Em. J. Biochem. 29,210-216 (1972)

Uber die Wechselwirkung des Actinomycin C, mit Mono-, Di- und Oligonucleotiden

Reinhard SCHARA und Werner MULLER Gesellschaft fur Dlolekularbiologische Forschung mbH, Stockheim

(Eingegangen am 4. April 1972)

Sequence specificity in the binding of the actinomycins to DNA has been studied by measuring the dissociation constants of several deoxyribodinucleotide-actinomycin complexes by spectral- titration. Additional data for some mononucleotides and for a deoxyribotetranucleotide have been collected for comparison. The results show that:

G-Containing dinucleotides form complexes of roughly 10 times higher stability than G-free dinucleotides. These data parallel the corresponding results for mononucleotides [16].

The G-containing dinucleotides may be subdivided into three classes of the following sequential types :

a) d(pX-G), which bind the actinomycins with similar affinity as the dGMP, b) d(pG-X), which bind the actinomycins less strongly than dGMP, and c) d(pG-C), which binds the actinomycins in a 2:l complex (two dinucleotides per dye

The tetranucleotjde d(pC-T-A-G) behaves as the dinucleotides of type a. Molecular weights of the complexes as determined by sedimentation equilibrium measurements

confirmed the stoichiometry of the actinomycin-d(pG-C) complex obtained by titration. Corresponding measurements for the actinomycin complexes of d(pC-G) and d(pC-T-A-G) revealed that the antibiotic strongly favours double helix formation of these self complementary oligonucleotides, yielding 2 : 2 complexes with two equivalent binding sites at the ends of the helices.

All data are consistent with fixation of the actinomycin chromophore on the 3'-side of the dG-residue as in the actinomycin-dG crystal [8].

molecule) of higher stability than all the other dinucleotides.

Die Hemmwirkung der Actinomycinantibiotica beruht auf ihrer Wechselwirkung mit der Desoxy- ribonucleinsiiure (DNA) in der Zelle [l-41. Der Komplex, der dabei entsteht, ist langlebig genug, um die Propagation der RNA-Polymerase im Trans- kriptionsprozefi nachhaltig zu hemmen [5]. Dieser Komplex ist durch eine Reihe von Fakten gekenn- zeichnet, von denen folgende im Zusammenhang mit der vorliegenden Untersuchung von Belang sind :

a) Die Wechselwirkung der Actinomycine mit DNA erfolgt guaninspezj fisch und erfordert ein doppelhelikales Polydesoxynucleotid [l, 61. Von den guaninfreien Polymeren vcrmag lediglich die Poly- desoxyinosinsiiure (poly dI) Actinomycin in nennens- wertem Umfang zu binden [7].

b) Bei der Komplexbildung schiebt sich der Actinomycinchromophor zwischen zwei Basenpaare der DNA, von denen eins ein Guanin-Cytosin-Paar sein mu13 [5].

Die Entstehung eines Einschubkomplexes zwi- schen dem Actinomycinchromophor und den DNA- Basenpaaren legte die Vermutung nahe, daB neben der erwiihnten Basenspezifitiit auch eine Sequenz- spezifitiit als Folge der Beteiligung beider Basen- paare am BindungsprozeB vorliegen miiBte. Diese Sequenzspezifitiit wurde mit HiLfe von sequenz- isomeren Polydesoxynucleotiden untersucht [7]. Die Ergebnisse besagten, daB der Einschub bevorzugt zwischen zwei GC-Paaren entgegengesetzter Poiaritiit erfolgen musse, da sich das poly[d(G-C)] als der beste Bindungspartner fiir das Actinomycin erwies. Die Rontgenstrukturanalyse von Einkristallen des Acti- nomycin-dG-Komplexes [8] zeigte, daB in Uber- einstimmung hierzu im Komplexkristall je ein dG- Molekiil oberhalb und unterhalb des Actinomycin- chromophors in entsprechender Orientierung ange- ordnet sind.

Der Unterschied in den Stabilitiitskonstanten der Actinomycinkomplexe des poly[d(G-C)] und des

Vol.29, No.2,1972 R. SCHARA und W. MULLER 211

isomeren poly(dG)-poly(dC) macht jedoch weniger K = Stabilitatskonstante des Komplexes in als den Faktor 2 aus, was man auf geringe Unter- l/Mol. Eine Auftragung von E A * E N / A Aa schiede in den Sekundarstrukturen beider Polymere gegen E N ergibt eine Gerade, aus deren zuriickfiihren konnte. Ferner steht die Stochio- Steigung A Q und aus deren Ordinaten- metrie, die im Actinomvcin-dG-Kristall vorliegt, im abschnitt K zu errechnen ist. Gegensatz zu der, die-man in wal3rigen LosGngen antrifft. Von mehreren Gruppen sind im Ionen- starkebereich zwischen 0,Ol und 0,2 bei pH-Werten um 7,O stets 1:l- bzw. n:n-Komplexe, jedoch nie I : 2-Komplexe gefunden worden [6,9,16]. Diese Un- klarheiten veranlal3ten uns, die Wechselwirkung des Actinomycin C, mit einer Reihe von Dinucleotiden sowie mit einem Tetranucleotid zu untersuchen in der Hoffnung, rnit diesen Daten einen Beitrag zur Klarung der Sequenzspezifitat der Actinomycine leisten zu konnen.

MATERIAL UND METHODEN BPES-Puffer: 0,18 M NaCI, 0,008 M Na,HPO,,

0,002 M NaH,PO,, 0,001 M EDTA, pH 7,Ol. Actinornycin C, wurde aus Kulturfiltraten von

Xtreptomyces chrysomallus in der von Brockmann et al. [lo] beschriebenen Weise isoliert und gereinigt.

Die Dinucleotide d(pA-G), d(pG-A), d(pC-G), d(G-C), d(pG-G), d(pT-G), d(pG-T) und d(pT-A) wurden in Anlehnung an die Verfahren von Khorana und Mitarb. [ll, 121 hergestellt, das Tetranucleotid d(pC-T-A-G) durch Kondensation aus den Dinu- cleotiden CE-pCAnpT und pABZpGAe- OAc. Die aus- fiihrliche Darstellung dieser Synthesen sol1 an anderer Stelle erfolgen.

Spektraltitrationen zur Ermittlung von Stabili- tiitskonstanten wurden mit dem Spektralphotometer Zeiss DMR 21 durchgefiihrt, indem Actinomycin- losungen in thermostatisierten Kuvetten mit steigen- den Mengen Nucleotidlosung versetzt und die Spek- tren der Losungen nach jeder Zugabe regi&riert wurden. Die Auswertung der Titrationen erfolgte nach dem Verfahren von Benesi und Hildebrand[13], welches bei 1 : 1-Komplexen die Konzentrationen der Komplexpartner mit dem Spektraleffekt der Bindung folgendermaDen korreliert :

EA = Einwaagekonzentration an Actinomycin

E N

AAa

c, ; = Einwaagekonzentration an Nucleotid ; = Unterschied zwischen der Absorption der

Actinomycinlosung der Konzentration E A und der Komplexlosung E A + E N bei der MeSwellenlange ;Z ;

A El = Unterschied zwischen den Extinktions- koefhienten des freien und komplexierten Actinomycin bei der MeDwellenliinge 2.

Molekulargewichtsbestimmungen an verschiede- nen Komplexen wurden durch Messungen der Sedi- mentationsgleichgewichte in der analytischen Ultra- zentrifuge Beckman, Model1 E (mit Scanner und Monochromator) durchgefiihrt.

ERGEBNISSE Zur Ermittlung von Sequenzspezifitaten haben

wir das Actinomycin C, in BPES-Puffer bei 25°C mit verschiedenen Dinucleotiden und einem Tetra- nucleotid titriert und die Daten durch entsprechende Messungen mit einigen Mononucleotiden erganzt. I n den meisten Fallen ergaben die MeSdaten in der Auf- tragung nach Benesi und Hildebrand [13], d. h. nach Beziehung (I) , lineare Abhangigkeiten und deuteten damit auf die Bildung von 1:l-Komplexen hin (Fig.1). I n diesen Fallen waren aus den Steigungen der Geraden der Unterschied zwischen den Extink- tionskoeffizienten des freien Actinomycin C, und des jeweiligen Nucleotid-Komplexes und aus den Ordi- natenabschnitten die Stabilitatskonstanten der Kom- plexe zu errechnen. Die Ergebnisse dieser Auswer- tungen sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Bei der Titration des Actinomycin mit rAMP und rnit dem Desoxydinucleotid d(pG-C) erhielten wir keine linearen Abhangigkeiten (Fig. 2). Die nachstliegende Erklarung hierfiir war, daD in diesen Fallen keine 1 : 1-Komplexe, sondern Assoziate an- derer Stochiometrie entstehen. Als wahrscheinlich- sten Fall zogen wir die Bildung von Komplexen aus einem Actinomycin- und zwei Nucleotidmole- kiilen in Betracht, d. h. Gleichgewichte der Form :

A + 2 N + AN, mit

Tabelle 1. Stabilitat~konstanten der Actinomycin-Nucleotid- n : n- Komplexe

BPES-Puffer, pH 7,Ol; 25 "C

Nucleotid StabilitBtskonstante E

212

40

30

a 20

10

0

Nucleotid-Komplexe des Actinomycins Eur. J. Biochem.

I I 5 10

CN.IC4

Fig. 1 A. flpektraltitration des Actinomycin C3 mit Nucleotiden. Auftragung nach Gleichung (1). Nucleotide: d(pG-A) (04); d(pG-T) (A-A); d(pC-T-A-G) (x-x);

d(pG-G) (0-0) und d(pC4) (6-4). BPES-Puffer, pH 7,Ol ; 25 "C. Actmomycmkonzentrationen: 2,7 x M bis 3,4 x M. Nucleotidkonzentrationen: 1 x M bis

dGMP (0-0); d(pT-G) (A-A); d(pA-G) (e-e);

1 x 10-3 M; EA * EN Q = ~ - . 108 * A 120

0 10 23 C~AMP lo3

Pig.2. Spektraltitration des Actinomycin C3 mit 2MP (A-A) und d(pB-C) (e-e). Auftragung nac Glei- ohung (1); BPES-Puffer, pH 7,Ol; 25 "C; Actinomycin- konzentration: 2,7 X bis 3,4x M; rAMP-Konzen- tration: 1 x 10-3 bis 2 x M; d(pG-C)-Konzentration: 1 x 10-4 bis 1 x

cd(pG-C) * lo4

M. Fiir d(pG-C):

fur rAMP:

Fur ein solches Gleichgewicht 1iiSt sich eine zur Benesi-Hildebrand-Gleichung analoge Beziehung ab- leiten, die folgende Form hat: I B

I I I I FN * 103

0 5 10

Fig. 1 B. Spektraltitration des Actinomycin C, mit dAMP (A-A) und d ( p T - A ) (e--e). Auftragung nach Glei- chung (1); BPES-Puffer, pH 7,Ol; 25 "C; Actinomycin- konzentration: 2,7 X bis 3.4 x M; Nucleotidkonzen- tration: I x bis 1 x M;

Die in Gl. (2) verwendeten Symbole haben die gleiche Bedeutung wie in G1. (l), allerdings wird die Stabili- tiitskonstante K in diesem Fall in [1/MolI2 erhalten. Eine Auftragung von - EA/A An gegen E N , muate somit fur ein 1 ; 2-Gleichgewichf eine Gerade ergeben, aus deren Steigung und Ordinetenabschnitt A E ~ und K in der gleichen Weise wie fur das 1 : 1-Gleich- gewicht zu ermitteln sind. Beriicksichtigt man je- doch, daI3 die Bildung eines 1 :2-Komplexes, wie er oben diskutiert wird, ein ZweistufenprozeS sein diirfte, der folgendermaBen zu formulieren wiire :

AN+N+,AN, mit

mit

Vo1.29,No.2, 1972 R. SCHARA und W. MULLER 213

0 50 100 c L P a 105

&-C). 108

Fig.3. Spektrdtitration des Actinmycin C, rnit rAMP (A-A) und d(pB-C) (e-e). Auftragung nach Gleichung (2) ; BPES-Puffer; pH 7,Oi ; 25 "C; Actinomycin- konzentration: 2,7 X bis 3,4 x 10-5 M; rAMP-Konzen- tration: 1 x bis 3,5 x 10-2 M; d(pG-C)-Konzentration: 1 x bis 1 x M. Fur d(pG-C):

fur rAMP:

so ist eine lineare Beziehung zwischen . EA/AAA und nur dann zu erwarten, wenn CAN gegeniiber CAN, nicht mel3bar in Erscheinung tritt. Da CK = CAN + CAN, = K , * CA - CN (1 + K,cN) ist, trifft dies nur zu, wenn K , - CN > 1 ist.

I n Fig. 3 sind die entsprechenden Auftragungen fiir die Titration von Actinomycin C, mit rAMP bzw. d(pG-C) wiedergegeben. Die in beiden Fiillen auftretenden linearen Beziehungen lassen sich mit der Bildung von 1 :2-IComplexen der Form AN, ver- einbaren, die wesentlich stabiler als ihre Vorstufen der Form AN sein miil3ten. Die Stabilitiitskonstanten betragen nach dieser Auswertung 9,2 x lo4 [1/Mo1I2 fur den rAMP-Komplex und 1,44x lo7 [1/Mo1I2 fur den d(pG-C)-Komplex.

Wir haben versucht, diese Ergebnisse durch Molekulargewichtsbestimmungen der Komplexe zu sichern. Als einziges Verfahren schien uns hierfur die Auswertung der Sedimentationsgleichgewichte in 15 Eur. J. Biochem., Vo1.29

der analytischen Ultrazentrifuge geeignet, weil es die Ultraviolett-Opt& dieses Gerates gestattet, den Komplex neben der iiberschiissigen Nucleotidkompo- nente zu vermessen. Allerdings war aufgrund der limitierten MeBgenauigkeit und der anzubringenden Korrekturen abzusehen, daB wir nur fiir den Di- nucleotid-Komplex ein klares Ergebnis erwarten durften.

Die Auswertung 1 des Sedimentationsgleichge- wichts zur Molekulargewichtsbestimmung setzt die Kenntnis des partiellen spezifischen Volumens 6 der interessierenden Komponente voraus. Diese GroBe ist fur das Actinomycin C, bekannt [14], fehlt jedoch fur den Komplex. Wir haben deshalb das partielle spezifische Volumen des d(pG-C) in einem Sedimen- tationsgleichgewichtslauf unter Beriicksichtigung der Ionenkorrektur [ 151 ermittelt und aus diesem Wert unter der Annahme der Additivitiit das partielle spezifische Volumen der beiden in Betracht kommen- den Actinomycin-Dinucleotidkomplexe AN und AN, errechnet.

Aus den Scanner-Aufzeichnungen der Sedimenta- tionsgleichgewichtsliiufe wurden die Molekularge- wichte unter Benutzung der partiellen spezifischen Volumina fur einen 1:l- und einen 1:2-Komplex rnit Hilfe folgender Pormel berechnet [15] :

in der Z die Anzahl der Ladungen des im Sedimenta- tionsgleichgewicht stehenden Polyelektrolyten be- deutet. Fur die Bestimmung des partiellen spezifi- schen Volumens von d(pG-C) betriigt Z = 2, ebenso fiir den Actinomycin-d(pG-C)-Komplex ; fiir den Acti- nomycin-d(pG-C),-Komplex betriigt Z = 4. Die Er- gebnisse dieser Auswertungen sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Wie aus den Daten hervorgeht, ist der 1 : 1-Komplex sicher auszuschlie~en; fur den 1 : 2-Komplex ist die obereinstimmung zwischen dem gemessenen Molekulargewicht und dem zu erwar- tenden Wert sehr gut.

Zu unserer Oberraschung ergaben entsprechende Gleichgewichtsliiufe fiir die Actinomycin-Komplexe des sequenzisomeren Dinucleotids d(pC-G) und des Tetranucleotids d(pC-T-A-G) etwa doppelt so hohe Molekulargewichte, wie man fur 1 : I-Komplexe er- warten durfte. Da wir bei diesen Liiufen durch Ver- wendung eines Mehrlochrotors in Kombination rnit einem Multiplexer stets freies Actinomycin zur Kon- trolle sowie das freie Di- bzw. Tetranucleotid zur simultanen Bestimmung der partiellen spezifischen Volumina mitlaufen lassen konnten, sehen wir diese Ergebnisse als besonders zuverlassig an. Kontroll- messungen in schwerem Wasser als Losungsmittel bestiitigten die erhaltenen Daten.

214 Nucleotid-Komplexe des Actinomycins Eur. J. Bioohem.

Tabelle 2. Sedimentatwnagleichgewiehtsmessungen von Desoxyribodi- and tetranucleotid-Actinomycin G,-Komplexen Losungsmittel: BPES-Puffer; Temp.: bei Lauf 1 und 2: 4 "C; bei den iibrigen: 16 "C; Dichte des Losungsmittels bei 4 O C :

1,0094; bei 16 "C: 1,0076; part. spez. Volumen des NaC1: 0,30 1151; Zentrifugationsdauer: 24 Std; Fiillhohe: 4 mm

G - c, Konzentr;rtionen Drehzahl log - (rzZ - rl*) V I Mrgem. Mr ber.

M Ufmin

2,52. 10-5 37020 0.0477 (260 nm) 0,433 680,4

d(PC-G1 2,20. 10-5 30000 0,0284 (260 nm) 0,462 680,4

d(pC-G)-AMC, 3,54 * 10-2 i,8s - 10-5 30000 0,1079 (460 nm) 4016 3 926 0,674

(2:2)

0,543 1 342 d(pC-T-A-G) 1 , ~ - 10-5 26000 0,0239 (260 nm)

d(pC-T-A-G)-AMC, 2,22 - LOW3 i , ~ . 10-5 26000 0,1053 (460 nm) 5271 5250 0,662

(2:2)

Nach diesen Molekulargcwichtswerten mussen bei der Wechselwirkung dieser selbst komplementiiren Oligonucleotide mit dem Actinomycin 2 : 2-Komplexe mit aquivalenten Bindungspunkten entstehen.

DISKUSSION DER ERGEBNISSE Vergleicht man die Stabilitiitskonstanten fur die

Actinomycin-Nucleotid-Koniplexe miteinander, so zeigt sich,

a) daB die Guaninspezifitat bei den Mononucleo- tiden unter unseren MeBbedingungen nicht groBer ist als ungefiihr eine Zehnerpotenz. Dieses Ergebnis stimmt mit den Daten von Behme und Cordes [16] uberein;

b) daB alle guaninhaltigen Desoxydinucleotide d(pX-G), in denen der Guanylrest am 3'-Ende steht, sowie das Tetranucleotid d(pC-T-A-G) mit dem Actinomycin C, 1 : 1- bzw. n : n-Komplexe von an- nahernd gleicher Stabilitadt wie der 5'-d(GMP)- Komplex bilden ; das qualitativ gleiche Verhalten zeigen auch die Actinomycin-Komplexe des 5'- d(AMP) und des d(pT-A) ;

c) da13 die guaninhaltigen Desoxydinucleotide d(pG-A) und d(pG-T) [Typ d(pG-Y)] mit dem Guanyl- rest am 5'-Ende deutlich schwiichere Komplexe bilden und

d) daB das Dinucleotid d(pG-C) mit dem Acti- nomycin C, einen 2:1-Komplex der Form AN, mit deutlich erhohter StabilitCit bildet.

Diese Ergebnisse sind verstiindlich, wenn man zugrunde legt, da13 sich der .4ctinomycinchromophor bei der Bindung an das 5'-d(GMP) nur auf eine Seite der Guaninringebene, und zwar die dem 3'-Ende zugewandte Seite, legen kann (vgl. Fig.4), wie es von Sobell et al. [S] im Actinomycin-Desoxyguanosin- Kristall gefunden wurde. Bei einer solchen Anord- nung wird verstandlich, daB Nucleotide am 5'-Ende

0-CH2

Yo- t v

QO-y-O AM 0 - C H 2 Py -0

Big. 4. Grundsdtzliche Anordnung des Actinamycinchronwphors im Actinomyeinkomplex guaninhaltiger Desoxyoligonucleotide

des Desoxyguanosins keinen EinfluB auf die Acti- nomycin-d(GMP)-Wechselwirkung haben konnen. Steht dagegen auf der 3'-Seite des d(GMP) ein wei- teres Nucleotid, so beeinflufit dies die Wechsel- wirkung deutlich. Im Falle von A und T kommt es zu einer betriichtlichen Senkung der Komplex- stabilitiit, moglicherweise als Polge einer zuvor not- wendigen Aufhebung der Basenwechselwirkung. Steht auf der 3'-Seite dagegen ein Desoxycytidylrest, so kommt es zur Bildung eines 1 :2-Komplexes. Will man diesen Komplex mit den ubrigen Actinomycin- Nucleotid-Komplexen vergleichen, so mu13 man aus Dimensionsgrunden die Wurzel aus der Stabilitiits- konstanten bilden, was zu dem Wert von 3,s x lo3 1/ Mol fiihrt. Dieser liegt deutlich fiber den entspre- chenden Werten der ubrigen Komplexe. Beriicksich- tigt man, da13 die in Fig.3 wiedergegebene lineare Abhangigkeit in Ubereinstimmung mit den Sedi-

Vo1.29, No.2,1972 R. SCHARA und W. MULLER 215

i! III g ni

5' PJPJOH 3'

3 ' H 0 T p T p 5' c @

5' PJPS-,, 3'

G

Fig. 5 . Schematische Darstellung des Actinornycin-[d(pB- C)lZ- Komplexes. Der Actinomycinchromophor ist als schraffierter

Block dargestellt 3' HOfPfPfPfP 5'

mentationsgleichgewichtsdaten den 1 : 1-Komplex ne- ben dem 1:2-Komplex nicht in Erscheinung treten laBt, so kommt man nicht umhin, den zweiten Schritt der Komplexbildung als den entscheidenden anzusehen. Denn nimmt man fur den ersten Teil- schritt eine Stabilitatskonstante Kl von etwa 1031/Mol an, was in der GroBenordnung der Werte fur die ubrigen Actinomycin-d(pG-Y)-Komplexe liegt, so miiBte K , wenigstens i,5x1041/Mol be- tragen. Selbst wenn diese Abschatzungen nur inner- halb einer Zehnerpotenz zutreffen, ist der Wert fur den zweiten Teilschritt noch ungewohnlich hoch. Beriicksichtigt man die Ergebnisse der Rontgen- strukturanalyse fur den Actinomycin-Desoxyguano- sin-Komplex [S], so darf man annehmen, daB sich beim zweiten Teilschritt der Komplexierung zwei GC-Basenpaare bilden, die den Actinomycinchromo- phor wie in einem Intercalationskomplex um- schlieBen (Fig. 5 ) . Die Stabilisierung des Komplexes wiirde dann wahrscheinlich durch eine Kooperativitat zwischen entstehenden H-Briicken, elektronischen und hydrophoben Kraften ahnlich wie bei der Helixbildung aus zwei komplementaren Trinucleoti- den erfolgen. AufschluB uber die thermodynamischen Teilbetrage dieser Wechselwirkungen sollten aus ihrer Temperaturabhangigkeit zu ermitteln sein ; entsprechende Messungen sind vorgesehen. Des- gleichen sol1 die Kinetik dieser Bindungsprozesse studiert werden.

Die Tendenz des Actinomycins, die Bildung doppelhelikaler Segmente zu begunstigen, die sich einmal in der stark bevorzugten Wechselwirkung dieses Antibioticurns mit nativer DNA gegenuber denaturierter, zum anderen in der Stochiometrie seines d(pG-C)-Komplexes BuBert, tritt auch bei seiner Wechselwirkung mit den beiden selbst kom- plementaren Oligonucleotiden d(pC-G) und d(pC-T-A-G) in Erscheinung ; nach den Molekular- gewichtsbestimmungen entstehen hierbei 2 : 2-Kom- plexe. Man darf sicherlich annehmen, dab auch hierbei doppelhelikale Segmente gebildet werden, in denen zwangslaufig Desoxyguanylsiiurereste an den 3'-Enden stehen, und damit identische Bin- dungspunkte fur das Actinomycin abgeben (Fig. 6). Nur so ist erklarlich, daB die Bildung dieser 2:2- 16'

@ A d ci 5' P J-PJPJPJOH 3'

4 6

Fig. 6. Schemtiscfie Darstellung der Actinomycinkomplexe des d(pC-B) und des d(pC-T-A-G) . Die Actinomycin-

chromophore sind als schraffierte Blocke dargestellt

Komplexe bei den Spektraltitrationen nicht in Er- scheinung tritt.

Ob das selbstkomplementiire Dinucleotid d(pT-A) mit dem Actinomycin ebenfalls einen 2 : 2-Komplex bildet, konnten wir bisher nicht priifen, weil die relativ schwache Wechselwirkung sehr hohe uber- schuBkonzentrationen an Dinucleotid zur voll- standigen Komplexierung des Actinomycins erfor- dert, die uns z.Zt. nicht zur Verfiigung stehen.

Interessant erscheint die Frage, warum sich bei den 2 : 2-Komplexen, in denen das Actinomycin end- stiindig fixiert ist (Fig.6), nicht auch hohere Aggregate bilden, indem sich an die gebundenen Actinomycinchromophore weitere Helixsegmente mit 3'-endstandigen Desoxyguanylsaureresten an- lagern. Dies beriihrt zwangsliiufig das Problem, warum sich in Losung keine 2:l-Komplexe des d(GMP) mit dem Actinomycin nachweisen lassen, wie sie im Actinomycin-dG-Kristall vorliegen. Wir miissen hierfiir als Erklarung annehmen, daB die Bindungsplatze fiir das Desoxyguanosin auf den beiden Seiten des Actinomycinchromophors in ihrer Affinitiit stark unterschieden sind. Nach der Ront- genstrukturanalyse wird ein Guaninringsystem an den benzoiden Teil des Chromophors, das zweite dazu rotationssymmetrisch auf der Gegenseite an den chinoiden Teil gebunden. Eine definitive Ent- scheidung dariiber, welcher der beiden Bindungs- punkte das Nucleosid stiirker bindet, laBt sich z.Zt. noch nicht fallen. Eine Reihe von Beobachtungen, die bei der Wechselwirkung des Desoxyguanosins mit Actinomycin-Derivaten und natiirlichen Actinomy- cinen anderer Aminosiiurezusammensetzung gemacht wurden, sprechen dafiir, daB der benzoide Teil des Chromophors das Nucleosid bevorzugt bindet.

Die eingangs gestellte Frage nach der Sequenz- spezifitiit der Actinomycine bei der Bindung an die

216 R. SCHARA und W. MULLER : Nucleotid-Komplexe des Actinomycins Eur. J. Bioehem.

DNA konnen wir nach den vorliegenden Daten dahingehend beantworten, daI3 die Sequenz d(pG-C) das Actinomycin urn einen Faktor 4-5 stiirker bindet als Sequenzen des Typs d(pG-T,A). Demnach konnen wir mit unseren Messungen die von Wells und Larson [7] mit Polydesoxynucleotiden gewonnenen Ergebnisse bestiitigen.

uber den Actinomycin-5'-rAMP-Komplex liil3t sich z.Zt. noch nicht vie1 sagen. Dal3 wir bei der Spektraltitration im Gegensatz zu Behme und Cordes [I61 einen 1 : 2-Komplex fanden, konnte daran liegen, daI3 wir unsere Messungen bei deutlich hoherer Ionenstarke und Nucleotidkonzentration durchgefiihrt haben. Wir mochten uns jedoch auf diese Stochiometrie vor der Anwendung weiterer Methoden nicht festlegen.

Herrn E. Reinholz danken wir fur wertvolle experimen- telle Mitarbeit. Herrn Dr. D. M. Crothers, Yale UniversitLt, New Haven, USA, sowie Herrn Dr. J.FloBdorf, GMBF, Stockheim sind wir fiir die Messungen an der analytischen Ultrazentrifuge zu grol3em Dank verpflichtet.

Diese Arbeit ist im Sonderforschungsbereich 75 fur Molekulare Biologie, Biochemie und Biophysik, Braun- schweig, entstanden.

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R. Schara und W. Muller Gesellschaft fur Molekularbiologische Forschung mbH BRD-3301 StockheimlBraunschweig, Mascheroder Weg 1 Bundesrepublik Deutachland