INTRODUCCION La expresin de la informacin gentica contenida en un segmento de DNA siempre requiere la sntesis de una molcula de RNA. Durante el proceso de transcripcin , una enzima, llamada RNA polimerasa, convierte la informacin gentica de un segmento de DNA en una hebra de RNA con una secuencia complementaria a una de las hebras del DNA.

Estructura y propiedades del RNA El RNA , al igual que el DNA es un polmero lineal de nucletidos unidos por enlaces fosfodiester 3',5' , a diferencia del DNA los nucletidos en el RNA son ribonucletidos, y se encuentra la base uracilo en lugar de la timina.La presencia caracterstica en el RNA del grupo hidroxilo 2' (2'OH) en la ribosa hace que la molcula de RNA sea ms susceptible a la hidrlisis

Estructura y propiedades del RNA El RNA normalmente esta compuesto de una sola hebra, pero puede formar regiones de doble hlice intramolecular que le dan una conformacin tridimensional. El RNA es la nica molcula que tiene funciones informacionales y catlticas.

Tipos de RNA

1. RNA mensajero (mRNA), lleva la informacin que codifican para la secuencia de aminocidos de uno o ms polipptidos especificados por un gen o conjunto de genes hacia los ribosomas donde se realiza la sntesis de las protenas. Tienen una vida media que va de minutos a horas.RNA de Transferencia (tRNA), es una molcula adaptadora que lee la informacin codificada en el mRNA y transfiere el aminocido apropiado a la cadena polipeptidica 1. en crecimiento durante la sntesis de protenas. Tiene una vida media que va de horas a das.

Tipos de RNA1. RNA ribosomal (rRNA), molculas que asociadas con protenas forman el ribosoma. Tienen una vida media que va de horas a das. 2. RNA pequeo del ncleo (snRNA), se encuentran formando complejos con protenas conocidas partculas ribonucleoproteicas pequeas del ncleo o "snurps". Estas se encuentran en el ncleo de las clulas eucarioticas y participan en el procesamiento de los pre-mRNA.

Tipos de RNA3. RNA de virus, muchos virus de bacterias, plantas y mamferos tienen RNA como material gentico.4. Ribozimas, algunas enzimas tienen RNA como una parte integral de sus sitios activos. Tambin hay enzimas que son puro RNA.

TRANSCRIPCION EN PROCARIONTES La bacteria E. coli una sola RNA polimerasa es la responsable de toda la transcripcin que ocurre en la clula. Tiene las siguientes caractersticas estructurales y funcionales. Tiene 6 subunidades funcionales: 2 subunidades alfa, una subunidad beta, una subunidad beta prima , la subunidad o factor sigma y una subunidad omega

Formas de la RNA polimerasa La enzima ncleo, compuesta de 2 subunidades alfa, una subunidad beta y una subunidad beta prima. Es capaz de copiar ambas hebras del DNA pero carece de especificidad. La RNA polimerasa holoenzima, es la forma totalmente funcional de la enzima. Consiste de la enzima ncleo ms el factor sigma. Tiene especificidad y reconoce seales especficas de inicio de transcripcin en el DNA conocidas como regiones promotoras, debido a la presencia del subunidad o factor sigma que reconoce las regiones promotoras y que luego de la iniciacin se disocia.

RNA Polimerasala sntesis de RNA llevada a cabo por la RNA polimerasa es semejante a la sntesis del DNA. sintetiza una hebra de RNA aadiendo unidades de ribonucletidos al extremo 3' terminal de una cadena de RNA, construyendo una cadena de RNA en direccin 5'->3.

Requerimientos de la RNA polimerasa Para su actividad la RNA polimerasa requiere: Un DNA molde Mg ++ o Mn++ Los cuatro ribonuclesidos trifosfatos (ATP, GTP,UTP,CTP)

Mecanismo general de la transcipcion La RNA polimerasa requiere un DNA de doble cadena como molde. Sin embargo durante la transcripcin de un gen en particular, slo una de las hebras del DNA llamada hebra anti-sentido o hebra molde (antisense strand) , es copiada a RNA. La hebra de DNA complementaria a la molde se le llama hebra con-sentido (sense strand).

Mecanismo II La direccin de la transcripcin es 5'->3', lo que significa que la hebra molde es leda en direccin 3'->5'. A diferencia de las DNA polimerasas , las RNA polimerasas no requieren RNA cebadores o primers. Durante la transcripcin , la RNA polimerasa desenrolla parcialmente la doble hlice del DNA.

Mecanismo III Conforme se mueve a lo largo del DNA una regin de aproximadamente 17 pares de bases se mantiene desenrrollada. Debido a que los nucletidos son incorporados al RNA teniendo como regla el apareamiento de bases con la hebra molde del DNA, se forma un hbrido transitorio DNA-RNA de 12 pares de bases justo detrs del sitio de polimerizacin.

Mecanismo IV Posteriormente , el RNA se libera del molde y las dos cadenas del DNA se unen. La RNA polimerasa aade entre 40 - 50 nucletidos por segundo.

PROMOTORESLa sntesis del RNA se inicia en un promotor PROMOTORES. Un promotor es una secuencia de DNA a la cual la RNA polimerasa se une, para posteriormente iniciar la transcripcin.

Pasos de la Transcripcin La RNA polimerasa se desliza a travs del DNA buscando promotores.Cuando encuentra un promotor migra a la regin -35, formando lo que se conoce como "complejo cerrado".

Pasos IILuego el DNA es desenrrollado en aproximadamente 17 pares de bases formando un "complejo abierto" que empieza en la regin -10, y que descubre la hebra molde en el sitio de iniciacin. Despus de la iniciacin la subunidad sigma se disocia de la RNA polimerasa y la enzima ncleo con el proceso de elongacin de la transcripcin.

Terminacin1. Terminacin independiente de factor, que consiste en una secuencia de nucleotidos que permite la formacin de una region apareada con forma de alfiler en el mRNA seguida de un tramo de residuos de uracilo (U).1. Terminacin dependiente de factor, requiere de un factor proteico. El sitio de terminacin llamado rut (el nombre viene de rho utilization) , es reconocido por un factor especfico llamado rho.

Transcripcin en eucariontesEsta compartemenlizada debido a la presencia de la envoltura nuclear.El RNA naciente de eucariontes es procesado para formar el RNA maduro.

RNA Polimerasa II Es ms compleja que la RNA pol de E. Coli.Consiste de 10 polipptidos (10 220 kD).RPB1, RPB2 y RPB3 son esenciales equivalen a las subunidades beta, beta prima y alfa respectivamente.RPB4 a la subunidad sigma

RNA Polimerasa IIRPB5, RPB6 y RPB8 son componentes esenciales de las 3 RNA polimerasas de eucariontes.

RNA pol de Procariontes y Eucariontes. Estructura conservada de las subunidades grandes

Promotores de EucariontesTienen una caja TATA cerca al sitio de inicio.Otros elementos adicionales de control estn localizados entre -40 y 110.Los promotores fuertes tienen:- caja CG- caja CAAT

Promotores: Porcariontes Vs Eucariontes

Elementos de transcripcin y del promotor para la RNA polimerasa II Promotor : secuencia de DNA cuesta arribia del genDetermina el sitio de inicio (+1) para la transcripcinSe localiza al lado del sitio de inicio (+1)Permite la transcripcin basal (bajo nivel)Elemento de transcripcin (secuencia de DNA que regula el gen.Determina la frecuencia o eficiencia de la transcripcin

Elementos de transcripcin y del promotor para la RNA polimerasa II Elemento de transcripcin (secuencia de DNA que regula el gen.Determina la frecuencia o eficiencia de la transcripcinUbicado cuesta arriba, cuesta abajo o dentro de los genes.Puede estar muy cerca o miles de bases aparte del gen.Incluye:Intensificadores.- Aumentan la velocidad de transcripcinSilenciadores: desminuyen la velocidad de transcripcin Elementos de respuesta (secuencias blanco para moleculas seal.Los genes pueden tener muchos elementos de transcripcin

Promotores de EucariontesLos genes constitutivos tienen tendencia a tener cajas GC.Las cajas GC y CAAT son efectivas en las hebras antisentido.

Elementos de transcripcin y promotores de la RNA polimerasa II

Complejo de TranscripcinEl ensamblaje de un complejo de trascripcin requiere de un grupo de protenas llamadas factores de transcripcin II (TFII):TFIID un complejo de 700 kD que tiene a la TATA binding protein (TBP) de 30 kD que se une directamente a la caja TATA.Factores asociados a TBP (TAFs) que se unen a la TBP.

Complejo de TranscripcinLa unin del TBP induce una curvatura de 90 grados en el DNA, quebrando el DNA a ambos lados de la caja TATA y desenrolla el DNA TFIIA, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TFIIJ se ensamblan junto con TFIID. Se requieren factores adicionales para la sntesis de mRNA en alto nivel

Formacin del Complejo de Iniciacin de la transcripcin (PIC) en Eucariontes en genes que codifican para protenas TFIID se une a la caja TATATFIIB se une al complejo TFIID-TATA El complejo TFIID-TATA ms TFIIB reclutan a la RNA polimerasa II al TFIIF, y forman el complejo mnimo de iniciacin de la transcripcin.TFIIE and TFIIH se unen y forman el complejo de iniciacin de la transcripcin completo (PIC).El PIC solo permite niveles bajos de transcripcin.Los niveles elevados son inducidos por los factores activadores que se unen a las secuencias intensificadoras.La interaccin entre el complejo factor activador , enhancer y PIC estimulan la transcripcin.

Unin de los factores generales de transcripcin

Unin de la RNA polimerasa II

Unin de los fatores de transcripcin especializados

Formacin de un complejo de preiniciacin estable

Iniciacin de la transcripcin. TFIIH fosforila al CTD

Secuencias IntensificadorasEl plegamiento del DNA permite que las protenas activadoras se unan a secuencias intensificadoras (secuencias que estn localizadas lejos de los promotores).Interactan con TFIID y otras protenas TF y la RNA polimerasa II

Secuencias IntensificadorasNo tienen actividad promotora.Pueden estar ubicadas cuesta arriba , cuesta abajo o dentro del transcrito.En cualquiera de las 2 hebras del DNA.Son especficos para cada tejido.

Edicin mediante SplicingLos intrones son removidos del mRNA en secuencias que contiene sitios especficos de ruptura y empalme (splice sites).La secuencia de consenso para el splice site 5terminal es AG/GUAAGU , donde AG es la ltima base del exn.

Edicin mediante SplicingLa secuencia de consenso del sitio 3terminal es (Py)nNCAG/G , n = 10 residuos de U o C.Despues del splicing la secuencia queda como AG-G

Edicin mediante SplicingSpliceosomasEl splicing es realizado por los snRNA en los spliceosomas. Los spliceososmas consisten de:snRNPS ( partculas ribonucleoproteicas pequeas del ncleo). U1,U2,U4,U5,U6.Los precursores del mRNA.

Edicin mediante SplicingSpliceosomasU1 y U2 se unen a los sitios de splice 5y 3 respectivamente.U4,U5 y U6 ( un complejo pre-ensamblado) se une a U1 y U2 formando el spliceosoma.Los snRNA alinean los sitios de splicing.La hidrlisis del ATP ( por las protenas) promueve la fusin de los pares de bases antes del splicing.

Edicin mediante SplicingSpliceosomasU2 y U6 forman un centro cataltico para remover la estructura lazo (lariat).

Auto-splicingEl RNA puede tener capacidad cataltica de splicing en ausencia de protenas catalizadoras.Una guanosina (GTP;GDP o GMP) ataca al RNA en el sitio de splicing 5Corta el RNA y une la guanina al extremo 5del intron.

Auto-splicingEl extremo 3 OH generado en el exon ubicado cuesta arriba, ataca al sitio de splincing 3del intron, uniendo los 2 exones y liberando el intron.Requiere la formacin de estructuras terciarias del RNA generadas por las secuencias de bases del intron y exon.

Auto-splicingEl splicing es bloqueado por agentes denaturantes tales como la dimetilformamida.La unin de G es saturable, lo que implica la presencia de un sitio de unin especfico en el RNA plegado.El trmino ribozimas hace referencia al RNA cataltico.

Auto-splicingLos estudios de ribozimas revelan la formacin de una estructura secundaria llamada cabeza de martillo en los RNA que se auto clivan.Presenta 3 dobles hlices, llamado brazo 1, 2 y 3, que rodean una hebra de RNA no apareada. El sitio cataltico esta en la base del brazo 1.

Tipos de SplicingGrupo I: una unidad de G ataca el extremo 5del intron.Grupo II: Una base de A en el RNA ataca el extremo 5terminal del intron de la misma cadena y el intron es removido como una estructura lazo.Grupo III: splicing catalizado por el spliceosoma.

TRADUCCIN O SNTESIS DE PROTENAS

INTRODUCCINLa clula necesita miles de protenas diferentes en un determinado momento.Las protenas son sintetizadas de acuerdo a las necesidades de la clula.Una vez sintetizadas son transportadas a un sitio apropiado dentro de la clula.

INTRODUCCINSon degradadas cuando ya no se necesitan.En las clulas eucariticas intervienen ms de 300 macromolculas .Se utiliza casi un 90% de la energa celular para la sntesis de polipptidos.

INTRODUCCINLa traduccin es la sntesis de protenas dirigida por RNA.Se requiere la participacin de 3 clases de RNA.El proceso que lleva a la capacidad de formar un enlace peptdico es muy complejo.

CDIGO GENTICOEs la relacin que hay entre la secuencia de bases en el DNA y la secuencia de aminocidos en las protenas.Fue descifrado en 1961.El cdigo gentico usa codones o tripletes de nucletidos, los cuales corresponden a un aminocido.

CARACTERSTICAS DEL CDIGO GENTICOUn grupo de 3 bases codifican para un aminocido. Se le denomina codn.Tiene 64 tripletes o codones.61 de los 64 codifican para aminocidos,UAA, UAG , UGA son seales de terminacin.

CARACTERSTICAS DEL CDIGO GENTICOEs degenerado, varios codones pueden codificar para un mismo aminocido.No tiene comas, a un triplete le sigue otro.No se traslapa, es decir, el marco de lectura lo establece el pirmer tRNA.Es casi universal para todos los organismos .

RNA de transferencia (tRNA)Las protenas son sintetizadas de acuerdo al mensaje gentico en forma de secuencia de codones a lo largo del mRNA.El tRNA es el interprete entre las 2 formas de informacin.El tRNA alinea los aminocidos apropiados para formar un nuevo polipptido.

tRNA. CaractersticasSon especficos para un aminocido en particular.Un extremo de la molcula del tRNA se une a un aminocido especfico.El otro extremo se une al codn del mRNA mediante el apareamiento de bases con el anticodon.El anticodon es un triplete de nucletidos en el tRNA que se aparea con un triplete de codones complementarios (codn) en el mRNA.

Aminoacil tRNA sintetasasEl enlace entre el tRNA y su correspondiente aminocido debe ocurrir antes que el anticodon se aparee con el codn complementario del mRNA.Este proceso de la correcta unin del tRNA con su aminocido apropiado es catalizado por la aminoacil-tRNA sintetasa.

RIBOSOMASSon las organelas que coordinan el apareamiento de los anticodones del tRNA con los codones del mRNA.Es un componente mayoritario en la clula.Hay unos 20,000 ribosomas en la clula bacteriana.Tiene el 10% de la protena bacteriana.80% de la masa total del RNA celular.

ESTRUCTURA DE LOS RIBOSOMASSon partculas ribonucleoproteicas grandes que contienen ms RNA que protenas y que se disocian en 2 subnidades.Los ribosomas de eucariontes y de procariontes difieren en tamao y estructura de las subunidades.

SITIOS FUNCIONALES DEL RIBOSOMA1. El sitio de unin del mRNA, es una hendidura localizada cerca de las interfase de las dos subunidadesEl sitio A, por donde ingresan los aminoacil tRNA trayendo el prximo aminocido a ser aadido y donde el tRNA se aparea con el correspondiente codon en el mRNA.

SITIOSEl sitio P, donde se ubica el tRNA que tiene la cadena polipptidica en crecimiento.El sitio E o sitio de salida, a donde se mueve el tRNA deacilado (descargado) despus de transferir el pptido en crecimiento al tRNA ubicado en el sitio A.Un tunel para el polipptido en crecimiento, que oculta 40 aminocidos de la protena dentro del ribosoma.Sitios de unin para los factores de iniciacin, elongacin y terminacin.

REGLAS BSICASDos reglas bsicas:1. El mRNA es traducido en direccin 5-- 3.2. Las protenas son sintetizadas a partir del extremo N-terminal hacia el extremo C-terminal.

SNTESIS DE PROTENAS ETAPASOcurre en 3 etapas: 1) iniciacin, 2 ) elongacin y 3) terminacin.Todas las etapas requieren enzimas y otros factores proteicos. La iniciacin y elongacin tambin requieren energa suministrada por GTP.

INICIACINUnin del met-tRNA iniciador colocado sobre el codon de inicio en el sitio P.Unin de la subunidad 50S.

COMPONENTES DE LA INICIACIN 1. Las 2 subunidades ribosomales, 30S y 50S.1 mRNA3 factores de iniciacin: IF1, IF2(GTP) IF3Un aminoacil-tRNA especial modificado.

ELONGACIN , PASOS1) Unin del nuevo aminoacil tRNA al sitio A.2. Formacin del enlace peptdico Es mediado por la peptidil transferasa.

ELONGACIN , PASOS3. Translocacin del ribosomaEl ribosoma se mueva a lo largo del mRNA en direccin 5 3 moviendo el peptidil tRNA localizado en el sitio A al sitio P.Un nuevo codon se ubica en el sitio A.El tRNA deacilado se mueve al sitio E y es liberado del ribosoma.

TERMINACINOcurre cuando un codn de terminacin se coloca en el sitio A del ribosoma.No hay tRNA que reconozcan los codones de pare.Estos son reconocidos por los factores de liberacin.RF1 reconoce los codones UAA y UAG.RF2 reconoce los codones UAA y UGA.RF3(GTP), estimula la unin de RF1 y RF2.Hidrlisis del peptidil tRNA.

Inhibidores de la traduccin en Procariontes

Eritromicina - inhibe la translocacin de la subunidad 50S. cido fusdico - inhibe la translocacin evitando la disociacin de EF-G-GDP del ribosoma. Puromicina - un anlogo del aminoacil-tRNA que causa la terminacin prematura de la cadena. Estreptomicina Provoca la lectura del ARNm e inhibe la iniciacin de la cadena. Tetraciclina - inhibe la unin del aminoacil-tRNA al sitio A del ribosoma.

Inhibidores de la traduccin en Eucarintes

Cicloheximida - inhibe la peptidil transferasa en la subunidad 60S.

La toxina diftrica - inactiva eEF-2 por ADP ribosilacin .

Modificacion Post-traduccionalQu es?La adicion de grupos o deleccin de partes para formar una protena activa Qu grupos? Cunto? Donde?MetilAcetilGlucofosfo

Modificacin de Protenas Diferentes tiposIncluyen co-traduccionales y post-traduccionalesSe estima que el proteoma humano consiste de ~ 1000,000 protenas diferentesModificaciones de las protenasSplicing alternativo

Disparidad entre el mRNA y los perfiles de protenasVariantes de splicingEn las clulas eucariticas, probablemente 6-8 protenas /genModificaciones post-traduccionales Se observan 22 formas diferentes de antitripsina en el plasma humano

Iniciativa del Proteoma HumanoSe genera prinicipalmente por splicing alternativo y modificaciones post- traduccionales

HPI Iniciativa del Proteoma HumanoFinalidad Anotar todas las secuencias de protenas humanas conocidasAnotacin de todos los polimorfismos humanos conocidos a nivel de secuencia de protenasAnotacin de todas las modificaciones post-traduccionales en la protenas humanas.Suministrar para cada protena, una riqueza de informacin que incluye su descripcin, estructura, localizacin celular, similitud con otras protenas

Modificaciones Post-traduccionales

Plegamiento de la protenaProcesamiento proteolticoModificaciones qumicasSeparacin de intenas

Modificacin de AminocidosAcetilacin : confiere resistencia a la degradacin, protege grupos amino (50% de las protenas eucariticas), se acetilan las cadenas laterales de las lisinas de las histonas.

MetilacilnIncorporacin de metilo al grupo epsilon amino de la cadena lateral de lisina o bien al grupo carboxilo del Glu, ej: calmodulina

MPTFuncinFosforilacinSealizacin, activacinAcetilacinEstabilidad, interaccin DNA-prots MetilacinRegulacin gnicaAcilacin, modif. por cidos grasosLocalizacin y sealizacin celularGlicosilacinProtenas excretadas, reconocimiento y sealizacin celularAnclas GPIFijacin de enzimas y receptores a membranaPuentes S-SEstabilidad de protenasUbiquitinacinSeal de destruccinSulfatacinModulador de interacciones

Identificacin de las Modificaciones Espectrofotometra de Masas, la mas comnPuede identificar el grupo con gran precisin, especialmente en combinacin con la digestin de protenas y anlisis con HPLCIncorporacin de grupos radiactivos a clulas en crecimientoReaccin cruzada de anticuerpos ej. Anticuerpos contra fosfoserina