TRANSFORMACIN 1 SESIN

Nota : todo el material debe estar estril. El trabajo con bacterias y con algunas de estas substancias debe de ser cuidadoso. Despus de terminar su experimento lave muy bien sus manos. No flamear el material de plstico.

1) Inocular 3 mL de medio Luria con E. coli, y dejar crecer en agitacin toda la noche a 37 C.

2) Tomar 200 L del precultivo y agregrselo a 10 mL de medio Luria. Las bacterias se dejan crecer hasta llegar a una absorbencia de 0.6-0.8 a 600 nm.

3) Centrifugar la suspensin de clulas a 5 000 r.p.m., durante 5 minutos a

4C. Descartar el sobrenadante.

4) Resuspender el paquete celular muy bien en 3 mL de NaCl 10 mM isotnico fro.

5) Centrifugar a 5 000 r.p.m. durante 5 minutos a 4C. Descartar el

sobrenadante y resuspender el precipitado en 5 mL de CaCl2 30 mM fro. 6) Dejar incubar en hielo 10 minutos con agitacin ocasional suave y

centrifugar a 2 500 r.p.m. por 7 min. El precipitado debe ser de forma anular.

7) Resuspender el precipitado en 300 L de CaCl2 30 mM fro. Tomar 100 L y depositarlos en un tubo de microfuga.

8) Agregar 2 L del plsmido a los 100 L de clulas competentes. 9) Agitar suavemente 10 minutos en hielo y despus incubar a 42 C durante

50 segundos, a continuacin poner en hielo durante 2 minutos.

10) Agregar 500 L de medio SOC e incubar a 37 C con agitacin por 45 minutos.

11) Centrifugar las clulas por 1 minuto a 10 000 r.p.m., eliminar la mayor

parte del sobrenadante, dejar 100 L aproximadamente y resuspender el paquete celular.

12) Tomar las clulas del paso 11 y esparcirlas homogneamente con una varilla de vidrio, en una caja de Petri con medio Luria ms antibitico, incubar a 37 C por 24 horas.

13) En una caja con medio Luria ms antibitico, sembrar 100 L de clulas sin transformar, incubar a 37 C por 24 horas.

14) Seleccionar las transformantes de acuerdo al marcador gentico adquirido.