Toxicita nanočástic

Miloslav Pouzar

Ústav environmentálního a chemického inženýrstvíUNIVERZITA PARDUBICE

2010

NanočásticePřírodního původu

Antropogenního původu - produkované nezáměrněobvykle též poly-dispersní systémy

• dehet, fulereny a uhlíkové nanotrubice v dýmech• znečištění při svařování a plazmovém obrábění kovů

poly-dispersní systémy• půdní koloidy - částice jílů, oxidy a hydroxidy kovů, huminové kyseliny• ultrajemné podíly polétavého prachu (airborne UFPs) - mořská sůl• nanočástice biologického původu - pyly, mikroorganismy

Antropogenního původu - produkované záměrně (Engineered - ENPs)obvykle mono-dispersní systémy

• jednostěnné a vícestěnné uhlíkové trubice (SWNTs, MWNTs), fulereny (C-60)

• TiO2, MnO, ZnO, Fe2O3

• polymerní nanočástice

Příklady použití ENPsAg

TiO2 , ZnO

• UV ochrana - opalovací krémy, nátěry, sluneční brýle, autokosmetika

• antimikrobiální účinky - lednice, vysavače, klimatizace, textil, .....

Pt , Pd

• katalytické vlastnosti - katalyzátory v automobilech

CNT• elektronika, aditiva do pneumatik, lubrikanty, adsorpce kontaminantů

SiO2

• ohnivzdorná skla, UV-ochrana, elektronika, farmaceutické produkty

Al2O3

• baterie, mletí, protipožární ochrana, absorpce kovů, biosorbent

Fe, Fe2O3

• čištění vody, aditivum do betonu

"Neptej se MĚ, zeptej se Paracelsa"

"Jsou nanočástic

e toxické ?"

"Jak už jsem řekl dříve - Všechny látky

jsou jedy, nic není nejedovaté. Pouze

dávka způsobuje, že látka přestává být

jedem. Ale dneska se přeci všichni ptají

sira Weba of Science...."

Počet odkazů týkajících se toxicity nanočástic na Web of Science

A. Kahru et al. / Toxicology 269 (2010) 105–119

Počet odkazů týkajících se toxicity nanočástic na Science Direct

A. Kahru et al. / Toxicology 269 (2010) 105–119

Současná úroveň poznání o toxicitě nanomateriálů

K. Savolainen et al. / Toxicology 269 (2010) 92–104

Nové nanomateriály (NNm)

Data o toxicitě/nebezpečnosti NNm

Data o toxicitě/nebezpečnostiNNm vyhodnocená regulačními orgány

Čas

Ob

jem

výz

kum

u

Dunford et al. (2002), McHugh and Knowland (1997)

• TiO2 / ZnO se podílí na tvorbě volných radikálů v kožních buňkách a na následném poškození DNA těchto buněk

Opalovací krémy

Long et al. (2006) EPA

• nanočástice TiO2 v opalovacích krémech mohou způsobovat poškození mozku u myší

Handy et al. (2008)

• genotoxické a cytotoxické účinky - ryby

Long et al. (2007) EPA

• NPs TiO2 stimulace vzniku ROS v mozkových mikrogliích a poškození neuronů in-vitro

Kreyling et al. (2002)

• iv aplikace radioaktivních NPs 191Ir - distribuce do vnitřních orgánů (potkan)

Vstup NPs do organismu

Oberdörster et al. (2004) a Elder et al. (2006)

• inhalované NPs MnO o velikosti 30 nm (potkan)

• přestup přes zakončení čichových nervů v nosní dutině do čichového laloku předního mozku a z něj pak dále do hlubších struktur mozku (kůra, mozeček)

• axonální translokace

Monteiro-Riviere et al. (2007)

• penetrace kůže na in-vitro a ex-vivo modelech, důkaz o přestupu NPs TiO2 nejednoznačný

Kreuter (2004) a Elder et al. (2006)

• NPs potažené polysorbátem přestupují hematoencefalickou bariéru (BBB)

Hematoencefalická bariéra

Kapilára Červená krvinka

Endoteliální buňky

kapilárních stěn

Těsné spojení

Astrocyty

Základová membrána

Polysorbát(Tween 80)

Oberdörster G. et al., Environmental Health Perspectives 113 (7) 823-839 (2005)

Donaldson et al. (2002, 2006); Lam et al. (2004, 2006)

• intra-tracheální instilace či aspirace suspenzí NPs TiO2 či uhlíkových nanotrubic způsobuje v plicích u myší silnou zánětlivou odpověď i při nízkých koncentracích

Pulmotoxické účinky NPs

Shvedova et al. (2007)

• akutní inhalační expozice uhlíkovým nanotrubicím (SWNTs, MWNTs) - zvýšený počet zánětlivých buněk v broncho-alveolární tekutině potkanů, plicní granulom a fibróza

Ma-Hock et al. (2009)

• tříměsíční inhalační studie na potkanech - uhlíkové MWNTs - vznik granulomů, při všech testovaných koncentracích (0; 0,1; 0,5 a 2,5 mg/m3)

Alenius et al. (2010)

• zesílení zánětlivé reakce v plicích potkanů po úpravě povrchu TiO2 zvyšující hydrofilitu

Pulmotoxické účinky NPs• při stejné dávce mají NSPs vyšší schopnost vyvolat zánětlivou

reakci než částice větších rozměrů – vliv povrchu

– TiO2 (anatas) 20 a 250 nm – intratracheální aplikace – potkan– po 24 h měřena plicní zánětlivá neutrofilní reakce– pro částice stejného složení a různého povrchu je lepší mírou dávky

celkový povrch částic, než jejich hmotnost či počet

Oberdörster G. et al., Environmental Health Perspectives 113 (7) 823-839 (2005)

Celkově nízký počet prací, velký počet možných mechanismů, značná časová náročnost

Genotoxické účinky NPsSCCP (2007)

• nevhodnost in-vitro testů (Amesův) gentoxicity používaných pro roztoky

• genotoxické účinky NPs souvisí se zánětlivým procesem

Savolainen et al., Toxicology 269 (2010), 92-104

• několik publikací popisujících in-vivo testy genotoxicity uhlíkových nanotrubic (SWCNT, MWNCT) - obvykle nesmyslně vysoké dávkování

• vliv krystalické formy TiO2 (rutil vs. anatas) na výsledky různých typů in-vitro testů genotoxicity (kometový test, mikrojaderný test)

Muller et al. (2009)

• MWCNT ip, potkan kmen Wistar - žádná indukce mesotheliomu

• trubice kratší než 5 m - úspěšná fagocytóza makrofágy

Karcinogenní účinky NPsTakagi et al. (2008)

• perzistentní částice (Azbest) obvykle vyvolávají lokální tvorbu reaktivních forem kyslíku (ROS), vzniká dlouhodobý zánět zvýšené riziko rakoviny

Savolainen et al., Toxicology 269 (2010), 92-104

• celá řada prací popisující schopnost SWCNT a MWNCT indukovat tvorbu ROS při testech in vivo

Takagi et al. (2008)

• schopnost MWCNT vyvolávat mesotheliom u p53 +/+ myší převyšovala účinek azbestu (crocidolit) - obvykle se jednalo o AGLOMERÁTY, intraperitoneální apl.

Karcinogenní účinky NPs

Singh N. et al., Biomaterials 30, 3891–3914 (2009)

Indukce oxidativního stresu vyvolaná NPs

Singh N. et al., Biomaterials 30, 3891–3914 (2009)

Scaper et al. (1999)

• vysoký obsah snadno peroxidovatelných nenasycených mastných kyselin, vysoká spotřeba kyslíku a relativně nízké % antioxidačních enzymů v mozkové tkáni - vysoká citlivost mozku na zvýšenou tvorbu ROS

Neurotoxické účinky NPsNel et al. (2006)

• oxidativní stres a následná zánětlivá odpověď organismu jsou hlavními mechanismy jak NPs poškozují neurony

Mates et al. (1999)

• zvýšená produkce ROS zvýšené riziko Alzheimerovy, Parkinsonovy a Huntingtnovy choroby

Campbel et al. (2005)

• zvýšená koncentrace NPs v mozkové kůře a hippocampu u nemocných Alzh.

Neurotoxické účinky NPs

Hu et al., International Journal of Pharmaceutics 394 (2010) 115 - 121

Ma et al. (2009)

• při ip aplikaci 150 mg/kg TiO2 během 14 dnů akumulace NPs v mozku myši - oxidativní stres a poškození mozku

• anatas se akumuluje lépe (500 ng/g) než "bulk" TiO2 (350 ng/g)

Neurotoxické účinky NPsWang et al. (2009)

• negativní vliv Cu-90 a Mn-40 NPs na sekreci dopaminu při in-vitro testech (PC12)

Deng et al. (2009)

• NPs ZnO (20-300 nm) - indukce apoptózy neurálních kmenových buněk - vliv Zn2+ iontu uvolněného uvnitř buněk

Lockman et al. (2004)

• vliv náboje NPs na destrukci BBB - neutrální NPs a nízké koncentrace záporně nabitých NPs bez efektu, destrukce BBB kladně nabitými NPs

Radomski et al. (2005)

• inhalace SWCNT a MWCNT - agregace krevních destiček, trombóza

Vliv NPs na oběhový systémNurkiewitz et al. (2008)

• znečištění ovzduší polétavým prachem má prokázanou spojitost se zvýšeným rizikem úmrtí na srdeční choroby

• prachové částice větších poloměrů (0,1 - 2,5 m) způsobují při intratracheální expozici u potkanů zánětlivou reakci cévních stěn

• inhalace nízkých koncentrací NPs TiO2 - microvaskulární disfunkce, trombóza

Ericson et al. (2008)

• nanočástice fumagillinu naplněné statinem použity k léčbě aterosklerózy

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

• srovnávací in vitro studie toxicity čtyř druhů nanočástic a odhad možných mechanismů jejich toxického účinku

Faktory ovlivňující toxicitu NPs

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

• pro pokus použity PMEF buňky (primary mouse embrio fibroblast)• viability test (test přežívání) - živné médium mění zabarvení vlivem enzymatické aktivity buněk

Faktory ovlivňující toxicitu NPs

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

• LDH (laktát dehydrogenáza) - enzym, jehož extracelulární přítomnost signalizuje mechanické poškození příslušných buněk

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

• SOD (superoxid dismutáza) - enzym redukující oxidativní stres• MDA (malondialdehyd) - produkt reakce ROS a polynenasycených lipidů

• Tail DNA - test poškození DNA prováděný pomocí SGCE (single cell gel electrophoresis)

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Hui Yang et al., J. Appl. Toxicol. 2009, 29, 69-78

Závěry studie

Cytotoxicita a oxidativní stres• ZnO (oxid kovu) má výrazně větší cytotoxický efekt, než oxid křemičitý a obě formy uhlíku

• tvarová podobnost a shodná velikost částic mezi ZnO a SiO2 ukazuje, že vliv na rozdíl v toxicitě má v daném případě chemické složení

• menší částice CB mají menší cytotoxický a oxidativní efekt než větší částice ZnO• rozdílné chemické složení částic vede k jejich rozdílné schopnosti katalyzovat reakce vedoucí k produkci ROS a tím k oxidativnímu stresu, tvar částic má menší vliv než jejich chemické složení

Genotoxicita• CNTs vykazují větší schopnost poškozovat DNA než ZnO, které je nejefektivnější z hlediska schopnosti vyvolat oxidativní stres• mechanismem genotoxického účinku CNTs může být mechanické poškození DNA• výrazný vliv tvaru na genotoxické účinky

Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104

Strategie testování toxicity NPs

Fyzikálně chemická charakterizace• specifický povrch• chemická reaktivita• úroveň znečištění - těžké a přechodové kovy, organická

rozpouštědla apod• chování v aerosolech a suspenzích - agregace

Stupeň I

Testování na acelulárních systémech • produkce ROS, RNS apod

vyřazení z dalšího testování, pokud je dostupný test s dostatečnou predikční schopností, klasifikace

Ne

Ano

Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104

Strategie testování toxicity NPsIn-vitro testy• genotoxicita, imunotoxicita, dermální toxicita, oční

toxicita, neurotoxicita, hepatotoxicitaStupeň II

In vivo testy • imunotoxicita, orgánová toxicita, genotoxiicita,

reprodukční toxicita, ADME

Ne

Ano

vyřazení z dalšího testování, klasifikace

Ne

Ano

Stupeň III

vyřazení z dalšího testování, klasifikace

Savolainen K. et al., Toxicology 269 (2010) 92 - 104

Strategie testování toxicity NPs

Pozitivní testy genotoxicity a mutagenity vedou k dlouhodobým in vivo testům karcinogenity a reprodukční toxicity

Stupeň IV

Daphnia magna přecpaná nanočásticemi TiO2, SWCNT a Daphnia držící dietu.......