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U N I V E R S I D A D E D E S Ã O P A U L O

Esco la de Engenh ar ia de Lore na – EEL

1

Trabalho de Conclusão de Curso

Engenharia Química

DIEGO PAVAN CORNETTA

“Aproveitamento biotecnológico do permeado de soro de

queijo para produção de biomassa em biorreator”

Lorena – SP

2013



2

Diego Pavan Cornetta

“Aproveitamento biotecnológico do permeado de soro de

queijo para produção de biomassa em biorreator”

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado à Escola de engenharia de

Lorena como requisito para conclusão do

curso de Engenharia Química

Orientador: Prof. Dr. Ismael Maciel de Mancilha

Lorena – SP

2013



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DEDICATÓRIA

Dedico o presente trabalho de conclusão de curso aos meus pais pelo apoio e suporte durante todo a período de graduação e vida.



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AGRADECIMENTOS

A minha família pelo apoio, suporte e compreensão durante toda a

graduação.

Ao professor Ismael, pela orientação e ajuda durante todo esse trabalho

e também pela oportunidade de conduzi-lo no laboratório de probióticos.

Ao Juan, por toda a ajuda e ensinamentos desde os tempos de iniciação

científica.

Ao professor Arnaldo Márcio, pela utilização do fermentador de bancada

e por toda sua paciência e atenção.

Aos amigos de laboratório Flávio, Cláudio e Aline, pela convivência no

ambiente de trabalho.

A todos os amigos que de alguma maneira contribuíram para a

realização deste trabalho.



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LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fórmulas estruturais da lactose (A), glicose (B) e galactose (C)................................12

Figura 2. Assimilação de lactose e glucose por Kluyveromyces marxianus....................................................................................................................................14 Figura 3. Fermentador de bancada............................................................................................18 Figura 4. Variação da concentração de lactose e biomassa em processo desenvolvido em

fermentador de bancada ao nível de aeração de 2,0 vvm..........................................................22

Figura 5. Variação da concentração de lactose e biomassa em processo desenvolvido em






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LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição do soro de queijo doce...........................................................................10

Tabela 2. Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionado 22 para a produção de

biomassa pela levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de

queijo...........................................................................................................................................17

Tabela 3. Matriz do planejamento experimental 22 para a para a produção de biomassa pela

levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de

queijo...........................................................................................................................................17

Tabela 4. Resultados do planejamento fatorial fracionado 22 para a produção de biomassa pela

levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de

queijo...........................................................................................................................................21

Tabela 5. Valores de concentração de lactose, biomassa e parâmetros fermentativos em

processo desenvolvido em reator de bancada ao nível de aeração de 2,0 vvm........................22






processo desenvolvido em reator de bancada após 21h............................................................25



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SUMÁRIO

1. Introdução..............................................................................................08

2. Revisão Bibliográfica............................................................................09

2.1 Soro de queijo..............................................................................09

2.2 Metabolismo da Lactose...............................................................12

2.3 Leveduras que Metabolizam Lactose...........................................14

3. Materiais e Métodos..............................................................................16

3.1 Obtenção e tratamento do permeado de soro.............................16

3.2 Microrganismos............................................................................16

3.3 Preparo do inóculo.......................................................................16

3.4 Processo fermentativo..................................................................16

3.5 Métodos analíticos.......................................................................19

3.5.1 Determinação da concentração celular..................................19

3.5.2 Determinação da concentração de lactose.............................19

3.6 Determinação dos parâmetros fermentativos..............................20

3.6.1 Cálculo do fator de rendimento – Yx/s.....................................20

3.6.2 Cálculo da produtividade – Qp................................................20

4. Resultados e Discussões.....................................................................21

5. Conclusões............................................................................................27

6. Referências Bibliográficas...................................................................28

7. Anexo.....................................................................................................32



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1. Introdução

A preocupação com a redução do impacto ambiental dos poluentes

estimula o desenvolvimento de pesquisas biotecnológicas para o

aproveitamento de subprodutos da agroindústria. Processos novos e

econômicos que utilizam resíduos como substratos para a obtenção de

proteína celular e biomoléculas vêm sendo investigado. No Brasil, a indústria

de laticínio gera milhares de toneladas de soro como resíduo da produção de

queijo. A composição do soro varia de forma considerável dependendo da fonte

de leite, tipo de queijo e dos processos aplicados na produção. A composição

típica do soro residual inclui lactose (5,0 % m/m); proteína (0,8 % m/m) e

minerais (0,4 – 1,0 % m/m) (LING, 2008).

O descarte de soro de queijo de forma direta ou indiretamente nos

cursos dos rios, sem qualquer tipo de tratamento, gera um grande problema

ambiental, pois o potencial poluidor do soro de queijo é aproximadamente cem

vezes maior que o esgoto doméstico, ou seja, cada 1000 litros de soro não

tratados por dia equivale a uma poluição diária de 470 pessoas. Os valores de

demanda química e bioquímica de oxigênio (DQO, DBO) do soro de queijo são

superiores a 50 g/L (ZAFAR, OWAIS, 2006).

Ao longo dos últimos anos, um dos desafios da biotecnologia é o

desenvolvimento de processos para a utilização de resíduos agroindustriais,

como o soro de queijo. Nesta perspectiva, a fermentação do soro para

obtenção de bioprodutos de elevado valor agregado emerge como uma

alternativa para a redução da carga poluidora dos resíduos líquidos da indústria

de laticínio. Assim, vários estudos têm sido realizados para utilizar a lactose

presente no soro como substrato para obtenção de produtos como etanol e

biomassa como suplemento alimentar para animais e humanos.

A presença de lactose como único carboidrato fermentável no soro limita

sua utilização como fonte de carbono e energia pelos microrganismos. Poucas

espécies de leveduras, incluindo Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces



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lactis, Kluyveromyces fragilis and Candida sp. apresentam atividade β-

galactosidase, enzima fundamental para a hidrólise da lactose.

O uso de espécies de microrganismos com interesses nutricionais teve

início no final da 2ª Guerra Mundial, e os alemães foram os pioneiros na

utilização de leveduras na alimentação animal e humana. Este produto foi

chamado de Single Cell Protein (SCP), que se refere à produção de proteínas

unicelulares. Microrganismos como algas (Spirulina, Chlorella, Laminaria,

Rhodymenia), bactérias (Lactobacillus, Cellulomonas, Alcaligenes), leveduras

(Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Pichia, Torulopsis) e fungos

(Aspergillus, Penicillium) são considerados como fontes de proteína. Assim, a

produção de proteína unicelular a partir de soro de queijo representa uma

opção para seu aproveitamento ao invés de trata-lo apenas como efluente

industrial.

A produção de proteína unicelular e etanol a partir de soro de queijo vêm

sendo estudado em frascos agitados e reatores de bancada por diversos

grupos de pesquisas. Entretanto, faz-se necessário o desenvolvimento de

pesquisas que visem a seleção de novas cepas de leveduras que apresentem

maior potencial de crescimento em soro de queijo.

Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial e a viabilidade

da utilização do permeado de soro de queijo na formulação de meio de cultivo

para a produção de biomassa pela levedura Kluyveromyces marxianus UFV-3.

2. Revisão Bibliográfica 2.1. Soro de queijo

Para a fabricação de queijos, adiciona-se ao leite uma cultura láctica

composta de bactérias produtoras de ácido láctico, e um preparado enzimático

capaz de coagular a caseína do leite. A atividade da enzima, combinada com a

acidez produzida pelo fermento, causam a desestabilização da caseina

promovendo sua coagulação, formando um gel de caseína. O coágulo formado

é cortado e aquecido lentamente, e este processo de cozimento provoca a



10

contração do gel e a expulsão de líquido do seu interior. Este líquido

remanescente da precipitação da caseína do leite, durante a fabricação do

queijo, recebe o nome de soro de queijo (SISO, MIG, 1996).

Fatores que interferem na composição do soro incluem o pH, seu

conteúdo em proteínas, sais minerais, ácidos graxos e lactose (SCOTT,

1986).No Brasil, a produção de soro é representada quase que exclusivamente

pelo soro doce, proveniente da fabricação de queijos de coagulação

enzimática, como o minas frescal, meia cura, prato, mussarela, entre outros. A

Tabela 1 apresenta a composição média do soro de queijo doce (GALVÃO,

2004).

Tabela 1. Composição do soro de queijo doce

Componente Concentração (g/L)

Sólidos totais 66,00

Proteína total 6,57

Nitrogênio não proteico 0,37

Lactose 52,30

Gordura 0,20

Minerais 5,00

Cálcio 0,50

Fosfato 1,00

Sódio 0,53

Segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Queijo (ABIQ), a

produção nacional de queijo em 2011 foi estimada em 867,1 mil toneladas.

Para cada kg de queijo produzido, são gerados em torno de 10 litros de soro, o

que representa uma importante fonte de poluição quando descartado no corpo

receptor sem tratamento (MENDES; ARAÚJO, 2010; SIENKIEWICZ, RIEDEL,

1990).

Além disso, o nitrogênio do soro de queijo é solúvel em água e pode ser

levado para o solo, o que pode comprometer a estrutura física e química do

mesmo, interferindo negativamente na produção agrícola e provocar sérios

problemas de poluição das águas (BEM-HASSAN, GHALY, 1994). Portanto, o



11

não aproveitamento do soro traz o problema da contaminação do meio

ambiente e, por esse motivo, vem se exigindo das indústrias o seu tratamento

antes do descarte.

Para atender a legislação ambiental, as indústrias têm buscado

alternativas para sua utilização. As proteínas contidas no soro, por exemplo,

podem ser separadas por ultrafiltração e utilizadas como suplemento alimentar.

Entretanto, a recuperação das proteínas pouco contribui para a diminuição da

carga poluente do soro, formada principalmente pela lactose presente no

permeado (MAWSON, 1994). Apesar de solucionar o problema legal associado

ao lançamento de soro sem tratamento em cursos d’água, o tratamento do soro

pelos métodos de tratamento de efluentes gera produtos com baixo ou nenhum

valor econômico. Dessa maneira, o tratamento de soro se constitui em uma

fonte de trabalho e custo, que são refletidos diretamente nos preços dos

produtos para o consumidor final.

Nas últimas décadas foram desenvolvidos vários processos que

permitem a obtenção de produtos com alto teor de proteínas a partir do soro,

preservando suas propriedades intrínsecas destacando-se os concentrados e

os isolados de soro. Os processos desenvolvidos empregam essencialmente

sistemas com membranas semipermeáveis, nos quais a separação dos

compostos do soro é baseada no tamanho molecular dos compostos. A

produção destes ingredientes proteicos envolve processos de separação com

membranas,: osmose reversa, ultrafiltração e microfiltação. Cromatografia de

troca iônica é usada na produção de isolados de soro; nesse caso, a separação

se baseia na carga eletrostática e no caráter anfótero das proteínas

(HUFFMAN, HARPER, 1999).

No soro bruto de queijo utilizado no presente trabalho, foi utilizada a

separação de proteínas mediante ultrafiltração em membrana polimérica para

sua posterior comercialização. O permeado resultante deste processo

apresenta uma alta concentração de lactose (12 - 18 %) que representa uma



12

fonte de carbono passível de ser utilizada como substrato em processos

fermentativos (TIM, MAWSON, 1993, ZAFAR, OWAIS, 2006).

2.2. Metabolismo da Lactose

A lactose é um dissacarídeo característico do leite dos mamíferos,

sendo praticamente essa sua única fonte. Outras fontes de lactose são raras,

como constituinte de oligossacarídeos, em flores do gênero Forsythia e

Sapotacea. O leite humano possui maior quantidade de lactose,

aproximadamente 7%, comparado aos 4,8% encontrado no leite bovino

(WONG et al, 1988). Quando hidrolisada, a lactose gera D-glicose e D-

galactose, cujas estruturas são mostradas na Figura 1.

Figura 1. Fórmulas estruturais da lactose (A), glicose (B) e galactose (C). Fonte: Zadow, 1984

Este dissacarídeo é hidrolisado pela enzima intestinal β-D-galactosidase

ou lactase, liberando seus componentes monossacarídicos para absorção na

corrente sanguínea. A galactose é enzimaticamente convertida em glicose, que

é o principal combustível metabólico de muitos tecidos. A atividade da lactase é

alta durante o período neonatal e de lactância, mas declina por ocasião do

desmame (BARBOSA,C. R.; ANDREAZZI, M. A. 2011).

A lactase é uma enzima situada nas microvilosidades do enterócito

(MORAIS, 2007). Quando há deficiência desta enzima, a lactose, que é uma

boa fonte de energia para os microrganismos do cólon, é fermentada a ácido



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láctico, metano (CH4) e gás hidrogênio (H2). O gás produzido cria um

desconforto por distensão intestinal e pelo incômodo problema de flatulência. O

ácido láctico produzido pelos microrganismos é osmoticamente ativo e

promove a retirada de água das células para o intestino, assim como a lactose

não digerida, resultando em diarreia (BARBOSA,C. R.; ANDREAZZI, M. A.

2011).

Sua utilização na indústria advém de algumas características físico-

químicas particulares, como a habilidade de carregar sabores e cores, sendo

utilizada na fabricação de biscoitos, recheios e outros produtos de panificação.

A natureza redutora da lactose aliada ao fato de que não é fermentada pelas

leveduras do pão lhe conferem características únicas para serem utilizadas na

indústria de panificação. Assim, sua adição à massa aumenta o dourado da

crosta do pão (WONG et al, 1988).

Uma alternativa para se utilizar a lactose presente no soro de queijo é a

produção de etanol. São poucas as espécies de leveduras capazes de produzir

etanol a partir de lactose. A maioria das espécies do gênero Saccharomyces

não apresenta a capacidade de metabolizar a lactose. A presença de lactose,

como única fonte de carbono no permeado, limita a sua utilização a um grupo

de espécies de microrganismos produtores da enzima β-galactosidase, entre

os quais sedestacam espécies de leveduras do gênero Kluyveromyces (GRBA

et al, 2005).

A enzima β-galactosidase atua como catalisador biológico na conversão

de lactose em unidades monoméricas de galactose e glicose (OZMIHCI;

KARGI, 2007). A Figura 2 ilustra a assimilação da lactose por leveduras.



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Figura 2. Assimilação de lactose e glucose por Kluyveromyces marxianus (Adaptado de Lee et

al., 1996)

Outra alternativa para utilização da lactose é a produção de proteínas

unicelulares. A aceitabilidade de um microrganismo em particular para o uso na

alimentação humana e animal depende de seu valor nutricional e sua

segurança, incluindo o teor de ácidos nucléicos, presença de toxinas e

compostos residuais indesejáveis. Os microrganismos apresentam alto teor de

proteínas e elevada velocidade de crescimento, o que leva a uma rápida

produção de biomassa, sendo que esta pode ser contínua e independe das

condições do ambiente (BEKATOROU et al., 2006).

2.3. Leveduras que Metabolizam Lactose

As leveduras foram os primeiros microrganismos utilizados na produção

de proteínas unicelulares (SCP) sendo as que receberam maior atenção nos

estudos e apresentam maior aceitação pelos consumidores. Isto se deve

principalmente ao fato de que raramente são tóxicas ou patogênicas. Apesar

de seu teor de proteínas não exceder 60%, sua concentração de aminoácidos

essenciais, como lisina, triptofano e treonina, é satisfatória. Além disso,

apresentam pequenas quantidades de aminoácidos sulfurados, como a

Etanol + CO2



15

metionina e a cisteína. Outras características incluem o fato que são células

maiores que as bactérias, facilitando sua separação; e de poderem ser

utilizadas em seu estado natural. Entretanto, sua taxa de crescimento

específico é relativamente baixa, com um tempo de geração de 2 a 5 horas.

Nos últimos anos, outras leveduras, além da S. cerevisiae, despertaram

interesse industrial como produtoras de proteínas heterólogas. Exemplos

destas leveduras são aquelas que utilizam o metanol, como a Hansenula

polymorpha e Pichia pastoris; e as espécies que degradam a lactose, como

Kluyveromyces lactis, K. fragilis e K. marxianus. A aplicação destas espécies

em processos de fermentação em larga escala para a produção de proteínas

heterólogas se tornou uma prática industrial comum (PINHEIRO et al., 2000).

A espécie K. marxianus é de grande interesse nos processos industriais,

pois apresenta a capacidade de crescimento a elevadas temperaturas,

diminuindo os custos de resfriamento e os riscos de contaminação; possui altas

velocidades de crescimento e ainda é considerada um microrganismo GRAS

(generally recognized as safe) pelo FDA (Food and Drug Administration) dos

EUA (FURLAN et al, 1995).

Sua versatilidade como espécie de microrganismo de interesse industrial

é amplamente ilustrada pela diversidade de processos industriais reportados na

literatura, como a produção de lactase (MAHONEY et al, 1974; BALES,

CASTILLO, 1979), algumas vezes silmutaneamente com inulinase (HEWITT,

GROOTWASSINK, 1984) e com pectinases (ESPINOZA et al, 1992). A

utilização do soro de queijo ou de sua fração glicolítica como meio de cultura é

destacada em todos esses processos. A possibilidade de utilização desta

matéria-prima, muitas vezes vista apenas como efluente industrial, baseia-se

no fato de que a levedura K. marxianus é capaz de metabolizar a lactose.



16

3. Material e Métodos

3.1. Obtenção e tratamento do permeado de soro

O permeado de soro de queijo obtido por ultrafiltração foi fornecido pela

empresa Dan-Vigor Indústria e Comércio de Laticínios Ltda - Cruzeiro-SP. O

permeado foi tratado com HCl (7 M) até pH 4,3 e submetido a tratamento

térmico de 50°C por 20 minutos com o objetivo de remover proteínas

remanescentes do processo de ultra filtração.

3.2. Microrganismos

A levedura Kluyveromyces marxianus UFV-3, gentilmente cedida pelo

Departamento de Microbiologia Agrícola da UFV, foi avaliada quanto a sua

capacidade de sintetizar biomassa a partir da lactose presente no permeado de

soro de queijo. Esta cultura foi mantida a 4 ºC e repicada periodicamente em

tubos contendo meio YEPD, constituído por extrato de levedura (10 g/L), bacto

peptona (10 g/L), dextrose (20 g/L) e ágar (20 g/L).

3.3. Preparo do inóculo

O preparo do inoculo, foi realizado em frascos Erlenmeyer de 250 mL

contendo 125 mL de meio formulado com permeado de soro de queijo

previamente tratado suplementado com 2 g/L de extrato de levedura Biorigin,

incubado em incubadora de movimento rotatório com agitação de 200 rpm, a

30 ºC por 24 horas. Em seguida as células foram recuperadas por

centrifugação a 2000 x g por 10 minutos e lavadas com água esterilizada,

resultando em uma suspensão que foi utilizada como inoculo.

3.4. Preparo do meio e condições da fermentação

As fermentações para a produção de biomassa foram conduzidas em

frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 ml do meio de fermentação,

constituído de permeado de soro de queijo com diferentes concentrações de

lactose (50, 75 e 100 g/L) e suplementado com ureia (NH2CONH2), 0,5 g/L e



17

fosfato de potássio dibásico (K2HPO4), 1,0 g/L, a pH 5,5. O meio foi inoculado

com uma suspensão celular em quantidade suficiente para conferir uma

concentração de células de 1,0 g/L e incubado em shaker de bancada até o

consumo total da lactose a temperatura de 30 ºC. Foram avaliados três níveis

de agitação: 150, 200 e 250 rpm.

As diferentes condições de agitação e concentração de lactose foram

avaliadas segundo um delineamento fatorial completo 22, conforme

apresentado nas Tabelas 2 e 3. Os experimentos foram realizados em

duplicata.

Tabela 2. Níveis das variáveis do planejamento fatorial fracionado 22 para a produção de

biomassa pela levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de queijo.

NÍVEIS

VARIÁVEIS FATORES -1 0 +1

Lactose (g/L)

50 75 100

Agitação (rpm) 150 200 250

Tabela 3. Matriz do planejamento experimental 22 para a para a produção de biomassa pela

levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de queijo.

Ensaios Lactose Agitação

1 -1 -1

2 +1 -1

3 -1 +1

4 +1 +1

5 0 0

6 0 0

7 0 0

O ensaio que apresentou melhores resultados foi avaliado em

fermentador de bancada em reator Bioflo III (The Microprocessor controlled

laboratory-scale fermentor) da New Brunswick Scientific, representado na



18

Figura 3. O esquema de montagem da cuba de fermentação está apresentado

em anexo. Foi utilizado 1 litro do meio de fermentação suplementado com

ureia (NH2CONH2), 0,5 g/L e fosfato de potássio dibásico (K2HPO4), 1,0 g/L. O

pH foi controlado entre 5,4 e 5,6 e a agitação constante em 500 rpm a

temperatura de 30 °C. Amostras foram coletadas nos tempos inicial, 2, 4, 6, 8,

10, 12, 15, 18 e 21 horas de cultivo, para quantificação da biomassa e lactose

presentes no meio.

As amostras coletadas durante a fermentação foram centrifugadas a

2360 x g por 20 minutos. As células foram lavadas com agua esterilizada e o

sobrenadante reservado para determinação da concentração da lactose.

Figura 3. Fermentador de bancada



19

3.5. Métodos Analíticos

3.5.1. Determinação da concentração celular

A concentração de células foi determinada por turbidimetria, a partir de

uma curva de calibração que correlaciona absorbância a 600 nm e a

concentração em g/L da biomassa obtida em diferentes tempos de

fermentação.

3.5.2. Determinação da concentração de lactose

A lactose remanescente foi determinada pelo método do ácido-3,4-

dinitro salicílico (DNS). Para a preparação do reagente, foram dissolvidos por

aquecimento 5 g de ácido-3,5-dinitrosalicílico em 100 mL de NaOH 2N.

Separadamente dissolveu-se por aquecimento 150 g de tartarato duplo de

sódio e potássio em 250 mL de água destilada. Misturou-se as duas soluções e

completou-se o volume para 500 mL. Para construção da curva de calibração,

adicionou-se 1 mL de amostra padrão com diferentes concentrações, 0,5 mL

de água destilada e 1 mL da solução preparada anteriormente em tubos de

ensaio. Então, os tubos foram levados ao banho-maria a 100ºC por 5 minutos e

em seguida, foram deixados sobre a bancada para esfriar até a temperatura

ambiente. Em seguida, adicionou-se 7,5 mL de água destilada a cada tubo e

leu-se a absorbância em 540 nm, utilizando água destilada como branco.



20

3.6. Determinação dos parâmetros fermentativos

Os resultados dos ensaios realizados foram analisados considerando os

seguintes parâmetros: fator de conversão de substrato em biomassa (YX/S) e

produtividade volumétrica em relação a biomassa (QP) .

3.6.1. Cálculo do fator de rendimento - YX/S

onde:

YX/S = fator de rendimento em biomassa (g/g); Xf = concentração final de

biomassa (g/L); Xi = concentração inicial de biomassa (g/L); Sf = concentração

final de lactose (g/L); Si = concentração inicial de lactose (g/L).

3.6.2. Cálculo da produtividade - Qp

onde:

QP = produtividade volumétrica em biomassa (g/L.h); Pf = concentração final de

biomassa (g/L); Pi = concentração inicial de biomassa (g/L); t = intervalo de

tempo da fermentação (h).



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4. Resultados e Discussão

Os resultados referentes ao consumo de lactose e produção de

biomassa desenvolvidos em conformidade com o planejamento fatorial 22 são

mostrados na Tabela 4. Observa-se que nos ensaios 1 e 3 os quais continham

50 g/L de lactose inicial, o açúcar foi totalmente consumido após 12 horas de

fermentação. Assim, os resultados para tal tempo estão representados na

Tabela 4 para todos os ensaios realizados.

Tabela 4. Resultados do planejamento fatorial fracionado 22 para a produção de biomassa pela

levedura K marxianus UFV-3 em meio formulado com soro de queijo.

Na Tabela 4, observa-se que os maiores valores de biomassa,

rendimento (YX/S) e produtividade (QP) foram obtidos para as concentrações

mais elevadas de substrato, independente do nível de agitação. Os máximos

valores foram observados nas condições de ensaio 4, obtendo-se YX/S e QP de

0,0979 g/g e 0,5025 g/L.h, respectivamente. Estes resultados são similares aos

observados por RIBEIRO et al. (2004), que constataram que o aumento da

concentração de lactose estimula a síntese da enzima β-galactosidase e

consequentemente, o aumento da concentração celular e acúmulo de

biomassa no meio fermentativo. Assim, a condição de 100 g/L de lactose inicial

foi a escolhida para realizar os experimentos no fermentador de bancada.

Ensaio Agitação

(rpm) Lactose 0h

(g/L) Lactose 12h

(g/L) Biomassa 0h

(g/L) Biomassa 12h

(g/L) Y x/s (g/g)

Qp (g/L.h)

1 150 52,95 0,96 1,17 5,26 0,0787 0,3408

2 150 96,31 33,36 1,21 7,14 0,0942 0,4942

3 250 48,48 0,91 1,15 5,40 0,0893 0,3542

4 250 95,64 34,03 1,16 7,19 0,0979 0,5025

5 200 78,53 11,27 1,06 6,69 0,0837 0,4692

6 200 80,50 8,19 1,18 6,95 0,0798 0,4808

7 200 77,46 8,55 1,11 7,08 0,0866 0,4975



22

Os ensaios foram realizados no fermentador de bancada utilizando-se

diferentes níveis de volumes de ar estéril por unidade de volume de meio (1,0;

1,5 e 2,0 vvm). Durante os ensaios, amostras foram retiradas a intervalos de 2

horas nas 12 primeiras horas e em seguida em intervalos de 3 horas até o

completo consumo de lactose. Os resultados estão apresentados nas Tabelas

5 a 8; e representados nas Figuras 4 a 6.


processo desenvolvido em reator de bancada ao nível de aeração de 2,0 vvm.


fermentador de bancada ao nível de aeração de 2,0 vvm.

horas lactose

(g/L) biomassa

(g/L) Y x/s (g/g)

Qp (g/L.h)

0 96,06 1,13 - - 2 92,66 1,88 0,2206 0,3750 4 79,96 3,55 0,1503 0,6050 6 73,52 5,71 0,2032 0,7633 8 59,39 7,65 0,1778 0,8150

10 51,66 9,3 0,1840 0,8170 12 45,44 10,95 0,1940 0,8183 15 31,77 12,54 0,1775 0,7607 18 19,96 13,67 0,1648 0,6967 21 8,04 15,44 0,1626 0,6814



23

Tabela 6 Valores de concentração de lactose, biomassa e parâmetros fermentativos em


Figura 5 Variação da concentração de lactose e biomassa em processo desenvolvido em


horas lactose

(g/L) biomassa

(g/L) Y x/s (g/g)

Qp (g/L.h)

0 95,17 0,93 - - 2 91,41 1,39 0,1223 0,2300 4 87,12 2,54 0,2000 0,4025 6 78,71 4,37 0,2090 0,5733 8 62,43 6,77 0,1784 0,7300

10 49,37 8,55 0,1664 0,7620 12 34,52 10,76 0,1621 0,8192 15 20,07 13,3 0,1647 0,8247 18 8,03 14,37 0,1542 0,7467 21 0 16,95 0,1683 0,7629



24



horas lactose

(g/L) biomassa

(g/L) Y x/s (g/g)

Qp (g/L.h)

0 93,38 1,14 - -

2 89,62 1,39 0,0665 0,1250

4 86,04 2,16 0,1390 0,2550

6 70,3 3,81 0,1157 0,4450

8 69,23 5,53 0,1818 0,5488

10 48,66 8,24 0,1588 0,7100

12 35,99 10,35 0,1605 0,7675

15 19,25 12,18 0,1489 0,7360

18 6,51 13,44 0,1416 0,6833

21 2,99 14,96 0,1529 0,6581





25


processo desenvolvido em reator de bancada após 21h.

Aeração (vvm)

Lactose remanescente

(g/L)

Biomassa (g/L)

Y x/s (g/g)

Qp (g/L.h)

2,00 8,04 15,44 0,1626 0,6814

1,50 0,00 16,95 0,1683 0,7629

1,00 2,99 14,96 0,1529 0,6581

Ao se analisar os resultados apresentados na Tabela 8, observa-se que

a maior concentração de biomassa foi obtida utilizando-se uma condição de

aeração de 1,5 vvm. Nesta condição, obteve-se o maior concentração de

biomassa (16,95 g/L), rendimento (0,1683 g/g) e produtividade volumétrica

(0,7629 g/L.h) após 21 horas de fermentação, condição ainda na qual a lactose

foi totalmente consumida pela levedura.

Húngaro et al. (2008), avaliaram o cultivo de Kluyveromyces marxianus

ATCC 8554 em meio contendo 55 g/L de lactose de soro de queijo frescal sob

diferentes condições em reator de bancada. Para os máximos valores dos

fatores avaliados (1,5 vvm, 300 rpm, pH 7,0, 30oC e concentração celular inicial

de 1,0 g/L), os autores observaram valores máximos de biomassa (3,5 g/L),

rendimento (0,07 g/g) e produtividade (0,1382 g/L.h) após 26 h de cultivo. Estes

resultados são inferiores aos observados no presente trabalho. Por outro lado,

Rech (1998) em estudos para produção de lactase, utilizando soro de queijo na

concentração de 150 g/L como substrato e a levedura K. marxianus CBS 6556,

obteve os maiores resultados nas utilizando 2 vvm, 500 rpm, 37 oC e

concentração celular inicial entre 0,05 e 0,1 g/L. A autora descreve valores de



26

conversão de substrato em biomassa de 0,320 g/g em biorreator de bancada

após 14,6 horas de cultivo.

Revillion et al. (2003) avaliaram a produção de células de

Kluyveromyces marxianus em biorreator contendo meio composto por 50 g/L

de lactose inicial. Os autores alcançaram uma conversão de 0,30 g/g após 15

horas de fermentação, valor superior ao encontrado no presente trabalho. Em

outros estudos, Brinques (2009) utilizou meio de cultivo contendo 140 g/L de

lactose, temperatura de 34 oC, agitação de 200 rpm, taxa de aeração de 2 vvm

e concentração celular inicial de 0,5 g/L para propagação de Lactobacillus

plantarum em biorreator, obtendo-se 14,97 g/L de biomassa após 48 horas de

cultivo.

Em relação aos cultivos conduzidos em condições de aeração de 2 vvm,

observa-se diminuição nos principais parâmetros bioquímicos. O rendimento

em ATP sob condições anaeróbias é muito menor que o obtida na oxidação

completa da glicose até o CO2 e H2O, sob condições aeróbias. Assim, era

esperado encontrar maiores valores de rendimento e produtividade em

biomassa na condição de maior aeração, o que não ocorreu. Uma possível

explicação para tal resultado, tendo em vista que a condição de aeração de 2

vvm foi a que apresentou maior lactose remanescente. Conforme descrito por

PINHEIRO; BELO; MOTA, 2000 o oxigênio é um fator limitante para o

crescimento celular, porém em grandes concentrações pode ser tóxico para o

microrganismo causando um estresse oxidativo. Onken e Liefke (1989)

afirmaram que como consequência de altas concentrações de oxigênio, as



27

células podem retardar ou até mesmo parar seu crescimento, dependendo da

sua sensibilidade ao excesso de oxigênio no meio. Tal afirmação foi

comprovada por Pinheiro et al. (2002) utilizando uma cepa da levedura

Kluyveromyces marxianus, trabalho no qual os autores encontraram baixas

porcentagens de células viáveis e pouco crescimento celular em condições de

alta pressão parcial de oxigênio.

5. Conclusões

O soro de queijo representa um substrato alternativo para a produção de

biomassa de leveduras. Neste trabalho, os melhores resultados obtidos após

21 h de cultivo foram 0,1683 gbiomassa/glactose de rendimento e 0,7629

gbiomassa/L.h de produtividade, utilizando-se 100 g/L de lactose suplementado

com ureia (NH2CONH2) e fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) e taxa de

aeração de 1,5 vvm.

Apesar dos resultados apresentados nesse trabalho estarem abaixo dos

encontrados na literatura, pode-se concluir que o soro de queijo apresenta

potencial para ser utilizado como meio de cultura para propagação de

biomassa. Entretanto, são necessários novos experimentos variando-se

parâmetros mantidos constantes no presente trabalho a fim de melhorar os

resultados obtidos.



28

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7. Anexo

Detalhes da cuba do fermentador utilizado no presente trabalho.



33



34



35

Documents

Trabalho de Conclusão de Curso Engenharia Química DIEGO ...sistemas.eel.usp.br/bibliotecas/monografias/2013/MEQ13019.pdf · da utilização do permeado de soro de queijo na formulação