayrıca çeşitli ajanlarla indüklenen gerek ileal reaktivite gerekse ileal mukozal salgılama ve absorpsiyon fonksiyonları test edilebilir. İnce barsağın ileum kısmı, diğer barsak segmentleri gibi sempatik ve parasempatik otonomik sinirler tarafından inerve edilir. Bu sinirler, ince barsağın longütidinal ve sirküler düz kas tabakası arasında yerleşmiş olan ve yaygın dağılım gösteren Myenterik pleksus (Auerbach) ile mukozaları inerve eden ve mukozal hücrelerin salgılama ve absorpsiyon olaylarını kontrol eden Meissner pleksusunu oluştururlar. Longütidinal düz kaslar barsağın dış yüzünde bulunurken, sirküler düz kaslar daha derinde lokalize olurlar. Bu dokuda sempatik ve parasempatik nörotransmiterler tarafından uyarılan kolinerjik ve adrenerjik reseptörlerin yanı sıra pek çok sisteme ait reseptörler de bulunmaktadır (örneğin, taşikinin, opioid, kannabinoid reseptörler ile purinerjik ve peptiderjik sisteme ait reseptörler gibi). Dolayısıyla ileum preparatında sadece nöronal çalışmalar değil aynı zamanda reseptör dağılımı ve fonksiyonları ile ilgili araştırmalar yapılabilir. Buna ek olarak, barsak dokusu kas olarak düz kas içerdiği için düz kas kasılma ve gevşeme mekanizmalarının araştırılmasıyla ilgili çalışmalar yapılmaktadır. İleum ayrıca histamin için biyoesey dokusu olarak da kullanılır. Özellikle kobay ileumu histaminin yaptığı kasılma yanıtlarına oldukça duyarlıdır ve bu dokuda bilinmeyen histamin konsantrasyonu, doz cevap çalışmalarıyla rahatlıkla tespit edilebilir.

İleum dokusu organ banyosuna monte edilirken iki ucunun da açık olmasına dikkat edilmelidir aksi takdirde ileum lümeninde oluşmaya devam eden mukus, içeride hapsolunca barsakta distansiyon oluşturabilir ve böylece buna bağlı spontan aktiviteler ya da stabil olmayan bazal tonus meydana gelebilir. Aynı duruma diğer barsak segmentleri ile çalışırken de dikkat edilmelidir.

Bazı durumlarda ileumun mukoza tabakası olmaksızın sadece nöron içeren düz kas tabakasında farmakolojik araştırmalar yapılabilir. Bu durumda ileumdan miyenterik pleksus içeren longitüdinal düz kas preparatı hazırlanır. Bu amaçla içi nazikçe temizlenmiş 4-5 cm’lik ileum segmenti uygun kalınlıkta bir pipetin üzerine yerleştirilir. Mezenterik damar bağlantıları referans alınarak fizyolojik sıvıya (genellikle Tyrode solüsyonu) bandırılmış temiz bir pamuk ile sağa ya da sola doğru silme eylemi yapar gibi longitüdinal kas tabakası sıyrılır. İleumun dairesel ekseni etrafında bu işlem tamamlanır ve sonunda zarımsı bir kas tabakası elde edilir. Uçlarından ipek ya da pamuk iple bağlanır ve izole organ banyolarına yerleştirilir. Bu preparatta yukarıda bahsedildiği gibi çok değişik deney protokolleri icra edilebilir.

İleokolonik kavşak: İleokolonik kavşak, düz kas tabaksının sirküler olarak yerleşmesiyle meydana

gelen güçlü bir düz kas tabakasıdır. Tonik olarak sempatik sistem hakimdir. Bu yapıda hem 1 hem de

2 adrenoseptörler, söz konusu tonusun oluşumuna katkıda bulunur. Bu dokuda aynı alt özofagus ve pilor sfinkterinde olduğu gibi deneysel çalışmalar yapılabilir. Eksitatör sempatik ve inhibitör nitrerjik nörotransmisyon çalışmaları yapılabildiği gibi reseptör ve düz kas kasılma/gevşeme olayları da incelenebilir. Ayrıca inhibitör (gevşetici) mediyatörün doğasının aydınlatılmasıyla ilgili çalışmalarda süperfüzyon tekniğinde donor doku olarak da kullanılabilir. Zira köpek ileokolonik kavşağında karekterizasyonu büyük ölçüde nitrik okside benzeyen transfer edilebilen bir faktörün varlığı bu şekilde gösterilmiştir.

Kolon: Özofagustan anal sfinktere kadar uzanan tüm gastrointestinal dokularda, interstisyel Cajal hücrelerinin oluşturduğu tempocu (pacemaker) aktivitenin bir sonucu olarak, spontan ritmik aktiviteler oluşur. Bu kasılmalar üzerinde farmakolojik araştırmalar yapılabilir. İleum ve diğer ince barsak segmentleriyle karşılaştırıldığında kalın barsak düz kaslarındaki spontan hareketlerin frekansı daha düşüktür. Buna karşılık bu düz kasların uyguladığı kuvvet daha fazladır. Kolonik propulsive hareketlerin ve kolonik düz kas kasılma/gevşeme olaylarının detaylarını araştırmak ya da patofizyolojik olarak irritabl barsak sendorumu, ülseratif kolit, megakolon, Hirschsprung hastalığı, kronik kabızlık gibi hastalık ya da sendromlarda kolon düz kasın fonksiyonlarını incelemek için bu segmente ait preparatlarla in vitro deneysel araştırmalar yapılabilir. Bu dokuda reseptör-ligand bağlanma ilişkisi, düz kas kasılmasına aracılık eden sinyal ileti mekanizmaları, hormon, nörotransmiter, otakoid ve ilaçların etkileri (örneğin bugün tedavide kullanılan bazı ilaçların prokinetik etkileri) incelenebilir. Düz kaslara ek olarak ayrıca barsak epitel hücrelerindeki iyon transport olayları uygun yöntemlerle araştırılabilir. Her ne kadar diyare ve kabızlık için barsaktaki iyon transportu primer rol oynasa da, ince ve kalın barsak motilitesinin de söz konusu iki durumda katkısı bulunmaktadır. Dolayısıyla diyare ve kabızlığın detayları, düz kas boyutunda incelenebilir.

Rektum: Kolon segmentinde yapılan pek çok araştırma rektum düz kaslarında da yapılabilir. Özel olarak defekasyon refleksinin detayları, buna aracılık eden nöronal ve humoral olaylarla reseptör-ligand bağlanma verimliliği, post- reseptör olaylar, ayrıca anal sfinkter ve rektum arasındaki koordinasyon olayları incelenebilir.

Anal Sfinkter: İnternal anal sfinkterdeki bazal tonus myojeniktir. Ancak sfinkterik gevşeme nörojeniktir ve büyük ölçüde NO salıveren nitrerjik sinir stimülasyonuna bağlıdır. Ayrıca vazoaktif intestinal polipeptid (VIP) ve karbonmonoksidin (CO) de kısmi rolleri olabilir. Spontan tonusun varlığından dolayı, internal anal sfinkter non-adrenerjik non-kolinerjik (nitrerjik) gevşemelerden sorumlu inhibitör nörotransmisyonun doğasını araştırmak için mükemmel bir model oluşturur.

Ölçme, Değerlendirme ve Sonuçların İfadesi: Gastrointestinal düz kas preparatlarında yapılan in vitro farmakolojik çalışmaların sonuçlarının ölçülmesi ve değerlendirilmesi çeşitli şekillerde yapılır. Bunlar dokunun kasılması ve gevşemesi için değişik şekillerde olur.

Kasılma için değerlendirme birkaç şekilde olmaktadır:

1. Kümülatif ya da tek tek uygulanan ajana dokunun verdiği kasılma yanıtı, ağırlık (gram), güç (Newton veya miliNewton) ya da milimetre cinsinden ölçülebilir. Ancak deneyde kullanılan dokularda boy, kalınlık ve bireysel güç farkları olacağı için sonuçların daha sağlıklı bir şekilde değerlendirilmesi amacıyla elde edilen değerler dokunun total yaş ağırlığına orantılanabilir. Gram olarak elde edilen kasılma sonuçların Newton şeklinde güç olarak ifade edilmesi için, hesaplanan gram değeri 9.81x10-3 (0.0098067) ile çarpılır. Gram şeklinde oldukça düşük seviyede kasılmalar elde edilebildiğinden dolayı genellikle bulunan değerler 1000 ile çarpılarak miliNewton şeklinde ifade edilir. Sonra bu değerler dokunun yaş ağırlığına (g) orantılanır. Yaş ağırlık tespiti için deney sonunda dokular çıkarılır ve bir kâğıt mendille üzerindeki ıslaklık alınır ve sonra basitçe uygun bir terazide tartılır.

Şekil 3. İnsan safra kesesi düz kasında karbakolle indüklenen kasılmaların (miliNewton) yaş doku ağırlığına (g) oranlanarak ifade edilmesine bir örnek (Büyükafşar ve ark., 2006).

2. Alternatif olarak esas deney serilerinden önce ilgili dokuda bir ajanla maksimum kasılma oluşturulur ve bu değer 100 kabul edilip deney serisindeki kasılma değerleri buna orantılanır, böylece % kasılma olarak sonuçlar ifade edilebilir.

Şekil 4. İzole fare gastrik fundusunda eksitatör bir ajanla oluşturulan kasılmaların KCl ile indüklenen maksimum kasılmaya orantılanması (Güldalı ve ark. Yayımlanmamış veri).

3. Sonuçların bir başka şekilde ifadesi şu şekilde yapılabilir: İki seri halinde yapılan deneylerde ikinci seri kasılma cevapları, birinci seriye orantılanıp 100 ile çarpılır. Böylelikle kasılmalar, ikinci serinin birinci seriye % oranları şeklinde ifade edilir.

Şekil 5. Koyun safra kesesinde iki seri halde yapılan elektriksel uyarı sonucu elde edilen kasılma yanıtları. İkinci seri kasılmalar, birinci seri kasılmaların yüzdesi (%) olarak ifade edilmiştir (Şahan-Fırat ve ark., 2005).

Gevşeme cevaplarının değerlendirilmesi de yukarıdakilere benzer bir şekilde yapılır.

1. Genellikle bir ajanla ön kastırılmış dokular üzerinde gevşeme yanıtları elde edilir; bu durumda ön kasılma değeri 100 kabul edilip gevşemeler bunun yüzdesi olarak ifade edilir.

Şekil 6. Karbakolle ön kasılma oluşturulmuş kurbağa üst özofagus sirküler şeritlerinde elektriksel uyarının oluşturduğu NO aracılı cevaplar. Karbakol kasılma değeri 100 kabul edilerek elektriksel uyarı ile oluşturulan gevşemeler bunun %’desi olarak ifade edilmiştir (Büyükafşar, 1994).

2. Bazen ön kastırılmaya rağmen deney serisinin sonunda bir ajanla (izoprenalin veya papverin gibi) maksimum gevşeme oluşturulur ve bu değer 100 kabul edilerek diğer gevşemeler yine bunun yüzdesi olarak değerlendirilir.

3. Ön kastırılmamış zaten intrinsik tonusu yüksek olan dokular (örneğin kobay gastrik fundusu gibi) üzerine gevşetici ajanlar (elektriksel uyarı, izoprenalin, NO donörleri vs) direkt olarak uygulanabilir. Bunu takiben uygun bir ajanla maksimum gevşeme yanıtları oluşturulur ve bu maksimum gevşemeler 100 kabul edilerek diğerleri bu cevaba orantılanır.

Şekil 7. Non-adrenerjik non-kolinerjik (guanetidin+atropin içeren) ortamda sinir stimülasyonuyla (tek frekans, 1 Hz) oluşturulan sub-maksimal gevşeme yanıtları ve izoprenalinle elde edilen maksimum gevşeme. İzoprenalin gevşemesi 100 kabul edilerek elektriksel uyarıyla indüklenen gevşemeler bunun %’desi olarak ifade edilebilir.

Deney Protokollerinin Oluşturulması: Gastrointestinal düz kasların in vitro farmakolojik araştırmalarında pek çok şekilde deney protokolleri oluşturulabilir. Klasik kümülatif doz cevap çalışmaları yapılabildiği gibi buna izin vermeyen doku ve/veya ajanlar için tek dozluk uygulamalar yapılabilir. Uygulanan kastırıcı veya gevşetici ajanlara karşı desensitizasyon gelişmesi durumunda iki uygulama arasındaki süre yeterince uzun tutulmalıdır. Bu sürelerin tespiti ön çalışmalarda bulunur.

Şekil 8. Kümülatif uygulamanın kolaylıkla yapılamadığı ajan ya da dokularla çalışırken test ajanının etkisinin iki seri halde incelenmesi (temsili protokol). İkinci seri kasılmalar, birinci seri kasılmaların yüzdesi (%) olarak ifade edilmiştir.

Bu arada spontan aktivite gösteren gastrointestinal düz kas preparatlarında bu aktiviteler üzerine çeşitli ajanların etkisinin test edilmesinde, spontan aktivitenin amplitüdündeki ve frekansındaki değişmeler değerlendirilebilir. Ayrıca uygulanan test ajanının dokunun bazal tonusunda oluşturacağı değişmeler de ölçülebilir.

Şekil 9. İnsan safra kesesi düz kasındaki spontan aktiviteler üzerine bir test ajanının etkisinin değerlendirilmesi. Kullanılan ajanın, konsantrasyona bağımlı olarak, hem kasılma amplitüdünü hem de bazal tonusu düşürdüğüne, buna karşılık dokunun spontan aktivitesinin frekansını etkilemediğine dikkat ediniz (Büyükafşar ve ark., 2006).

Elektriksel uyarı cevaplarında artan frekanslara (örneğin 1, 2, 4, 8 Hz gibi) dokunun verdiği yanıtlar değerlendirilebilir (Şekil 5) ya da tek frekans (3 Hz gibi) ile oluşturulan cevaplar üzerine ajanların etkisi değerlendirilebilir. Her ardışık uygulamada dokunun oluşturduğu cevaplar frekans aynı olsa da artarak gelişebilir. Sonuçta cevaplar sanki frekans artışına bağlı imiş gibi algılanabilir. Bunu ekarte

etmek için bazen tersten (örneğin 16, 8, 4, 2 Hz gibi) ya da karışık frekanslarla (örneğin 1, 0.1, 5, 10, 2 Hz gibi) uyarılar verilebilir. Test ajanları iki seri halinde yapılan uygulamalarda birinci ve ikinci seri arasında uygulanabilir; yeterli süre (örneğin 45-60 dk) inkübe edildikten sonra ikinci serilere geçilir. Bu durumda kayıt durdurula da bilir, devam da ettirilebilir. Ancak durdurulan kayıtlarda test ajanının bazal tonus üzerine etkisi doğal olarak atlanmış olacaktır.

Şekil 10. Fare özofagusunda elektriksel uyarıyla oluşturulan kasılmaların 2 seri halde gösterilmesi. İkinci seri cevaplar, birinci serinin %’desi olarak ifade edilebilir. Test ajanları birinci ve ikinci seriler arasına uygulanabilir (Büyükafşar, 1996).

Bazen test ajanının etkisinin zaman içindeki seyri de incelenebilir bu durumda sürekli elektrik uygulaması yapılırken ajan banyo ortamına verilir ve bu şekilde etkisi zamansal boyutta da değerlendirilebilir.

Şekil 11. Nitrik oksid sentaz (NOS) inhibitörü nitroargininin sürekli elektriksel uyarıyla oluşturulan gevşeme yanıtları üzerine etkisi. Nitroargininin etkisinin zaman içinde belirgin hale geldiğine dikkat ediniz (Cellek ve Moncada, 1998).

Kaynaklar:

Bickel M., Herling A.W. Activity on the gastrointestinal tract. Drug Discovery and Evaluation. S. 827-945. Editor, H Gerhard Vogel, 2002.

Bult H., Boeckxstaens GE., Pelckmans PA., Jordaens FH., Van Maercke YM., Herman AG. Nitric oxide asn inhibitory non-adrenergic non-cholinergic neurotransmitter. Nature, 345: (6273): 346-347.

Büyükafşar K. İzole kurbağa üst özofagus şeritlerinde elektriksel uyarıyla oluşturulan gevşemelerde nitrik oksidin muhtemel katkısı. Yüksek Lisans Tezi. Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji AD., Adana, 38 sayfa, 1994.

Büyükafşar K. İzole fare özofagus longitüdinal segmentinin elektriksel uyarıya verdiği kontraktil cevapları bazı özellikleri. Doktora Tezi. Ç.Ü. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Adana , 69 sayfa, 1996.

Büyükafşar K., Akça T., Tiftik R. N., Şahan-Fırat S., Aydın S. Contribution of Rho-kinase in human gallbladder contractions. Eur. J. Pharmacol., 540: 162–167, 2006.

Büyükafşar K., Levent A. Involvement of Rho/Rho-kinase signalling in the contractile activity and acetylcholine release in the mouse gastric fundus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303: 777–781, 2003.

Cellek S., Moncada S. Nitrergic neurotransmission mediates the non-adrenergic, non-cholinergic responses in the clitoral corpus cavernosum of the rabbit. Br. J. Pharmacol., 125: 1627-1629, 1998.

Grider JR. Role of cholecystokinin in the regulation of gastrointestinal motility. J. Nutr. 124 (8 Suppl): 1334S-1339S, 1994.

Hansen MB. The enteric nervous system II: Gastrointestinal Functions. Pharmacol. Toxicol., 92: 249-257, 2003. http://teknopark.erciyes.edu.tr/birimler4.htm

Lecci A., Capriati A., Altamura M., Maggi CA. Tachykinins and tachykinin receptors in the gut, with special reference to NK2 receptors in human. Auton. Neurosci., 126-127: 232-249, 2006.

Maggi CA., Catalioto RM., Criscuoli M., Cucchi P., Giuliani S., Lecci A., Lippi A., Meini S., Patacchini R., Renzetti AR., Santicioli P., Tramontana M., Zagorodnyuk V., Giachetti A. Tachykinin receptors and intestinal motility. Can. J. Physiol. Pharmacol., 75(6): 696-703, 1997.

Pelckmans PA., Van Maercke YM., De Maeyer MH., Herman AG., Verbeuren TJ. Cholinergic and adrenergic contractile properties of the canine ileocolonic junction. J. Pharmacol. Exp. Ther., 254 (1): 158-164, 1990.

Pertwee RG. Cannabinoids and the gastrointestinal tract Gut., 48(6): 859-867, 2001.

Üstünes L. İzole kobal ileumu preparatı. İzole Organ Preparatları-1. Düz Kas Preparatları. Türk Farmakoloji Derneği Eğitim Simpozyumları Dizisi II. Türk Farmakoloji Derneği Yayınları ss: 64-116, Ankara, 1993.

Rattan S. The internal anal sphincter: regulation of smooth muscle tone and relaxation Neurogastroenterol. Motil., 17 Suppl. 1: 50-59, 2005.

Sanders KM. Regulation of smooth muscle excitation and contraction Neurogastroenterol. Motil. 20 (Suppl. 1): 39-53, 2008.

Schwartz GJ., Moran TH. CCK elicits and modulates vagal afferent activity arising from gastric and duodenal sites. Ann. N Y. Acad. Sci., 713: 121-128, 1994.

Shaffer EA. Review article: control of gall-bladder motor function. Aliment. Pharmacol.Ther., 14; suppl 2: 2-8, 2000.

Şahan-Fırat S., Tiftik, RN., Nacak, M., Büyükafşar K. Rho kinase expression and its central role in ovine gallbladder contractions elicited by a variety of excitatory stimuli. Eur. J. Pharmacol., 528: 169-175, 2005.

Takaki M. Gut pacemaker cells: the interstitial cells of Cajal (ICC). J. Smooth Muscle Res. 39(5):137-161, 2003. Yurtsever AS., Pektaş M., Kurt AH., Özkur M., Ün, I. Erenmemişoğlu A., Büyükafşar K. Proton pompa inhibitörü

omeprazolün sıçan alt özofagus sfinkter tonusu üzerine etkisi: Rho/Rho-kinaz yolağının katkısı. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi., S-07, Trabzon, 2007.

Wood JD., Alpers DH., Andrews PLR. Fundamental of neurogastroenterology. Gut. 45: 6-16, 1999.

GASTROİNTESTİNAL MOTİLİTE ÖLÇÜM YÖNTEMLERİ

Prof. Dr. Berrak Ç. Yeğen

Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı, İstanbul

1. Mide kanülü aracılığı ile mide boşalması hızı ölçüm yöntemi:

Anestezi altında aseptik koşullar sağlanarak, paramedyan bir kesi ile sıçanların mide korpuslarına paslanmaz çelik Gregory kanülleri yerleştirilir. Kanül orta hat insizyonundan çıkarılarak, paramedyan kesi kapatılır. Deneylerden önce sıçanlar 15-20 gün kadar cerrahiden derlenme amacıyla bekletilirken, deneylerin yapılacağı Bollman kafeslerinde oturmaya ve kanüllerinin ellenmesine alıştırılırlar. Deney günü öncesinde geceden aç bırakılan sıçanların mide kanüllerinin kapağı açılarak ılık (37oC) fizyolojik tuzlu su ile mideleri yıkanır ve 45 dakika kadar suyun süzülmesi beklenir. Mideden boşalma hızı belirlenecek olan fizyolojik tuzlu suya (% 0.9 NaCl, 300 mOsm/kg) absorbe olmayan bir boya olan fenol kırmızısı (60 mg/L) katılır. Fenol kırmızısı içeren ılık serum fizyolojik kanülden 3 ml hacimde verilir ve 5 dak beklendikten sonra petri tabaklarına midede kalan hacim toplanır. Bu sıvının spektrofotometrede (550 nm) absorbansı ölçülerek, beş dakikalık mide boşalma hızı saptanır. Serum fizyolojik dışında farklı sıvıların (pepton, asit, glikoz vb.) boşalma hızlarını belirlemek mümkün olduğu gibi, aynı sıçanlarda farklı ajanların uygulanmasından sonra da mide boşalma hızı ölçümü yapılarak kıyaslama yapmak mümkündür. Tekrarlanabilir olması ve az denek ile çok sonuç çıkarılabilmesi açısından tercih edilen bir yöntemdir.

2. Kalori değeri olan katı gıdanın mideden boşalma hızının ölçüm yöntemi:

Geceden aç bırakılan sıçanlara tartılmış (15 g) sıçan pellet yemi 3 saat boyunca verilir, bu arada su serbesttir. Daha sonra hem su hem de yem 5 saat süreyle uzaklaştırılır. Beşinci saatin sonunda dekapite edilen sıçanların karın boşlukları açılarak pilor ve kardiyadan klemplenerek çıkarılan mideleri tartılır, mide büyük kurvatürden açılıp içerik boşaltılarak mide yıkanır. Mide duvarı kurulanarak tekrar tartılır. Sıçanlara tartılarak verilmiş olan yemden kalan ve dökülenler dikkate alınarak gıda alımı hesaplandıktan sonra, mide boşalma hızı formül ile hesaplanır (5 saatlik mide boşalma hızı (%) = 1- *mide içeriği (g) / 3 saatlik gıda alımı (g)] x 100 ).

3. Kalori değeri olmayan test besinle mide boşalma hızının belirlenmesi:

Gece açlığını takiben, absorbe olmayan fenol kırmızısı (0.5 mg/ml) boyar maddesi içeren % 1.5’luk

metil selüloz (viskozite 400) 37oC’de ısıtılarak gavajla mideye 1.5 ml hacimde verilir. Protokole göre belirlenmiş olan zamanda sıçanlar dekapite edilerek, mideleri pilor ve kardiyadan klemplenerek çıkarılır ve 100 ml 0.1M NaOH ile 30 sn homojenize edilir. Arasıra hafifçe sallamak suretiyle 60 dak kadar oda ısısında bekletilir. Supernatanın 5 ml’si alınarak 0.5 ml triklorasetik asit (%20 ağırlık:hacim) ile karıştırılarak 2800 rpm’de 4oC’de 20 dak santrifüj edilir. Süpernatan daha sonra 4 ml 0.5 M NaOH’e eklenerek her bir örneğin absorbansı spektrofotometrede 560 nm’de olunur. Fenol kırmızısı karışımı verilir verilmez öldürülen sıçanların elde edilen absorbans değerleri (standart değer) belirlenerek, aşağıdaki formüle göre mide boşalma hızı hesaplanır: Mide boşalma hızı (%) =

[1- (denek midesinden elde edilen absorbans değeri/ standart absorbans değeri)+ x 100.

4. Cam boncuk ile mide boşalma hızı ölçümü:

Hafif anestezi altındaki sıçanlara 1 ml su içinde 1 mm çapında 100 adet cam boncuk ağızdan Nelaton sondası ile verilir. Otuz dakika sonra öldürülen sıçanların mideleri çıkarılır ve midede kalan boncuklar sayılarak, mideden boşaltılmış olan boncukların sayısı % mide boşalma hızı olarak ifade edilir.

5. Farelerde mide boşalmasının ölçümü ve test gıda hazırlığı:

İki adet dana bulyon küp ezilerek üzerine 90-95 oC’ye ısıtılmış 100 ml distile su eklenir. On gram metil selüloz eklenip karışım 10-15 dak karıştırılarak metil selülozun iyice ıslanması sağlanır. Karışım daha sonra 200 ml buz-soğukluğunda distile su ile karıştırılıp mutfak blenderinde parçalanır. Kazein (16 g), pudra şekeri (8 g) ve mısır unu (8 g) sırayla ve herbirinden sonra 2 dak blenderde parçalamaya devam ederek eklenir.Parçalanma sırasında hapsolan hava kabarcıklarının çıktığından emin olmak için besin buzdolabında en az 36 saat bekletilmelidir. Enjektöre (1 cm3) alınıp 37 oC su banyosunda

tutulduktan sonra besin 0.5 ml hacminde ( 0.55 g) farelere verilir. Deney protokolüne uygun olarak belirlenmiş olan zamanda öldürülen farelere laparotomi yapılarak mide çıkarılır ve kalan gıda ile birlikte mide tartılır, içerik boşaltılarak tekrar tartılır.Verilen gıdadan midede kalanın %’si şu şekilde hesaplanır: *1-(verilen gıda miktarı- net mide içeriği)/ (verilen gıda miktarı)+ x 100.

6. Sıçanda radyoaktif madde ile ince barsak transit ölçümü:

Sıçanlar hafif anestezi altında iken, floresin isotiyosiyanat-işaretli dekstran (MW 70000) ağız yoluyla verilir (25 mg/ml’lik stok solüsyondan 200 l). İki saaat sonra 10 eşit segmente bölünen ince barsak, çekum, proksimal kolon ve distal kolon, içerikleri ile birlikte ayrı ayrı 2 ml tuzlu su ile vortekslenir. Her bir barsak segmentinin lümeninde bulunan floresan işaretleyiciyi içeren süpernatanlar alınarak 7000

rpm’de santrifüje edilir. Süpernatanlar çok-kuyulu floresan okuyucu (eksitasyon ve emisyon 500 nm) ile okunarak her bir barsak segmentindeki floresan sinyali ölçülür. Sonuçlar floresan işaretli dekstranın dağılımının geometrik merkezini (GM) elde etmek üzere aşağıdaki formüle konur:

GM= (segment başına toplam floresan sinyalinin %’si x segmentin sayısı) / 100. (Segment sayısı mide için 1, ince barsak için 2-11, çekum 12, proksimal kolon 13, transvers kolon 14 ve distal kolon için 15 olarak verilir)

GM değeri, floresanın gastrointestinal kanal boyunca ilerlemesini, yani transit hızını gösterir. Büyük değerler elde edilmesi daha distalde dağılım olduğunu, yani hızlı transiti gösterir.

7. Strain gauge transdüser kullanımı ile gastrointestinal motilite ölçümü:

Minyatür (3x4 mm) strain gauge transdüserler yalıtılmış bakır tellere (0.12 mm) bağlanıp birlikte silikon levhalar şeklinde hazırlanır. Kenarları düzeltilen transdüserin sonunda ulaşılan boyutları 4x6 mm olacak şekilde olur. Anestezi altındaki sıçanın orta hat insizyon sonrası sirküler kas tabakasına paralel olacak şekilde transdüser yerleştirilir. Strain gauge’in bakır telleri karın duvarından dışarı alınıp cilt altından skapulalar arasındaki ciltten dışarı ağızlaştırılır. Teller bağlantı kurulacak şekilde bağlantı uçlarıyla lehimlendikten sonra küçük paketçik haline getirilip ense derisine dikilir. Sıçanların motilite kaydı alınmadan önce 3 gün derlenmelerine izin verilir. Kayıt sırasında uyanık sıçanlar Bollman kafesi denen kısıtlayıcı kafeslere yerleştirilir ve strain gauge transdüser telleri wheatstone köprülere bağlanarak A/D dönüştürücü kartı olan bilgisayar aracılığıyla kayıt gerçekleştirilir. Benzer yöntem köpeklerde de uygulanabilmektedir.

8. Sıçanda elektromiyografik ölçüm yöntemi:

Anestezi altındaki sıçanlara orta hat kesisi ile farklı gastrointestinal bölgelere üçer adet olacak şekilde bipolar paslanmaz çelik veya nikel-krom tel elektrodlar (80 m çapında, 60 cm uzunluğunda) yerleştirilir. Elektrodlar cilt altından ilerletilip sıçanın ensesinden dışarıya ağızlaştırılır ve cilde dikilen

bir plastik tüp içinde korunacak şekilde yerleştirilir. Cerrahiden sonra en az 7 gün iyileşme süreci tanınıp bu dönemde hayvanlar deney koşullarına ve Bollman kafeslerinde oturmaya alıştırılır. Deney günü elektrodlar EEG preamplifierı aracılığıyla poligrafa bağlanır ve kayıt alınır.

9. Arap sakızı ve kömür ile ince barsak transit zamanının ölçümü:

Sıçanlara hafif eter anestezisi altında orogastrik yolla 1 ml arap sakızı ve aktif kömür karışımı (20 ml fizyolojik tuzlu su içinde 1.5 g kömür, 2.5 g sakız) verilir. Bir saat süreyle kafeslerine bırakılan sıçanlar, bu süre dekapite edilerek laparotomi ile ince barsakları pilordan ve çekumdan klemplenerek çekiştirmeden çıkarılır. Uzunlamasına yerleştirilen barsakta ilerlemiş olan kömürün ulaştığı uzaklık tespit edilerek, ince barsak motilitesi (transit indeksi) kömürün ulaştığı uzaklığın tüm uzunluğa oranı olarak ifade edilir.

10. Kömür ile üst gastrointestinal transit ölçümü:

Fareler deneyden 18 saat önce aç bırakılır, ancak son yarım saat öncesine kadar su alımı serbest bırakılır. Koprofajiyi önlemek için altı telli kafeslere yerleştirilen farelere gavajla 0.2 ml kömür karışımı verilir. Kömür karışımı, 1 birim kömür, 2 birim un, ve 6 birim su ile hazırlanır. Ölçüm yapılması istenilen zamanda öldürülen hayvanların ince barsakları çıkarılarak, siyah renkli işaretin pilor sfinkterinden itibaren ilerlediği uzaklığın farenin tüm ince barsak uzunluğuna oranı ince barsak transiti olarak değerlendirilir.

11. Fekal pellet çıktısı ile defekasyon sıklığı ve kolon motilitesinin belirlenmesi:

Altı telli kafese yerleştirilen sıçanın çıkardığı fekal pelletler her yarım saatte sayılarak toplam 2 saat boyunca takip edilerek kaydedilir. Günlük takip yapıldığında ise feçes hacmi (mg/ gün) ve fekal pellet sayısı (adet/ gün) kaydedilip, 24 saatlik ortalama feçes ağırlığı (mg/ adet) “fekal çıktı” olarak hesaplanarak, kolon motilitesinin bir göstergesi olarak ifade edilebilir.

12. Radyoaktif işaretli sodyum kromat ile sıçanda gastrointestinal transit ölçümü:

Deneyden 24 saat önce sıçanlar aç bırakılır, ancak su alımları son 30 dakikaya kadar serbest bırakılır. Hafif anestezi altındaki sıçanlara 1 ml hacim içinde radyoaktif işaretleyici (0.5 Ci;18.5 kBq) olarak kromun sodyum tuzu (51Cr; Na2CrO4) mideye gavajla verilir. Birkaç dakikada uyanan sıçanlar, 30. dakikada dekapite edilerek fundusun proksimalinde özofagustan ve pilorun distalinde duodenumdan klemplenerek mide çıkarılırken, ince barsak da dikkatlice dışarı alınır. Bu amaçla, ince barsağa 12 adet klemp yerleştirilerek, içeriğin hareketinin en az olması sağlanır. Çıkarılan ince barsak, cetvel bulunan bir yüzeye yerleştirilerek 10 eşit segmente ayrılır ve mide ile ince barsak segmentleri ayrı ayrı sayım tüplerine yerleştirilmek suretiyle her bir segmentteki radyoaktivite otomatik gamma sayacı ile ölçülür ve dakika başına sayımlar (counts per minute-cpm) belirlenir. Kontrol sayım için radyoaktif işaretli 1 ml fizyolojik tuzlu su tübe konarak radyoaktivitesi ölçülür. İnce barsak ya da midede kimus mevcut ise ölçümler kullanılamaz. Sıvıların mide boşalma hızı, ince barsağa ulaşan radyoaktivitenin (cpm) yüzdesi olarak hesaplanır:

Mide boşalması (%) = *(toplam cpm-midedeki cpm)/ (toplam cpm)] x 100.

Gastrointestinal transit ise aynı ölçümler sonucunda “geometrik merkez” (GM) kullanılarak belirlenir. Buna göre,

GM= (Ci/Si)/ Ci (Ci= Segment Si’deki sayım değeri’dir).

13. Kolon transit zamanını belirlenmesi:

Gece açlığını takiben sıçanlara anestezi verilerek çekuma (çekokolik bileşkeden 1 cm proksimalde) bir kateter sokulur ve proksimal kolona (çekokolik bileşkeye göre 1 cm distalde) girmesi sağlanır. Bu

kateterin ucu karın duvarından çıkarılıp cilt altından yürütülerek skapulalar arası bölgeden dışarı ağızlaştırılarak sabitlenir. Cerrahi işlemden 3 gün sonra absorbe olmayan bir radyoaktif işaretleyici olan radyokrom (0.2 ml; 0.5 Ci; tuzlu su içinde Na51CrO4), kateterden verilir. Ardından katetere tuzlu su (0.3 ml) uygulanır ve 90 dak beklenir. Anestezi altında tüm kolon çıkarılarak 10 eşit segment ayrılır ve ayrı ayrı minik şişelere konulan segmentlerin radyoaktiviteleri gamma sayıcı ile 1 dak boyunca sayılır. Feçesteki radyoaktivite de okunur ve segment 11 olarak adlandırılır. Kolon radyoaktif kromun dağılımının geometrik merkezi (GM) şu formülle hesaplanır:

GM= (segment başına 51Cr değeri x segment sayısı)

Konferansta yukarıdaki yöntemler ayrıntılı olarak anlatılacak ve bu yöntemler kullanılarak yapılmış çeşitli deneysel çalışmalardan örnekler verilecektir.

KAYNAKLAR

1. Schwarz NT, Nakao A, Nalesnik MA, Kalff JC, Murase N, Bauer AJ. Protective effects of ex vivo graft radiation

and tacrolimus on syngeneic transplanted rat small bowel motility. Surgery 2002; 131:413-23.

2. Huge A, Kreis ME, Jehle EC, Ehrlein HJ, Starlinger M, Becker HD, Zittel TT. A model to investigate

postoperative ileus with strain gauge transduceres in awake rats. J. Surg. Res. 1998; 74: 112-8.

3. Osinski MA, Seifert TR, Cox BF, Gintant GA. An improved method of evaluation of drug-evoked changes in

gastric emptying in mice. J Pharmacol Toxicol Methods 2002; 47: 115-120.

4. Schmidt PT, Bozkurt A, Hellström PM. Tachykinin-stimulated small bowel myoelectric pattern: sensitization

by NO inhibition, reversal by neurokinin receptor blockade. Regul. Pept. 2002; 105: 15-21.

5. Radzievsky AA, Cowan A, Byrd C, Radzievsky AA, Jr., Ziskin MC. Single millimeter wave treatment does not

impair gastrointestinal transit in mice. Life Sci. 2002; 71: 1763-70.

6. İşman ÇA, Yeğen BÇ, Alican İ. Methimazole-induced hypothyroidism in rats ameliorates oxidative injury in

experimental colitis. J Endocrinol. 2003; 177(3):471-6.

7. Tache Y, Maeda-Hagiwara M, Tukelson CM. Central nervous system action of corticotrophin-releasing factor

to inhibit gastric emptying in rats. Am. J. Physiol. 1987; 253: G241-5.

8. Miller MS, Galligan JJ, Burks TF. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. Journal of

Pharmacological Methods 1981; 6: 211-7.

9. Yamano M, Kamato T, Yukinori N, Miyata K. Effects of gastroprokinetic agents on gastroparesis in

streptozotocin-induced diabetic rats. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1997; 356: 145-50.

10. Song CW, Lee KY, Kim CD, Chang T-M, Chey WY. Effect of cisapride and renzapride on gastrointestinal

motility and plasma motilin concentration in dogs. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997; 281(3): 1312-6.

11. Shahbazian A, Holzer P. Regulation of guinea pig intestinal peristalsis by endogenous endothelin acting at

ETB receptors. Gastroenterology 2000; 119:80-8.

12. Mizuta Y, Takahashi T, Owyang C. Nitrergic regulation of colonic transit. Am. J. Physiol. 1999; 277: G275-9.

13. Asai T, Mapleson WW, Power I. Differential effects of clonidine and dexmedetomidine on gatric emptying

and gastrointestinal transit in the rat. Br. J. Anaesth. 1997; 78:301-7.

14. Gülpınar MA, Bozkurt A, Cotkun T, Ulusoy NB, Yeğen BÇ. Glucagon-like peptide (GLP-1) is involved in the

central modulation of fecal output in rats. Am. J. Physiol. 2000; 278:G924-9.

15. Bozkurt A, Oktar BK, Kurtel H, Alican İ, Coksun T, Yeğen BÇ. Capsaicin-sensitive vagal fibres and 5-HT3-,

gastrin releasing peptide- and cholecystokinin A-receptors are involved in distension-induced inhibition of

gastric emptying in the rat. Regul. Pept. 1999; 83: 81-6.

16. Bozkurt A, Deniz M, Yeğen BÇ. Cefaclor, a cephalosporin antibiotic, delays gastric emptying rate by a CCK-

receptor-mediated mechanism in the rat. Br. J. Pharmacol. 2000; 131: 399-404.

17. Aube AC, Blottiere HM, Scapignato C, Cherbut C, Roze C, Galmiche JP. Inhibition of acetylcholine induced

intestinal motility by interleukin 1 in the rat. Gut 1996; 39: 470-4.

18. Çorak A, Coksun T, Alican İ, Kurtel H, Yeğen BÇ. The eefect of nitric oxide synthase blockade and

indometacin on gastric emptying and gastric contractility. Pharmacology 1997; 54: 298-304.

19. Foxx-Orenstein AE, Jin J-G, Grider JR. 5HT4 receptor agonists and -opioid receptor antagonists act

synergistically to stimulate colonic propulsion. Am. J. Physiol. 1998; 275: G979-83.

20. Topçu T, Gülpınar MA, İşman ÇA, Yeğen BÇ, Yeğen C. Enterogastric brake in rats with segemental bowel

resection: role of capsaicin-sensitive nerves. Clin. Exper. Pharmacol. Physiol. 2002; 29: 68-72.

21. Ünlüer E, Alican İ, Yeğen C, Yeğen BÇ. The delays in intestinal motility and neutrophil infiltration following

burn injury in rats involve endogenous endothelins. Burns 2000; 26: 335-40.

22. Cingi A, Ahıskalı R, Oktar BK, Gülpınar MA, Yeğen C, Yeğen BÇ. Biliary decompression reduces the

susceptibility to ethanol-induced ulcer in jaundiced rats. Physiol. Res. 2002; 51: 619-27.

DENEYSEL ÜLSER MODELLERİ

Doç.Dr. Halis SÜLEYMAN

Erzurum Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D. Erzurum

Peptik ülser, polietiolojili nüks eden kronik bir hastalıktır. Dünya üzerinde peptik ülser hastalığı bulunmayan bir bölgeye rastlanmamıştır. 1900–1955 yılları arasında bu hastalığın ABD’deki insidans ve prevalansının yüksek olduğu bildirilmiştir. Sadece ABD’de 20 milyon kişinin ülser hastası olduğu ve her yıl 6 bin kişinin ülser komplikasyonları sonucunda hayatlarını kaybettikleri rapor edilmiştır. Ülser tanısı ile yılda ikiyüzbin kişi hastaneye yatmakta ve üç milyon kişi polikliniğe başvurmaktadır. Ülke için bu hastalığın maliyeti 4 milyar doları bulmaktadır (1, 2).

Ülser tedavisinde kullanılan ilaç sayısının fazla olmasına rağmen, ülser tedavisinde her zaman istenilen etkiyi elde etmek mümkün olmamaktadır. Bu durum ülserin polietiyolojik bir hastalık olduğunu ortaya koyar ve ülser tedavisinin nedene yönelik olmasının gerektiğini gösterir. Bazen ülser tedavisi ilaçların yan etkileri nedeniyle de kısıtlanmaktadır.Ülser tedavisi henüz gelişmekte olan tıbbın önemli sorunlarından biri olarak karşımıza çıkmaktadır ve ülserin kalıcı tedavisine yönelik birçok çalışmalar yapılmaktadır.

Ülser Etiyolojisi

Ülser hastalığının uzun yıllardan beri bilinmesine rağmen, etiyolojisi hakkındaki fikirler her geçen yılda değişiklikler göstermektedir. Hastaların yaklaşık % 60-80’inde etiyolojik faktör bilinmemektedir (3). Peptik ülserin oluşmasında agresif ve koruyucu faktörler arasındaki dengenin bozulmasının rolü olduğu savunulmaktadır. İlaç (non-steroidal antiinflamatuvar ilaçlar- NSAİİ’ler), alkol kullanımı ve stres en fazla ülsere yol açan agresif faktörlerdendir (4, 5). Araştırmalar çeşitli nedenlerle uzun süre NSAİİ kullananlarda gastroduodenal hasarın ortaya çıktığını göstermiştir (6). NSAİİ’ler, özellikle de indometazin hayvanlarda deneysel ülser modeli oluşturmak amacıyla kullanılmaktadır (7). Ülser riskini artıran birçok faktörler arasında etanolün de yer aldığı bilinmektedir. Etanol de hayvanlarda ülser modeli oluşturmak için kullanılmaktadır (8-10). Birçok deneysel araştırmalar, stresin ülser riskini artıran önemli faktörlerden olduğunu ve ülser modeli oluşturmak için kullanıldığını göstermiştir (11-13). Stresle karşılaşan normal insanlarda gastroduodenal hasarın %29,6 oranında görülmesi ve duyarlı insanlarda bu oranın % 80’in üstüne çıkması ülser etiyolojisinde stresin önemli faktör olduğunu ortaya koyar (4).

Yapı olarak birbiriyle ilişkisiz pek çok kimyasal madde, insanlar ve deney hayvanlarında mide mukozasında hemoraji ve nekroza sebep olur. Kimde ve ne zaman ülser gelişeceği ve bu ülserin nerede lokalize olacağı önceden tahmin edilemez, bu sadece hayvan modellerinde oluşturulabilir. Sıçanlarda oluşturulan ülser modelleri (gastrik mukozal lezyolar), insanda oluşan ülser hastalığın hem patojenezini öğrenmek, hemde uygun tedavi yöntemleri geliştirebilmek için yararlı olmaktadır. Mukozal lezyonların patogenezinin iyi bilinmesi, ülser hastalığına başarılı bir farmakolojik yaklaşım sağlar. Etyolojik hikâyenin başlangıcından itibaren yapılan tedavi ve önlem her hastalık için en uygun müdahaledir. Yeni anti-ülser ilaçların üretilebilmesi (anti-ülser aktivitenin araştırılması) için, ülser etiyolojisinde rolü gösterilen agresif faktörlerin oluşturduğu ülser modelleri kullanılmaktadır. Bu modeller içerisinde en fazla kullanılanları indometazin, etanol ve stres ülser modelleridir.

İNDOMETAZİN ÜLSER MODELİ

İndometazinin ülser yapma potensiyeli diğer NSAİİ’lere göre daha fazla olduğu için, daha çok ülser modeli oluşturmak amacı ile deneylerde kullanılmaktadır. Deney için ağırlıkları 180–250 gram arasında değişen albino Wistar veya sprague Dawley türü rat kullanılmaktadır. Hayvanlar deneyden önce gruplar halinde laboratuarda normal oda sıcaklığında (22ºC) barındırılır ve beslenir.

İndometazin Ülser modeli oluşturma tekniği

1. Deneyde kullanılan hayvanlar 24 saat aç bırakılır.

2. Bu süre sonunda hayvanlara 25 mg/kg dozda indometazin sonda ile intragastrik yoldan mideye verilir.

3. İndometazin verildikten 6 saat sonra, hayvanlar yüksek doz genel anestezik (tiopental sodyum 50 mg/kg ) verilerek öldürülür.

4. Öldürülen hayvanların mideleri çıkartılır ve mide yüzeyindeki ülser odakları makroskopik olarak değerlendirilir.

5. Oluşan ülser alan genişlikleri milimetrik kâğıt üzerinde ölçülerek tespit edilir. İndometazin ülser modelinde denenen ilaçlar hayvanlara, indometazin uygulanmadan 5 dakika önce verilir.

İndometazin ülserlerinin makroskopik özellikleri ( makroskopik bulgular )

İndometazin ülserleri farklı sayı ve çapta bütün mide yüzeyine dağılmış halde, değişik derinlikte, yuvarlak, oval ve düzensiz mukozal defektlerden ibarettir. Ülser sınırları belirgindir. Ülser çevresindeki dokuda kabarıklık ve hiperemi görülür.

İndometazin ülserlerinin oluşma mekanizması

İndometazin PGE-2, bikarbonat, mukus üretimini inhibe ederek; mide asit sekresyonunu artırarak; oksidan parametrelerin düzeyini yükselterek; antioksidan parametrelerin düzeyini ise düşürerek mide hasarına yol açtığı savunulmaktadır.

PGE-2 İNHİBİSYONU

İndometazinin COX–1 inhibisyonuyla PGE-2 düzeyini azaltarak mide hasarına yol açtığı gösterilmiştir (14). Dışarıdan verilen PGE-2 ise indometazinin sebep olduğu gastrik mukozal hasarı önlemiştir (15). PGE-2’ler mide asit sekresyonunu azaltarak, mukus tabakasının kalınlığını artırarak ve mukozada kan akımını iyileştirerek gastroprotektif etki oluşturdukları savunulmaktadır (16). Fakat sitoprotektif PGE-2’yi inhibe eden aspirinin midede hasara yol açmadığı, hatta paranteral veriliminin indometazin ülserlerini önlediği rapor edilmiştir(17). Bir başka çalışmada gastroprotektif etki oluşturan naloksonun, indometazinin neden olduğu PGE-2 inhibisyonunu önleyemediği gösterilmiştir (18). Yine antialerjik bir ajan olan ketotifenin ratlarda PGE-2 seviyesini azaltarak, anti-ülser etki oluşturduğu bulunmuştur (19). Bir başka çalışmada NSAİİ’lerin kronik verilişiyle PGE-2 oluşumunun büyük ölçüde azalmış olmasına rağmen, mukozal lezyonun azaldığı (gastro-proteksiyon) gösterilmiştir (20). Butoksamin in hem oral hem de i.p yoldan uygulanması, her iki durumda da indometazin ülserlerini gidermiştir. Fakat oral yoldan uygulanan butoksamin PGE-2 seviyesini artırırken, i.p yoldan uygulandığında PGE-2 seviyesini etkilememiştir. Edinilen bu literatür bilgileri COX ve PG inhibisyon derecesi ile indometazinin oluşturduğu GİS hasar arasında doğrudan bir bağlantının olmadığını göstermektedir. Glukokortikoidlerin de fosfolipaz A2 enzimini inhibe ederek araşidonik asit ve metabolitlerinin oluşumunu frenlediği bilinmektedir. Fakat glukokortikoidlerin intakt sıçanlarda

ülserojen, adrenalektomili sıçanlarda ise anti-ülser olması (21), PG inhibisyonu ile GİS hasar arasında direkt bağlantının olmadığını açıkça ortaya koymaktadır.

ASİT SEKRESYONUNUN ARTIRILMASI

İndometazinle mide hasarının oluşmasında, gastrik asit salgısının artmasının önemi gösterilmiştir. Bu nedenle ülser tedavisinde kullanılan ilaçların ortak özelliği, mide asidinin inhibisyonuna yönelik olmasıdır. Bir atropin analogu olan anisodaminin gastrik asit sekresyonunu inhibe ederek indometazinin neden olduğu gastrik hasarı önlemesi bunun basit bir örneğidir (22). Atropin de indometazinin neden olduğu mide ülserini önler. Fakat atropinin bu gastroprotektif etkisi, bilateral cerahi vagotomi sonrası ortadan kaldırılmıştır. Morfinin ise gastrik asit sekresyınunu azaltmasına rağmen, indometazin ülserlerini önleyemediği ortaya çıkmıştır (18). Bu literatür bilgileri, gastrik asit sekresyonunun inhibisyonu ile gastroproteksiyon arasındaki bağlantının inandırıcı olmadığını işaret etmektedir.

GASTRİK MUKUS ÜRETİMİNİN AZALTILMASI

Gastroprotektif etkide gastrik mukozal bariyerin korunmasının önemi gösterilmiştir. İndometazinin neden olduğu ülserden, mukus sekresyonunun azalması da sorumlu tutulmaktadır. Güzel C ve arkadaşları, ratlar üzerinde yaptıkları bir çalışmada balık yağının gastrik mukus sağısını artırarak, mideyi indometazin ülserinden koruduğunu göstermişlerdir (23). Bir klasik anti-ülser ilaç olan omeprazol, sadece proton pompası inhibitörü değil, aynı zamanda gastrik mukus salgısının uyarıcısı olarak da bilinir. Fakat bazı alkoloidlerin (Rhizoma Captis Chinensis) gastrik mukus sekresyonunu etkilemeden de gastroprotektif etki oluşturdukları gösterilmiştir (24).

BİKARBONAT SALGISINA ETKİSİ

İndometazinin neden olduğu ülserde PG miktarının azalmasına paralel olarak bikarbonat sekresyonunun da azaldığı görülmüştür. Gastroprotektif PG’lerin mide bikarbonat üretimini artırdığı bilinmektedir. Peptik ülser tedavisinde kullanılan klasik ilaçlarında gastroprotektif PG üretimini artırarak anti-ülser etki oluşturdukları savunulmaktadır. Bu bilgiler gastro-proteksiyonda PG - HCO3 ilişkisinin önemini ortaya koymaktadır. Fakat Mimaki H ve arkadaşları klasik anti-ülser ilaçlar olan nizatidin ve ranitidinin HCO3 sekresyonunu artırdıklarını, famotidinin ise HCO3 sekresyonunu etkilemediğini deneyde göstermişlerdir (25). Bu literatür bilgileri, HCO3 salgı inhibisyonu ile ülser arasında, ya da HCO3 salgı stimülasyonu ile gastroproteksiyon arasında önemli bir rolün olmadığını işaret etmektedir.

OKSİDAN ve ANTİOKSİDAN PARAMETRELERE ETKİSİ

İndometazinin oluşturduğu hasarlı mide dokusunda antioksidan parametrelerin azaldığını, oksidan parametrelerin ise arttığını gösteren birçok çalışmalar mevcuttur.

İndometazin verilmiş hayvan mide dokusunda MPO, MDA düzeyleri yükselmiş, glutatyon (GSH), Glutatyon –S –transferaz (GST), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), Glutatyon peroksidaz (GPx) gibi enzimatik ve non enzimatik antioksidan parametrelerde düşüş görülmüştür (26). Bu nedenle indometazin ülserlerinin antioksidan etki ile giderilebileceği savunulmaktadır.

İndometazinin yol açtığı mukozal MPO ve MDA artışı, klasik anti-ülser ilaçlar (omeprazol lansoprazol vs.) tarafından azaltılmıştır. Klasik anti-ülser ilaçların anti-ülser ve gastroprotektif etkileri asit ile alakalı olmayan oksidatif doku hasarı ve nötrofil infiltrasyonunun önlenmesi gibi mekanizmalarla da ilişkilidir (26). Bu literatür bilgileri de indometazin ülserinin oluşmasında toksik oksijen radikallerinin rolünü ortaya koymaktadır ve ayrıca ilaçların anti-ülser aktivitesinde toksik oksijen ürünlerinin azaltılmasının önemini göstermektedir. Edinilen bu bilgiler antioksidan aktivite ile anti-ülser etki arasındaki ilişkinin daha önemli olduğunu işaret eder. Fakat simetidinin lökosit aktivasyonuna bağlı

granülosit elestaz salınımını inhibe etmemesine ve artmış MPO aktivitesini azaltmamasına karşın, indometazinin neden olduğu gastrik hasarı önlediği gösterilmiştir. Yine bir başka çalışmada süperoksit dismutaz (SOD) inhibitörü olan diethildithiokarbamatın SOD aktivitesini, inhibe etmekle beraber, indometazine bağlı mukozal hasarı önlediği bulunmuştur (27). Robert A ve arkadaşları bir sülfhidril blokörü olan DEM (dietilmalcimid) in gastrik mukozada glutatyonu azaltarak gastroproteksiyon oluşturduğu ve gastrik glutatyonun mide hasarına karşı tek başına koruyucu olmadığını belirtmişlerdir (28). Bir başka çalışmada da ranitidinin GST düzeyini indometazine göre daha fazla düşürerek, indometazin ülserini önlediği gösterilmiştir. Ranitidinin ayrıca sıçan mide dokusunda CAT ve GST aktivitelerini azaltarak indometazin ülserlerini önlediği görülmüştür (29). Berenguer B ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada, bitki ekstresinin GPx aktivitesini daha fazla artıran dozda anti-ülser aktivitesinin daha düşük olduğunu bulmuşlardır (30).

İndometazin mide asit salgısını artırarak, nitrik oksit (NO) sentezini azaltarak mide hasarına yol açar. NO in mide dokusunda asit ve gastrik mukus salınımını ve kan akımını düzenlediği bilinmektedir. Hasarlı mide dokusunda NO in sağlıklı dokuya göre anlamlı düşüş gösterdiği görülmüştür (31). Ranitidinin NO düzeyini kontrole göre anlamlı yükselterek anti-ülser etki oluşturduğu rapor edilmiştir. Fakat Morsy MA ve ark. indometazinin NO seviyesini artırdığını, Eugenolun ise NO düzeyini düşürerek anti-ülser etki oluşturduğunu göstermişlerdir (32). Bu bilgilerde NO düzeyi ile indometazin ülserleri arasındaki ilişkinin inandırıcı olmadığını ortaya koyar.

Murakami K ve ark. aktive edilmiş lökositlerden salınan granülosit elestaz inhibisyonunun, NSAİİ’lerin neden olduğu gastrik lezyonların önlenmesindeki önemini açıklamışlardır (33). Fakat bir granülosit elestaz inhibitörü olan ONO–5046, indometazinin neden olduğu ülseri önlerken, simetidin granülosit elestazı inhibe etmeden indometazin ülserlerini önlemiştir.

İndometazin mide mukozasında nötrofil infiltrasyonu ve TNF-alfa seviyesinde artışı takip eden PGE-2 düzeyinde bir azalma ile birlikte gastrik mukozal lezyona sebep olur: dışarıdan verilen PGE-2 indometazinin sebep olduğu TNF-alfa artışını önleyerek anti-ülser etki oluşturmuştur. Pentoksifilin de TNF-alfa düzeyinin artışını önleyerek anti-ülser etki oluştururken, metotreksat TNF-alfa düzeyini etkilemeksizin anti-ülser etki oluşturmuştur.

İndometazin, mide mukozal dokuda sAMP düzeyini yükselterek mide hasarına yol açtığı bildirilmiştir. Nalokson ise mide mukozal sAMP düzeyini yükselterek, indometazin ülserini iyileştirmiştir. Edinilen bu bilgiler indometazin ülserlerinin oluşmasında adı geçen faktörlerin rolünün inandırıcı olmadığını gösterir.

Biz de çalışmamızda antiinflamatuvar bir ilaç olan nimesulidin, intakt sıçanlarda indometazin ülserlerini önlediğini gösterdik. Fakat, nimesulidin adrenalektomili sıçanlarda indometazin ülser şiddetini artırdığı ve hatta tek başına ülser oluşturduğu görüldü (21). Nimesulidin intakt sıçanlarda anti-ülser, adrenalektomili sıçanlarda ise ülserojen olması, vücutta adrenal gland kaynaklı endojen anti-ülser faktörün olduğunu ve nimesulidin anti-ülser etki mekanizmasında bu faktörlerin yer aldığını gösterir. Edinilen bu bilgi ve sonuçlardan yola çıkarak, deneyimizde nimesulidin anti-ülser etki mekanizmasında 11-deoksikortikosteron (DOC), kortizol ve adrenalinin rolünün olup olmadığı araştırıldı. Deney sonuçlarımız nimesulidin anti-ülser etki mekanizmasında kortizol ve adrenalinin rol aldığını, DOC’un ise rolünün olmadığını göstermiştir. Çalışmamızda ayrıca adrenalektomili sıçanlarda prednisolon (kortizol yerine prednisolon kullanılmıştır) ve adrenalinin hangi reseptör üzerinden anti-ülser etki oluşturdukları araştırıldı. Elde edilen sonuçlar her iki ilacında (prednisolon ve adrenalin) anti-ülser etkisinin alfa–2 adrenerjik reseptör üzerinden olduğunu ortaya koymuştur.Ayrıca biz bu çalışmamızda prednisolonun adrenalektomili hayvanlarda anti-ülser, intakt hayvanlarda ise ülserojen olduğunu gösterdik. Adrenalinin ise hem intakt ve hem de adrenalektomili sıçanlarda anti-ülser olduğu saptandı. Yine bu çalışmamızda prednisolonun sadece adrenalektomili hayvanlarda değil, adrenalin düzeyi azaltılmış (metirosin alan) intakt hayvanlarda da, anti-ülser etkili olduğuortaya koyduk. Bu sonuçlarımız prednisolonun, adrenalin yokluğunda veya belli bir düzeye kadar azaldığında

alfa–2 adrenerjik reseptör üzerinden gastroprotektif etki oluşturduğunu göstermektedir. Bu deney sonuçları nimesulidin de metirosin gibi adrenalin düzeyini düşürerek anti-ülser etki oluşturduğunu düşündürmektedir. Nimesulidin antiülser etki mekanizmasına açıklık getirilebilmesi için nimesulidin 10, 20, 40 ve 100 mg/kg dozlarının indometazin ülserlerine etkisi araştırıldı. Ve aynı dozlarda sadece nimesulid alan hayvan gruplarında kan adrenalin düzeyi ölçüldü. Deney sonuçlarımız, nimesulidin anti-ülser aktivitesinin adrenalin düzeyinin azalmasına, adrenalin düzeyindeki azalmanın ise nimesulidin doz artışına paralellik gösterdiğini ortaya koydu. Buda nimesulidin adrenalin düzeyini düşürerek alfa–2 adrenerjik reseptörlerin endojen kortizolle uyarılmasını sağladığını ve indometazin ülserlerinin alfa–2 adrenerjik reseptörlerle önemli ilişkisinin olduğunu gösterir.

ETANOL ÜLSER MODELİ

Etanol tüketiminde akut gastro-duodenal hasarların predispozan faktörlerinden biridir. Sıçanlarda etanolun intra gastrik verilişi gözle görülür mukozal hasar oluşturur. Bu tür hasarların önlenmesi için vücutta savunma mekanizmaları bulunur. Fakat etanol protektif ajanların varlığında bile gastrik mukozaya hızlı bir şekilde penetre olur.

İndometazin ülser modelinde olduğu gibi, etanol ülser modelinde de deney için ağırlıkları 180–250 gram arasında değişen albino Wistar veya sprague -Dawley türü sıçan kullanılmaktadır. Hayvanlar deneyden önce gruplar halinde laboratuarda normal oda sıcaklığında (22c) barındırılır ve beslenir.

Etanol Ülser modeli oluşturma tekniği

Deneyde kullanılan hayvanlar 24 saat aç bırakılır. Bu süre sonunda hayvanlara (%50–100) 1 ml etanol sonda ile intra-gastrik yoldan mideye verilir. Etanol verildikten 1 saat sonra, hayvanlar yüksek doz genel anestezik (tiyopental sodyum 50 mg/kg) verilerek öldürülür.

Öldürülen hayvanların mideleri çıkartılır ve mide yüzeyindeki ülser odakları makroskopik olarak değerlendirilir. Oluşan ülser alan genişlikleri milimetrik kâğıt üzerinde ölçülerek tespit edilir. Etanol ülser modelinde anti-ülser aktivitesi araştırılan ilaçlar hayvanlara, etanol verilmeden 30 dakika önce uygulanır.

Etanol ülserlerinin makroskopik özellikleri (makroskopik bulgular)

Lezyonlar çeşitli şekil ve büyülükte midenin bütün yüzeyine dağılmış durumda bulunur. Midede hiperemi, ülser çevresinde kabarıklık gözükür. Ülser sınırları belirgindir. Etanolla oluşan lezyonlar daha büyük ve uzun siyah çizgiler oluşturur.

Etanol ülserlerinin oluşma mekanizması

Sıçanlarda etanolun intra gastrik verilişinden 1 dakika sonra vasküler hasar medyan gelir. Etanol gastro-duodenal mukozaya penetre olarak membran hasarı, hücre eksfoliasyonu ve erozyona sebep olur. Mukozal permeabilitedeki artışla birlikte mast hücreleri, makrofajlar ve diğer kan hücrelerinden vazo-aktif ürünlerin salınımı vasküler hasar, nekroz ve ülsere neden olur. Etanol ile ilişkili mukozal hasarda oksijen kökenli serbest radikaller patojen faktörler olarak kabul edilmektedir. Dokularda normalde de az miktarda oluşan serbest radikallere karşı korunmak için süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon peroksidaz gibi enzimler mevcuttur. Fakat bu enzimler ekstra-selüler sıvıda fazla miktarda bulunmadığı için, insan ve diğer tüm memeli hücreler eksojen oksidanlara maruz kaldığında tahrip olur veya ölürler.

STRES ÜLSER MODELİ

Stres ve gastrik ülser gelişimi arasındaki ilişkiyi açıklayabilmek için çeşitli deneysel hayvan modelleri geliştirilmiştir. Deneysel olarak stres ülseri oluşturma yöntemleri arasında en sık kullanılanlar

immobilizasyon, soğukta bırakma ve yüzdürme yöntemleridir (11-13). Hayvanlardaki bu modellerin kullanımı ile insanlarda stres ülseri etiyolojisinin açıklanabileceği düşünülmektedir (4).

Stres ülserleri modeli için, indometazin ve etanol modellerinde olduğu gibi deney için ağırlıkları 180–250 gram arasında değişen albino Wistar veya sprague -Dawley türü rat kullanılmaktadır. Hayvanlar deneyden önce gruplar halinde laboratuarda normal oda sıcaklığında (22c) barındırılır ve beslenir.

Stres ülser modeli oluşturma tekniği

Zorunlu immobilizasyon yöntemi

Zorunlu immobilizasyon yöntemi İlaçların stres ülserlerine etkisini araştırmak için en sık kullanılan yöntemdir. Deneyde kullanılan hayvanlar 24 saat aç bırakılır (su hariç). Bu süre sonunda hayvanlar sırtüstü pozisyonda bağlanır ve aynı pozisyonda 24 saat normal oda ısısında bekletilir. Bu süre sonunda hayvanlar yukarıda belirtildiği şekilde (tiyopental sodyum 50 mg/kg ) öldürülür. Öldürülen hayvanların mideleri çıkartılır ve mide yüzeyindeki ülser odakları makroskopik olarak değerlendirilir. Oluşan ülser alan genişlikleri milimetrik kâğıt üzerinde ölçülerek tespit edilir. Stres modelinde anti-ülser aktivitesi araştırılan ilaçlar, hayvanlar sırtüstü pozisyonda bağlanmadan 1 saat önce verilir.

Stres ülserlerinin makroskopik özellikleri ( makroskopik bulgular )

Stres ülserleri makroskopik olarak indometazin ülserlerine benzerdir. İndometazin ülserlerinde olduğu gibi stres ülserlerde değişik çap ve derinlikte, yuvarlak, oval ve düzensiz mukozal defektlerden oluşur. Ülser tabanı beyazımtırak, kenarları düzenli, sınırları belirgindir. Etraf dokularda hiperemi ve kabarıklık görülür.

Stres ülserlerinin oluşma mekanizması

Stres ülserlerinin oluşmasında mide mukozal bariyerinin bozulması, safra tuzlarının artması, mukozal enerjinin yetersizliği, asit fazlalığı, sitoprotektif prostaglandinlerin azalması ve bikarbonat eksikliği gibi faktörlerin üzerinde durulmaktadır. Stres ülseri oluşumunda mukozal iskeminin kritik faktör olduğu ve mukozal hasarın bu nedenle geliştiği belirtilmektedir (34, 35). Stres ülserlerinin oluşmasında diğer kritik bir faktörün de toksik oksijen radikalleri olduğu gösterilmiştir.

DİĞER YÖNTEMLER

Pilor bağlanması: İlk olarak Shay ve ark. tarafından tanımlanmıştır. Pilorun bağlansması ile oluşturulan bu modelin mekanizmasında esas olarak mide içinde asit ve pepsin birikiminin yanı sıra midede oluşan gerilimin ve kan akımında oluşan değişimin de bu modele katkısının olabileceği düşünülmektedir (36).

Asetik asitle indüklenen ülser modelleri

Asetik asitle indüklenen ülser modelleri genel olarak kronik ülser deneyleri için tercih edilir. Bu model daha çok peptik ülser hastalığının iyileşme sürecini gözlemlemek amacıyla kullanılmaktadır (37).

KAYNAKLAR

1. Roth HP. What you should know about peptic ulcers. Occup Health Saf. 1980;49(6):13, 26.

2. Sivri B, Gönen Ö. Peptik ülser hastalığı. In: Friedman S, editor. Gastroenteroloji. Ankara: Güneş Kitabevi; 2007. p. 323-42.

3. Mozsik G, Javor T. A biochemical and pharmacological approach to the genesis of ulcer disease. I. A model study of ethanol-induced injury to gastric mucosa in rats. Dig Dis Sci. 1988;33(1):92-105.

4. Gökgöz MS, Utkan NZ, Yıldırır C, Önen F. Stres ülserinde tedavi seçenekleri. Sendrom. 1996;8(1):56-8.

5. Griffin MR, Piper JM, Daugherty JR, Snowden M, Ray WA. Nonsteroidal anti-inflammatory drug use and increased risk for peptic ulcer disease in elderly persons. Ann Intern Med. 1991 Feb 15;114(4):257-63.

6. Chan FK, Sung JJ, Chung SC, To KF, Yung MY, Leung VK, et al. Randomised trial of eradication of Helicobacter pylori before non-steroidal anti-inflammatory drug therapy to prevent peptic ulcers. Lancet. 1997 Oct 4;350(9083):975-9.

7. Sigthorsson G, Crane R, Simon T, Hoover M, Quan H, Bolognese J, et al. COX-2 inhibition with rofecoxib does not increase intestinal permeability in healthy subjects: a double blind crossover study comparing rofecoxib with placebo and indomethacin. Gut. 2000 Oct;47(4):527-32.

8. Schmidt KM, Klopfer FD. Ethanol and stomach ulcers: absence of influence in the albino rat. Q J Stud Alcohol. 1968 Sep;29(3):558-65.

9. Kawashima K, Jerzy Glass GB. Alcohol injury to gastric mucosa in mice and its potentiation by stress. Am J Dig Dis. 1975 Feb;20(2):162-72.

10. Schimdt KM, Kangas JA, Solomon GF. The effects of ethanol on the development of gastric ulceration in the rat. J Psychosom Res. 1971 Mar;15(1):55-61.

11. Brodie DA: Stress ulcer as an experimental model of peptic ulcer disease. In Pfeiffer CJ (ed), Peptic Ulcer. Philadelphia, Lippincott, 1971, 71-83.

12. Brodie DA. Ulceration of the stomach produced by restraint in rats. Gastroenterology. 1962 Jul;43:107-9.

13. Brodie DA. Experimental peptic ulcer. Gastroenterology. 1968 Jul;55(1):125-34.

14. Willoughby DA, Moore AR, Colville-Nash PR. COX-1, COX-2, and COX-3 and the future treatment of chronic inflammatory disease. Lancet. 2000 Feb 19;355(9204):646-8.

15. Ding SZ, Lam SK, Yuen ST, Wong BC, Hui WM, Ho J, et al. Prostaglandin, tumor necrosis factor alpha and neutrophils: causative relationship in indomethacin-induced stomach injuries. Eur J Pharmacol. 1998 May 8;348(2-3):257-63.

16. Buttgereit F, Burmester GR, Simon LS. Gastrointestinal toxic side effects of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and cyclooxygenase-2-specific inhibitors. Am J Med. 2001 Feb 19;110 Suppl 3A:13S-9S.

17. Komoike Y, Takeeda M, Tanaka A, Kato S, Takeuchi K. Prevention by parenteral aspirin of indomethacin-induced gastric lesions in rats: mediation by salicylic acid. Dig Dis Sci. 2002 Jul;47(7):1538-45.

18. Waisman Y, Dinari G, Marcus H, Ligumsky M, Rosenbach Y, Zahavi I, et al. Naloxone is protective against indomethacin-induced intestinal ulceration in the rat. Gastroenterology. 1985 Jul;89(1):86-91.

19. Zahavi I, Weizen T, Marcus H, Karmeli F, Dinari G. Ketotifen is protective against indomethacin-induced intestinal ulceration in the rat. Isr J Med Sci. 1996 May;32(5):312-5.

20. Brzozowski T, Konturek PC, Konturek SJ, Brzozowska I, Pawlik T. Role of prostaglandins in gastroprotection and gastric adaptation. J Physiol Pharmacol. 2005 Sep;56 Suppl 5:33-55.

21. Suleyman H, Halici Z, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Keles S, Gocer F. Indirect role of alpha2-adrenoreceptors in anti-ulcer effect mechanism of nimesulide in rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2007 May;375(3):189-98.

22. Yong DG, Geng BQ, Gu GG, Zhong FM, Yu WH. [Anti-ulcer effect of anisodamine in rats]. Zhongguo Yao Li Xue Bao. 1991 Nov;12(6):522-5.

23. Guzel C, Ulak G, Sermet A, Cicek R, Ulak M. Effect of fish oil on indometacin-induced gastric lesions in rats. Arzneimittelforschung. 1995 Nov;45(11):1172-3.

24. Li B, Liu HR, Pan YQ, Jiang QS, Shang JC, Wan XH, et al. [Protective effects of total alkaloids from rhizoma Coptis chinensis on alcohol-induced gastric lesion in rats]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2006 Jan;31(1):51-4.

25. Mimaki H, Kawauchi S, Kagawa S, Ueki S, Takeuchi K. Bicarbonate stimulatory action of nizatidine, a histamine H(2)-receptor antagonist, in rat duodenums. J Physiol Paris. 2001 Jan-Dec;95(1-6):165-71.

26. Naito Y, Yoshikawa T, Yoshida N, Kondo M. Role of oxygen radical and lipid peroxidation in indomethacin-induced gastric mucosal injury. Dig Dis Sci. 1998 Sep;43(9 Suppl):30S-4S.

27. Takeuchi K, Takehara K, Ohuchi T. Diethyldithiocarbamate, a superoxide dismutase inhibitor, reduces indomethacin-induced gastric lesions in rats. Digestion. 1996;57(3):201-9.

28. Robert A, Lancaster C, Davis JP, Field SO, Sinha AJ, Thornburgh BA. Cytoprotection by prostaglandin occurs in spite of penetration of absolute ethanol into the gastric mucosa. Gastroenterology. 1985 Jan;88(1 Pt 2):328-33.

29. Cadirci E, Suleyman H, Aksoy H, Halici Z, Ozgen U, Koc A, et al. Effects of Onosma armeniacum root extract on ethanol-induced oxidative stress in stomach tissue of rats. Chem Biol Interact. 2007 Oct 20;170(1):40-8.

30. Berenguer B, Sanchez LM, Quilez A, Lopez-Barreiro M, de Haro O, Galvez J, et al. Protective and antioxidant effects of Rhizophora mangle L. against NSAID-induced gastric ulcers. J Ethnopharmacol. 2006 Jan 16;103(2):194-200.

31. Martin MJ, Jimenez MD, Motilva V. New issues about nitric oxide and its effects on the gastrointestinal tract. Curr Pharm Des. 2001 Jul;7(10):881-908.

32. Morsy MA, Fouad AA. Mechanisms of gastroprotective effect of eugenol in indomethacin-induced ulcer in rats. Phytother Res. 2008 Oct;22(10):1361-6.

33. Murakami K, Okajima K, Uchiba M, Harada N, Johno M, Okabe H, et al. Rebamipide attenuates indomethacin-induced gastric mucosal lesion formation by inhibiting activation of leukocytes in rats. Dig Dis Sci. 1997 Feb;42(2):319-25.

34. Brodie DA, Hanson HM. A study of the factors involved in the production of gastric ulcers by the restraint technique. Gastroenterology. 1960 Mar;38:353-60.

35. Hanson HM, Brodie DA. Use of the restrained rat technique for study of the antiulcer effect of drugs. J Appl Physiol. 1960 Mar;15:291-4.

36. Shay H, Komarov SA, Fels SS, Meranze D, Gruenstein M, Siplet H. A simple method for the uniform production of gastric ulceration in the rat. Gastroenterology 1945; 5: 45-48.

37. Okabe S, Amagase K. An overview of acetic acid ulcer models--the history and state of the art of peptic ulcer research. Biol Pharm Bull. 2005 Aug;28(8):1321-41.

DENEYSEL KOLİT MODELLERİ

Yrd.Doç.Dr. Turhan Dost

Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D., Aydın

Ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığını (CH) içeren inflamatuvar barsak hastalıkları (IBD)’nın

etiyolojisi, genetik, çevresel ve immünolojik etkenlerin tümünün hastalık sürecine katkıda

bulunmasına rağmen tam anlaşılmış değildir.

Klinik olarak diyare, rektal kanama, abdominal ağrı, kilo kaybı, deri ve görme bozuklukları ve özellikle

çocuklarda büyüme ve seksüel olgunlaşmanın gecikmesini içeren bir dizi gastrointestinal ve

ekstraintestinal bozukluğa neden olur.

Hastalığın oluşması ile ilgili olarak, epitel bütünlüğün/geçirgenliğin bozulması, immün hücrelerdeki

kalıtsal defektler veya immün sistemdeki defektler üzerinde durulmaktadır. Tek katlı barsak epiteli,

lümendeki mikroorganizmalar ile barsak mukozasının direkt temasını önleyen fiziksel ve immünolojik

bir bariyerdir. Hasarlanmış barsak epiteli, lümendeki mikroorganizma ve antijenlerin mukozaya

girişine ve artmış enflamatuar yanıtların başlamasına izin vermesi nedeniyle IBD’nin gelişmesinde

kritik bir rol oynayabilir. (1) İlginç olarak, klinik olarak asemptomatik Crohn hastalarında, klinik relaps

öncesinde barsak epitelial permeabilite artışının gözlenmesi, bariyer defektini gösterir ki, bu defekt

hastalığın oluşumunda erken bir gösterge olabilir.

Enflamatuar yolaklar ve immün yanıta baktığımızda;hem UC hem de CH’nda immün sistemin kalıcı

aktivasyonu sözkonusudur. Ancak, immün sistemin epitelin mukozal bariyer fonksiyonundaki defekt

sonucu sürekli uyarılması nedeniyle mi yoksa immün hücrelerin kalıtsal olarak anormal olması sonucu

mu aktive olduğu hala açık bir sorudur. Hayvan modellerindeki çalışmalar, aşırı immün hücre

aktivasyonu ya da uygunsuz yanıtların mukozal enflamasyonun oluşumuna kritik bir şekilde katkısı

olduğu varsayımını önemli oranda desteklemektedir. (1)

Normal olarak, epitelial sıkı bağlantılar ve sağlam mukus tabakası, lümendeki bakterilerin

translokasyonu ve antijenlerin uptake’ini önlemek için birlikte çalışırlar. Goblet hücreleri epiteli

örtmek için trefoil faktör kadar etkili olan mukus salgılar. Trefoil faktör, hasar gören yüzeyin

kaplanması için epitel hücrelerinin migrasyonunu hızlandırır ve böylece epitel bütünlüğü sağlanmış

olur. Fibroblastlar ve lamina propriya mononükleer hücrelerden salgılanan growth factor (keratinosit

growth factor; KGF) ve transforming growth factor-β (TGF-β) aracılığı ile de epithelial onarım gücü

artırılır. Salgılanan ürünlere ek olarak, epitel hücreleri, paneth hücreleri ve plazma hücrelerinde

salgılanan sekretuar IgA (sIgA) tarafından yapılan defensinler (patojenlere karşı defansta major rol

oynar. İleal defensinlerin azalması Chron gelişimine neden olabilir), bakterilere karşı koruyuculuğu

sağlar. Salgılanan IgA kompleksi bakteriyel ve diyetle alınan antijenlerin uptake’ini önlerken,

defensinler bakterileri liziseuğratır. Sonuç olarak, active edilmiş immune hücreler gibi mezenkimal

hücrelerden (fibroblast, düz kas hücreleri ve miyofibroblastlar) oluşan PGE2’yi içeren koruyucu

prostaglandinler, epitel bariyer fonksiyonunu artırır, lümendeki patojenlerin uzaklaştırılmasını

sağlayan klor sekresyonunu stimule eder ve mukozal kan akımının artırır.

Bu nedenlerle deneysel kolit modelleri geliştirilmiştir ve bu modellerin, hastalığın patojenezinin

araştırılması ve terapötik ajanların keşfi için önemi büyüktür. Genel anlamda, Deneysel kolit modelleri

5 kategoriye ayrılır ve her kategori de kendi içinde alt gruplara ayrılmaktadır. Bunlar;

1) Gen Knockout (belirli bir genden yoksun bırakılan) Modelleri 2) Transjenik Fare ve Sıçan Modelleri 3) Spontan Kolit Modelleri 4) Adoptive Transfer Modeller 5) İndüklenebilir Kolit Modelleri

1) GEN KNOCKOUT (KO) MODELLERİ: DNA’sının bir parçasının suni olarak bozulması ya da değiştirilmesi sonucu elde edilen ve geni inaktive edilmiş laboratuar hayvanlarıdır. İnsanlardaki çeşitli hastalıklarla ilgili genin hastalığa katkısı veya hastalık nedeni olup olmadığının anlaşılması için kullanılabilirler.

Bu kategori oluş şekline ve uygulama yoluna göre alt gruplara ayrılmaktadır;

IL (interlökin)-2 /IL-2 Reseptör’den Yoksun Fareler

IL-10 Geninden Yoksun Fareler

T Hücre Reseptörü Değiştirilmiş (Mutant) Fareler

Trefoil Faktörü Eksik Fareler

A) IL-2 / IL-2 RESEPTÖR (R) ’DAN YOKSUN FARELER

İnterlökin (IL)-2 immün sistemin düzenleyici sitokinidir. Bu modelde, farelerin yaklaşık % 50’sinin, 4-9

haftalık iken splenomegali, lenfadenopati ve otoimmün hemolitik anemi ile öldükleri bildirilmiştir.

Hayvanların geri kalanlarında ise 6-15 hafta arasında kronik kolit gelişmektedir. Bu farelerin

kolonlarında (rektumdan çekuma kadar) ciddi duvar kalınlaşması ve ülser oluşmasına rağmen ince

barsakları sağlamdır. Patolojik olarak, kript abseleri, müsin eksikliği ve epitel hücrelerde displazi

mevcuttur. Buna ek olarak, MHC class-II ekspresyonunda artışla aktive edilmiş T- ve B-hücre

infiltrasyonu, IgG1 ve IgE artışı ve antikolon antikorlar da gözlemlendi. (2)

B) IL-10 GENİNDEN YOKSUN FARELER

IL-10, T-hücreleri, B-hücreleri, makrofajlar, timus hücreleri ve keratinositler tarafından yapılır ve T

helper-1 hücreler, NK hücreler ve makrofajların fonksiyonunu düzenler. IL-10 eksik farelerde, tüm

barsaklarda inflamasyon bulunduğunu bildirilmiştir. Lezyonlar esas olarak duodenum, proksimal

jejunum ve çıkan kolonda bulunmaktadır. Patolojik olarak duodenum ve jejunumda hiperplastik

değişikliklere bağlı olarak barsak duvarında kalınlaşma gözlenir. Kolonda ise goblet hücre deplesyonu,

epitel dejenerasyonu, IgA salgılayan plazma hücrelerinde infiltrasyon ve MHC klas-II ekspresyonunda

artış olmaktadır. (3)

Cantorna ve arkadaşları, IL-10 geninden yoksun farelerde IBD’nın seyri üzerinde D-vitamininin rolünü

araştırdılar. Fareleri 3 gruba böldüler; D-vit eksik olan grup, D-vit yeterli grup ve aktif D-vit eklenmiş

grup olarak… D-vit yetersiz olan IL-10 KO farelere karşılık, D-vit yeterli olan farelerde diyare gelişimi,

zayıflama veya erken ölüm görülmemesine karşın, sadece 2 hafta aktif D-vit ilave edilen farelerde

semptomların anlamlı olarak düzelmesi ve ilerlemenin durması otörleri de şaşırtmıştır. (4)

C) T HÜCRE RESEPTÖRÜ (TCR) DEĞİŞTİRİLMİŞ (MUTANT) FARELER

Bu modelde, doğumdan sonra 16 haftada tüm kolonda (rektumdan çekuma kadar) yumuşak

dışkılama, istikrarlı inflamasyon ve hipertrofi gözlenir, fakat ince barsaklarda herhangi bir patoloji

gelişmemektedir. Kolon epitelinde hiperplazi, kript abselerinde ve goblet hücrelerinde azalma ile

birlikte lenfositlerde, plazma hücrelerinde ve nötrofillerde infiltrasyon mevcuttur. (5)

D) TREFOİL FAKTÖRÜ EKSİK FARELER

İntestinal trefoil faktör (ITF), inflamatuar hasar sonrası mukus hücrelerinden peptidlerin salınımına

neden olur. ITF eksik farelerin mukoza iyileşmesinin ciddi olarak zayıfladığı ve epitel

rejenerasyonunun azaldığı görülmektedir. Bu fareler, içme sularına dekstran sülfat sodyum (DSS)

ilave edilerek kolit oluşturulduktan sonra ölmektedirler. Sıçanlarda asetik asidle veya trinitrobenzen

sulfonik asidle (TNBS) oluşturulan kolitte, intestinal mukozada onarım sürecinde ITF’nin rolü

gösterilmiştir. Bu nedenle, barsakta yara iyileştirici ve intestinal hasarın tedavisindeki çalışmalarda

uygun bir model olabilir. (6)

2) TRANSJENİK FARE VE SIÇAN MODELLERİ: Gen aktarılarak veya başka bir türün DNA'sının eklenmesi gibi müdahele edici bir teknikle normal genomu değiştirilmiş fare ve sıçanlardır. Bu modeldeki alt gruplar; IL-7 Transjenik Fareler Sinyal Transducer and Activator of Transcription (STAT)-4 Transjenik Fareler HLA-B27 Transjenik Sıçanlar

A) IL-7 TRANSJENİK FARELER

Epitel hücrelerinden elde edilen IL-7’nin, intraepitelial lenfositler, intramukozal lenfositler ve epitelial

hücrelerin fonksiyonel regülasyon mekanizmaları ve proliferasyonu için esansiyel sitokin olduğu

gösterilmiştir. IL-7, ülseratif kolitli hastaların serumunda gösterilmiştir ve timusta T-hücrelerinin

proliferasyon ve diferansiyasyonunu etkilemektedir. (7)

IL-7 transjenik fareler ile yapılan araştırmalar, IL-7 üretimindeki artışı göstermektedir. barsaklarda

nötrofil infiltrasyonu, CD4+ T hücreleri ve T hücrelerinin infiltrasyonu ile 1-3 haftaya kadar akut

kolit oluşmaktadır. Bu farelerde barsakların inflamasyonlu bölgelerinde IL-7 protein ekspresyonu

artmıştır. 8-12. haftalarda anal kanama ile rektal prolapsus meydana gelmektedir. Patolojik olarak,

barsaklarda lamina propria’da ciddi ve diffüz monosit infiltrasyonu, goblet hücrelerinde azalma ve

kript abselerinde artış görülür. Bu yüzden, bu model insan ülseratif kolitine yakın benzerlik gösteren

kronik kolit modelidir. Akut kolite zıt olarak, bu modelde IL-7 proteini azalmıştır. Bu durumun IL-7’den

zengin olan goblet hücrelerindeki azalmaya bağlı olduğu kabul edilmektedir. Bu da göstermektedir ki,

kronik fazda, IL-7’nin eksikliği sonucu aktive edilmiş lenfositlerin apoptozisi kolit nedeni olarak kabul

edilirken, akut fazda IL-7’nin aşırı salınımının mukozal lenfosit aktivasyonu yapması kolit nedenidir.

(8)

B) SİGNAL TRANSDUCER AND ACTİVATOR OF TRANSCRİPTİON (STAT)-4 TRANSGENİK FARELER

Son zamanlarda birçok sitokinin sinyal aktarımında esas rolü olan yedi STAT molekülü rapor

edilmiştir. STAT ailesinin her bir üyesi birkaç sitokin için çalışmaktadır ve bu durum sitokinlerin

gereğinden fazla üretimine neden olabilmektedir. STAT-4, IL-12’nin sinyal transdüksiyonuna özgüdür

ve STAT-4 -/- fareler Th tip-I kolitin tipik KO modelidir. (9)

C) HLA B27 TRANSJENİK SIÇANLAR

Sıçanlar, insan HLA B27 molekülü (insan spondiloartropatisi ile karışmış molekül) için transjeniktir ve

2-mikroglobulin mide, ileum ve tüm kolonu etkileyen spontan IBD yapar. Kript hiperplazisi ve

mononükleer inflamatuar hücrelerin mukozal infiltrasyonu çoğu kez hastalığın karakteristiğidir.

Patojenezde, aktive edilmiş tip-I helper T lenfositlerinin fonksiyonel rolü olduğu ileri sürülmüştür. Bu

model, gastrointestinal inflamasyonun akut ve kronik evresinde intestinal floradaki bakterilerin

etkisini kapsamlı olarak çalışmak için kullanılmıştır. Sıçanlarda çeşitli bakteri türleri kolit gibi, gastrit

gibi çeşitli tipte patolojilere neden olabilmektedirler. (10)

Steril şartlar altında üretilen (germ-free) HLA B27/β2 mikroglobin transjenik sıçanlar da kolit gelişimi

olmamaktadır. Bununla birlikte, normal spesifik kommensal çekal bakteriler ile kolonize edildiğinde, 1

ay içinde kolon, antrum ve duodenumu içine alan agressif hastalık gelişmektedir. Oysa, tek bakteri

zincirleri ile kolonize edildiğinde, Bacteroides vulgatus, bu sıçanlarda gastroduodenal hastalık

yapmamakla birlikte, orta şiddette kolit gelişimine neden olur. E. coli ile kolonize edildiğinde ne

hastalık ne de T hücre aktivasyonu görülür. Buna karşılık, Lactobacillus GG gibi bazı bakteriler, çekal

bakterilerle kolonize edilen HLA B27 transjenik sıçanlardaki koliti azaltmak suretiyle, enflamasyonu

önlerler. Hastalık oluşumunda bütün komensal bakteri türleri aynı derecede etki göstermezler,

Bacteroides vulgates gibi bazıları agressif, bazıları nötral ve E.coli, Lactobacillus gibi bazı türler ise

koruyucudur.

HLA B27 transjenik sıçanların içme suyuna çeşitli antibiyotikler (siprofloksasin, metronidazol,

vankomisin/imipenem v.s.) eklenerek, tedavideki etkileri araştırılmıştır. (11)

3) SPONTAN KOLİT MODELLERİ: Hastalığı taşıyan türlerin kendi içinde çiftleştirilmesi sonucu

belli bir nesil sonra hastalık görülen modellerdir.

A) C3H/HEJBİR FARELER

Bazen kolit ve perianal ülser geliştiği bilinen kolitli C3H/Hej farelerin selektif doğumundan türemiştir.

C3H/HejBir farelerde oluşan kolit, sağ kolonda ve ileoçekal lezyonlarla sınırlıdır. Yaşamın 3. veya 4.

haftasında spontan olarak ortaya çıkar ve 10-12 hafta sonra ortadan kaybolur. Ülserler, kript abseleri

ve epitel rejenerasyonu mevcuttur, fakat intestinal duvarda kalınlaşma ve granülomlar

gözlemlenmez. Lamina propria lenfositlerinde IFN- ve IL-2 seviyelerinde artış gösterilmiştir, bu da

göstermektedir ki bu modeldeki kolit bir Th tip-I yanıtıdır. Bu model, dışarıdan oluşturulan (TNBS gibi)

kolit modeliyle kombine olarak kullanılabildiği gibi genetik olarak etkilenen faktörleri tesbit etmek için

de kullanılmıştır. (12)

B) SAMP1/YİT FARELER

Bu model, enflamasyonun spontan olarak oluşması ve CH lezyonlarının primer lokalizasyonunun

terminal ileumda ciddi enflamasyonla karakterize olan birkaç modelden biri olması nedeniyle, Crohn

hastalığının mekanizmalarını çalışmak için uygun bir deneysel sistemdir. (13) Bu lezyonlar, transmural

enflamasyon, granulomlar ve epitel morfolojisindeki değişiklikler ile karakterizedir. Diğer germ-free

SAMP fare modellerinden farklı olarak, daha kısa süreli olsa da, barsaklarda enflamasyon gelişimine

neden olur. Artmış epitelial permeabilite enflamasyonun başlangıcından önce ortaya çıkar ve bu da

epitel hücre disfonksiyonunun hastalığın ilerlemesinden primer olarak sorumlu olabileceğini

göstermektedir. Fakat, bu modeldeki farelerde görülen epitel permeabilite defektinin ileitis’in nedeni

mi sonucu mu olduğu belirlenememiştir. İlginç olarak, “peroxisome proliferator-activated receptor

gamma (PPAR- )” SAMP fareler ve dolayısı ile insanlardaki CH’da şüpheli gen olarak saptanmıştır. (14)

4) ADOPTİVE TRANSFER MODELLERİ: Bağışık bir kişiden duyarlı lenfositlerin veya serumun bir başkasına aktarılması işlemidir (hücre transferi).

Isı Şoku Proteini (hsp) 60’a Spesifik CD8 T Hücreleri Tarafından Oluşturulan Kolit CD45RB Transfer Kolit

A) ISI ŞOKU PROTEİNİ (HSP) 60’A SPESİFİK CD8 T HÜCRELERİ TARAFINDAN OLUŞTURULAN KOLİT

Ciddi, genellikle öldürücü intestinal patolojilerle seyreden, daha belirgin ince barsaklarda gelişen kolit

modelidir. Bu model, barsaklardaki bakteriyel floraya bağımlı değildir.

B) CD45RB TRANSFER MODEL

Kronik kansız diyare ve zayıflama, transferi takiben birkaç hafta içinde gelişir. Hastalık progresif olup,

deney hayvanının ölümüne neden olur. Histopatolojik değişiklikler diğer kolit modellerine çok benzer,

esas olarak kolonda olup, hiperplazi nedeniyle bariz bir kalınlaşmaya neden olur. (15)

5) İNDÜKLENEBİLİR KOLİT MODELLERİ: Çeşitli ajanların kullanımına bağlı olarak hastalık gelişen modellerdir. Bu grupta yer alan kolit modelleri;

Asetik Asidle Oluşturulan Kolit İodoasetamid İle Oluşturulan Kolit Trinitrobenzen Sulfonik Asid (TNBS) İle Oluşturulan Kolit Dinitrobenzen Sulfonik Asid (DNBS) İle Oluşturulan Kolit Dinitroklorobenzen (DNCB) İle Oluşturulan Kolit Oksazolon Koliti Dekstan-Sulfat-sodyum (DSS) Koliti Peptidoglikan-Polisakkarid (PG-PS) Koliti Karragenin İle Oluşturulan Kolit (Kobay) Formalin İle Oluşturulan Kolit (Tavşan)

A) ASETİK ASİDLE OLUŞTURULAN KOLİT

Doza bağlı olarak dilüe asetik asidin lümene damlatılmasıyla epitelde ya da mukozada nekroz ve

geçici enflamasyon oluşturulabilir. Enema şeklinde veya assenden kolon modellerinde % 4’lük asetik

asid 15-30 saniye süreyle uygulanır, Daha yüksek konsantrasyonlar sıklıkla perforasyona neden

olmaktadır Maruz kaldıktan 30 saniye sonra fazla sıvı geri çekilir ve kolon 1.5 ml PBS veya serum

fizyolojik ile basınçlı bir şekilde yıkanır. (15) Bu modeldeki ilk hasar nisbeten hafif epitelial nekroz ve

ödemdir. Lamina propria, submukoza ve eksternal kas tabakalarını içine olan yayılım, asetik asite

maruz kalan alana ve konsantrasyona bağımlıdır. Epiteldeki hasar, organik asitlere spesifik

reaksiyonla orantılı olarak gelişir çünkü benzer pH’da olan HCl aynı şekilde hasara neden olmaz. (16)

Kısa süreli lokal iskemi, akut hasara katkıda bulunur fakat nötrofiller, çok erken fazda olaya

karışmazlar. Mukoza ve submukozadaki enflamasyon ilk hasarı takiben oluşur ve araşidonik asid

yolaklarının aktivasyonuyla ilişkilidir. Asetik asitle oluşan kolit, IBD modelinin en kolay oluşturulan

modellerindendir ve enflamatuar mediyatörlerin profili açısından IBD ile benzerlik göstermektedir.

Enflamatuar faz insandaki akut intestinal enflamasyonuna bazı benzerlikler gösterir. (15)

Antioksidan ilaçlar (17) ve antianginal (18) ilaçlarla tedavi, bu modeldeki makroskobik ve mikroskobik

skorları iyileştirmiştir.

B) İODOASETAMİD İLE OLUŞTURULAN KOLİT

Bu model, gastrik mukozanın korunmasında önemli rol oynayan, glutatyon gibi endojen sülfidril (SH)

bileşikleri temeline dayanır. Kolona SH- blokörlerinin damlatılması, koruyucu SH-bileşiklerinin

miktarını azaltarak mukozada hasara ve kolite neden olabilir. İodoasetamidin uygulanan dozuyla

ilişkili olarak hastalığın ciddiyeti ve derecesi farklılık gösterebilir. Diyare, dilatasyon, adezyon, hafiften

derin lezyonlara kadar mukozal hasar ve kilo kaybı görülür. (19). % 3 iodoasetamid, % 1 metilselüloz

içinde çözünüp, kateter aracılığı ile rektumdan 7 cm girilerek 0.1ml uygulanarak kolit oluşturulur.

C) TNBS İLE OLUŞTURULAN KOLİT

Deri duyarlılaştırılması ile veya bu işlem yapılmadan etanol içinde çözünmüş olan hapten yapısındaki

TNBS, DNBS veya Oksazolon’un intrarektal uygulanması ile hassas farelerde kolit oluşturulabilir (20).

Etanol, mukozal bariyeri ortadan kaldırmak için gereklidir. TNBS’ye duyarlılık her farede

değişmektedir. Bazı fareler haptenle oluşan gecikmiş tipte hipersensitivite göstererek kolit

geliştirirken, bazıları direk kronik kolit gelişimiyle sonlanır. Bu modelde barsaklarda, tüm tabakalarda

enflamatuar hücre infiltrasyonu ile karakterli granülomlar görülür. Buradan izole edilen makrofajlar

çok miktarda IL-12 üretimine ve lenfositler IL-2 ve IFN- üretimine neden olmaktadır. Bu modelde

oluşturulan kolit Th tip-1 cevabı gösterir ve crohn hastalığı oluşturur. CD4+ T hücrelerin kronik TNBS

kolitinde esas rolü oynadığı gösterilmiştir, bu nedenle bu model, T-helper hücrelere bağımlı mukozal

immün yanıtı çalışmak için uygun bir modeldir. (21) TNBS kolit modeli genel olarak sitokinlerin

sekresyon kalıplarını içeren barsak enflamasyonunun, oral tolerans, hücre adezyonu ve

immünoterapi mekanizmalarının birçok yönünü araştırmak için de uygun bir modeldir.

D) OKSAZOLON KOLİTİ

Enema şeklinde uygulanan etanol ile oksazolonun kolit yaptığı gösterilmiştir. TNBS ile

karşılaştırıldığında, oksazolon daha erken kolit gelişimine neden olmaktadır. Sensitizasyon için, % 5’lik

oksazolon (etanol içinde) hazırlanarak 300ml cilde uygulanabilir. % 50 etanol solüsyonu içinde % 5

oksazolon, enema şeklinde kolona doğru 8 cm yerleştirilen kateter aracılığı ile uygulandığında kolite

neden olmaktadır. Enema şeklinde uygulandıktan sonraki ikinci günde kilo kaybı ve diyare en yüksek

seviyededir ve semptomlar 10-12 gün sonra azalır. Ülser ile aynı zamanda gelişen kolit, distal kolonda

lokalizedir. Histopatolojik çalışmalar epitel hücreleri, goblet hücreleri ve glandlarda, kontrol ile

karşılaştırıldığında azalma olduğunu göstermiştir. TNBS ile oluşan kolitin tersine, bu bulgular ülseratif

kolit ile hemen hemen benzerlik gösterir. (22)

E) DSS KOLİTİ

Farelerin birkaç gün boyunca içme suyu içinde Dekstran-Sulfat-Sodyum (DSS) polimerleri ile

beslenmesi kanlı diyare, ülserasyon ve granülositlerde infiltrasyonla karakterize akut kolit

oluşturmaktadır. DSS’in bazal kriptalardaki barsak epitel hücreleri için direkt toksik olduğuna

inanılmaktadır ve bu yüzden mukozal bariyerin bütünlüğüne zarar vermektedir. Akut DSS kolit

modelinin, kolitin kalıtsal immün mekanizmaları ve epitel onarım mekanizmalarını çalışmak için

uygun olduğu gösterilmiştir. (23)

Suda çözünmüş DSS’nin fare veya sıçanlara uygulanması hematoçezya, kilo kaybı, barsaklarda

yağlanma, mukozal ülserler ve nötrofil infiltrasyonuna neden olur. DSS modelinde, akut kolit DSS

uygulandığı sırada görülür, kronik kolit ise DSS’nin uygulanmasında kısa bir süre sonra meydana gelir.

Akut kolite, doğuştan gelen bağışıklık neden olmaktadır. Kronik kolitte ise, aktive edilmiş

makrofajlardan açığa çıkan sitokinlerin aktiflediği lenfositlerin neden olduğu düşünülmektedir.

F) PEPTİDOGLİKAN-POLİSAKKARİD (PG-PS) KOLİTİ

Bakteri hücre duvarı komponenti olan PG-PS’in sıçanların distal kolonuna intramural enjeksiyonu ile

transmural enterokolit oluştuğu göstermiştir. Genetik olarak hassas Lewis sıçanlarında,

enjeksiyondan sonra 3-4. haftalarda kronik gronülomatöz kolit gelişmiştir. Anestezi altında ve aseptik

şartlarda, distal kolona PG-PS (10µg rhamnose/g) subserozal olarak 9-10 kez, 20-25 µl enjekte edilir.

Histopatolojik olarak kolon duvarında kalınlaşma, lenfosit, makrofaj ve nötrofillerde infiltrasyon

gösterilmiştir. PG-PS, mukozal permeabiliteyi ve MPO (miyeloperoksidaz) aktivitesini artırmış, NO

üretimini ve kollajen sentezini yükseltmiştir. Bu model, non-patojenik enterik bakterilerin hücre

duvarı komponentleri kolon duvarına penetre oldukları zaman, akut ve kronik kolitis gelişimine yol

açabileceğini göstermektedir.

HANGİ MODEL SEÇİLMELİDİR?

İnsan IBD’nın patojenik ve klinik özelliklerinin tümünü özetleyen tek bir model olmamasına rağmen,

her bir model, kronik barsak enflamasyonunun altında yatan mekanizmaları anlamamız için önemli

katkılar sağlamıştır.

Modellerin çoğunda, İnce barsaktan ziyade kalın barsaklar (CH’nın önemli karakteristikleri ve farklı

klinik belirtilerinin lokalize olduğu yer) etkilenmektedir. Fakat, bu modellerin önemli bir kısmında,

CH’ındaki gibi, IFN- , TNF-α ve IL-17 üretilmesiyle lokal enflamatuar yanıtları gösteren enflamatuar

lezyonlarda IL-12/IL23 tarafından aktive edilen TH1/TH17 T hücreleri bulunabilmektedir. Şimdilik

neden birçok modelde ileitisin gelişmediği tam olarak açık değildir ve bazı görüşlere göre terminal

ileumdaki CH’nın olası etiyopatojenezinin araştırılması için bu modellerin değeri sınırlıdır.

Muhtemelen Crohn hastalığına en uygun model SAMP1/Yit modelidir, çünkü, enflamasyon terminal

ileumda çok belirgindir ve insanlardaki gibi, dışarıdan müdahale olmaksızın spontan olarak gelişir.

Transjenik modellerin çoğundaki hastalığın başlangıcı ve şiddeti oldukça çeşitlidir ve genellikle büyük

oranda deney hayvanlarının enterik florası gibi çevresel faktörlere de bağlıdır. Bazı modellerde (Ör; IL-

10 / fareler…), kolitin oluşması birkaç ay alır, bu nedenle geniş çaplı ilaç gözlem çalışmaları için

elverişli değillerdir. Bu yüzden, yeni terapötik ajanların değerlendirilmesi için insandaki hastalıklara

sadece bazı yönlerden benzemelerine rağmen, akut deneysel kolit modelleri (Ör; DSS veya TNBS

koliti…) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu indüklenebilir modeller, maliyetin az olması, kolay

uygulanabilirliği ve kabul edilebilir olmaları nedeniyle tercih edilirler.

KAYNAKLAR

1. Wirtz S, Neurath MF. Mouse models of inflammatory bowel disease. Adv Drug Deliv Rev 2007; 59:

1073-1083.

2. Sadlack B, Merz H, Schorle H, Schimpl A, Feller AC, Horak I. Ulcerative colitis-like disease in mice with a

disrupted interleukin-2 gene. Cell 1993; 75: 253-261.

3. Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, Muller W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic

enterocolitis. Cell 1993; 75: 263-274.

4. Cantorna MT, Munsick C, Bemiss C, Mahon BD. 1,25-Dihydroxycholecalciferol prevents and

ameliorates symptoms of experimental murine inflammatory bowel disease. J Nutr 2000; 130: 2648-

2652.

5. Mombaerts P, Mizoguchi E, Grusby MJ, Glimcher LH, Bhan AK, Tonegawa S. Spontaneous development

of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell 1993; 75: 274-282.

6. Mashimo H, Wu DC, Podolsky DK, Fishman MC. Impaired defense of intestinal mucosa in mice lacking

intestinal trefoil factor. Science 1996; 274: 262-265.

7. Hibi T, Ogata H, Sakuraba A. Animal models of inflammatory bowel disease . Journal of

Gastroenterology 2002; 37: 409-417.

8. Watanabe M, Watanabe N, Iwao Y, Ogata H, Kanai T, Ueno Y, Tsuchiya M, Ishii H, Aiso S, Habu S, Hibi

T. The serum factor from patients with ulcerative colitis that induces T cell proliferation in the mouse

thymus is interleukin-7. J Clin Immunol 1997; 17: 282-292.

9. Wirtz S, Finotto S, Kanzler S, Lohse AW, Blessing M, Lehr HA, Galle PR, Neurath MF. Cutting edge:

chronic intestinal inflammation in STAT-4 transgenic mice: characterization of disease and adoptive

transfer by TNF- plus IFN-gamma-producing CD4+ T cells that respond to bacterial antigens. J Immunol

1999; 162: 1884-1888.

10. Rath HC. Role of commensal bacteria in chronic experimental colitis: lessons from the HLA-B27

transgenic rat. Pathobiology 2002; 70: 131-138.

11. Rath HC, Schultz M, Freitag R, Dieleman LA, Li F, Linde HJ, Scholmerich J, Sartor RB. Different subsets

of enteric bacteria induce and perpetuate experimental colitis in rats and mice. Infect Immun 2001;

69: 2277-2285.

12. Cong Y, Brandwein SL, McCabe RP, Lazenby A, Birkenmeier EH, Sundberg JP, Elson CO. CD4+ T cells

reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell

type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med 1998; 187: 855-864.

13. Matsumoto S, Okabe Y, Setoyama H, Takayama K, Ohtsuka J, Funahashi H, Imaoka A, Okada Y,

Umesaki Y. Inflammatory bowel disease-like enteritis and caecitis in a senescence accelerated mouse

P1/Yit strain. Gut 1998; 43: 71-78.

14. Sugawara K, Olson TS, Moskaluk CA, Stevens BK, Hoang S, Kozaiwa K, Cominelli F, Ley KF, McDuffie M.

Linkage to peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in SAMP1/YitFc mice and in human

Crohn's disease. Gastroenterology 2005; 128: 351-360.

15. Elson CO, Sartor RB, Tennyson GS, Riddell RH. Experimental models of inflammatory bowel disease.

Gastroenterology 1995; 109: 1344-1367.

16. Jurjus AR, Khoury NN, Reimund JM. Animal models of inflammatory bowel disease. J Pharmacol

Toxicol Methods 2004; 50: 81-92.

17. Choudhary S, Keshavarzian A, Yong S, Wade M, Bocckino S, Day BJ, Banan A. Novel antioxidants

zolimid and AEOL11201 ameliorate colitis in rats. Dig Dis Sci 2001; 46: 2222-2230.

18. Kuralay F, Yildiz C, Ozutemiz O, Islekel H, Caliskan S, Bingol B, Ozkal S. Effects of trimetazidine on acetic

acid-induced colitis in female Swiss rats. J Toxicol Environ Health A 2003; 66: 169-179.

19. Satoh H, Sato F, Takami K, Szabo S. New ulcerative colitis model induced by sulfhydryl blockers in rats

and the effects of antiinflammatory drugs on the colitis. Jpn J Pharmacol 1997; 73: 299-309.

20. Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, Neurath MF. Chemically induced mouse models of intestinal

inflammation. Nat Protoc 2007; 2: 541-546.

21. Neurath MF, Fuss I, Kelsall BL, Stuber E, Strober W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established

experimental colitis in mice. J Exp Med 1995; 182: 1281-1290.

22. Boirivant M, Fuss IJ, Chu A, Strober W. Oxazolone colitis: A murine model of T helper cell type 2 colitis

treatable with antibodies to interleukin 4. J Exp Med 1998; 188: 1929-1939.

23. Williams KL, Fuller CR, Dieleman LA, DaCosta CM, Haldeman KM, Sartor RB, Lund PK. Enhanced

survival and mucosal repair after dextran sodium sulfate-induced colitis in transgenic mice that

overexpress growth hormone. Gastroenterology 2001; 120: 925-937.

ISBN: 975-7863-18-1