1040 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

PRACE ORYGINALNE

Twardzina uk³adowa i ograniczona do skóry� zaburzenia w stê¿eniu wybranych czynnikóww surowicy odpowiedzialnych za zmianynaczyniowe i ekspresja CD34 w chorobowozmienionej skórze

Systemic sclerosis and scleroderma circumscripta� disturbances of selected serum parameters which areresponsible for vascular changes and CD34 expressionin involved skin

Bo¿ena DZIANKOWSKA-BARTKOWIAK1

Agnieszka ¯EBROWSKA2

Ma³gorzata W¥GROWSKA-DANIELEWICZ3

Józef KOBOS4

El¿bieta WASZCZYKOWSKA1

1Zak³ad ImmunodermatologiiKatedry Dermatologii i WenerologiiKierownik Zak³adu ImmunodermatologiiKatedry Dermatologii i Wenerologii UMw £odzi: Prof. dr hab. med.El¿bieta Waszczykowska

2Katedra Dermatologii i WenerologiiKierownik Katedry Dermatologii i WenerologiiUM w £odzi:Prof. dr hab. med. Anna Sysa-Jêdrzejowska

3Pracownia NefropatologiiZak³adu Patomorfologii

4Zak³ad Immunopatologii Kliniki DzieciêcejUniwersytetu Medycznego w £odzi

Dodatkowe s³owa kluczowe:twardzina¿elatynazyVEGFsVEGFR2CD34

Additional key words:sclerodermagelatinasesVEGFsVEGFR2CD34

Praca zosta³a finansowana z funduszypracy w³asnej Nr 502-18-344 i statutowejNr 503-8019-1 UM w £odzi

Adres do korespondencji:Bo¿ena Dziankowska-BartkowiakZak³ad ImmunodermatologiiKliniki Dermatologii UM94-017 £ód�, ul. Krzemieniecka 5Tel./Faks: +48 42 686 45 65e-mail bozenadz@interia.pl

Twardzina jest chorob¹ tkanki ³¹cz-nej, w której nadmierne w³óknienie wskórze (scleroderma circumscripta �morphea) lub w skórze i w narz¹dachwewnêtrznych (twardzina uk³adowa,Systemic sclerosis, SSc) jest wynikiemz³o¿onych zaburzeñ naczyniowych,immunologicznych i wzmo¿onej syn-tezy kolagenu i innych sk³adników ma-cierzy zewn¹trzkomórkowej (extracel-lular matrix, ECM). Obie postacie twar-dziny maj¹ podobny obraz kliniczny ihistopatologiczny w obrêbie zmianskórnych, jednak ich zwi¹zek patoge-netyczny pozostaje nadal dyskutowa-ny. Celem obecnej pracy by³a ocenazmian naczyniowych w obu postaciachtwardziny na podstawie okre�lenia stê-¿enia w surowicy: ¿elatynaz � metalo-proteinazy -2 i -9 oraz naczyniowo-�ródb³onkowego czynnika wzrostu(vascular endothelial growth factorVEGF) i 2 rozpuszczalnego receptora(sVEGFR2) a tak¿e ekspresji antyge-nu CD34 w chorobowo zmienionej skó-rze. Do badañ zakwalifikowano 34 cho-rych z SSc i 31 z morphea. Stê¿eniebadanych czynników okre�lano meto-d¹ immunoenzymatyczn¹ ELISA nato-miast ekspresjê CD34 metod¹ immu-nohistochemiczn¹. Wykazano zna-miennie wy¿sze stê¿enie MMP-9 w su-rowicy chorych na twardzinê uk³ado-w¹ i morphea w porównaniu do wyni-ków uzyskanych w grupie kontrolnej(848,6 ng/ml; 844,4 ng/ml vs 535,9 ng/ml p<0,05). Stwierdzono znamiennie(p<0,05) wy¿sze �rednie stê¿enie MMP-2 w surowicy chorych z SSc w stosun-ku do wyników uzyskanych w morpheai grupie kontrolnej (240,4 ng/ml vs208,1 ng/ml vs 211,9 ng/ml) oraz VEGFw surowicy chorych z morphea w po-równaniu do wyników uzyskanych wgrupie kontrolnej (422,2 pg/ml vs. 188,7pg/ml). Wykazano statystycznie zna-mienn¹ ró¿nicê stosunku �rednich stê-

Scleroderma is a connective tissuedisease characterized by fibrosis con-fined only to skin (scleroderma circum--scripta, morphea) or to skin and in-ternal organs (systemic sclerosis, SSc)as a result of vascular changes, im-mune dysfunction and increased pro-duction of collagen and other extracel-lular matrix (ECM) components. Bothtypes of scleroderma present clinicaland histological similarities in skinchanges but their pathogenic relation-ship is still not elucited. The aim ofour study was to evaluate vascularchanges in both types of sclerodermaon the basis of: serum levels ofgelatinases - MMP-2 and MMP-9, vas-cular endothelial growth factor (VEGF)and its soluble receptor 2 (sVEGFR2)and expression of CD34 antigen inskin changed samples. The followingpatients were involved in the study: 34patients with SSc, 31 with morpheaand 15 healthy controls. Serum levelsof selected parameters were estimatedby ELISA method; whereas CD34 anti-gen immunoexpression was per-formed by immunohistochemistry. Se-rum level of MMP-9 was statisticallysignificantly higher in SSc andmorphea patients compared to thecontrol group (848.6 ng/ml; 844.4 ng/ml vs. 535.9 ng/ml; p<0.05). Statisticalanalysis revealed that mean serum lev-els of MMP-2 was significantly (p<0.05)higher in SSc group compared tomorphea and control group (240.4 ng/ml vs. 208.1 ng/ml; 211.9 ng/ml) andVEGF was higher in morphea groupcompared to the control group (422.2pg/ml vs. 188.7 pg/ml). Statistically sig-nificant difference between ratio VEGF/sVEGFR2 of mean serum levels in SScpatients and the control group (0.038pg/ml vs. 0.018 pg/ml) and positivecorrelation between serum levels ofMMP-9 and sVEGFR2 only in control

1041Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12

WstêpTwardzina (scleroderma) jest chorob¹

tkanki ³¹cznej, która w postaci ograniczonejdo skóry (morphea, scleroderma circum-scripta) mo¿e dotyczyæ tylko skóry, tkankipodskórnej, niekiedy miê�ni w okolicy zmianskórnych, lub w postaci uk³adowej (Syste-mic sclerosis, scleroderma � SSc) zajmujeskórê i narz¹dy wewnêtrzne. Twardzinaograniczona ró¿ni siê od twardziny uk³ado-wej brakiem objawu Raynauda, zmian wnarz¹dach wewnêtrznych oraz odmiennymprzebiegiem i rokowaniem [20]. Zwi¹zek po-miêdzy postaci¹ ograniczon¹ a uk³adow¹twardziny wynika z jednakowego charakte-ru stwardnieñ i zaników skóry a tak¿e zbli-¿onego obrazu histologicznego i mikrosko-powoelektronowego [15]. Mechanizm po-wstawania stwardnieñ skóry w przebiegutwardziny pozostaje nadal niedok³adnie po-znany. Podkre�lana jest miêdzy innymi istot-na rola zaburzeñ autoimmunologicznych imetabolizmu kolagenu [3,30]. Zaniki naczyñkrwiono�nych w miejscach stwardnia³ej skó-ry s¹ widoczne nie tylko w badaniu histoto-logicznym, ale równie¿ u chorych z posta-ci¹ uk³adow¹ w badaniu kapilaroskopowym,gdzie obserwuje siê zanikanie w³o�niczek iobecno�æ pêtli Raynauda. Jednak¿e mecha-nizm zaburzeñ naczyniowych nie jest do-k³adnie poznany. Postulowany jest wp³ywuszkodzenia komórek �ródb³onka a tak¿ezaburzeñ powstawania nowych naczyñkrwiono�nych � angio- i waskulogenezy [10].Spowolnienie przep³ywu krwi, adhezja leu-kocytów do komórek �ródb³onka a nastêp-nie ich przenikanie przez �ciany naczyñ dotkanek otaczaj¹cych wp³ywa na wzbudze-nie stanu zapalnego i pobudzenie fibrobla-stów do nadmiernej produkcji kolagenu i in-nych sk³adników macierzy zewn¹trzkomór-kowej (extracellular matrix � ECM) [7,21].Dotychczasowe badania wskazuj¹, ¿ew�ród wielu czynników odpowiedzialnych zazmiany w naczyniach, istotne znaczenie od-grywaj¹ miêdzy innymi: naczyniowo-�ró-b³onkowy czynnik wzrostu (vascular endo-thelial growth factor � VEGF) i jego recep-tory oraz enzymy degraduj¹ce ECM � me-taloproteinazy a zw³aszcza ¿elatynazy, któ-re u³atwiaj¹ diapedezê leukocytów poza na-czynia krwiono�ne [11,16]. Stwierdzono rów-nie¿, ¿e zaburzenia ekspresji antygenuCD34 w komórkach �ródb³onka mog¹ byæjednym z czynników stymuluj¹cych fibrobla-sty do nadmiernej produkcji ECM [1,28].

Celem obecnej pracy by³a ocena zabu-rzeñ naczyniowych w obu postaciach klinicz-nych twardziny na podstawie okre�lenia stê-¿enia VEGF, jego receptora (soluble vascu-lar endothelial growth factor 2 sVEGFR2, atak¿e dwóch ¿elatynaz � metaloproteinazy-2 i -9 (MMP-2 i MMP-9) w surowicy orazoceny ekspresji antygenu CD34 w choro-bowo zmienionej skórze.

Materia³ i metodykaDo badañ zakwalifikowano 34 chorych spe³niaj¹-

cych kryteria American College of Rheumatology (ACR)dla twardziny uk³adowej [12] (33 kobiety i 1 mê¿czyznaw wieku od 38-72 lat � �redni wiek 54,4 lata), 31 chorych(30 kobiet i 1 mê¿czyzna w wieku od 34 do 50 lat � �red-ni wiek � 43,8 lat) z klinicznym rozpoznaniem morpheapotwierdzonym badaniem histopatologicznym i 15 zdro-wych osób (10 kobiet i 5 mê¿czyzn, w wieku 19-49 lat ��redni wiek 38 lata) (tabela I).

Oznaczenia stê¿eñ MMP-2 i MMP-9 oraz VEGF isVEGFR2 przeprowadzono u 34 chorych z SSc i 10 zmorphea metod¹ immunoenzymatyczn¹ (ELISA) stosu-j¹c zestawy odczynników Quantikine firmy R&D SystemsMineapolis USA. Próg czu³o�ci ustalono dla: MMP-2 �0,16 ng/ml; MMP-9 � 0,156 ng/ml; dla VEGF � 9,0 pg/ml; sVEGFR2 � 4,6 pg/ml.

Stê¿enie badanych parametrów w surowicy zdro-wych osób okre�lono w granicach: MMP-2 � 166,6-269,1ng/ml; MMP-9 � 174-1349 ng/ml; VEGF � 23-571,5 pg/ml; sVEGFR2 � 6730-100065 pg/ml.

Badania tkankoweWycinki ze skóry chorobowo zmienionej, okolicy

grzbietu rêki u 27 chorych z SSc i okolicy zmian u 31chorych z morphea, utrwalono w formalinie i zatopionow bloczkach parafinowych. Pobrano ponadto wycinki zeskóry od 10 zdrowych osób, z okolicy niezmienionej cho-robowo skóry otaczaj¹cej usuwane chirurgicznie znamio-na barwnikowe.

ImmunohistochemiaSkrawki parafinowe o grubo�ci 3-4 mikrometrów

pos³u¿y³y do sporz¹dzenia rutynowych preparatów bar-wionych hematoksylin¹ i eozyn¹ (H+E) oraz do badañimmunohistochemicznych w systemie detekcyjnymDAKO EnVision wed³ug metody immunoperoksydazo-wej, z u¿yciem pierwotnego, mysiego przeciwcia³a mo-noklonalnego przeciwko CD 34 firmy Novocastra.

Do badañ immunohistochemicznych skrawki para-finowe, po na³o¿eniu na szkie³ka adhezyjne i wysusze-niu w cieplarce o temperaturze 56°C przez 24 godziny,poddawane by³y odparafinowaniu w szeregu sk³adaj¹-cym siê z ksylenów i alkoholi o zmniejszaj¹cych siê stê-¿eniach (96%, 80%, 70%, 60%). Nastêpnie hamowanoaktywno�æ endogennej peroksydazy, przy u¿yciu 3%roztworu perhydrolu w metanolu, przez 5 minut.

W celu odzyskania antygenowo�ci tkanki i otworze-nia drogi dla przeciwcia³a przeciwko CD34 skrawki pod-dawano trawieniu enzymatycznemu przy u¿yciu roztwo-ru trypsyny o stê¿eniu 1 mg/ml w 1 mM HCL, o ph 7,8, wtemperaturze 37°C, przez 20 minut. Po trypsynizacji

skrawki p³ukano najpierw w wodzie destylowanej, po-tem w 0,05 M buforze TRIS (TBS) o pH 7,6 przez 5 min.i poddawano je 60 min. inkubacji, w temperaturze poko-jowej, w komorze wilgotnej, z odpowiednio rozcieñczo-nym przeciwcia³em CD 34 1: 50. Po inkubacji, dwukrot-nie p³ukano skrawki w buforze TBS i stosowano dwu-etapowy system wizualizacji DAKO EnVision, aby uwi-doczniæ reakcjê antygen � przeciwcia³o. Pierwszy etapreakcji polega na 30 minutowej inkubacji w w/w warun-kach z polimerem znakowanym peroksydaz¹ i zwi¹za-nym z wtórnymi, kozimi przeciwcia³ami skierowanymiprzeciwko u¿ytym przeciwcia³om monoklonalnym (my-sim). Ostatni etap detekcji jest przyk³adem reakcji enzy-matycznej, w której przy zastosowaniu substratu dla pe-roksydazy � tetrachlorku 3,3`diaminobenzydyny (DAB)powstaje barwny produkt (czas inkubacji z roztworemDAB - 5 min.). Po uzyskaniu pozytywnej reakcji immu-nohistochemicznej podbarwiano j¹dra komórkowe he-matoksylin¹ Meyera (2 min.), a nastêpnie odwadnianoskrawki w szeregu alkoholi o rosn¹cych stê¿eniach (70%,80%, 96%) i przeprowadzano przez szereg acetonów iksylenów. Tak przygotowane zatapiano w balsamie ka-nadyjskim.

Kontrolê negatywn¹ metody stanowi³y skrawki, wktórych zastêpowano pierwotne przeciwcia³a buforemTBS, stosuj¹c dalej opisan¹ procedurê immunohistoche-miczn¹. Kontrol¹ pozytywn¹ by³y skrawki daj¹ce znan¹wcze�niej, silnie pozytywn¹ reakcjê w kierunku badane-go antygenu. Ekspresjê oceniano przy u¿yciu mikrosko-pu Nikon Microfob FXA (Nikon LTD, Japonia).

Metodyka badañ pó³ilo�ciowychNasilenie immunoekspresji CD34 w wycinkach skó-

ry pobranych od chorych na twardzinê uk³adow¹ i ogra-niczon¹ oraz w grupie kontrolnej oceniono pó³ilo�ciowostosuj¹c nastêpuj¹c¹ skalê: 0 � brak odczynu, 1 � od-czyn s³aby, 2 � odczyn mierny, 3 � odczyn silny. Dla ka¿-dej jednostki chorobowej i grupy porównawczej obliczo-no �rednie warto�ci nasilenia immunoekspresji CD34, awyniki poddano analizie statystycznej.

Metodyka badañ statystycznychWszystkie dane przedstawiono jako �rednie ± od-

chylenie standardowe (SD). Korelacje zosta³y ustalonena podstawie testu Manna-Whitney'a i okre�lenia wspó³-czynnika rang Spearmana (r). Ró¿nice pomiêdzy grupa-mi zbadano za pomoc¹ testu t-Studenta poprzedzone-go ocen¹ rozk³adu i jednorodno�ci wariancji. Wyniki uzna-no za statystycznie znamienne przy wspó³czynniku istot-no�ci statystycznej p<0,05.

Wszyscy badani pacjenci oraz osoby zdrowe zo-sta³y poinformowane o celu badania, wyrazili zgodê naudzia³ w nim. Badania przeprowadzono po uzyskaniuzgody lokalnej Komisji Bioetyki.

WynikiW surowicy chorych na twardzinê uk³a-

dow¹ stê¿enie badanych parametrów wa-ha³o siê w nastêpuj¹cych granicach: MMP-2 � 179,6-334,5 ng/ml; MMP-9 � 130-2140ng/ml; VEGF � 18,3-1311 pg/ml; sVEGFR2� 5650-13120 pg/ml. Natomiast w surowicy

¿eñ VEGF/sVEGFR2 w grupie chorych na twardzinê uk³a-dow¹ w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kon-trolnej (0,038 pg/ml v.s. 0,018 pg/ml) oraz dodatni¹ korela-cjê pomiêdzy stê¿eniem MMP-9 a sVEGFR2 jedynie w gru-pie kontrolnej (r=0,143). Immunoekspresjê CD34 stwierdzo-no w cytoplazmie komórek �ródb³onka naczyñ. �redniawarto�æ nasilenia immunoekspresji CD34 u chorych natwardzinê uk³adow¹ wynios³a 1,59 ± 0,69, w morphea 1,42± 0,50 i by³a znamiennie ni¿sza ni¿ w grupie kontrolnej 2,8± 0,42 (p<0,001); nie wykazano znamiennej ró¿nicy immu-noekspresji w wycinkach od chorych na obie postacie twar-dziny uk³adow¹ i morphea (p=0,27). Uzyskane wyniki wska-zuj¹ na podobieñstwa patogenetyczne obu postaci twar-dziny � uk³adowej i ograniczonej do skóry dotycz¹ce uszko-dzenia komórek �ródb³onka naczyñ krwiono�nych.

group (r=0.143) were obtained. Possitive CD34 expressionwas found in vascular endothelial cells cytoplasm. Meanvalue of immunoexpression of CD34 was statistically sig-nificantly higher in the control group (2.8 ± 0.42) comparedto SSc group (1.59 ± 0.69) and morphea (1.42 ± 0.50)(p<0.001). There was no statistically significant differencebetween immunoexpression of CD34 in skin samples ofboth types of scleroderma (p=0.27). The obtained resultsseem to confirm pathogenic similarities in endothelial cellsdisturbances in both types of scleroderma � SSc andmorphea.

1042 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

chorych z rozpoznaniem morphea: MMP-2� 168,8-296,6 ng/ml; MMP-9 � 334-1191 ng/ml; VEGF � 96,6-1125 pg/ml a sVEGFR2 �6270-11945 pg/ml (tabela II).

Analiza statystyczna uzyskanych wyni-ków wykaza³a, ¿e �rednie stê¿enie MMP-9by³o statystycznie wy¿sze w surowicy cho-rych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniudo wyników uzyskanych w grupie kontrol-nej (848,6 ng/ml vs. 535,9 ng/ml; p<0,05)jak równie¿ w surowicy chorych z rozpozna-n¹ twardzin¹ ograniczon¹ do skóry ni¿ wgrupie kontrolnej (844,4 ng/ml vs. 535,9 ng/ml; p<0,05). Stwierdzono, ¿e �rednie stê-¿enie MMP-2 by³o znamiennie wy¿sze w su-rowicy chorych z SSc w stosunku do wyni-ków uzyskanych w morphea oraz w grupiekontrolnej (240,4 ng/ml vs. 208,1 ng/ml;211,9 ng/ml; p<0,05) (tabela II). �rednie stê-¿enie VEGF by³o znamiennie statystycznie

wy¿sze w surowicy chorych z morphea wporównaniu do wyników uzyskanych w gru-pie kontrolnej (422,2 pg/ml vs. 188,7 pg/ml;p<0,05). Nie stwierdzono ró¿nic statystycz-nie istotnych surowiczego stê¿eniasVEGFR2 w badanych grupach (tabela II).

Dalsza analiza statystyczna wykaza³astatystycznie znamienn¹ ró¿nicê stosunku�rednich stê¿eñ VEGF/sVEGFR2 w grupiechorych na twardzinê uk³adow¹ w porów-naniu do wyników uzyskanych w grupie kon-trolnej (0,038 pg/ml vs. 0,018 pg/ml; p<0,05)(tabela III). Analiza statystyczna wykaza³aistotn¹, dodatni¹ korelacjê pomiêdzy stê¿e-niem MMP-9 a sVEGFR2 jedynie w grupiekontrolnej (r=0,143; p<0,05). Stwierdzonorównie¿, ¿e zale¿no�æ pomiêdzy stê¿eniemVEGF a sVEGFR2 mia³a dodatni charakterw grupie chorych z SSc i zdrowych osób,natomiast w morphea mia³a ujemny charak-

ter, jednak wyniki te nie by³y statystycznieznamienne (p>0,05) (tabela IV).

Wyniki badañ pó³ilo�ciowych nasileniaimmunoekspresji CD34 przedstawiono wtabeli V.

Immunoekspresjê CD34 stwierdzono wcytoplazmie komórek �ródb³onka naczyñ. Wwycinkach skóry pobranych od chorych natwardzinê uk³adow¹ nasilenie immunoek-spresji CD34 by³o s³abe w wiêkszo�ci pre-paratów, mierne w 10 skrawkach, a jedyniew 2 przypadkach silne. �rednia warto�ænasilenia immunoekspresji CD34 u chorychna twardzinê uk³adow¹ wynios³a 1,59 ± 0,69.Badanie immunohistochemiczne wykaza³ou wiêkszo�ci chorych w tej grupie obecno�ænielicznych naczyñ o w¹skim �wietle. Wtkance ³¹cznej podnaskórkowej ogniskowonie wykazano dodatniej reakcji z przeciw-cia³em CD34 (rycina1).

W wycinkach skóry pobranych od cho-rych na twardzinê ograniczon¹ nasilenieimmunoekspresji CD34 by³o s³abe w wiêk-szo�ci skrawków, a mierne w 13 przypad-kach. W ¿adnym wycinku ze skóry pobra-nym od chorych na twardzinê ograniczon¹nie stwierdzono silnego odczynu z przeciw-cia³em CD34. �rednia warto�æ nasileniaimmunoekspresji CD34 u chorych na twar-dzinê ograniczon¹ wynios³a 1,42 ± 0,50. Wskrawkach skóry pobranych od chorych natwardzinê ograniczon¹ stwierdzano naczy-nia o w¹skim �wietle zatopione w skolage-nizowanej skórze. Na do�æ znacznych ob-szarach odczyn z przeciwcia³em CD34 niewykaza³ obecno�ci naczyñ, szczególnie wwarstwie podnaskórkowej (rycina 2). Prze-prowadzona analiza statystyczna nie wy-kaza³a znamiennej ró¿nicy (p=0,27) w nasi-leniu immunokspresji CD34 u chorych natwardzinê uk³adow¹ i morphea (tabela V).

W skrawkach pochodz¹cych z grupykontrolnej odczyn by³ silny i wykaza³ obec-no�æ licznych naczyñ o do�æ szerokim �wie-tle (rycina 3). Jedynie w 2 przypadkach na-silenie odczynu okre�lono jako mierne.�rednia warto�æ nasilenia immunoekspre-sji CD34 w grupie porównawczej wynios³a2,8 ± 0,42. Wyniki analizy statystycznej wy-kaza³y, ¿e w skrawkach z grupy kontrolnejnasilenie immunoekspresji CD34 by³o zna-miennie wiêksze w porównaniu ze skraw-kami pobranymi od chorych na twardzinêuk³adow¹ (p<0,001) i ograniczon¹ (p<0,001)(tabela V).

OmówieniePatogeneza w³óknienia, które jest za-

sadniczym objawem twardziny pozostajeniedok³adnie poznana. Wyniki badañ Chun-ga i wsp. sugeruj¹ udzia³ wielu ró¿norod-nych czynników w tym genetycznych i in-fekcyjnych [8]. W obu odmianach twardzi-ny � uk³adowej i ograniczonej do skóry wy-kazano równie¿ aktywacjê uk³adu immuno-logicznego [30]. Stwierdzono, ¿e ograniczo-ny charakter zmian skórnych w morpheamo¿e wynikaæ z ró¿nic w zakresie genówodpowiedzialnych za w³óknienie i ró¿nic waktywno�ci cytokin [18,19]. Wojas-Pelc iwsp. przedstawiaj¹ dane �wiadcz¹ce o po-dobnym pod³o¿u zmian w morphea i twar-dzinie uk³adowej [31]. Zasadniczymi zjawi-skami obserwowanymi w twardzinie s¹zmiany w ma³ych naczyniach krwiono�nych,

Tabela ICharakterystyka kliniczna badanych.Clinical characteristic of examined groups.

Tabela IIStê¿enie MMP-2, MMP-9, VEGF, sVEGFR2 w surowicy badanych chorych z SSc, morphea i grupie kontrolnej.Serum concentration of MMP-2, MMP-9, VEGF, sVEGFR2 in SSc, morphea and control group.

N - liczba badanych; Me - mediana; �R - �rednia; SD - odchylenie standardowe* - porównanie w stosunku do grupy kontrolnej statystycznie znamienne p<0,05# - porównanie twardziny uk³adowej do morphea statystycznie znamienne p<0,005

Tabela III.Stosunek MMP-2/MMP-9 i VEGF/sVEGFR2 w twardzinie uk³adowej, morphea i grupie kontrolnej.Ratio of MMP-2/MMP-9 and VEGF/sVEGFR2 in systemic sclerosis, morphea and control group.

apurganadaB enzcytsytatsenaD 9-PMM/2-PMM 2RFGEVs/FGEV

awoda³kuanizdrawT43=N

serkaZeM

DS±R�

591,2-8811,0303,0

1704,0±134,0

341,0-0200,0820,0

6430,0±*830,0

aehproM01=N

serkaZeM

DS±R�

505,0-371,0942,0

721,0±682,0

971,0-900,0440,0

850,0±450,0

anlortnokapurG51=N

serkaZeM

DS±R�

115,1-951,0874,0

7283,0±2175,0

150,0-10100,010210,0

610,0±810,0

N - liczba badanych; ME - mediana; �R - warto�æ �rednia;SD - odchylenie standardowe* - porównanie w stosunku do grupy kontrolnej statystycznie znamienne p<0,05

)cSS(awoda³kuanizdrawT aehproM anlortnokapurG

hcynadababzciL 43 13 51

M/Kæe³P 1/33 1/03 5/01

)atal(ainder�keiW 4,45;27-83 8,34;05-43 83;94-91

)atal(ainder�;yborohcainawrtsazC 01;02-1 5,1;3-1 -

)tkp()SST(erocSnikSlatoT 51;82-01 - -

ksingoabzciL - 8-1 -

ANA 43 4 0

apurganadaB enaDenzcytsytats

rtemarapynadaB

)lm/gn(2-PMM )lm/gn(9-PMM )lm/gp(FGEV )lm/gp(2RFGEVs

;awoda³kuanizdrawT43=N

serkaZeM

DS±R�

5,433-6,9714,042

61,53±*4,042

0,0412-0,0315,528

57,554±*6,848

0,1131-3,819,982

9,123±2,763

0,02131-0,05650,01001

7,8871±9,65001

aehproM01=N

serkaZeM

DS±R�

;6,692-8,861;5,991

7,24±#1,802

;0,1911-0,433;0,969

4,923±*4,448

;0,5211-6,69;9,514

8,843±*9,224

0,54911-0,07265,2119

5,5112±5,2209

anlortnokapurG51=N

serkaZeM

DS±R�

1,962-6,6617,602

7,92±9,112

0,9431-0,4710,624

9,723±9,535

5,175-0,323,101

1,771±7,881

0,560001-0,03760,5379

6,46432±3,23551

1043Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12

przewlek³y stan zapalny oraz wzmo¿ona ak-tywno�æ fibroblastów prowadz¹ca do nad-miernego gromadzenia w tkankach kolage-nu i innych sk³adników ECM [27].

W obecnej pracy podjêto próbê porów-nania zaburzeñ naczyniowych w twardzi-nie uk³adowej i ograniczonej do skóry napodstawie okre�lenia stê¿enie w surowicybadanych chorych dwóch ¿elatynaz A i B -metloproteinazy -2 i -9 oraz VEGF isVEGFR2, a tak¿e oceny ekspresji antyge-nu CD34 na komórkach endotelium w cho-robowo zmienionej skórze.

Metaloproteinaza 2 wydzielana jestprzez fibroblasty, neutrofile, makrofagi imonocyty, natomiast metaloproteinaza 9przez monocyty, makrofagi, neutrofile, ke-ratynocyty, fibroblasty, osteoklasty, chondro-cyty i komórki �ródb³onka [5]. Wskazuje siê,¿e mog¹ one wp³ywaæ na migracjê komó-rek miê�ni g³adkich i neointimy lub degra-dacji proteolitycznej blaszki elastycznej [22].

Znane s¹ jednak¿e wyniki badañ wskazuj¹-ce, ¿e w�ród endopeptydaz, ¿elatynazy -2 i-9 w szczególny sposób wp³ywaj¹ na degra-dacjê zdenaturowanego kolagenu. Obiemetaloproteinazy trawi¹ równie¿ kolagentypu I, IV � g³ówny sk³adnik b³ony podstaw-nej i agrekany [12].

Niektórzy autorzy stwierdzili, ¿e w fibro-blastach pochodz¹cych od chorych na twar-dzinê uk³adow¹ obserwowano ni¿sz¹ eks-presjê niektórych kolagenaz [4]. Bogacze-wicz i wsp. wykazali jednak wy¿sze stê¿e-nia pro-MMP-9 i MMP-9 w surowicy cho-rych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniudo wyników w grupie zdrowych osób [6]. Yui wsp. potwierdzili, ¿e obie ¿elatynazy �MMP-2 i MMP-9 mog¹ braæ udzia³ w akty-wacji latentnej formy TGFb jak te¿ w proce-sie angiogenezy [32]. Zarówno w twardzi-nie uk³adowej jak i w morphea udowodnio-no kluczow¹ funkcjê autokrynnej stymulacjifibroblastów przez Tumor Growth Factor b

(TGFb) [2]. W�ród ró¿norodnych efektówdzia³ania tej cytokiny wykazano równie¿ jejhamuj¹cy wp³yw na proliferacjê komórek�ródb³onka, co mo¿e byæ jedn¹ z wielu przy-czyn zanikania kapilarów.

W przeciwieñstwie do danych innychautorów [31] w obecnej pracy stwierdzono,¿e �rednie stê¿enie MMP-9 by³o znamien-nie wy¿sze w surowicy chorych na twardzi-nê uk³adow¹ i ograniczon¹ do skóry w po-równaniu do wyników uzyskanych w grupieosób zdrowych. Wykazano tak¿e wy¿sze�rednie stê¿enie metaloproteinazy 2 w su-rowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ wstosunku do wyników uzyskanych w grupiebadanych chorych z morphea i w grupiekontrolnej. Obserwacja ta wskazuje na ist-nienie wiêkszych zaburzeñ w sekrecji me-taloproteinazy 2 w uk³adowej postaci twar-dziny. Zwiêkszone wydzielanie obu bada-nych metaloproteinaz w porównaniu z wy-nikami uzyskanymi w grupie zdrowych osóbpotwierdza ich znacz¹c¹ rolê w patogene-zie obu postaci twardziny. Wyniki naszychwcze�niejszych badañ przeprowadzone uchorych na twardzinê uk³adow¹ wykaza³ywyra�n¹ ekspresjê MMP-2 i MMP-9 w po-równaniu z wycinkami pochodz¹cymi odosób zdrowych, zlokalizowan¹ w okolicy nie-licznych naczyñ krwiono�nych [13]. Uzyska-ne wyniki potwierdzaj¹ znacz¹cy udzia³ obu¿elatynaz w powstawaniu zmian naczynio-wych, w³óknieniu tkankowym a tak¿e w no-wotworzeniu naczyñ krwiono�nych.

Jednym z najsilniejszych czynników pro-angiogennych jest naczyniowo-�ródb³onko-wy czynnik wzrostu, który spe³nia wa¿n¹ rolêzarówno w fizjologicznej jak i patologicznejskórnej angiogenezie [14]. VEGF zwiêkszaprzepuszczalno�æ naczyñ dla bia³ek osocza.W ten sposób umo¿liwia powstawanie wprzestrzeni pozakomórkowej ¿elu fibryno-wego, co uznano za prawdopodobnie pierw-szy element rozpoczynaj¹cy tworzenie no-wych naczyñ [11]. Ta pro-angiogenna cyto-kina zwiêksza równie¿ ekspresjê enzymówproteolitycznych na komórkach �ródb³onka[16]. Efekt dzia³ania VEGF na komórki �ród-b³onka odbywa siê poprzez wi¹zanie ze spe-cyficznymi receptorami kinazy tyrozynowej(VEGFR1 i VEGFR2), które prawie wy³¹cz-nie znajduj¹ siê na tych komórkach. Recep-tory te po zwi¹zaniu z cytokin¹ ulegaj¹ fos-forylacji, wywo³uj¹c nastêpnie wzrost ró¿ni-cowania, proliferacji i migracji komórek en-dotelium do nowotworzonego naczyniakrwiono�nego [26].

W morphea podobnie jak w twardzinieuk³adowej zmiany w komórkach endotelial-nych i naczyniach krwiono�nych s¹ najwcze-�niejszymi cechami stwierdzanymi w bada-niu histopatologicznym [31].

W obecnej pracy stwierdzono, ¿e stê-¿enie naczyniowo-�ródb³onkowego czynni-ka wzrostu by³o znamiennie statystyczniewy¿sze w surowicy chorych z morphea i nie-znamiennie wy¿sze w grupie SSc w porów-naniu do wyników uzyskanych w grupie kon-trolnej. Natomiast stê¿enie sVEGFR2 by³onieznamiennie statystycznie ni¿sze w obupostaciach twardziny, ni¿ w grupie osóbzdrowych. Odmienne wyniki uzyska³ Distleri wsp., wykazano wy¿sze stê¿enie sVEGFR wsurowicy chorych z SSc w stosunku do wyni-ków uzyskanych w grupie kontrolnej [9].

apurganadaB hcynadababzciL r p

2RFGEVs-FGEV

cSS 43 950,0 837,0

aehproM 01 123,0- 284,0

anlortnokapurG 51 753,0 191,0

2-PMM-FGEV

cSS 43 132,0- 981,0

aehproM 01 393,0 383,0

anlortnokapurG 51 340,0 981,0

9-PMM-FGEV

cSS 43 523,0 060,0

aehproM 01 971,0 207,0

anlortnokapurG 51 051,0 207,0

2-PMM-2RFGEVs

cSS 43 122,0- 012,0

aehproM 01 170,0- 978,0

anlortnokapurG 51 174,0- 670,0

9-PMM-2RFGEVs

cSS 43 031,0 364,0

aehproM 01 341,0 067,0

anlortnokapurG 51 341,0 *140,0

Tabela IVZale¿no�ci pomiêdzy VEGF, sVEGFR2 i MMP-2, MMP-9 w badanych grupach.Correlations between VEGF, sVEGF, sVEGFR2 and MMP-2, MMP-9 in examined groups.

* - zale¿no�æ statystycznie znamienna p<0,05

Tabela V�rednie warto�ci nasilenia immunoekspresji CD34 w wycinkach skóry w twardzinie uk³adowej i ograniczonejoraz w grupie kontrolnej.Mean values of intensity of CD34 immunoexpression in systemic slcerosis, morphea and control group skin samples.

awoda³kuanizdrawT)cSS( aehproM anlortnokapurG

hcynadababzciL 72 13 01

)DS±R�(43DC *96,0±95,1 *05,0±24,1 24,0±8,2

�R - warto�æ �rednia; SD - odchylenie standardowe* - ró¿nica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej p<0,001

1044 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

W badaniach w³asnych stwierdzonoponadto zale¿no�æ pomiêdzy wy¿szym stê-¿eniem VEGF i sVEGFR2 w surowicy cho-rych z SSc. U pacjentów z morphea wy¿szestê¿enie VEGF wi¹za³o siê z ni¿szym stê-¿eniem badanego receptora. Wykazano tak-¿e znamienny statystycznie stosunek war-to�ci badanej cytokiny proangiogennej do jejrozpuszczalnego receptora jedynie w gru-pie chorych z twardzin¹ uk³adow¹ w porów-naniu do wyników uzyskanych w grupie kon-trolnej. Wiadomo, ¿e angiogeneza stymu-lowana jest przez proces niedotlenienia

tkankowego, natomiast w twardzinie bada-niem histopatologicznym stwierdza siê za-nik naczyñ krwiono�nych. Uzyskane wynikiwskazuj¹, i¿ prawdopodobnie jednym z czyn-ników odpowiedzialnych za zahamowanieangiogenezy w twardzinie uk³adowej mo¿ebyæ zaburzona funkcja naczyniowo-�ród-b³onkowego czynnika wzrostu lub jej 2 re-ceptora, a w morphea zmniejszona ekspre-sja receptora na komórkach �ródb³onka.Analiza statystyczna uzyskanych wyników,w której porównywano stosunek warto�cibadanych parametrów w surowicy wykaza-

³a, ¿e jedynie w grupie chorych na twardzi-nê uk³adow¹ istnieje znamienny stosunekstê¿enia VEGF/sVEGFR2 w porównaniu dowyników uzyskanych w grupie kontrolnej.Podobne wyniki uzyskano w badaniachprzeprowadzonych przez Mackiewicza iwsp., które wykaza³y wzrost ekspresji VEGFi jego receptorów w skórze chorych na twar-dzinê uk³adow¹ [23]. Autorzy uznali zabu-rzenia w równowadze pomiêdzy tymi para-metrami za decyduj¹cy czynnik hamuj¹cyproces angiogenezy w SSc. Jednym z za-sadniczych czynników stymuluj¹cych pro-ces angiogenezy jest niedotlenienie. Jed-nak¿e w twardzinie pomimo w³óknienia skó-ry nie stwierdza siê wzrostu tworzenia no-wych naczyñ krwiono�nych. Wy¿sze stê¿e-nia VEGF i 2 receptora tej cytokiny, które wwarunkach fizjologicznych mog³yby wzbu-dzaæ angiogenezê, w twardzinie wskazywaæmog¹ na zaburzenie funkcji samej cytokinylub jej receptora.

Wykazana statystycznie znamienna za-le¿no�æ pomiêdzy stê¿eniem w surowicyVEGF i MMP-9 jedynie w grupie kontrolnejwskazuje, ¿e tylko u osób zdrowych stymu-luj¹ce dzia³anie VEGF na komórki �ródb³on-ka wzbudza w nich miêdzy innymi produk-cjê kolagenazy u³atwiaj¹cej podjêcie angio-genezy. Takiej zale¿no�ci nie stwierdzonou badanych chorych na twardzinê, zarów-no uk³adow¹ jak i morphea. Potwierdza topodobny charakter zmian w komórkach en-dotelium w obu postaciach twardziny.

Uzyskane wyniki u chorych na twardzi-nê ograniczon¹ do skóry i uk³adow¹ wyka-za³y obecno�æ zaburzeñ w wydzielaniu me-taloproteinaz (MMP-2 i MMP-9) oraz VEGFi sVEGFR2 potwierdzaj¹c ich podobieñstwapatogenetyczne. Tak¿e stwierdzony staty-stycznie znamienny stosunek VEGF/sVEGFR2 w surowicy chorych na twardzi-nê uk³adow¹ wskazywaæ mo¿e na zaburze-nie ich funkcji prowadz¹c¹ do zaburzeñ pro-cesu angiogenezy.

Rola komórek CD34+ w powstawaniuzmian skórnych w przebiegu twardziny po-zostaje nadal niedok³adnie poznana. Wia-domo, ¿e dendrocyty, na powierzchni któ-rych obecny jest antygen CD34, spe³niaj¹wa¿ne funkcje immunologiczne w skórze[17,24]. Zmniejszenie ilo�ci komórek CD34+w skórze mo¿e powodowaæ rozwój zjawiskautoimmunologicznych lub niekontrolowa-ne w³óknienie w przebiegu twardziny[24,28]. Antygen CD34 jest przezb³onow¹glikoprotein¹, obecn¹ na powierzchni ko-mórek �ródb³onka i komórek hematopetycz-nych. Stwierdzono, ¿e zwiêkszona jego eks-presja odgrywa znacz¹c¹ rolê w powsta-waniu nowych naczyñ krwiono�nych zarów-no w ¿yciu p³odowym jak i doros³ym[1,25,28]. Badania wykonane przez Aiwa iwsp. wykaza³y, ¿e komórki �ródb³onkaCD34+ obecne by³y w pó�nym okresie w³ók-nienia w skórze zajêtej przez twardzinê [1].

W obecnej pracy wykazano, podobniejak inni autorzy [1,28], znamiennie staty-stycznie zmniejszenie liczby komórek en-dotelium CD34+ w skórze chorych zarów-no na twardzinê uk³adow¹ i ograniczon¹ doskóry w porównaniu do wyników uzyska-nych w wycinkach grupy kontrolnej.

Rycina 1S³aba immunoekspresja CD34 w komórkach �ródb³onka w twardzinie uk³adowej (400x).Weak immunoexpression of CD34 in endothelial cells in systemic sclerosis (400x).

Rycina 2S³aba immunoekspresja CD34 w komórkach �ródb³onka w morphea (200x).Weak immunoexpression of CD34 in endothelial cells in morphea (200x).

1045Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12

Rycina 3Silny odczyn CD34 w okolicy naczyñ krwiono�nych skóry w grupie kontrolnej (200x)Strong reaction with CD34 in surrounding of skin`s vessels in the control group (200 x)..

Pi�miennictwo1. Aiba S., Tabata N., Ohtani H. et al.: CD34+ spindle-

shaped cells selectively disappear from the skin le-sion of scleroderma. Arch. Dermatol. 1994, 130, 593.

2. Asano Y., Ihn H., Kubo M. et al.: Clinical signifi-cance of serum matrix metalloproteinase-13 levelsin patients with localized scleroderma. Clin. Exp.Rheumatol. 2006, 24, 394.

3. Asano Y., Ihn H., Jinnin M. et al.: Involvement ofavb5 integrin in the establishment of autocrine TGF-b signaling in dermal fibroblasts derived from local-ized scleroderma. J. Invest. Dermatol. 2006, 126,1761.

4. Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D.:Rola metaloproteinaz macierzy i tkankowychinhibitorów metaloproteinaz w twardzinie uk³adowej.Przegl. Dermatol. 2003, 5, 373.

5. Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D.:Rola metaloproteinaz macierzy i tkankowychinhibitorów metaloproteinaz w gojeniu siê ran skóry.Przegl. Dermatol. 2004, 3, 253.

6. Bogaczewicz J., Krasowska D., Stryjecka-ZimmerM., Chodorowska G.: Wysokie ca³kowite stê¿eniemetaloproteinazy macierzy 9 (pro-MMP-9 i MMP-9)w surowicy krwi chorych na twardzinê uk³adow¹.Przegl. Dermatol. 2005, 3, 217.

7. Carmichael D.F., Stricklin G.P., Stuart J.M.: Sys-temic administration of TIMP in the treatment of col-lagen -induced arthritis in mice. Agents Actions 1989,

27, 378.8. Chung L., Lin J., Furst D.E., Fiorentino D.: Sys-

temic and localized scleroderma. Clin. Dermatol.2006, 24, 374.

9. Distler O., Distler J.H.W., Scheid A. et al.: Uncon-trolled expression of vascular endothelial growth fac-tor and its receptors leads to insufficient skin angio-genesis in patients with systemic sclerosis. Circ. Res.2004, 95, 109.

10. Distler J.H., Kalden J.R., Gray S., Distler O.: Vas-cular changes in the pathogenesis of systemic scle-rosis. Z. Rheumatol. 2004, 63, 446.

11. Dvorak H.F.: Tumors: Wounds that do not heal. NEJM1986, 315, 1650.

12. Dziankowska-Bartkowiak B., Waszczykowska E.,Sysa-Jêdrzejowska A.: Rola metaloproteinazmacierzy i ich tkankowych inhibitorów w procesachw³óknienia. Przegl. Dermatol. 2001, 5, 473.

13. Dziankowska-Bartkowiak B., ̄ ebrowska A., Joss-Wichmann E. et al.: Stê¿enie metaloproteinazy 2 i9 (MMP-2 i MMP-9) w surowicy chorych na twardzinêuk³adow¹ - porównanie z ich ekspresj¹ w chorobowozmienionej skórze - badania wstêpne. PostêpyDermatologii i Alergologii 2007, 2, 73.

14. Felmeden D.C., Blann A.D., Lip G.Y.H.: Angiogen-esis: basic pathophysiology and implications for dis-ease. Eur. Heart. J. 2003, 24, 586.

15. Fleischmajer R., Perlish J.S., Krieg T. et al.: Vari-

ability in collagen and fibronectin synthesis by scle-roderma fibroblasts in primary culture. J. Invest.Dermatol. 1981,76, 400.

16. Gerber H.P., Ferrara N.: The role of VEGF in normaland neoplastic hematopoiesis. J. Mol. Med. 2003,81, 20.

17. Glimour T.K., Wilkinson B., Breit S.N., KossardS.: Analysis of dendritic cell populations using a re-vised histological staging of morphoea. Br. J.Dermatol. 2000, 143, 1183.

18. Higley H., Persichitte K., Chu S. et al.: Immunocy-tochemical localization and serologic detection oftransforming growth factor b1. Arthritis Rheum. 1994,37, 278.

19. Izumi T., Tajima S., Nishikawa T.: Stimulated ex-pression of deocorine and the deocorine gene infibroblasts cultured from patients with localized scle-roderma. Arch. Dermatol. Res. 1995, 287, 417.

20. Jab³oñska S., Rodnan G.P.: Localized forms of scle-roderma. Clin. Rheum. Dis. 1979, 5, 215.

21. Lee M.M., Yoon B.J., Osiewicz K. et al.: Tissue in-hibitor of metalloproteinase 1 regulates resistenceto infection. Infect. Immun. 2005, 73, 661.

22. Lijnen H.R.: Metalloproteinases in development andprogression of vascular disease. Pathophysiol.Haemost. Thromb. 2003, 33, 275.

23. Mackiewicz Z., Sukura A., Povilenaite D. et al.:Increased but imbalanced expression of VEGF andits receptors has no positive effect on angiogenesisin systemic sclerosis. Clin. Exp. Rheumatol. 2002,20, 641.

24. McNiff J.M., Glusac E.J., Lazova R.Z. et al.:Morphea limited to the superficial reticular dermis:an underrecognized histologic phenomenon. Am. J.Dermatol. 1999, 21, 315.

25. Norton W.L., Huro E.R., Lewis D.C., Ziff M.: Evi-dence of microvascular injury in scleroderma andsystemic lupus erythematosus: quantitative study ofthe microvascular bed. J. Lab. Clin. Med. 1968, 71,919.

26. Odoriso T., Failla C.M., Zambruno G.: Mollecularcontrol of physiological skin angiogenesis. Eur. J.Dermatol. 2002, 12, VII.

27. Peltonem J., Kahari L., Jaakkola S. et al..: Evalu-ation of transforming growth factor b and type Iprocollagen gene expression in fibrotic skin diseasesby in situ hybridization. J. Invest. Dermatol. 1990,94, 365.

28. Skobieranda K., Helm K.F.: Decreased expressionof the human progenitor cell antigen (CD34) inmorphea. Am. J. Dermatol. 1995, 17, 471.

29. Subcommittee for Scleroderma Criteria of theAmerican Rheumatism Association Diagnosticand Therapeutic Criteria Committee: Preliminarycriteria for the classification of systemic sclerosis(scleroderma). Arthritis. Rheum. 1980, 23, 581.

30. Takehara K., Sato S.: Localized scleroderma is anautoimmune disorder. Rheumatology 2005, 44, 274.

31. Wojas-Pelc A., Lipko-Godlewska S.: Pathogenesisof skin scleroderma-literature revivew. Przegl. Lek.2005, 62, 310.

32. Yu Q., Stamenkovic I.: Cell surface-localized matrixmetalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogen-esis. Genes. Dev. 2000, 15. 163.