BAB VITUGAS KHUSUSINSTRUKSI KERJA UJI STERILITAS BERDASARKAN USP 35, BP 2011, SUPLEMEN I FARMAKOPE IV, DAN PETUNJUK OPERASIONAL PENERAPAN CPOB.

6.1 PENDAHULUANSediaan obat dan alat kesehatan seharusnya bersifat steril, bebas dari kuman terutama sediaan obat yang langsung kontak dengan mukosa atau langsung masuk ke aliran darah seperti injeksi, tetes mata, cairan infus, dan salep mata. Demikian juga dengan alat-alat kesehatan seperti kasa dan benang bedah. Standar ini dibuat dengan tujuan agar tidak terjadi infeksi pada pasien yang menggunakan sediaan obat maupun alat kesehatan tersebut akibat kontaminasi bakteri patogen

Produk steril dibuat dengan peralatan khusus dengan tujuan memperkecil risiko pencemaran mikroba, partikulat dan pirogen, yang sangat tergantung dari keterampilan, pelatihan, dan sikap personil yang terlibat. Keadaan steril adalah kondisi mutlak yang tercipta sebagai akibat penghancuran dan penghilangan semua mikroorganisme hidup. Sterilisasi adalah proses yang dirancang untuk menciptakan keadaan steril. Tujuan proses sterilisasi adalah untuk menghancurkan semua mikroorganisme di dalam atau di atas permukaan suatu benda atau sediaan dan menandakan bahwa alat untuk sediaan tersebut bebas dari risiko untuk menyebabkan infeksi.

6.2 DEFINISI UJI STERILITAS Uji sterilitas dilakukan terhadap produk dan bahan yang sebelumnya telah mengalami proses pensterilan yang telah diberlakukan. Hasilnya membuktikan bahwa prosedur sterilisasi dapat diulang secara efektif. Tetapi umumnya disetujui bahwa kontrol yang dilaksanakan selama proses validasi memberikan jaminan telah efektifnya proses sterilisasi. Uji ini dilakukan terhadap sampel yang dipilih untuk mewakili keseluruhan lot bahan tersebut.Sampel bisa diambil dari kemasan atau wadah akhir suatu produk, atau sebagian bagian dari tangki bulk cairan atau dari bahan bulk lainnya.

6.3 LINGKUNGAN UJI STERILITAS 1. Klasifikasi Ruangan Kelas A: Zona untuk kegiatan yang berisiko tinggi, misalnya zona pengisian, wadah tutup karet, ampul, dan vial terbuka, dan penyambungan aseptis. Umumnya kondisi ini dicapai dengan memasang unit aliran udara laminar (laminar air flow) di tempat kerja. Sistem udara laminar hendaklah mengalirkan udara dengan kecepatan 0.36-0.54 m/ detik (nilai acuan) pada kondisi kerja dalam ruang bersih terbuka. Kelas B: Untuk pembuatan dan pengisian secara aseptis, kelas ini adalah lingkungan latar belakang untuk zona kelas A Kelas C & D: Area bersih untuk melakukan tahap proses pembuatan yang mengandung resiko lebih rendah

2. Jumlah Maksimum Partikulat UdaraJumah maksimum partikulat udara yang diperbolehkan untuk tiap kelas kebersihan adalah sebagai berikut:

Untuk tujuan klasifikasi zona Kelas A, perlu diambil sampel udara minimum 1 m3 per lokasi pengambilan sampel. Alat yang digunakan adalah alat penghitung partikel portable dengan selang pendek, karena akan terjadi presipitasi yang tinggi dari partikel >5,0 m apabila menggunakan sistem pengambilan sampel dari jarak jauh yang menggunakan selang yang panjang.

3. Batas MikrobaBatas mikroba yang disarankan untuk ruang bersih selama kegiatan berlangsung

Keterangan:* : nilai rata-rata**: cawan papar dapat dipaparkan kurang dari 4 jam

Pada saat berlangsung kegiatan aseptis, harus sering dilakukan pemantauan, misalnya dengan cawan papar, pengambilan sampel udara secara volumetric, dan pengambilan sampel permukaan (dengan menggunakan cara usap dan cawan kontak).

4. Pemantauan Lingkungan Laboratorium Mikrobiologi dengan Cawan PetriA. Penyiapana. Sterilisasi cawan petriSterilkan cawan petri yang bersih dan kering dalam oven pada suhu 180C selama 1 jam, kemudian simpan di tempat bersihb. Pembuatan Media Pembiakan TSAMedia pembiakan TSA dibuat sesuai dengan prosedur yang tertera di kemasanc. Pembuatan Lempeng Agar1. Bawa cawan petri steril dan media pembiakan steril ke LAF2. Dinginkan media pembiakan sampai 50C dan tuangkan ke cawan petri sebanyak 10-20 mL dan biarkan memadat3. Inkubasi cawan petri pada suhu 35-37C selama 48 jam4. Periksa adanya pertumbuhan mikroorganisme di setiap lempeng agar5. Lempeng yang ada pertumbuhan mikroorganisme harus dibuang6. Beri label untuk identitas lempeng agar dan tanggal pembuatan7. Simpan pada suhu 20-25C atau di lemari esB. Pemantauan Lingkungana. Setiap lempeng agar diberi label pada bagian bawah sebagai berikutTanggal:No. Lempeng Agar:Ruang:b. Masukkan lempeng agar ke dalam wadah plastik atau bagian tahan karat yang seluruhnya sudah di desinfeksi dengan larutan alcohol 70% dan bawa ke ruangan yang akan dipantauc. Petugas yang akan memapar media pembiakan harus berpakaian laboratorium yang bersih, memakai masker, dan sarung tangand. Pemantauan dilakukan dengan alat Air Sampler sebagai berikut:1. Siapkan media TSA daam cawan petri yang akan digunakan2. Siapkan alat Air Sampler sebagai berikut Letakkan alat Air Sampler di lokasi yang akan dilakukan pemantauan Tekan tombol sebelah kiri bawah pada alat selama lebih kurang 3 detik, hingga muncul tampilan menu pada layar Pastikan bahwa tampilan layar telah sesuai dengan volume yang diinginkan (1000 L) Tekan tombol yang menunjukkan start, hingga tampilan layar berubah menunjukkan user confirmation Lepas bagian penutup wadah serta filter dibagian atas sehingga tampak bagian wadah untuk meletakkan cawan petri Letakkan cawan petri, hingga sesuai dengan wadah alat tersebut Buka penutup cawan petri, dan tutup kembali dengan filter Pastikan filter tertutup dengan rapat agar alat dapat bekerja dengan baik Tekan tombol yang menunjukkan start hingga alat mulai bekerja (kurang lebih 10 menit) Pastikan bahwa tidak ada gangguan selama alat bekerja3. Setelah alat digunakan, tekan tombol yang menunjukkan menu kemudian pilih tombol select pada tampilan shut down hingga muncul tampilan information. Setelah itu tekan tombol OK untuk mematikan alat.4. Buka filter, ambil cawan petri, dan tutup kembali cawan petri dengan penutupnya. Sedangkan Air Sampler ditutup kembali seperti semula dengan filter dan penutup bagian atas.5. Beri label data pada cawan petri sesuai lokasi dan tanggal pemantauan ruang6. Inkubasi cawan petri pada 35-37C selama 48 jam, kemudian lanjutkan inkubasi pada 20-25C selama 4 hari7. Hitung jumlah bakteri dan jamur yang tumbuh pada setiap cawan dan catat dalam formulir yang disediakan8. Lakukan pemantauan setiap satu bulan, apabila pemantauan tidak dapat dilaksanakan sesuai jadwal karena kendala tertentu (misalnya: renovasi ruangan, pengecatan ulang, dsbg.), maka pemantauan dilakukan segera setelah kendala tersebut diatasie. Apabila alat Air Sampler tidak tersedia atau tidak berfungsi baik, pemantauan lingkungan dapat dilakukan dengan cara settled plate sebagai berikut:1. Lakukan pemaparan cawan petri selama satu jam di tempat dan lokasi yang telah ditentukan. Letakkan tutup cawan petri di samping media yang berisi media pembiakan.2. Setelah selesai pemaparan, segera cawan ditutup, inkubasi pada 35-37C selama 48 jam,kemudian dilanjutkan inkubasi pada 20-25C selama 4 hari3. Hitung jumlah bakteri dan jamur yang tumbuh pada setiap cawan dan catat pada formulir yang telah disediakanf. Jumlah danlokasi penempatan cawan petri untuk pemantauan lingkungan ditentukan sebagai berikut1. Pemantauan dengan Air Sampler, jumlah titik pemantauan adalah (m2), sedangkan lokasi penempatan disesuaikan dengan tingkat pemakaian ruangan yang paling tinggi2. Pemantauan dengan settled plate untuk ruang dengan kelas 10.000 (Ruang Uji Cemaran), jumlah dan lokasi pemantauan adalah disesuaikan dengan tingkat pemakaian ruangan yang paling tinggi3. Pemantauan dengan settled plate untuk ruangan dengan kelas 100 (LAF, ruang bioclean), jumlah titik pemantauan ditentukan oleh luas area/ square feet.

6.4 MEDIA UJI STERILITAS 1. Brain Heart Infusion BrothFormula:Brain Infusion Solids12.5 gBeef Heart Infusion Solids5.0 gProteose Peptone10.0 gDextrose2.0gSodium Chloride5.0gDisodium Phosphate2.5gpH akhir 7.4 0.2 pada 25CCara Pembuatan: 37 gram dilarutkan dalam 1 liter air suling dan dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk, kemudian disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.2. Media Tioglikolat CairFormula:L-sistin0.5 gNatrium Klorida2.5 gGlukosa5.5 gAgar, granul (kadar air tidak lebih dari 15 %)0.75 gEkstrak ragi (larut dalam air)5.0 gPancreatic digest of casein15.0 gLarutan Na Resazurin (1 dalam 1000), dibuat baru1.0mlAir 1000 mlpH akhir 7,1 + 0,2 CCara Pembuatan : 29.8 gram dilarutkan dalam 1 liter air suling dan dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk, kemudian disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.Tempatkan media dalam tabung yang sesuai yang memberikan perbandingan permukaan dengan ke dalam medium sedemikian rupa hingga tidak lebih dari setengah bagian atas media yang mengalami perubahan warna. Sebagai indikasi masuknya oksigen pada akhir masa inkubasi. Sterilisasi dalam otoklaf. Jika lebih dari sepertiga bagian atas warna merah muda, media dapat diperbaiki satu kali dengan pemanasan di atas tangas air atau dalam uap yang mengalir bebas hingga warna merah memuai. Media siap digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh bagian atas media berwarna merah muda hilang. Media siap digunakan jika tidak lebih dari sepersepuluh bagian atas media berwarna merah. Gunakan media tioglikolat cair untuk inkubasi dalam kondisi aerob.3. Media Tioglikolat Alternatif Formula:L-sistin0.5 gNatrium Klorida2.5 gGlukosa5.5 gEkstrak Ragi 5.0 gPancreatic digest of casein15.0 gNa Tioglikolat, atau 0.5 mlAsam Tioglikolat 0.3 mlair1000 mLpH akhir 7,1+ 0,2 CCara Pembuatan : 29 gram dilarutkan dalam 1 liter air suling dan dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk, kemudian disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.

4. Soybean Casein Digest Medium/ Tripton Soya BrothFormula:Pancreatic digest of casein 17.0 gPapaic digest of soyabean meal 3.0 gGlukosa 2.5 gNatrium Klorida 5.0 gDibasic Potassium Phosphate 2.5 gAir1000 mLpH akhir 7,3 + 0,2 CCara Pembuatan : 30 gram dilarutkan dalam 1 Liter air suling dan dipanaskan sampai mendidih sambil diaduk, kemudian disterilkan dengan otoklaf pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs selama 15 menit.

6.5 Cairan Pelarut dan Pembilas1. Fluid APreparasi:1 g pepton dilarutkan ke dalam 1 liter air. Jika diperlukan atur pH hingga 7,10,2C, masukkan ke dalam wadah, dan sterilisasi dengan metode yang sesuai.2. Fluid DPreparasi:Pada tiap liter fluid A ditambahkan 1 mL polisorbat 80, atur pH hingga 7,10,2C, masukkan ke wadah, dan disterilkan dengan metode yang sesuai. Fluid D digunakan untuk sampel yang mengandung lesitin atau minyak, atau untuk alat yang diberi label sterile pathway3. Fluid K5 g pepton, 3 g beef extract, dan 10 g polisorbat 80 dilarutkan ke dalam 1 Liter air. Atur pH hingga 6,90,2 C, masukkan ke wadah, dan disterilkan dengan metode yang sesuai.

6.6 BAKTERI UJITabel 27. Mikroba Uji yang Digunakan pada Uji SterilitasBakteri Aerob

Staphylococcus aureus1ATTC 6538; CIP 4.38; NCTC 10788; NCIMB 9518; NBRC 13276

Bacillus subtillisATCC 6633; CIP 52.62; NCIMB 8054; NBRC 3134

Pseudomonas aeruginosa2ATCC 9027; NCIMB 8626; CIP 82,118; NBRC 13275

Bakteri Anaerob

Clostridium sporogenes3ATCC 19404; CIP 79.3; NCTC 532 atau ATCC 11437; NBRC 14293

Jamur

Candida albicansATCC 10231; IP 48.72; NCPF 3179; NBRC 1594

Aspergillus nigerATCC 16404; IP 143.83; IMI 149007; NBRC 9455

catatan:1: Alternatif untuk Staphylococcus aureus adalah Bacillus subtillis ATCC 6633 (FI IV)2: Alternatif untuk Pseudomonas aeruginosa adalah Micrococcus luteus (Kocuria rhizophila) ATCC 9341 (USP 35)3: Alternatif Clostridium sporogenes, jika diinginkan mikroba yang bukan pembentuk spora adalah Bacteroides vulgatus ATCC 8482 (USP 35)

6.7 JENIS DAN JUMLAH SAMPEL YANG DIGUNAKAN DALAM PENGUJIANTabel 28. Jumlah Minimum Sampel yang Digunakan untuk Tiap MediumNo.Jumlah per WadahJumlah Minimum yang Digunakan (Jika Tidak Dinyatakan Lain)

Cairan (Selain Antibiotik)

a.Kurang dari 1 mLSeluruh isi tiap wadah

b.1 40 mLSetengah isi tiap wadah, tetapi tidak kurang dari 1 mL

c.Lebih banyak dari 40 mL, tetapi tidak lebih dari 100 mL20 mL

d.Lebih banyak dari 100 mL10 % isi wadah, tetapi tidak kurang 20 mL

Antibiotik (Cairan)1 mL

Sediaan lain yang larut dalam air atau dalam isopropil miristatSeluruh isi tiap wadah sehingga diperoleh tidak kurang dari 200 mg

Sediaan yang tidak larut, krim, dan salep yang disuspensikan atau diemulsikanGunakan isi tiap wadah sehingga diperoleh tidak kurang dari 200 mg

Sediaan Vaksin Ruahan10 mL

Padat

a.Kurang dari 50 mgSeluruh isi tiap wadah

b.50 mg atau lebih, tetapi kurang dari 300 mgSetengah isi tiap wadah, tetapi tidak kurang dari 50 mg

c.300 mg-5 g150 mg

d.Lebih besar dari 5 g500 mg

Alat Kesehatan

a.Tali dan benang bedah lainnya untuk veteriner3 potongan untuk helai (panjang tiap potong 30 cm)

b.Baju operasi/ kapas (dalam paket) [MA PPOMN 2012]100 mg per kemasan

c.Benang bedah dan bahan sejenis yang dikemas tunggal (sekali pakai) [MA PPOMN 2012]Seluruh alat

d.Alat kesehatan lainnya [MA PPOMN 2012]Seluruh alat, potong kecil-kecil atau diuraikan*

Ket *: Jika isi wadah cukup untuk diinokulasikan ke dalam dua media (FTM dan TSB), kolom ini menyatakan jumlah wadah yang diperlukan untuk kedua media Tabel 29. Jumlah Minimum Sampel yang Diuji Sesuai dengan Jumlah Sampel dalam BetsNo.Jumlah Sampel dalam Bets*Jumlah Minimum Bahan yang Diuji untuk Tiap Media(Jika Tidak Dinyatakan Lain)

Sediaan Parenteral

a.Tidak lebih dari 100 wadah10% atau 4 wadah, diambil jumlah yang lebih besar

b.Tidak lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 wadah10 wadah

c.Lebih dari 500 wadah2% atau 20 wadah, diambil jumlah yang lebih kecil

d.Untuk sediaan volume besar2% atau 10 wadah, diambil jumlah yang lebih kecil

Antibiotik Padat

a.Ruahan bahan farmasi dalam kemasan (< 5 g)20 wadah

b.Ruahan bahan farmasi dalam kemasan ( 5 g)6 wadah

c.Ruahan dan CampuranLihat Produk Ruahan Padat

Sediaan Mata dan Sediaan Lain yang Tidak Disuntikkan

a.Tidak lebih dari 200 wadah5% atau 2 wadah, diambil jumlah yang lebih besar

b.Lebih dari 200 wadah20 wadah

c.Jika produk dalam bentuk dosis wadah tunggal, gunakan skema di atas untuk sediaan injeksi

Alat Kesehatan

a.Benang bedah dan alat bedah lainnya untuk hewan2% atau 5 kemasan, diambil jumlah yang lebih besar, sampai total maksimum 20 kemasan

b.Tidak lebih dari 100 bahan10 %atau 4 wadah, diambil jumlah yang lebih besar

c.Lebih dari 100, tetapi tidak lebih dari 500 bahan10 bahan

d.Lebih dari 500 bahan2% atau 20 bahan, diambil jumlah yang lebih kecil

Produk Ruahan Padat

a.Sampai dengan 4 wadahTiap wadah

b.Lebih dari 4 wadah, tetapi tidak lebih dari 50 wadah20 % atau 4 wadah, diambil jumah yang lebih besar

c.Lebih dari 50 wadah20% atau 10 wadah, diambil jumlah yang lebih besar

Keterangan: * : Jika bets tidak diketahui, gunakan jumah maksimum yang tercantum

Tabel 30. Jumlah Sampel yang Diambil untuk Bahan CairIsi wadah (ml)Volume minimum yang diambil dari tiap wadah untuk tiap mediaVolume minimum tiap media digunakan untuk inokulasi langsung volume yang diambil dari tiap wadah (ml)Jumlah wadah per media

Kurang dari 101 ml, atau seluruh isi jika kurang dari 1 ml1520 (40 jika volume tiap wadah tidak cukup untuk kedua media)

10 sampai kurang dari 505 ml4020

50 sampai kurang dari 10010 ml8020

50 sampai kurang dari 100 dimaksukan untuk pemberian intravenaSeluruh isi-10

100 sampai 500Seluruh isi-10

Di atas 500500 ml-10

6.8 PROSEDUR PENGUJIAN1. Uji Pendahuluan Mikroba Uji dibiakkan dalam media BHIB MikrobaWaktu Inkubasi

Bacillus subtilis ATCC 663324 jam

Clostridium sporogenes ATCC 19404

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Candida albicans ATCC 1023172 jam

Aspergillus niger ATCC 16404

Uji angka lempeng total dilakukan pada biakan mikroba uji. Hasil uji pendahuluan digunakan untuk menentukan konsentrasi mikroba uji pada uji fertilitas media2. Uji Pertumbuhan bakteri aerob, bakteri anaerob, dan fungi/ Uji Fertilitas Media Buat pengenceran biakan bakteri dan jamur dari galur mikroba seperti pada uji sterilitas Enam tabung berisi 15 mL FTM dan enam tabung berisi 15 mL TSB disiapkan. Inokulasikan sejumlah kecil mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU) ke dalam media yang ditentukan. Masing-masing ke dalam 2 tabung media.MediaMikroorganismeLama Inkubasi

Fluid Thioglycolate MediumClostridium sporogenesPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusTidak lebih dari 3 hari

Soya-Bean Casein Digest MediumAspergillus brasiliensisBacillus subtillisCandida albicansTidak lebih dari 5 hari

Uji ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas media Media memenuhi syarat jika pada setiap media yang diinokulasi terdapat pertumbuhan mikroorganisme.

3. Metode Uji Kesesuaian Uji kesesuaian dilakukan jika : Uji sterilitas dilakukan pada produk yang baru Terdapat perubahan pada kondisi pengujian

Metode Uji Kesesuaian Filtrasi membranSetelah melakukan penyaringan terhadap produk yang diuji, tambahkan sejumlah mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU) pada cairan pembilas filter. Inkubasikan selama 5 hari. Inokulasi langsungSetelah menginokulasikan produk yang diuji ke dalam media, tambahkan sejumlah mikroorganisme (tidak lebih dari 100 CFU) pada cairan pembilas filter. Inkubasikan selama 5 hari.

Mikroba yang ditambahkan sama dengan mikroba yang digunakan untuk uji pertumbuhan pada media. Jika terdapat pertumbuhan mikroorganisme setelah inkubasi, maka dinyatakan bahwa produk tidak memiliki aktivitas antimikroba sehingga pengujian dapat dilanjutkan tanpa modifikasi lebih lanjut.Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroorganisme setelah inkubasi, maka dinyatakan bahwa produk memiliki aktivitas antimikroba sehingga diperlukan modifikasi pada pengujian untuk mengeliminasi aktivitas antimikroba.Setelah dilakukan modifikasi dilakukan pengujian kesesuaian kembali.

4. Uji Sterilitas MediaMasing-masing satu tabung berisi media 15 mL FTM dan 15 mL TSB dari bets yang sama diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama dengan media yang digunakan pada uji sterilitas

5. Cara PengujianMETODA INOKULASI LANGSUNGPrepasrasi Sampel Cairana. Pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik sterilb. Secara aseptis, inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media Cairan yang mengandung minyakGunakan media yang sudah ditambahkan pengemulsi pada konsentrasi yang sesuai saat dilakukan uji kesesuaian, contoh: Tween 80 pada konsentrasi 10 g/L Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropil miristata. Pilih 20 wadah yang mewakili, dibagi atas 2 kelompok terdiri dari 10 wadah, dan perlakukan tiap kelompok sebagai berikutb. Secara aseptik pindahkan 100 mg dari tiap wadah dari 10 wadah ke dalam labu berisi 100 mL pembawa air steril (BP 2012: larutan netral pepton) yang dapat mendispersi homogen bahan uji dalam seluruh campuran cairanc. Campur 10 mL alikuot dari campuran cairan yang diperoleh dengan 80 ml tiap media yang tidak mengandung pengemulsi. Zat padata. Ambil sejumlah tertentu produk dalam bentuk pada kering (atau yang terlebih dahulu dibuat larutan atau suspensi dalam cairan pengencer steril) sesuai dengan tidak kurang 300 mg tiap wadah atau seluruh isi wadah jika tiap isi kurang dari 300 mgb. Inokulasikan ke dalam masing-masing tidak kurang dari 40 mL media tioglikolat cair dan soybean-casein digest medium Kapas murni perban, pembalut, benang bedah dan bahan sejenisnyaa. Dari setiap kemasan kapas, perban gulung, atau pembalut perban yang diuji diambil secara aseptis dua bagian atau lebih masing-masing 100 sampai 500 mg dari bagian paling dalamb. Dari individu contoh bentuk kemasan tunggal seperti bantalan perban, ambil secara aseptis sejumlah 250 mg sampai 500 mg atau keseluruhan contoh bila ukurannya kecil, seperti pembalut serap berperekat 25 mm x 75 mm atau lebih kecil atau benang bedahc. Secara aseptis pindahkan bagian bahan uji ini ke dalam sejumlah tertentu wadah media yang sesuai dan inkubasi Catgut dan benang bedah lainnya untuk veterinera. Segel kemasan dibuka secara aseptik dan keluaarkan 3 bagian dari 1 helai untuk tiap media.b. Pengujian dilakukan pada 3 bagian, masing-masing sepanjang 30 cm, potong dari bagian awal, tengah, dan akhir (seluruh helai yang digunakan berasal dari kemasan yang baru dibuka)c. Tiap bagian dipindahkan pada media yang digunakan, jumlah medium harus dapat menutupi semua bagian sampel (20-150 mL) Alat kesehatan sterila. Untuk alat yang bentuk dan ukurannya memungkinkan dicelupkan keseluruhan ke dalam tidak lebih dari 1000 ml media, uji alat utuh menggunakan media yang sesuai dan diinkubasib. Untuk alat yang mempunyai pipa/ saluran berlubang seperti alat transfusi atau infus atau yang ukurannya menyebabkan pencelupan tidak dapat dilakukan dan hanya saluran cairannya yang harus steril, bilas lumen masing-masing dari 20 unit dengan sejumlah secukupnya media tioglikolat cair dan soybean-casein digest medium hingga diperoleh kembali tidak kurang dari 15 mL tiap media, dan diinkubasi dengan tidak dari 100 mL masing-masing media. Untuk alat dengan lumen yang sangat kecil sehingga media tioglikolat cair tidak mengalir, gunakan media tioglikolat alternatif, tetapi inkubasi dilakukan secara anaerobc. Jika karena ukuran dan bentuk alat tidak dapat diuji dengan cara pencelupan keseluruhannya ke dalam tidak lebih dari 1000 mL media, uji bagian alat yang paling sulit disterilisasi, dan jika mungkin lepaskan 2 atau lebih bagian yang paling dalam dari alat. Secara aseptik pindahkan bagian tersebut ke dalam sejumlah tabung berisi tidak kurang dari 1000 mL media yang sesuai dan inkubasi

Alat suntik kosong atau terisi sterila. Cara inokulasi langsung dapat digunakan jika penetapan bakteriostatik dan fungistatik telah menunjukkan aktivitas yang tidak merugikan dalam kondisi pengujian. b. Untuk alat suntik terisi yang dilengkapi jarum steril, keluarkan isi produk melalui lumen. c. Untuk alat suntik yang dikemas dengan jarum terpisah secara aseptik pasang jarum dan pindahkan produk kedalam media yang sesuai. d. Untuk alat suntik kosong steril, masukkan media atau pengencer steril ke dalam alat suntik melalui jarum yang disertakan, atau jika tidak disertakan melalui jarum steril yang dipasang untuk tujuan pengujian dan pindahkan isi dengan cepat ke media yang sesuaiProsedur Kerja:1) Pengujian dilakukan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya telah disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan desinfektan yang sesuai dan hidupkan kira-kira selama 1 jam2) Sejumlah sampel disiapkan (penentuan jumlah sampel disesuaikan dengan jenis sampel, Lampiran ?3) Wadah sampel disucihamakan dengan etanol 70%4) Disiapkan wadah yang berisi media FTM dan wadah yang berisi media TSB dengan volume yang sesuai (volume sampel tidak boleh lebih dari 10% volume media, jumlah wadah disesuaikan dengan jumlah sampel)5) Sejumlah tertentu sampel diinokulasikan masing-masing ke dalam media FTM dan TSB menggunakan pipet Komagome (jumlah minimum sampel yang dapat diinokulasikan dapat dilihat pada Tabel 2)6) Inkubasikan media FTM pada suhu 32,52,5C dan media TSB pada suhu 22,52,5C selama 14 hari. Buat kontrol negatif untuk masing-masing media.7) Amati pertumbuhan pada media visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke-3 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari terakhir dari masa uji. Goyang-goyangkan wadah pengujian perlahan setiap hari. Jika FTM digunakan untuk mendeteksi mikroba anaerob, maka wadah digoyang harus seminimal mungkin untuk mempertahankan kondisi anaerobnya.8) Jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak segera dapat ditentukan secara visual, pindahkan sejumlah memadai media ke dalam tabung baru berisi media yang sama, sekurangnya satu kali antara hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai. Lanjutkan inkubasi media awal dan media baru selama total waktu tidak kurang dari 14 hari sejak inokulasi awal (FI IV, 1995)9) Pada akhir periode inkubasi, disiapkan media FTM dan TSB yang baru, diinokulasikan dengan tidak kurang dari 1 mL suspensi dari tiap tabung yang telah diinkubasi selama 14 hari. Semua tabung termasuk tabung awal diinkubasi selama tidak kurang dari 4 hari dan diamati ada tidaknya kekeruhan (MA PPOMN, 2012).

METODA PENYARINGAN MEMBRANMetoda ini dilakukan untuk:1. Sediaan yang mengandung air dan dapat disaring2. Sediaan yang beralkohol atau berminyak3. Sediaan yang dapat dicampur dengan pelarut yang larut dalam air atau minyak (pelarut tidak mempunyai efek antimikroba pada kondisi pengujian)

Peralatan Khusus Membran dengan porositas tidak lebih dari 0.45 m dengan ukuran diameter membran 50 mm. Peralatan penyaringan membran dan membran disterilkan terlebih dahulu dengan cara yang sesuai.Preparasi Sampel Larutan aquaeusa. Lewatkan larutan sampel sesuai dengan jumlah minimal yang disyaratkan ke membran penyaring, bila perlu tambahkan pengencer steril yang sesuai sampai jumlah tertentub. Untuk sampel yang mempunyai aktivitas antimikroba, cuci membran tidak kurang dari 3 kali dengan pelarut steril yang sesuai atau yang digunakan pada uji kesesuaian metode dengan cara menyaring pelarut tersebut. Pencucian tidak boleh lebih dari 5 kali dan tiap kali pencucian dilewatkan 100 ml pelarut (Farmakope Indonesia = 200 ml pelarut)c. Pindahkan membran ke medium atau membran dapat dipotong secara aseptik menjadi 2 bagian lalu masukkan masing-masingnya ke medium Padatan yang laruta. Sejumlah sampel yang jumlahnya sesuai dengan persyaratan dilarutkan dalam pelarut yang sesuai seperti WFI, salin atau larutan netral dari meat atau casein pepton 1 g/Lb. Lakukan tahapan yang sama dengan tahapan pada pengujian larutan aquaeus Minyak dan larutan mengandung minyaka. Gunakan sampel dengan jumlah sesuai dengan persyaratanb. Minyak yang kental dapat diencerkan dengan pelarut steril yang sesuai seperti isopropil miristat yang tidak memiliki aktivitas antimikroba pada kondisi pengujianc. Biarkan minyak untuk berpenetrasi melalui membran lalu saring, dapat dengan menggunakan tekanan atau penghisapan secara bertahapd. Cuci membran setidaknya 3 kali dengan cara menyaringnya melalui membran sebanyak 100 ml tiap kalinya dengan pelarut steril seperti larutan netral dari daging atau casein pepton 1 g/L yang mengandung pengemulsi seperti polysorbat 80 10 g/L.e. Pindahkan membran ke medium atau membran dapat dipotong secara aseptik menjadi 2 bagian lalu masukkan masing-masingnya ke medium Salep dan krima. Gunakan sampel dengan jumlah sesuai dengan persyaratan b. Salep yang berbasis lemak dan krim tipe air dalam minyak dapat diencerkan menjadi 1% dalam isopropil miristat, jika perlu dapat dipanaskan dengan suhu pemanasan tidak lebih dari 400Cc. Cuci membran setidaknya 3 kali dengan cara menyaringnya melalui membran sebanyak 100 ml tiap kalinya dengan pelarut steril seperti larutan netral dari meat atau casein pepton 1 g/L yang mengandung pengemulsi seperti polysorbat 80 pada konsentrasi 10 g/L.d. Pindahkan membran ke medium atau membran dapat dipotong secara aseptik menjadi 2 bagian lalu masukkan masing-masingnya ke medium Alat suntik terisia. Keluarkan isi dari tiap alat suntik. Untuk alat tak berjarum steril saring terlebih dahulu menggunakan membran.b. Saring sejumlah sampel menggunakan satu atau beberapa membran sesuai ketentuan jenis dan jumlah sampel, bila perlu tambahkan pengencer steril yang sesuai sampai jumlah tertentu.c. Jika produk mempunyai daya antimikroba, cuci membran minimal 3 kali dimana setiap pencucian tidak lebih dari 5 kali 100 mL.d. Masukkan seluruh membran utuh ke dalam media atau potong membran secara aseptis menjadi dua bagian yang sama dan masukkan masing-masing bagian ke dalam dua media yang sesuai. Zat padat untuk injeksi selain antibiotika. Konstitusikan bahan sesuai petunjuk yang ada di etiket.b. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air atau Minyak dan Larutan Minyak Zat padat antibiotik untuk injeksiRuahan farmasi yang dikemas < 5 ga. Ambil secara aseptis zat sampel masing-masing sebanyak 300 mg dari 20 wadah atau konstitusikan terlebih dahulu sesuai petunjuk etiket, lalu ambil larutan atau suspensi yang setara dengan 300 mg bentuk padatnya.b. Masukkan ke Erlenmeyer 500 mL, dan larutkan dalam 200 mL cairan A.c. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air atau Minyak dan Larutan Minyak.

Ruahan farmasi yang dikemas 5 ga. Ambil secara aseptis zat sampel masing-masing 1 g dari 6 wadah atau konstitusikan terlebih dahulu sesuai petunjuk pada etiket terlebih dahulu, lalu ambil larutan atau suspensi yang setara 1 g zat padat.b. Masukkan ke Erlenmeyer 500 mL, dan larutkan dalam 200 mL cairan A.c. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air. Antibiotik padat ruahan , dan campurana. Ambil sampel uji secara aseptis sesuai ketentuan jenis dan jumlah sampel.b. Campur hingga diperoleh campuran yang setara dengan 6 g sampel uji.c. Masukkan ke Erlenmeyer 500 mL steril, kemudian larutkan dengan 200 mL cairan A.d. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air. Produk aerosol sterila. Untuk produk cair bertekanan, bekukan wadah dalam campuran etanol - es kering pada suhu tidak kurang -20C selama 1 jam.b. Jika memungkinkan biarkan propelan menguap sebelum wadah dibuka secara aseptis, masukkan isinya ke dalam wadah pengumpul steril.c. Tambahkan 100 mL cairan D, campur perlahan. d. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air atau Minyak dan Larutan Minyak. Alkes dengan lumen beretiket sterila. Secara aseptis, alirkan cairan D sejumlah tidak kurang dari 10 kali volume lumen alat yang akan diuji.b. Untuk alat suntik steril kosong, ambil pengencer steril melalui jarum steril (dengan jarum yang sudah terpasang atau dipasangkan secara khusus).c. Kumpulkan cairan ke dalam wadah steril yang sesuai.d. Lakukan pengujian seperti pada petunjuk untuk Larutan Air atau Minyak dan Larutan Minyak.

Prosedur Kerja:a. Sistem Terbuka1) Pengujian dilakukan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya telah disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan desinfektan yang sesuai dan hidupkan kira-kira selama 1 jam2) Sebanyak 20 sampel disiapkan (penentuan jumlah sampel dapat dilihat pada lampiran 2 pada sediaan antibiotik padat)3) Wadah sampel disucihamakan dengan etanol 70 %4) Buka tutup kemasan sampel, larutkan dengan akuades steril (volume disesuikan dengan etiket)5) Pipet sejumlah larutan setara dengan lebih kurang 300 mg zat (penentuan jumlah minimum dilihat pada lampiran 1) dan dimasukkan ke dalam lebih kurang 200 mL Fluid A6) Sampel yang lain dilarutkan dengan cara yang sama dan dimasukkan ke dalam Fluid A yang sama7) Seperangkat alat penyaring disiapkan dan dihubungkan dengan pompa vakum8) Ke dalam perangkat penyaring dituang secara bertahap sebanyak setengah bagian volume sampel yang telah dikumpulkan dan disaring dengan bantuan pompa vakum9) Selesai penyaringan dibilas 3 kali, masing-masing dengan 100 mL Fluid A10) Secara aseptik membran dikeluarkan dari perangkat penyaring menggunakan pinset steril, dimasukkan ke dalam 100 mL FTM dan diinkubasi pada 32,5 2,5C selama 14 hari11) Prosedur yang sama juga dilakukan terhadap setengah bagian volume yang tersisa, tetapi membran filter dimasukkan secara aseptik ke dalam 100 mL TSB dan diinkubasikan pada 22,5 2,5C selama 14 hari12) Lakukan pengamatan ada tidaknya kekeruhan

b. Sistem Tertutup1) Pengujian dilakukan dalam Laminar Air Flow yang sebelumnya telah disucihamakan dengan etanol 70% atau larutan desinfektan yang sesuai dan hidupkan kira-kira selama 1 jam2) Sebanyak 20 sampel disiapkan (penentuan jumlah sampel dapat dilihat pada lampiran 2 pada sediaan antibiotik padat)3) Wadah sampel disucihamakan dengan etanol 70 %4) Buka tutup kemasan sampel, larutkan dengan akuades steril (volume disesuikan dengan etiket)5) Pipet sejumlah larutan setara dengan lebih kurang 300 mg zat (penentuan jumlah minimum dilihat pada lampiran 1) dan dimasukkan ke dalam lebih kurang 200 ml Fluid A6) Sampel yang lain dilarutkan dengan cara yang sama dan dimasukkan ke dalam Fluid A yang sama7) Seperangkat steriltest dan canister disiapkan dan dihubungkan dengan pompa peristaltik8) Jarum canister dimasukkan ke wadah yang berisi sampel9) Larutan disaring dengan bantuan pompa peristaltik sehingga mengalir ke dalam 2 buah canister dan ditampung ke dalam wadah pembuangan10) Selesai penyaringan dibilas 3 kali, masing-masing dengan 100 mL fluid A11) Sebanyak 100 mL FTM dan 100 mL TSB dialirkan ke dalam canister dengan bantuan pola peristaltik hingga habis12) Canister diangkat dari pompa peristaltik, kemudian potong kedua selang, kemudian tutupkan selang pada lubang rongga canister13) Media FTM diinkubasikan pada 32,52,5C dan media TSB pada 22,52,5C selama 14 hari14) Lakukan pengamatan ada tidaknya kekeruhan

6.9 INTERPRETASI HASIL FI IV, 1995; USP 351. Tahap pertama Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, amati isi semua wadah akan adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan/ atau pertumbuhan pada permukaan. Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, tetapi peninjauan dalam pemantauan fasilitas pengujian sterilitas, bahan yang digunakan, prosedur pengujian dan kontrol negatif menunjukkan tidak memadai atau teknik aseptik yang salah digunakan dalam pengujian, tahap pertama dinyatakan tidak absah dan dapat diulang. Jika pertumbuhan mikroba teramati tetapi tidak teruji uji tahap pertama tidak absah, lakukan tahap kedua.

2. Tahap kedua Jumlah spesimen uji yang diseleksi minimum dua kali jumlah tahap pertama. Volume minimum tiap spesimen yang diuji dan media dan periode inkubasi sama seperti yang tertera pada tahap pertama. Jika tidak ditemukan pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan, hasil yang diperoleh membuktikan bahwa bahan uji tidak memenuhi syarat. Jika dapat dibuktikan bahwa uji pada tahap kedua tidak absah karena kesalahan atau teknik aseptik tidak memadai, maka tahap kedua dapat diulang

BP 2012 Jika produk yang digunakan menyebabkan kekeruhan dengan media sehingga pertumbuhan mikroba tidak dapat diamati secara visual, maka diambil 1 mL dari media dan dipindahkan ke media baru dan diinkubasi selama 4 hari Jika tidak ada pertumbuhan mikroba, maka produk tersebut memenuhi syarat uji sterilitas. Pengujian tidak valid jika: Data monitoring uji sterilitas menunjukkan kesalahan Peninjauan ulang terhadap prosedur menunjukkan adanya kesalahan Ditemukan pertumbuhan mikroba pada kontrol negatif Setelah menetapkan identitas mikroorganisme yang diisolasi dari pengujian, pertumbuhan miroba tersebut menunjukkan adanya kesalahan pada bahan atau teknik yang digunakan selama pengujian sterilitas Jika pengujian tidak valid, maka dilakukan pengulangan dengan jumlah yang sama sesuai dengan uji sebelumya Jika tidak ada bukti pertumbuhan mikroba pada uji ulang, maka produk tersebut memenuhi syarat uji sterilitas Jika pertumbuhan mikroba ditemukan pada pengujian ulang, maka produk tersebut tidak memenuhi syarat uji sterilitas

6.10 PERSYARATANSemua produk steril harus steril

6.11 HASIL VALIDASI Pada kelompok sampel negatif tidak menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba Pada kelompok kontrol positif dan sampel positif menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba74