Transformación de bacterias

CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Transformación de células competentes de Escherichia coli.

IntroducciónPara el clonaje y amplificación del plásmido recombinante preparado en la práctica

anterior es necesario introducirlo en una bacteria. Al proceso de incorporación de un DNA aislado de forma estable por una bacteria se denomina “transformación”. Salvo algunas excepciones, las bacterias son impermeables a la entrada de ácidos nucleicos exógenos en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, disponemos de métodos químicos y físicos que facilitan la entrada del DNA en la bacteria.

Todos los métodos químicos de transformación que se utilizan actualmente derivan de la observación de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) según la cual las bacterias tratadas en frío con una disolución de CaCl2, y a continuación sometidas a un choque térmico a 37ºC o 42ºC, se hacen “competentes” y permiten la entrada del DNA del fago . Este método se extrapoló posteriormente a DNA de plásmidos (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114). Los métodos actualmente en uso son variaciones del original, encaminadas a optimizar la eficiencia de transformación de cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de DNA plasmídico. A pesar de las mejoras metodológicas conseguidas, aún desconocemos el mecanismo molecular por el que las células se hacen “competentes” a la entrada de DNA exógeno. Por otra parte, de entre los métodos físicos de transformación de bacterias podemos destacar la “electroporación”. Consiste en exponer las células de E. coli a una descarga eléctrica, que induce la formación transitoria de poros en las membranas por donde penetran las moléculas de DNA.

Los plásmidos que estamos usando en estas prácticas de clonaje tienen el gen de resistencia al Cloranfenicol (clo). Este gen codifica una -lactamasa que hidroliza el anillo -lactámico de la ampicilina, inactivándola. La ampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro. Inhibe la síntesis del péptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en células en fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plásmidos en este experimento utilizaremos una TOP 10 F, que contiene un episoma de resistencia a la tetraciclina, se pueden seleccionar creciéndolas en presencia de Cloranfenicol y Tetraciclina . Obviamente, las bacterias que no han incorporado el plásmido no crecerán en este medio de cultivo.

ObjetivosObtención de clones bacterianos conteniendo el plásmido recombinante resistente a

cloranfenicol (pLyss)

Materiales- Todo el material debe ser estéril.- E. coli BL21(DE3)pLysS o pLysE (Invitrogen). Estas cepas tienen el lisógeno del

fago DE3 que expresa el gen de la RNA polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor lacUV5, cuando se induce con IPTG. Los plásmidos pLysS o pLysE expresan constitutivamente niveles bajos de lisozima T7 que inhibe los niveles

8

Transformación de bacterias

basales de la RNA polimerasa de T7 y, de este modo, reduce el nivel basal de expresión del gen clonado. Otras características importantes de estas cepas son la deficiencia en la proteasa dependiente de la ATPasa Lon, que disminuye la degradación de la proteína recombinante expresada en la bacteria, y la ausencia del elemento lacZM15, requerido para el test de complementación .

- TOP 10F- Placas de Petri con medio LB sólido (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura,

10 g de NaCl, 15g de bacto agar, y agua destilada hasta 1000 ml).- Palillos estériles o asas de siembra.- Medio LB líquido (igual que el sólido pero sin agar): tubos o matraces de 25 ml con

2 ml; natraces de 100 ml con 25 ml. - Pipetas automáticas y puntas.- Pipetas normales, probetas.- Baño termostatizado a 37ºC.- Espectrofotómetro y cubetas.- Hielo y recipientes para hielo; tubos Falcon de 50 ml, centrífuga de mesa

refrigerada, papel de filtro.- 0.1 M CaCl2.- DMSO (dimetilsulfóxido), hielo seco/etanol (ambos opcional). - Tubos eppendorf.- ddH2O estéril.- Plásmido pLysS sin digerir.- Baño de agua o bloque térmico a 42ºC.- Placas de Petri con medio LB sólido y Cloranfenicol (100 g/ml).- Asas de vidrio estériles para extensión de bacterias sobre las placas de Petri.- Estufa a 37º.

ProcedimientoA) Crecimiento de Escherichia coli .

1. La tarde anterior picar una colonia de bacterias BL21 de un placa de Petri reciente y transferirla a 2 ml de medio LB. Incubar en baño con fuerte agitación a 37ºC durante toda la noche.

2. A la mañana siguiente, inocular 25 ml de medio LB con 0.5 ml del cultivo anterior. Incubar con fuerte agitación en baño a 37ºC. Medio de cultivo y baño precalentados a 37ºC.

3. A los 60-90 min de incubación, medir la A550 nm del cultivo. Parar el crecimiento cuando se alcance un valor 0.28-0.32, poniendo el cultivo en hielo. Nota: En las condiciones en las que se está creciendo E. coli, el tiempo de generación (tiempo en que se duplica el número de bacterias y la A550 nm aumenta al doble) es aproximadamente de 20 min.

B) Preparación de células competentes. 1. Enfriar el cultivo 5-10 min en hielo y transferir a un tubo Falcon estéril de 50 ml

en frío.

9

Transformación de bacterias

2. Recuperar las bacterias por centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC, utilizando una centrífuga de mesa refrigerada.

3. Decantar el sobrenadante. Dejar el tubo invertido sobre un papel absorbente durante 1 min con objeto de eliminar los restos de medio.

4. Resuspender las bacterias en 5 ml de 0.1 M CaCl2 frío. Mezclar con suavidad, con ayuda de una pipeta, para no lisar las células.

5. Después de unos 20 min en hielo, recuperar las bacterias por centrifugación a 3000 rpm durante 10 min a 4ºC, y decantar de nuevo el sobrenadante como antes.

6. Resuspender las bacterias en 0.5 ml de 0.1 M CaCl2 frío y mantener en hielo.7. En el caso de que las bacterias competentes no se vayan a utilizar

inmediatamente para la transformación se pueden dividir en alícuotas, congelar rápidamente y conservar a –70ºC siguiendo el protocolo siguiente:- Al 1 ml de bacterias añadir 35 l de DMSO y mezclar suavemente,

manteniendo la suspensión en hielo durante 15 min.- Añadir otros 35 l de DMSO, mezclar y volver a poner en hielo.- Enfriar tubos eppendorf en hielo seco/etanol (o nitrógeno líquido) y poner

alícuotas de 100-107 l de la suspensión de bacterias con DMSO en cada tubo.

- Mantener congeladas a –70ºC.- Cuando se necesiten, descongelar el tubo con la mano y mantener en hielo

durante 10 min.

C) Transformación de las bacterias. 1. Preparar 5 tubos Eppendorf en hielo para las distintas transformaciones y añadir a

cada uno de ellos 100 l de células competentes.2. Añadir a cada tubo los DNAs siguientes:

Tubo 1: 1 l de agua destilada (control negativo).Tubo 2: 1 l (10 ng) del vector pRSET no digerido de una disolución 10 ng/ l en

H2O preparada previamente (control positivo).Tubo 3: 1 l (10 ng de vector) de la mezcla de ligación control sin inserto.Tubo 4: 1 l (10 ng de vector) de la mezcla de ligación problema con inserto.Tubo 5: 2 l (20 ng de vector) de la mezcla de ligación problema con inserto.

3. Mantener en hielo durante 30 min.4. Transferir los tubos a un baño de agua o bloque térmico a 42ºC e incubar sin

agitación durante 30 segundos.5. Transferir los tubos al hielo y mantener durante 2 min.

D) Crecimiento y selección de los transformantes.1. Añadir a cada tubo 500 l de medio LB e incubar a 37ºC con agitación intensa

durante 1 hora. Si la incubación se hace sin agitación, conviene agitar las células suavemente a intervalos de tiempo para resuspenderlas.

2. Plaquear alícuotas de 100 l de cada una de las muestras en placas de Petri conteniendo medio LB sólido con ampicilina. Extender la suspensión sobre la superficie de la placa con un asa de vidrio doblada y estéril. Dejar secar bien.

3. Una vez secas, invertir las placas, comprobar que están debidamente marcadas e incubarlas en estufa a 37ºC durante toda la noche.

4. Al día siguiente, recoger las placas de la estufa y analizar los resultados.

10

Transformación de bacterias

Resultados y Cuestiones1) Busque las características de la cepa bacteriana usada en esta práctica e interprételas

en su cuaderno.

2) ¿Por qué se crecen las bacterias en medio LB líquido durante una hora antes de pasarlas al medio sólido que contiene ampicilina?.

3) ¿Por qué se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio sólido con ampicilina?.

4) Determine la eficiencia de transformación (número de colonias/g de DNA) utilizando la placa de Petri procedente de la transformación con pRSET no digerido.

5) Determine el número de colonias obtenidas en las placas procedentes de las transformaciones con las mezclas de ligación control (sin inserto) y problema (con inserto). Analice los resultados obtenidos.

6) El método de selección de bacterias conteniendo plásmidos recombinantes basado en la complementación del fragmento falla en ocasiones, observándose resultados contrarios a lo esperado: colonias azules de bacterias transformadas con el plásmido recombinante y colonias blancas de bacterias transformadas con el plásmido sin inserto. ¿A qué se pueden deber estos resultados?.

11