ÇUKUR OVA Ü NĐVERSĐTES ĐLĐMLER Đ ENST ĐTÜSÜ YÜKSEK … · Çukur ova Ü nĐversĐtes Đ fen b ĐlĐmler Đ enst ĐtÜsÜ yÜksek lĐsans te zĐ esen bĐlg Đn toprak bakter

ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ

FEN BĐLĐMLER Đ ENSTĐTÜSÜ

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ

Esen BĐLGĐN

TOPRAK BAKTER ĐLERĐNDEN ĐZOLE EDĐLEN FĐTAZLARIN ÖZELL ĐKLER Đ

BĐYOLOJ Đ ANABĐLĐM DALI

ADANA, 2007



TOPRAK BAKTE RĐLERĐNDEN ĐZOLE EDĐLEN FĐTAZLARIN ÖZELL ĐKLER Đ

Esen BĐLGĐN

YÜKSEK L ĐSANS


Bu tez …./…./2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirli ği/Oyçokluğu Đle Kabul Edilmi ştir.

Đmza ……………………. Prof. Dr. Sadık DĐNÇER DANIŞMAN

Đmza…………………. Doç Dr. Hatice GÜVENMEZ Üye

Đmza……………… Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR Üye

Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır.

Kod No:

Prof. Dr. Aziz ERTUNÇEnstitü Müdürü Đmza-Mühür

Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi ta rafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2006YL7

Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir

ÖZ

YÜKSEK L ĐSANS TEZĐ

TOPRAK BAKTE RĐLERĐNDEN ĐZOLE EDĐLENFĐTAZLARIN ÖZELL ĐKLER Đ

Esen BĐLGĐN




Danışman : Prof. Dr. Sadık DĐNÇER

Yıl : 2007 Sayfa: 62

Jüri : Prof. Dr. Sadık DĐNÇER

Doç. Dr. Hatice GÜVENMEZ

Yrd. Doç. Dr. Fatih MATYAR

Toprak izolatlarındaki fitaz aktivitesinin belirlenmesi amacıyla yapılan bu

çalışmada; Çukurova Üniversitesi kampüsü topraklarından Bacillus cinsine ait

organizmalar izole edilmiştir. Bu bakterilerin fitaz üretimi, fitatli besiyerinde

37ºC‘de 24 saatlik inkübasyon sonucu mikroorganizmaların etrafında oluşan şeffaf

zonlarla saptanmıştır.Bacillus sp. 6’dan izole edilen enzim en iyi aktivite gösterdiği

için bu suş diğer çalışmalarda kullanılmıştır.

Üretilen enzimlerin kısmi saflaştırılması yapıldıktan sonra, enzim

örneklerinin belirli sıcaklık ve pH değerlerindeki aktiviteleri saptanmıştır.Deney

sonucunda Bacillus sp. 6’dan izole edilen fitazın 65ºC’de pH 6’da maksimum

aktiviteye sahip olduğu saptanmıştır.

SDS-PAGE uygulamasıdan sonra ilk bandı 53 kda ve ikinci bandı 60 kda

olan iki farklı moleküler ağirlığa sahip bant bulunmuştur.

Anahtar Kelimeler: Bacillus sp., Fitaz, Fitik Asit

I

ABSTRACT

M.Sc. THESIS

CHARAC TERIZATION OF PHYTAS ES ISOLAT EDFROM SOIL BACTERIA

Esen BĐLGĐN

DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUE OF NA TURAL A PPLIED

SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA

Supervisor : Prof. Dr. Sadık DĐNÇER

Year : 2007 Pages: 62

Jury : Prof. Dr. Sadık DĐNÇER

Assoc. Prof. Dr. Hatice GÜVENMEZ

Assist. Prof. Dr. Fatih MATYAR

In this study, to determine phytse activity in soil isolates, the organisms

belong to Bacillus spp. were isolated from Çukurova University campus. Phytase

production of these strains were determined by production of clear zones around the

colonies on the phytate containing media, after 24 hours incubation at 37ºC.The

organisms called Bacillus sp.6 showed the best activity, so choosed for other studies.

After portial purification of enzymes, phytase activities were determined at

different temperature and pH values. Consequently the highest phytase activity of

Bacillus sp.6 was obtained at 65ºC and pH 6.

After SDS-PAGE, two bands with different molecular weights were seen.It

was found that, the first one was 53 kda and the second band was 60 kda.

Keywords: Bacillus sp., Phytase, Phytic acid

II

TEŞEKKÜR

Çalışmalarım sırasında ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, beni her konuda

destekleyen danışman hocam Prof. Dr. Sadık Dinçer’e teşekkür ederim.

Deney aşamasında değerli bilgi ve yardımlarını esirgemeyen Doç.Dr. Hatice

Korkmaz Güvenmez’e, çalışmalarım sırasında yardımlarını gördüğüm Prof. Dr.

Ömer Çolak’a, Prof. Dr. Burhan Arıkan’a, Arş. Gör. Ashabil Aygan’a, Araş. Gör.

Gülcihan Güzeldağ’a, Araş. Gör. Ayşenur Kaya’ya, Araş. Gör. Osman Gülnaz’a ve

çok sevdiğim arkadaşlarım Uzman Biyolog Emel Karadeniz ve Yasemin Uçak’a

teşekkür ederim.

Beni maddi ve manevi her konuda destekleyen canım ablama ve son olarak

bugünlere gelmemi sağlayan sevgili anne ve babama teşekkürü bir borç bilirim.

III

ĐÇĐNDEKĐLER SAYFA

ÖZ.…………………………………………………………………………………….I

ABSTRACT………………………………………………………………………….II

TEŞEKKÜR…………………………………………………………………………III

ĐÇĐNDEKĐLER…………………………………………………………………..….IV

ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ…………………………………………………………......VII

ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ………………………………………………………………..VIII

1. GĐRĐŞ………………………………………………………………………………1

1.1. Fitatların Tarihçesi……………………………………………….………….…2

1.2. Fitatların Fizyolojik Fonksiyonları………………………………………….…3

1.3. Fitik Asidin Antinutritive Etkisi…………………………………………….…3

1.4. Enzimler……………………………………………………………………..…3

1.4.1. Enzimlerin Sınıflandırılması…………………………………………….…4

1.5. Fitaz Enzimi……………………………………………………………………5

1.5.1. Mikrobiyal Kaynaklar……………………………………...………………7

1.5.2. Bitkisel Kaynaklar…………………………………………………………8

1.5.3. Hayvansal Kaynaklar………………………………………………………8

1.6. Fitazların Kullanım Alanları…………………………………...………………9

1.6.1. Yem Uygulaması………………………………………………………..…9

1.6.2. Gıda Uygulaması………………………………………………………..…9

1.6.3. Myo-Đnositol Fosfatların Hazırlanması………………………..............…10

1.6.4. Kağıt Hamuru ve Kağıt Endüstrisi…………………………………….…10

1.7. Bacillus Cinsi…………………………………………………………………11

1.7.1. Hücre Morfolojisi…………………………………………………………11

1.7.2. Hücre Duvarının Yapısı…………………………………..………………12

1.7.3. Kapsül Yapısı…………………………………………….…………….…12

1.7.4. Kamçı…………………………………………………………………..…12

1.7.5. Sporlar………………………………………………………………….…12

1.7.6. Hücre Duvarı………………………………………………...……………12

1.7.7. Koloni Karakterleri…………………………………….…………………13

IV

1.8. Çalışmanın Amaçları………………………………………………………....13

2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR…………………………………………..……………15

3. MATERYAL VE METOD……………………………………………………….18

3.1. Materyal………………………………………………………………………18

3.1.1. Kullanılan Besiyerleri…………………………………………………….18

3.1.1.1. Fitatlı Besiyeri………….…………………………………………….18

3.1.1.2. Enzim Üretim Ortamı………………………………………………...19

3.1.1.3. Buğday Unu Ekstraktı………………………………………………..19

3.1.1.4. Buğday Unu- Pepton Agar……………………………………………19

3.1.1.5. LB Broth……………………………………………………………...19

3.1.2. Enzim Aktivitesi Đçin Kullanılan Çözeltiler………………………….…..20

3.1.2.1. 6 N Hidroklorikasit…………………………………….……………..20

3.1.2.2. %2.5 Amonyum Molibdat……………………………………………20

3.1.2.3. %10 Askorbik Asit………………………………………..………….20

3.1.3. Substratın Hazırlanışı………………………………………………….….20

3.1.3.1. 0,1 M TRĐS-HCl……………………………………………………...20

3.1.3.2. 2Mm Na-Fitat…………………………………………………………21

3.1.3.3. 2mM CaCl2(2H2O) …………………………………………………...21

3.1.4. Durdurucu Çözelti………………………………………...………………21

3.1.5. SDS-PAGE Stok Solüsyonları……………………………………………21

3.1.5.1. 2M Tris HCl………………………………………...………………...21

3.1.5.2. 1M Tris-HCl…………………………………………….…………….21

3.1.5.3. %10 SDS………………………………………………………….…..21

3.1.5.4. %50 Gliserol…………………………………………….……………22

3.1.5.5. %1 Bromfenol Mavisi………………………………………………..22

3.1.6. SDS-PAGE Çalışma Solüsyonları……………………………….…….…22

3.1.6.1. Akrilamid Monomer Solüsyonu (Solüsyon A)…………………..…...22

3.1.6.2. 4X Seperating (Ayırma) Jel Tamponu (Solüsyon B)…………………22

3.1.6.3. 4X Stacking (Dengeleme) Jel Tamponu (Solüsyon C)….……………22

3.1.6.4. %10’luk Amonyum Persülfat……………………………...............…22

3.1.6.5. Yürütme Tamponu (pH: 8.3)…………………………………………23

V

3.1.6.6. Örnek Hazırlama Tamponu (5X)………………………..……………23

3.1.6.7. Ayırma (Seperating) Jeli (%10’luk)………………………………..…23

3.1.6.8. Dengeleyici (Stacking) Jelin Bileşenleri…………………...............…23

3.1.6.9. Coomasi Brillant Blue Boyası (CBB) Stok Solüsyonu (1L)…………23

3.1.6.10. Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu (1 L)…………………...24

3.1.7. pH Aktivitesi Đçin Kullanılan Tamponlar……………………...............…24

3.1.7.1. Formik Asit-Sodyum Format Tamponu……………………………24

3.1.7.2. Sitrik Asit-Sodyum Sitrat Tamponu………………………………24

3.1.7.3. Tris-HCl Tamponu……………………………………………………25

3.1.7.4. Glisin-NaOH Tamponu……………………………….………………25

3.2. Metod…………………………………………………………………………27

3.2.1. Bacillus’ların Đzolasyonu…………………………………………………27

3.2.2. Fitaz Pozitif Bakterilerin Đzolasyonu…………………………………......27

3.2.3. Fitaz Eldesi…………………………………………….………………….27

3.2.4. Fitazın Saflaştırılması………..……………………………………...……28

3.2.5. Kalibrasyon Eğrisinin Hazırlanması…………………………………...…28

3.2.6. Fitaz Aktivitesinin Tespiti…………………………………………....…..28

3.2.7. Fitazın pH Aktivitesinin Ölçümü ………….…………………….………29

3.2.8. Fitazın Moleküler Ağırlığının Belirlenmesi………...………………....…29

4. BULGULAR……………………………………………………………….....…..30

4.1. Bacillus sp. ile Yapılan Enzim Đzolasyonuna Ait Bulgular…………....…...30

4.2. Fitaz Aktivitesine Ait Bulgular……………………………………….….…33

4.3. Enzimin Sıcaklık Aktiviteleri……………………………………………....33

4.4. Enzimin pH Aktiviteleri……………………………………………….…35

4.5. SDS-PAGE Elektroforez Bulguları…………………………………….…..37

5. TARTIŞMA VE SONUÇ…………………………………………………….…..39

KAYNAKLAR…………………………………………………………… ……...…43

ÖZGEÇMĐŞ………………………………………………………………………....50

VI

ÇĐZELGELER DĐZĐNĐ SAYFA

Çizelge 1.1. Mantar ve Mayalardan Elde Edilen Fitazlar…………………………….6

Çizelge 1.2. Bakteri, Bitki ve Hayvanlardan Elde Edilen Fitazlar………………..….7

Çizelge 4.1. Fitaz Pozitif Đzolatların Oluşturdukları Zon Çapları…………………...32

Çizelge 4.2. 6. Suşun 120 Saatlik Yüzde Fitaz Aktivitesi……………………….….32

Çizelge 4.3. Bacillus sp.’den Đzole Edilen Fitaz Enziminin Aktivitesi……………...34

Çizelge 4.4. Standart Enzimin Farklı Sıcaklıklardaki Enzim Aktivitesi……………34

Çizelge 4.5. Bacillus sp.’ den Đzole Edilen Fitaz Enziminin

Farklı pH’lardaki Aktivitesi……………………………….......………36

Çizelge 4.6. Standart Enzimin 55°C Sıcaklıkta

Farklı pH’lardaki Aktivitesi…………………………………………...36

VII

ŞEKĐLLER DĐZĐNĐ SAYFA

Şekil 4.1. Fitaz Pozitif Đzolatların Besiyerindeki Görüntüsü……………………..…30

Şekil 4.2. Fitaz Negatif Đzolatların Besiyerindeki Görüntüsü…………………….....31

Şekil 4.3. 6 Nolu Suşun Besiyerindeki Görüntüsü……………………………….…31

Şekil 4.4. KH2PO4 Konsantrasyonları………………………………………………33

Şekil 4.5. Sıcaklığa Bağlı Enzim Aktivitesi…………………………………………35

Şekil 4.6. pH Bağlı Enzim Aktivitesi…………………………………………….….37

Şekil 4.7. SDS-PAGE Elektroforez Jel Görüntüsü………………………………….38

VIII

1. GĐRĐŞ Esen BĐLGĐN

1. GĐRĐŞ

Tahıl bitkileri, legümler dünyada hasat edilen alanların yaklaşık % 90’ında

üretilmektedir. Bunlar, hayvanlar alemi için temel besin kaynaklarıdır. Bu bitkilerin

en önemli içeriklerinden biri de fitik asittir (myo-inositol hexakis fosfat). Tahıl

bitkileri ve legümlerdeki toplam fosforun %80’inden fazla miktarı tuz formunda

(fitat) depo edilir (Reddy ve ark.,1989).

Kimyasal yapısına bağlı olarak fitik asit oldukça stabildir. Normal fizyolojik

şartlar altında fitik asit kalsiyum, magnezyum, demir ve çinko gibi bazı temel

mineralleri şelatlar. Aynı zamanda protein ve aminoasitlere bağlanabilir ve sindirim

enzimlerini inhibe edebilir (Pallauf ve Rimbach, 1996). Dolayısıyla bitkisel kökenli

gıdalarda fitik asit antinutritive bir etki gösterir ve bu nedenle enzimatik hidrolizi

şarttır.

Fosfatazlar, birçok organo-fosfat bileşiklerindeki monofosfoester bağlarının

parçalanmasını katalizleyen enzimlerdendir. Ancak bu enzimler fitik asit içindeki

monofosfoester bağlarını hidrolize edemez. Fitik asidin hidrolizi oldukça önemli

olduğu için, fitik asidi hidrolizleyen enzim sınıfına fitazlar denmiştir. Bu enzimler

(myo-inositol hexakisfosfat hidrolazlar) fitik asidi daha az fosforlanmış myo-inositol

türevlerine hidrolize ederler ve inorganik fosfat açığa çıkarırlar. Fitazlar doğada

oldukça yaygındır; mikroorganizmalarda, bitkilerde ve hatta bazı hayvan dokularında

vardır (Kerovno, 2000).

Geviş getiren hayvanlar; anaerobik bağırsak fungusları ve rumen

mikroflorasında bulunan bakteriler tarafından üretilen fitazların aktivitesine bağlı

olarak fitik asidi parçalarlar. Ancak domuz, kümes hayvanları ve balık gibi

monogastrik hayvanlar fitat fosforunu çok az kullanabilirler. Çünkü bunlar

gastrointestinal fitaz sisteminden yoksundurlar. Dolayısıyla bunların yemlerine

inorganik fosfat eklenir ve iyi bir büyüme sağlanır. Ancak bu eklenen inorganik

fosfat, fitik asidin antinutritive etkisini azaltmaz. Bu problem fitaz eklenip fitat

hidrolizinin sağlanması ile çözülebilmiştir (Simell ve ark., 1989). Dolayısıyla fitaz

önemli bir endüstriyel enzim ve geniş kapsamlı araştırmaların konusu olmuştur.

Eklenen fi taz, substratı üzerinde etkili bir şekilde çalışarak fitik asidin antinutritive

1


etkisini azaltmış ve inorganik fosfat eklenme gereksinimini azaltarak ya da yok

ederek besinlerin maliyetini de azaltmıştır. Ayrıca fitaz doğaya geçen fosforların

miktarını da azaltarak doğa için faydalı bir ürün olmuştur(Wodzinski ve Ulah, 1996).

Bunların yanı sıra fitazlar, fitatların parçalanmasıyla oluşan spesifik ürünlerin

ekonomik kullanımı için önemlidir. Fitazlar myo-inositol hexafosfatın sıralı

hidrolizini gerçekleştirerek, myo-inositol fosfat üretimini sağlarlar (Greiner ve

Konietzy, 1999).

Myo-inositol fosfatlar hayvan hücrelerinde de bulunmuştur. Ancak hayvan

hücrelerindeki bu bileşikler fosfor deposu ya da myo-inositol deposu olarak rol

almazlar. Bunların temel rolü, hücre zarı yapısının sağlamlığı ve bütünlüğünü

sağlamaktır. Myo-inositol fosfatlar metabolik parçalanma için enzim substratı, enzim

inhibitörleri ve dolayısıyla ilaç olarak kullanılabilirler (Laumen ve Ghisalba, 1994).

Bu bileşiklerin kimyasal sentezi oldukça zordur (Billington, 1993). Dolayısıyla

fitazlar bu özel myo-inositol fosfat türevlerinin endüstriyel üretimi için kullanılır.

1.1. Fitatlar ın Tarihçesi

Fitatların bulunuşu 1855-1856 yıllarında Hartig’in bir çok bitki tohumundan

nişastasız küçük tanecikleri izole etmesiyle başlar. Hartig bu küçük partiküllerin

tohumun çimlenmesi ve bitkinin büyümesi için temel olan maddelerin kaynağı olarak

düşünür (Rose, 1912). Daha sonra 1872 de Pfeffer, Hartig tarafından izole edilen bu

partiküllerin nişasta içermediğini ancak Ca, Mg ve P içerdiğini bulmuştur (Pfeffer,

1872). Ayrıca bu partiküller içinde organik maddeler de gözlemlenmiş ve fosfatın

karbonhidrat ile birleştiği tahmin edilmiştir ve inosite-fosforik asit olarak

adlandırılmıştır (Schulze ve Winterstein, 1896).

Pek çok araştırmacı tarafından yapılan çalışmalarda, bu bileşik için çeşitli

kimyasal yapılar gösterilmiştir. Fitik asidin konformasyonel yapısı X-ray analizi ve 31P –NMR içeren modern kimyasal analizlerle artık bilinmektedir.

Fitik asidin günümüzde kabul edilen adı; Myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis

fosfattır ve fitik asit tuzları genelde fitatlar olarak adlandırılır.

2


1.2. Fitatlar ın Fizyolojik Fonksiyonlar ı

Fitik asidin tohum ve tanelerde birçok fizyolojik rolü olduğu düşünülmüştür.

Bunlar; fosfor deposu olma, enerji kaynağı olma, katyon kaynağı olma, myo-inositol

kaynağı olma, dormansinin başlaması, gibi etkiler olarak sıralanabilir (Reddy ve ark.,

1989). Ayrıca fitik asit tohumlarda bilinmeyen pek çok fonksiyona da sahip olabilir.

Tohumlarda dormansi sırasında fitik asidin doğal bir antioksidan rolü üstlendiği Graf

ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir (1987).

1.3. Fitik Asidin Anti nutritive Etkisi

Fitik asit; Cu, Ca, Mg, Zn ve Fe gibi divalent minerallerin güçlü bir

şelatörüdür. Fitik asidin bu mineralleri şelatlama özelliğinden dolayı fitik asit, insan

ve hayvanların beslenmesini etkileyen önemli bir moleküldür. Đnsanlar ve

hayvanlarda yapılan invivo ve invitro çalışmalar göstermiştir ki; fitatlar bu

minerallerle kompleksler oluşturarak, bu minerallerin biyolojik kullanımını

azaltmaktadır (Reddy ve ark., 1989). Birçok fitat-mineral kompleksi çözülemez ve

dolayısıyla normal fizyolojik şartlarda absorbsiyonu sağlanamayabilir. Fitatlar,

doğada iyonik halde oldukları için, proteinlerin yüklü olan gruplarıyla direkt olarak

ya da Ca gibi pozitif yüklü mineraller vasıtasıyla proteinlerin negatif olan gruplarıyla

indirekt olarak reaksiyona girebilirler. Fitat-protein ve fitat-mineral-protein

kompleksi oluşumu, proteinin parçalanmasını ve biyolojik kullanımını da olumsuz

bir şekilde etkileyebilir (Cheryan, 1980).

1.4. Enzimler

Enzimler metabolizma reaksiyonlarının birçoğunu hızlandıran, protein

yapısında biyolojik katalizörlerdir. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce

tepkimenin hızını ve özgüllüğünü düzenlerler. Ayrıca hücre dışında da etkinliklerini

korurlar. Enzimlerin kimyasal katalizörlerden en büyük farkı özgül (spesifik)

olmalarıdır. Genel olarak enzimler belirli maddeler arasındaki belirli reaksiyonları

katalize ederler (Lehninger,1988).

3


Enzimlerin tümü protein yapısındadır ya da protein kısmı bulundururlar.Etki

ettikleri maddenin sonuna 'Ase=Az' eki getirilerek ya da katalizlediği tepkimenin

çeşidine göre adlandırılırlar. Çok defa renksizdirler, bazen sarı, yeşil, mavi,

kahverengi ya da kırmızı olabilirler. Suda veya sulandırılmış tuz çözeltisinde

çözülebilirler (Demirsoy, 1995).

Enzimlerin protein kısmına apoenzim denir. Apoenzim ısı ile kolayca

denatüre olur. Bu kısım enzimin hangi maddeye etki edeceğini saptar. Enzimlerin

bazıları basit proteinlerdir. Bunların katalitik etki gösteren kısmı doğrudan doğruya

proteinin polipeptid zinciridir. Birçok enzimin katalitik etki gösterebilmesi için

proteinden başka metal iyonuna, bazılarının protein olmayan organik bir bileşiğe,

bazılarının ise her ikisine de ihtiyacı vardır. Bu iyon veya bileşiğe genel olarak

kofaktör adı verilir. Organik bileşik, enzimin protein kısmı ile oldukça sıkı birleşmiş

ve ayrılmıyorsa prostetik grup, çok sıkı birleşmemiş ve ayrılabiliyorsa koenzim adını

alır (Lehninger, 1988).

Koenzimi ile bileşik halde bulunan Apoenzim-Koenzim bütününe Haloenzim

adı verilir. Yani haloenzim, koenzim veya kofaktörü ile birlikte katalitik olarak aktif

durumdadır. Koenzimlerin yapısında çoğunlukla vitaminler bulunmaktadır. Bu

bakımdan vitaminler, koenzimlerin yapısına girdiği için metabolik olayların enzimler

tarafından kolaylıkla başarılabilmesi için organizma bakımından son derece gerekli

bileşiklerdir (Lehninger,1988).

1.4.1. Enzimlerin Sınıflandır ılması

1-Oksidoredüktazlar: Redoks tepkimelerini katalizler.

a-Dehidrogenazlar: Elektron kazandırıcı tepkimeleri etkilerler.

b-Oksidazlar: Elektron kaybeden tepkimeleri etkilerler.

c-Redüktazlar: Substratı bir redüktör aracılığıyla indirgeyen enzimlere denir.

d-Transhidrogenazlar: Bir molekülden diğerine hidrojen taşıyarak onu

redüklerler.

e-Hidroksilazlar: Substratlarına bir hidroksil ya da su molekülü katan

enzimlere denir.

4


2-Transferaz Enzimler: Hidrojenin dışında bir atomun veya atom grubunun

bir molekülden diğerine aktarılmasını sağlarlar.

Dekarboksilazlar: Karboksilik asitlerden CO2 çıkmasını sağlarlar.

3-Hidr olaz Enzimler: Bir molekül su sokmak suretiyle ya da su molekülü

aracılığıyla moleküllerin yıkılmasını sağlayan enzimlerdir. Ester, peptid, asitanhidrit

ve glikozidik bağlarına etki ederler.

a-Esterazlar: Ester bağını yıkan enzimlerdir.

b-Proteazlar: Peptid bağını yıkan enzimlerdir

4-Liazlar: Su molekülü çıkarmadan molekülleri yıkan enzimlerdir.

5-Đzomerazlar: Molekül içinde değişiklik yaparak onun uzayda dizilişini

değiştiren enzimlerdir.

6-Ligazlar (=Sentetazlar): Enerji kullanarak substrat moleküllerinin

birbirine bağlanmasını; örneğin aminoasitlerin ve yağ asitlerinin aktifleşmesini

sağlarlar.

1.5. Fitazlar

Fitaz (myo-inositol hexakisfosfat fosfohidrolaz) myo-inositol hexakisfosfat’ ın

(fitik asit), inorganik mono fosfat ve düşük myo-inositol fosfatlar ve bazı durumlarda

serbest myo-inositol’e hidrolizini katalizler. Başlıca iki tip fitaz bilinmektedir; 3-fitaz

(E. C. 3. 1. 3. 8) ve 6- fitaz (E. C. 3. 1. 3.26). Bu sınıflandırma, enzim tarafından

tutulan ilk fosfat grubu tarafından yapılmıştır. 3-fitaz mikroorganizmalar için ve 6-

fitaz bitkiler için tipiktir (Powar ve Jaganatthan, 1982). Fitaz doğada oldukça

yaygındır. Birçok mikroorganizmada, hayvan dokusunda ve bitkide fitaz aktivitesi

rapor edilmiştir.

5


Çeşitli kaynaklardan elde edilen fitazlar Çizelge 1. 1. ve Çizelge 1.2’de

özetlenmiştir.

Çizelge 1.1. Mantar ve Mayalardan Elde Edilen Fitazlar

Fitaz Kaynağı Lokali zasyon Referans

Mantar

Aspergillus niger NRRL 3135

EX Shieh ve ark. (1969)

A.flavus EX Shieh ve Ware (1968)

A.terrus EX Yamada ve ark. (1968)

A.carneus EX Ghareib (1990)

A.oryzae EX Shimizu (1993)

A.fumigatus EX Pasamontes (1997)

Mucor sp. EX Shieh ve Ware(1968)

Penicillium spp. EX Shieh ve Ware (1968)

Penicillium caseoicolum EX Amano Pharmaceuticals (1995)

Rhisopus oligosporus IN ve EX Sutardi ve Buck (1988)

Maya

Saccharomyces cerevisiae EX Nayini ve Markasis (1984)

Schwanniomyces castelii EX Lambrechts ve ark. (1992)

Kluyveromyces fragilis EX Lambrechts ve ark. (1992)

Candida tropicalis EX Lambrechts ve ark. (1992)

Torulopsis candida EX Lambrechts ve ark. (1992)

Debaryomyces casteli EX Lambrechts ve ark. (1992)

6


Çizelge 1.2. Bakteri, Bitki ve Hayvanlardan Elde Edilen Fitazlar

Fitaz Kaynağı Lokali zasyon Referans

Bakteri

Bacillus subtilis EX Powar ve Jagannathan (1982)

B. subtattoilis (n) EX Shimizu (1992)

B. amyloliquefaciens EX Kim ve ark. (1998)

Eschericia coli IN Grenier ve ark. (1993)

Klebsiella aerogenes IN Tambe ve ark. (1994)

K. terrigena IN Grenier ve ark. (1997)

K. oxytoca IN Jareonkitmongkol ve ark. (1997)

Pseudomanas sp. EX Irving ve Cosgrove (1971)

Enterobacter sp. EX Yoon ve ark. (1996)

Bitkiler

Mısır IN Laboure ve ark.(1993)

Soya tohumu IN Gibson ve Ulah (1988)

Legüm tohumu IN Scott (1991)

Typha latifolia, polen IN Hara ve ark. (1985)

Hayvanlar

Fare bağırsak mukozası IN Yang ve ark. (1991)

Fare karaciğer IN Craxton ve ark. (1997)

Paramesyum IN Freund ve ark. (1992)

EX: Ekstraselüler, IN : Intraselüler

1.5.1. Mikrobiyal Kaynaklar

Mikrobiyal fitaz aktivitesi en çok funguslarda, özellikle de Aspergillus

türlerinde belirlenmiştir. Shieh ve Ware (1998) fitaz üretimi için topraktan 2000’den

fazla mikroorganizma izole etmişlerdir. Çoğu fitaz pozitiflerin sadece intraselüler

fitaz ürettiği gözlenmiştir. Az sayıda görülen ekstraselüler fitaz üreticilerin

filamentöz funguslar olduğu gözlenmiştir. Bunların büyük çoğunluğu Aspergillus

7


cinsine ait organizmalar, ayrıca az bir kısmı da Penicillium ve Mucor cinsine ait

organizmalardır. Diğer çalışmalarda, en iyi ekstraselüler fitaz üreticilerinin

Aspergillus niger türleri olduğu gösterilmiştir (Howson ve Davis, 1983; Volfava ve

ark. 1994).

Fitaz ayrıca Aerobacter aerogenes (Greaves ve ark. 1967), Pseudomanas sp.

(Irving ve Cosgrave, 1971), Bacillus subtilis (Powar ve Jagannathan, 1982),

Klebsiella sp. (Shah ve Parekh, 1990), Escherichia coli (Greiner ve ark. 1993),

Enterobacter sp. (Yoon ve ark. 1996) ve Bacillus sp. DS11 (Kim ve ark. 1998) gibi

birçok bakteri türünde tespit edilmiştir.

Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida,

Debaryomyces castelli, Kluyveromyces fragilis, Schwanniomyces castelli gibi

mayaların da fitaz ürettikleri görülmüştür (Nayini ve Markasis, 1984; Lambrechts ve

ark. 1992; Machizuki ve Takanashi, 1999).

1.5.2. Bitkisel Kaynaklar

Fitaz yaygın olarak bitkiler alemi tarafından da oluşturulur. Fitaz; pirinç,

arpa, buğday, mısır gibi tahıllardan ve çeşitli fasulye türlerinden izole edilmiştir.

Ayrıca, beyaz hardal, patates, ıspanak, zambak poleni gibi bitkilerden de fitaz izole

edilmiştir (Dvorakova v, 1998).

1.5.3. Hayvansal Kaynaklar

Fitaz monogastrik hayvanlardan da izole edilmiştir (Bitar ve Reinhold, 1972;

Copper ve Goving, 1983; Yang ve ark. 1991; Chi ve ark. 1999). Ancak intestinal

fitaz monogastriklerde, genelde besin türevli fitat parçalanmasında belirgin bir role

sahip değildir.

8


1.6. Fitazlar ın Kullan ım Alanları

1.6.1. Yem Uygulaması

Ruminantlar, rumenlerindeki mikrobial flora ile üretilen fitazlarla fitatı

parçalarlar. Fitazların yardımıyla fitattan hidrolize olan inorganik fosfat hem

mikroflora hem de ruminantlar tarafından kullanılır. Bu durum monogastrik

hayvanlarda farklıdır. Domuz, balık, kümes hayvanları gibi monogastrikler, fitik

asidi metabolize edemezler. Çünkü gastrointestinal fitazları yoktur. Dolayısıyla

bunların fosfat ihtiyacını karşılamak için yemlerine inorganik fosfat eklenir. Bu da

maliyeti ve fosfat kirlilik problemlerini arttırır. Hayvan yemlerine fitaz eklenmesi

fosfatın yem malzemesi içine geçmesini sağlar ve gübredeki fosfat miktarını azaltır.

Hayvanları fitazlı yemle beslemenin kirlilik üzerindeki etkisi belirlenmiştir. Eğer

fitaz A. B. D. ‘de yetiştirilen tüm monogastrik hayvanların yemlerinde kullanılsaydı

168 milyon dolar değerinde fosfor açığa çıkardı ve 8.23x104 ton fosfat çevreye

geçmezdi (Wodzinski ve Ulah, 1996).

Domuz besinine Finaz ® fitazı eklenerek kullanılmayan fosfatın yaklaşık

1/3’ü kullanılabilir forma dönüştürülmüştür (Cromwell ve ark. 1993). Domuz ve

tavuklarla yapılan birçok deneyler, monogastrik hayvanların fitatça zengin

yemlerinde mikrobiyal fitaz kullanılmasının inorganik fosfat eklenmesinin yerine

geçeceğini göstermiştir.

Fitazların besin enzimi olarak kullanılması, enzimin bazı özelliklerinin

değiştirilmesini gerektirmektedir. Çünkü kümes hayvanları ve domuz yemleri

genelde pellet haldedir ve bu proses sırasında sıcaklık 900C’ye kadar ulaşabilir

(Wyss ve ark. 1998).

1.6.2. Gıda Uygulaması

Tahıl, legüm ve soya proteinlerince zengin beslenme, fitat alınımında artışa

neden olur. Vejeteryanlar, yüksek oranda tahıl yiyen, dengesiz beslenen insanlar,

gelişmemiş ülkelerde mayasız ekmek yiyen insanlar, soya bağlı mama tüketen

9


bebekler fazla oranda fitat almaktadır (Simell ve ark.1989). Đnce bağırsakta

parçalanmamış fitat Zn, Ca, Mg ve Fe absorbsiyonunu negatif olarak etkiler. Bu

ayrıca sindirim enzimlerini ve bazı proteinleri de inhibe eder. Simell ve ark. (1989)

düşük pH (3)’da çözünürlüğü artmış fitat içermeyen soya protein izolatı

hazırlamışlardır. Anno ve ark. (1985) buğday fitazı kullanarak soya sütünden fitatı

uzaklaştırmışlardır. Aspergillus niger fitazının un içeren buğday kepeğine eklenmesi,

insanlarda demir absorbsiyonunu arttırmıştır (Sandberg ve ark. 1996). Ancak fitazın

besin ek maddesi olarak kullanılmadan önce, daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır.

1.6.3. Myo-Đnositol Fosfatlar ın Hazırlanması

Myo-inositol fosfatların artritis ve astım gibi solunum hastalıklarını

engellediği düşünülmektedir. Ayrıca spesifik inositol-trifosfatların ağrı kesici olarak

kullanılması da önerilmiştir (Siren, 1995). Đlginç olarak inositol-trifosfat esterlerinin

HIV’ı da içine alan retroviral enfeksiyonlara karşı inhibitör etkisinin olduğu

gösterilmiştir (Siren, 1998). Bu tip etkilerinden dolayı spesifik myo-inositol

fosfatların kullanılmasına olan ilgi artmıştır.

Myo-inositol fosfatların kimyasal sentezi oldukça zordur ve oldukça ekstrem

basınç ve sıcaklıkların uygulanması gerekmektedir (Billington, 1993). Fitazlar, myo-

inositol hexafosfatın sıralı hidrolizini sağladığı için, myo-inositol fosfat türevleri ve

serbest myo-inositolün fitaz kullanılarak üretilmesi kimyasal senteze potansiyel bir

alternatiftir. Saccharomyces cerevisiae fitazının, fitik asidi hidroliz etmesiyle; D-

myo-inositol 1, 2, 6-trifosfat, D- myo-inositol 1, 2, 5-trifosfat ve myo-inositol 1, 2, 3-

trifosfatın elde edilebileceği gösterilmiştir (Siren, 1986).

1.6.4. Kağıt Hamuru ve Kağıt Endüstrisi

Bitki fitik asidinin uzaklaştırılmasının kağıt hamuru ve kağıt endüstrisinde

önemli olabileceği fikri ortaya atılmıştır. Fitik asidin enzimatik parçalanması,

karsinojenik ve yüksek oranda toksik madde üretimine neden olmaz. Dolayısıyla

10


fitazın selüloz ve kağıt üretiminde kullanılması çevreye uygun ve temiz

teknolojilerin gelişmesinde faydalı olabilir (Liu ve ark. 1998).

1.7. Bacillus Cinsi

Bacillaceae familyasının bir üyesidir. Hücreler çomak şekilli, düz veya

hemen hemen düze yakın, çoğu ortam koşulları için çok dirençli, tek endospora

sahip, gram pozitif, peritrik kamçılı, aerobik veya fakültatif anaerob bir

bakteridir.Birçok türünde hücre duvarı çapraz bağlı mezo-diamino-pimelik asitten

oluşur (Lennete ve ark., 1985).

1.7.1. Hücre Morfolojisi

Bacillus zincirleri tek veya çok sayıda uzun zincirler meydana getirebilirler.

Çubuklar yuvarlak ya da kare şekilli ve oldukça küçük ( 0.5 x 1.2mM) ya da büyük

(2.5 x 10 mM) olabilir. Ana hücrede bulunan sporun şekli ve Sporogonium yeri,

Bacillus sp. türlerinde karakteristik bir özellik gösterir. Endosporlar, genellikle

silindirik, elipsoidal, oval ya da yuvarlaktır. Bazı türler ise böbrek ya da buz şekilli

endosporlar üretirler. Sporlar, Sporogonium'un içinde merkezde, merkeze yakın, uca

yakın, uçta veya lateralde bulunur. Ana hücrede, endospor oluşumu sırasında

endosporun şekli değişmez ya da şişebilir. Yapılan çalışmalarda, Sporogonium’un

şişmesi ve sporun şekli 3 grup altında toplanmıştır. Birinci grup, elipsoidal sporlara

sahip olup Sporogonium'da şişmeye neden olmazlar. Đkinci grup ise elipsoidal

sporlara sahip olup Sporogonium’da şişmeye neden olurlar. Üçüncü grup sferik

sporlar Sporogonium'un şişmesine neden olurlar (Lennete ve ark., 1985).

Endosporların oluşması sporogoniumların lizi olması ile ilişkili olabilir. Bazı

türlerde sferik ve elipsoidal spor görülmez. Spor kabuğu markırlar kullanılarak

tanımlanabilir ve bazılarında exosporium bulunur. Kapsüller bazı suşlar tarafından

değişik koşullarda oluşturulabilirler. Bazı türler değişik koşullarda siyah, sarı,

portakal veya kahverengi ve kırmızı pigmentler üretirler (Lennete ve ark., 1985 ).

11


1.7.2. Hücre Duvarının Yapısı

Bacillus suşlarında yoğun halde bulunan mürein tipi direkt birbirine bağlı

mezo-diamino pimelik asit şeklindedir. Bazı Bacillus türlerinde ise hücre duvarı

taykonik asit yapısındadır (Lennete ve ark. 1985).

1.7.3. Kapsül Yapısı

Bazı Bacillus türlerinde kapsüller karbonhidrat yapısında olup, dekstran

yapısında değildir ( Lennete ve ark. 1985).

1.7.4. Kamçı

Bacillus türlerinin çoğunda, hareket peritrik kamçılar tarafından sağlanır.

Bazı türlerde kamçı birkaç tane olabilir. Bu türlerin sayısı fazla değildir. Bu cinste

kamçı taksonomik sınıflandırmada kullanılan bir karakter değildir ( Lennete ve ark.

1985).

1.7.5. Sporlar

Sporların şekilleri, Sporogonium’daki durumları, taksonomide

kullanılmaktadır. Bacillus sporları çok kompleks bir yapı göstermekte olup, vejetatif

hücrede kolayca görülür. Protoplast haldeki spor içten dışa doğru hücre duvarı,

korteks ve kabuk yapılarından oluşur (Lenete ve ark. 1985).

1.7.6. Hücre Duvarı

Bu güne kadar yapılan çalışmalarda Bacillus hücrelerinin, birçok prokaryot

hücrede olduğu gibi, hücre duvar yüzeyi tabakalarının parakristal şeklinde olduğu ve

hücre yüzeyini tamamen kapladığı bulunmuştur. Bu tabakaların protein veya

12


glikoproteinden oluştuğu ve düzenli bir yapıya sahip olduğu saptanmıştır (Lennete ve

ark. 1985).

1.7.7. Koloni Karakterleri

Bacillus suşlarının koloni yüzeylerinin görüntüsü genelli kle çevresel

faktörlerle değişir. Bu faktörler arasında en önemlileri kültürün bulunduğu

besiyerinin bileşimi ve inkübasyon sıcaklığıdır. Çevresel faktörlerin değişmesi ile

kültürlerin kendisinde de birtakım değişiklikler olur. Yalnızca küçük koloni

formlarını içeren suşların dışında koloni çapı, besiyeri ve içerisindeki agar

konsantrasyonuna bağlı olarak değişir (Lennete ve ark. 1985).

Bazı Bacillus türleri katı besiyerinde, inokülasyondan önce ortamdaki nem

uzaklaştırılmadığı takdirde yığınlar halinde bulunma eğili mi gösterirler.

1.8. Çalışmanın Amaçları

Fitazlar fitik asitten fosfatı ayıran fosfataz enzimlerindendir. Son 15 yıldır

özellikle domuz ve kümes hayvanlarının yemlerinde kullanılabildiği için bilim

adamları ve girişimcilerin ilgisini çekmektedir. Domuz ve kümes hayvanları basit

yapılı midelerinden dolayı, yemlerinde kullanılan fitat fosfatını kullanamazlar.

Dolayısıyla bu hayvanların yemlerine inorganik fosfat eklenmek zorundadır ve bu

oldukça pahalı bir yöntemdir. Ayrıca fitat fosforu bu hayvanlar tarafından dışkı ile

atıldığından fosfor kirliliğine neden olur. Fitazlar hayvan dışkılarındaki fosfat

kirlili ğini azaltmak ve fosfat beslenmesini geliştirmek için hayvan yemlerine

eklenmektedir. Ayrıca fitazlar fitatların parçalanmasıyla oluşan spesifik ürünlerin

üretimi için de çok önemlidir.

Bu sebeplerden dolayı çalışmanın amaçları;

1- Bakteri izolasyonu ve identifikasyonunun yapılması.

2- Đzole edilen bakterilerin fitaz aktivitelerinin saptanması.

3- Yüksek enzim aktivitesi gösteren suşların tespit edilmesi.

13


4- Belirlenen suşlardan enzim izolasyonu yapılarak enzim aktivitesinin,

enzimin optimum pH ve sıcaklık değerlerinin saptanması.

5- Enzimin SDS-PAGE metodu ile moleküler ağırlığının saptanması.

14

2. ÖNCEKĐ ÇALIŞMALAR Esen BĐLGĐN

2. ÖNCEKĐ ÇAL IŞMA LAR

Powar ve Jagannathan (1987), Bacillus subtilis filtratında myo-inositol

hexafosfattan inorganik fosfatı açığa çıkaran enzimin varlığını göstermişlerdir. Bu

enzimi ultrasantrifüjle saflaştırıp poliakrilamid jel elektroforezinde iki izozim

bulmuşlardır. Bu enzimlerden birinin yalnızca fitatı hidrolize ettiğini görmüşler ve

enzimin optimum aktivite gösterdiği pH ve sıcaklık değerlerini tespit etmişlerdir.

Ba+2, Sr+2, Hg+2, Cd+2, Tripsin, Papayin, Florid, Arsenat ve üre gibi moleküllerin

enzim aktivitesini etkilediğini göstermişlerdir.

Greiner ve ark. (1997), Klebsiella terrigena’dan sitoplazmik fitaz izole

etmişlerdir. Bu enzimin yaklaşık 40kDa moleküler ağırlığında, monomerik bir

protein olduğunu tespit etmişlerdir. Enzimin özellikle fitat için spesifik olduğunu, pH

5’de 55oC’de maksimum aktivite gösterdiğini gözlemlemişlerdir. Ayrıca fitat hidroliz

ürünü olarak; I (1, 2, 3, 4, 5, 6 ) P5 ve I (1, 2, 3, 5, 6) P4 elde etmişlerdir

Liu ve ark. (1998), Aspergillus ficuum fitazını izole edip bu enzimin amino

asit residularını ve sekonder yapısını ortaya çıkarmış, ayrıca enzimin glikoprotein

olduğunu göstermişlerdir.

Kim ve ark., (1998), Bacillus sp. DS 11’den ekstraselüler fitaz izole

etmişlerdir. Enzimi; aseton presipitasyonu, Fenil-Sepharose, Resources ve Superose

12 kolon kromotografisine tabi tutarak homojenize etmişlerdir. SDS-PAGE’de

enzimin moleküler ağırlığının 44kDa olduğunu görmüşlerdir. Optimum aktivitenin

700C olduğunu ve 5mM CaCl2 varlığında, 900C’de 10 dakika inkübasyondan sonra

enzim aktivitesinin %50’sini koruduğunu gözlemlemişlerdir. Enzimin fitat için

maksimum spesifite gösterdiği; diğer fosfat esterleri için ise çok az ya da hiç aktivite

göstermediğini tespit etmişlerdir.

Kerovuo ve ark. (1998), Bacillus subtilis VTT-E- 68013’den izole ettikleri

fitazı saflaştırmışlardır. Maksimum fitaz aktivitesinin pH 7 ve 550C’de olduğunu

tespit etmişlerdir. Enzimin aynı zamanda ADP ve ATP’yi hidrolize ettiğini

görmüşlerdir. Ayrıca Bacillus subtilis VTT-E-68013’den fitaz genini klonlamışlar ve

enzimin amino asit sekuensinin (383 residue) diğer fi tazlarla veya diğer bilinen

15


fosfatazlarla bir homoloji göstermediğini tespit etmişlerdir. Bilinen fitazlarda aktif

bölgede korunmuş olan RHGXRXP sekuensinin bu gende olmadığını gözlemleyip,

bu enzimin fitaz veya histidin asit fosfataz üyesi olmadığını, yalnızca fitaz aktivitesi

gösteren bir enzim olduğunu gözlemlemişlerdir. Enzimin pH profil ve optimumuna

bakarak, yem uygulamalarında kullanılabileceğini düşünmüşlerdir

Jongbloed ve ark. (1999), Aspergillus niger fitazının domuzlardaki besin

parçalama performansı, idrar kompozisyonu üzerine olan etkisini incelemişlerdir.

Mikrobiyal fitazın hayvan performansını oldukça iyi bir şekilde etkilediğini

gözlemlemişlerdir. Formik asit ve fitazın yemdeki fosfatın parçalanmasını 0,20g/kg

oranında arttırdığını tespit etmişlerdir. Mikrobiyal fitazın idrardaki Ca ve P içeriğini

etkilediğini ancak pH, osmolarite ve Mg üzerinde herhangi bir etkisi olmadığını

görmüşlerdir.

Bae ve ark.(1999), enzim aktivitesinin gösterimi için kullanılan diferansiyel

agar ortamının Streptococcus bovis gibi anaerobik bakterilerde yanlış pozitif sonuç

verebileceğini ve bu yanlış sonucun kobalt klorid ve amonyum vanadat kullanılarak

iki aşamalı bir çalışma yapılarak elemine edilebileceğini göstermişlerdir.

Kerovuo ve ark. (2000), Bacillus subtilis’den izole ettikleri fitazın metal

bağımlılığını incelemişlerdir. Enzimden EDTA ile metal iyonlarının

uzaklaştırılmasıyla enzimin tamamen inaktif olduğunu görmüşlerdir. Bunun

nedeninin enzimin konformasyonel bozukluğundan kaynaklandığını tespit

etmişlerdir. Ayrıca Ca+2 varlığında enzimin termal denatürasyonunun durduğunu

gözlemlemişlerdir.

Lopez ve ark., (2000), farelerin besinlerine fitik asit ekleyerek, ince

bağırsaklarındaki fitaz üretim aktivitesini incelemişlerdir. Đnce bağırsakta üç ayrı

segmenti (duedonum, jejunum, ileum) ele almışlardır. Fitik asit ve buğday unu

verilen farelerde kontrol grubuna göre daha fazla fitat hidrolize edildiği ve Ca

absorbsiyonunun daha fazla olduğunu tespit etmişlerdir.

Vats ve Banerjee (2002), Aspergillus niger var. teigham’dan fermentör ve

çalkalayıcılarda fitaz elde etmişler. Bu izolatın minimal ortamda oldukça yüksek

fitaz aktivitesi verdiğini görmüşlerdir. Enzimin optimum koşullarını araştırmışlardır.

16


En uygun Nitrojen kaynağının Amonyum nitrat olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca

ortamda belli orandan fazla fosfatın enzim üretimini durdurduğunu bulmuşlardır.

Casey ve Walsh (2002), Aspergillus niger ATTC 9142 fitazını ultrafiltrasyon,

iyon değiştirme kromotografisi, jel filtrasyonu gibi yöntemlerle saflaştırmışlardır.

Saflaştırılmış enzimin optimum pH değerinin 5 ve optimum sıcaklığının 650C

olduğunu tespit etmişlerdir. Substrat spesifite çalışmalarında enzimin fitatı tercih

ettiğini ancak fitat içermeyen fosforillenmiş substratları da kullandığını

göstermişlerdir. Enzimin 800C’de diğer bazı ticari fitazlara göre daha yüksek

termostabilite gösterdiğini ve dolayısıyla enzimin hayvan yeminde kullanılmasının

uygun olacağını düşünmüşlerdir.

Quan ve ark. (2002), Candida krusei WZ-001’den fitaz enzimini izole

etmişler ve jel filtrasyonu, iyon değiştirme kromotografisi kullanarak

saflaştırmışlardır. SDS-PAGE’de 116 kDa ve 31kDa moleküler ağırlıkta iki farklı alt

birim bulmışlardır. NMR analizleri ile enzimin son hidroliz ürününün Myo-inositol

2-monofosfat olduğunu tespit edilmiştir.

Simon ve Igbasan (2002), çeşitli mikrobiyal orijinlerden izole edilen

fitazların gıda uygulamalarında invivo etkileri hakkında önemli tahminlerde

bulunmak için, invitro ortamlardaki özelliklerini araştırmışlardır.Enzimlerin yüksek

sıcaklık ve farklı pH’lardaki stabilitelerini ve pepsin gibi bazı enzimlerin varlığında

aktivitelerini ne kadar koruyabildiklerini gözlemlemişlerdir

Casey ve Walsh (2004), Rhisopus oligosporus ATCC 22959 ‘dan izole

ettikleri fitaz enziminin fizikokimyasal karakteristiklerine bakarak enzimin

endüstriyel açıdan kullanılabilme potansiyeli olduğunu görmüşlerdir.HPLC analizi

ile enzimin, fitatın neredeyse tamamını parçaladığını tespit etmişlerdir. Düşük

asiditede aktivitesini oldukça fazla oranda koruduğunu görmüşlerdir.

Gautam ve ark.(2002), Aspergillus ficuum TUB F-1165 ve Rhizopus

oligosporus TUB F-1166’dan katı yüzey fermentasyon yöntemi ile ekstraselüler fitaz

üretmişlerdir.Katı yüzey fermentasyonunda destekleyici olarak polistireni

kullanmışlardır.Bu yöntem ile bu organizmalardan izole edilen fitazın optimum pH

ve sıcaklık aktivitelerini incelemişlerdir.

17

3. MATERYAL VE METOD Esen BĐLGĐN

3. MATERYAL ve METOD

3.1. Materyal

Araştırmada kullanılan bakteri örnekleri Çukurova Üniversitesi kampüsünden

dört farklı Legüm bitkisinin (akasya ağacının) bulunduğu topraklardan izole

edilmiştir.

3.1.1. Kullanılan Besiyerleri

3.1.1.1. Fitat lı Besiyeri

Fitaz pozitif organizmaların izolasyonu amacıyla kullanılmıştır (Kerovuo ve

ark. 1997).

Bileşimi (g/L)

D-glikoz 20

Sodyum fitat 4

Kalsiyum klorür (CaCl2) 2

Amonyum nitrat (NH4NO3) 5

Potasyum klorür (KCl) 0.5

Magnezyum sülfat (MgSO4 (7H2O)) 0.5

Demir sülfat ( FeSO4(7H20)) 0.01

Mangan sülfat (MnSO4(7H20)) 0.01

Agar 15

Besiyerinin pH’sı 7±0.1’e ayarlanır.

18


3.1.1.2. Enzim Üretim Orta mı

Enzim üretimi için kullanılan besiyeri (Powar ve Jagannathan, 1982).

Bileşimi (g/L)

Buğday unu ekstraktı 1L

Magnezyum sülfat (MgSO4(7H2O)) 0.2

Kazein 1

Potasyum dihidrojenfosfat (KH2PO4) 0.5

Dipotasyum hidrojenfosfat (K2HPO4) 0.4

Amonyum sülfat ((NH4)2SO4) 0.4

pH 6-6.2’ye ayarlanır.

3.1.1.3. Buğday Unu Ekstraktı

1 kg buğday unu 10 litre su içinde 120°C’de 60 dakika otoklava bırakılır.

Soğutulduktan sonra tülbent bezinden süzülür.

3.1.1.4. Buğday Unu- Pepton Agar

%10 sıvı buğday unu ekstraktı, %1 pepton ve %1,5 agar içeren besiyeri.

3.1.1.5. LB Broth

Bileşimi (g/L)

Tryptone 10

Maya 5

Sodyum klorür (NaCl) 5

Agar 15

19


3.1.2. Enzim Aktivitesi Đçin Kullanılan Çözeltiler

Enzim aktivitesinin ölçümü için sırasıyla; 1: 1: 1: 2 oranında 6 N H2SO4

(Sülfirik asit ): %2.5 Amonyum molibdat: %10 Askorbik asit: distile su karıştırılır

(Kim ve ark. 1998).

3.1.2.1. 6 N Sülfirik Asit

16 ml Sülfirik asit alınır ve distile su ile 100ml’ye tamamlanır.

3.1.2.2. %2.5 Amonyum Molibdat

2.5 gr Amonyum molibdat tartılır ve son hacim distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

3.1.2.3. %10 Askorbik Asit

10 gr askorbik asit tartılır ve son hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlanır.

Bu karışımlar sırasıyla;1:1:1 ve 2 birim distile su oranında karıştırılarak

aktivite için solüsyon hazırlanır.

3.1.3. Substratın Hazırlanışı

Substratın hazırlanması için 100 ml 0,1 M Tris HCl çözeltisi içerisine 2mM

Na-fitat, 2mM CaCl2(2H2O) karıştırılır (Kim ve ark. 1998).

3.1.3.1. 0,1 M TRIS-HCl

0,121 gr Tris tartılır ve 100 ml distile su ile seyreltilir. Çözelti HCl ile pH

5.15’e getirilir.

20


3.1.3.2. 2Mm Na-Fitat

0,132 gr Na-fitat tartılır ve tris çözeltisi üzerine eklenir.

3.1.3.3. 2mM CaCl2(2H2O)

0.0294 gr CaCl2 tartılır ve tris çözeltisi üzerine eklenir.

3.1.4. Durdurucu Çözelti

Reaksiyonu durdurmak için %15 TCA (Trikloroasetikasit) kullanılır; 15 gr

TCA 100 ml’ye tamamlanacak şekilde distile suda çözülür.

3.1.5. SDS-PAGE Stok Solüsyonlar ı

1991).

Stok solüsyonlarının hazırlanışı aşağıda verilmiştir (Bollag ve Edelstein,

3.1.5.1. 2M Tris HCl

24,2 gr Tris tartılır, 50 ml distile suda çözülür. Konsantre HCl ile pH:8.8’e

ayarlanıp distile suyla 100 ml’ye tamamlanır.

3.1.5.2. 1M Tris-HCl

12,1 gr Tris tartılır, 50 mL distile suda çözülür. Konsantre HCl ile pH:6.8’e

ayarlanıp distile suyla 100 mL’ye tamamlanır.

3.1.5.3. %10 SDS

10 gr SDS tartılıp distile suyla 100 ml’ye tamamlanır.

21


3.1.5.4. %50 Gliserol

50mL %100’lük gliserol alınıp distile suyla 100 mL’ye tamamlanır.

3.1.5.5. %1 Bromfenol Mavisi

100 mg Bromfenol mavisi tartılıp, 10 mL distile su içinde çözülür.

3.1.6. SDS-PAGE Çalışma Solüsyonları

3.1.6.1. Akrilamid Monomer Solüsyonu (Solüsyon A) ( %30 akrilamid, %0,8

bisakrilamid)

29,2 gr akrilamid ve 0,8 gr bisakrilamid tartılıp distile su ile 100 mL’ye

tamamlanarak çözülür. Buzdolabında kahverengi şişede saklanır (Bollag ve

Edelstein, 1991).

3.1.6.2. 4X Seperating (Ayırma) Jel Tamponu (Solüsyon B)

75 mL 2 M Tris-HCl (pH:8,8) ve 4 mL %10’luk SDS karıştırılır üzerine 21

mL distile su eklenir. Buzdolabında saklanır (Bollag ve Edelstein,1991).

3.1.6.3. 4X Stacking (Dengeleme) Jel Tamponu (Solüsyon C)

50 mL 1M Tris HCl (pH:6,8) ve 4 ml %10’luk SDS karıştırılır, üzerine 46

mL distile su eklenir. Buzdolabında saklanır (Bollag ve Edelstein,1991).

3.1.6.4. %10’luk Amonyum Persülfat

SDS-PAGE jellerinin hazırlanmasında polimerizasyon başlatıcı olarak

kullanılmıştır. 0,5 gr Amonyum Persülfat tartılıp distile suyla 5 mL’ye tamalanır.

22


3.1.6.5. Yürütme Tamponu (pH: 8.3)

3 gr Tris (25 mM), 14,4 gr Glisin, 1 gr %0,1 SDS tartılıp distile suyla 1 L’ye

tamamlanır (Bollag ve Edelstein, 1991).

3.1.6.6. Örnek Hazırl ama Tamponu (5X)

0,6 mL, 1 M Tris-HCl (pH:6,8), 5 mL %50 Gliserol, 2 mL %10 SDS, 0,5 mL

2-merkaptoetanol,1 mL %1Bromfenol mavisi, 0,9 mL distile su (Bollag ve Edelstein,

1991).

3.1.6.7. Ayırma (Sepereting) Jeli (%10’luk)

4,9 mL Solüsyon A (stok), 3,75 mL Solüsyon B (stok), 35 mL distile su, 50

µL Amonyum persülfat, 10 µL TEMED (Bollag ve Edelstein, 1991).

3.1.6.8. Dengeleyici (Stacking) Jelin Bileşenleri

1mL Solüsyon A (stok), 1,5 mL Solüsyon C (stok), 3,5 mL Distile su , 20 µL

Amonyum persülfat, 5µL TEMED (Bollag ve Edelstein, 1991).

3.1.6.9. Coomasi Brillant Blue Boyası (CBB) Stok Solüsyonu (1L)

SDS-PAGE jellerinin elektroforezden sonra boyanması ve protein bantlarının

görünür hale gelmesi amacı ile kullanılmıştır. 1 gr Coomasi Blue R-250, 450 mL

Metanol, 100 mL Glasial asetik asit, 450 mL distile su (Bollag ve Edelstein, 1991).

23


3.1.6.10. Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu (1L)

SDS-PAGE jellerin CBB R-250 ile boyandıktan sonra jeldeki boya fazlasının

geri alınarak bantların netleşmesi amacıyla kullanılmıştır. 100 mL Metanol, 100 mL

Glasial asetik asit, 800 mL distile su (Bollag ve Edelstein, 1991).

3.1.7. pH Aktivitesi Đçin Kullan ılan Tamponlar

3.1.7.1. Formik Asit-Sodyum Format Tamponu

pH 3-4 arasında aktivite gösteren enzimlerin pH optimumlarını saptamak için

kullanılmıştır (Long,1961).

Bileşimi:

X ml, 1M formik asit ve y ml, 1 M NaOH alınıp distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

pH 3: 29.4 ml formik asit, 5 ml NaOH alınır ve distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

pH 4: 6.5 ml formik asit, 5 ml NaOH alınır ve distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

3.1.7.2. Sitrik Asit-Sodyum Sitrat Tamponu

pH 5-6 arasında aktivite gösteren enzimlerin pH optimumlarını saptamak için

kullanılır (Gomori, 1955).

Bileşimi:

A: 0.1 M Sitrik asit (1 Lt’de 21.09 g)

B: 0.1 m Na-Sitrat (1 Lt’de 29.41 g C6H5O7Na3:2H2O)

24


pH 5: 20.5 ml A’dan, 29.5 ml B’denalınıp son hacim distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

pH 6: 9.5 ml A’dan, 41.5 ml B’den alınıp son hacim distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

3.1.7.3. Tris-HCl Tamponu

pH 7-9 arasında aktivite gösteren enzimlerin pH optimumlarını saptamak

amacı ile kullanılmıştır (Bates and Bower,1956).

Bileşimi: 50 ml 0.1 M Tris (12..114 g/l) ve X ml 0.1 M HCl alınıp son hacim

distile su ile 100 ml’ye tamamlanır.

pH 7: 50 ml 0.1 M Tris ve 46.6 ml 0.1 M HCl alınıp son hacim distile su ile

100 ml’ye tamamlanır.

pH 8: 50 ml 0.1 M Tris ve 29.2 ml 0.1 M HCl alınıp son hacim distile su ile

100 ml’ye tamamlanır.

pH 9: 50 ml 0.1 M Tris ve 5.7 ml HCl alınıp son hacim distile su ile 100

ml’ye tamamlanır.

3.1.7.4. Glisin-NaOH Tamponu

pH 10’da aktivite gösteren enzimlerin pH optimumlarını saptamak amacı ile

kullanılmıştır (Gomori,1955).

Bileşimi:

25 ml 0.2 M glisin (15.01 g/l) ve x ml NaOH alınıp distile su ile 100 ml’ye

tamamlanır.

25


pH 10: 25 ml 0.2 M glisin ve 16 ml 0.2 M NaOH alınıp distile su ile 100

ml’ye tamamlanır.

26


3.2. Metod

3.2.1. Bacillus’ların Đzolasyonu

Çukurova Üniversitesi kampusünden Akasya ağaçları köklerinden toprak

örnekleri alınmıştır. Örnekler 2’şer gr. tartılıp 18 ml steril saf su ile iyice karıştırılıp

homojen hale getirilmiştir ve 85°C’de 10 dakika ısısal işlemlerden geçirilmiştir.

Uygun seyreltmeler yapılıp fitaz pozitif besiyerine ekim yapılmıştır.Örnekler 48 saat

37°C’de inkübasyona bırakılmıştır.

3.2.2. Fitaz Pozitif Bakterilerin Đzolasyonu

Fitatlı besiyerinde etrafında zon oluşturan tek düşmüş bakteriler nokta ekimi

ile aynı besiyerine tekrar ekilmiş ve oluşan zonlar belirli aralıklarla ölçülmüştür. Bu

bakterilerin fotoğrafı çekilmiştir. En fazla zon oluşturan bakterilerin stok kültürleri

hazırlanmıştır.

3.2.3. Fitaz Eldesi

En iyi zon veren bakteri örnekleri, buğday unu ve pepton içeren ortama

ekilmiştir.37°C’de inkübasyona bırakılmıştır. 24 saatlik inkübasyondan sonra

yüzeyde oluşan bakteriler öze ile sıyrılarak enzim üretimi için 100 ml’lik buğday unu

içeren 500 ml’lik steril şişeler içine aktarılmıştır. Örnekler fitaz eldesi için 28°C’de 4

gün inkübasyonda bırakılmıştır. Đnkübasyon süresince her 24 saat sonunda

kültürlerden belli bir miktar alınıp 20 dakika boyunca 18000xg’de santrifüj

edilmiştir. En iyi aktivite gösteren bakteri örneği diğer enzim incelemeleri için

kullanılmıştır.

Maksimum enzim aktivitesi 3. gün sonunda gözlendiği için daha sonraki

çalışmalarda fitaz eldesi için 72 saatlik inkübasyon yapılmıştır.

27


3.2.4. Fitazın Kısmi Saflaştır ılması

Tüm saflaştırma basamakları 0-4°C’de yapılmıştır. Islak buğday ekstraktında

büyütülen bakteriler 30 dakika boyunca 7000xg’de santrifüjle toplanmıştır. Daha

sonra süpernatant alınmış ve üzerine son konsantrasyonu 1mM olacak şekilde CaCl2

eklenmiştir. Enzim üzerine 3 hacim soğuk etanol eklenmiş ve çökme için

buzdolabında bir gece bekletilmiştir. Presipitat 1800xg’de 20 dakika santrifüjle

toplanmış ve toplanan presipitat soğuk etanolle tekrar yıkanmıştır.Ardından bir defa

da soğuk asetonla yıkanmıştır. Fazla aseton azot gazı akımı ile uzaklaştırılmış ve

kurutmaya liyofilizasyonla devam edilmiştir.Kuru presipitat bu şekilde buzdolabında

saklanmıştır.Bu şekilde enzimin kısmi saflaştırılması yapılmıştır (Kim ve ark., 1998).

3.2.5. Kalibrasyon Eğrisinin Ha zırlanması

Enzim aktivitesinin belirlenmesi için 0,01µM/ml’den 0,06µM/ml arasında

değişen KH2PO4 çözeltileri hazırlanmıştır. Hazırlanan bu çözeltiden 2 hacim alınıp

daha önce hazırlanışı anlatılmış olan 1 hacim amonyum molibdat çözeltisi üzerine

eklenir. Karışım 10 dakika renk dönüşümü için bekletildikten sonra 625 nm’de

spektrofotometrede ölçülür.

3.2.6. Fitaz Aktivite sinin Tespiti

1- Katı halde bulunan enzim preparatı 0,01 gr tartılarak 1 mM CaCl2

içeren 10 ml, 0,1 M Tris-HCl (pH:7,5) içinde çözünmüş ve homojenize bir hale

getirilmiştir.

2- Bir hacim enzim ve 4 hacim substratlı çözelti karıştırılmıştır.

3- Örnekler 20°C’den 90°C’ye kadar değişen belirli sıcaklıklarda 30

dakika reaksiyona sokulmuştur.

4- Đnkübasyon sonunda reaksiyonu durdurmak için 5 hacim % 5’lik TCA

eklenmiştir.

28


5- Bu karışımdan 2 hacim ve amonyum molibdatlı çözeltiden 1 hacim

oranında karıştırılıp 10 dakika beklenmiştir.

6-Örnekler 625 nm’de spektrofotometrede ölçülmüştür (Kim ve ark., 1998).

3.2.7. Fitaz Enziminin pH Aktivitesinin Ölçümü

Farklı pH değerleri için hazırlanan çözeltilere daha önce anlatılan oranlarda

enzim eklenip maksimum sıcaklık aktivitesinin ölçüldüğü sıcaklık değerinde enzim

aktivitesi ölçülmüştür.

3.2.8. Fitazın Moleküler Ağırlı ğının Belirlenmesi

Fitaz enzimin moleküler ağırlığının belirlenmesi amacıyla %10’luk SDS-

PAGE elektroforez kullanılmıştır. Standart protein olarak Amresco K494-500UL

kullanılmıştır. Marker protein içinde moleküler ağırlıkları farklı olan 4 protein bant

oluşmuştur.

Enzim proteinleri 1:3 oranında örnek tamponu içinde çözülmüş ve 20

mikrolitrelik miktarlarda çukurlara uygulanmıştır. Örnekler jele uygulandıktan sonra

alt ve üst rezervuara elektroforez tamponu doldurularak 100 mA voltajda izleme

boyası jel tabanının 2-3 cm üzerine gelinceye kadar separe edilmiştir.

SDS-PAGE jeli elektroforez işleminden sonra CBB R-250 protein boyası ile

boyanmış, fazla boya geri alınmıştır (Bollag ve Edelstein, 1991).

29

4. BULGULAR Esen BĐLGĐN

4. BULGULAR

4.1. Bacillus sp. Đle Yapılan Enzim Đzolasyonuna Ait Bulgular

Farklı toprak örneklerinden metod kısmında belirtildiği şekilde izole edilen

Bacillus sp. izolatlarının fitaz aktiviteleri araştırılmış ve yüksek enzim aktivitesi

tespit edilen bakteri suşuna ait enzimin optimum sıcaklık ve pH değerleri

saptanmıştır.

Fitaz pozitif ve negatif özellik gösteren bazı izolatların fitaz pozitif

besiyerindeki görüntüleri Şekil 4.1, Şekil 4.2 ve Şekil 4.3’te verilmiştir.

Şekil 4.1. Fitaz Pozitif Đzolatların Besiyerindeki Görüntüsü

30


Şekil 4.2. Fitaz Negatif Đzolatların Besiyerindeki Görüntüsü

Şekil 4.3. 6 Nolu Suşun Besiyerindeki Görüntüsü

Fitaz pozitif bakterilerin oluşturdukları zon çapları Çizelge 4.1’de verilmiştir.

31


Çizelge 4.1. Fitaz Pozitif Đzolatların Oluşturd uklar ı Zon Çaplar ı

Đzolatlar Koloni Çapı (cm) Koloni ve zon çapı (cm)

1 2.75 3

2 1.5 1.7

3 0.8 1.2

4 2.1 2.3

5 0.9 1.4

6 1.2 1.8

1 nolu izolatın oluşturduğu koloni çapı 2.75 cm iken koloni ve zon çapı 3 cm

olarak ölçülmüştür.6 nolu izolatın oluşturduğu koloni çapı 1.2 cm iken koloni ve zon

çapı 1.8 cm olarak ölçülmüştür. Çizelgede de görüldüğü gibi en yüksek zon çapını 6

nolu suş vermiştir. Bakterilerin oluşturdukları zon çaplarına bakılarak 6. suştan izole

edilen fitaz enziminin aktivitesi incelenmiştir.

6. suşun günlük fitaz aktivitesi (%) Çizelge 4.2’de gösterilmiştir.

Çizelge 4.2. 6. Suşun 120 Saatlik Yüzde Fitaz Akti vitesi

Zaman (saat) Fitaz Aktivitesi (%)

24 24

48 72

72 100

96 84

120 76

Verilerde de görüldüğü gibi 24. saatte %24’lük enzim aktivitesi görülürken

72. saatte maksimum enzim aktivitesi gözlenmiştir. 72.saatten sonra enzim

aktivitesinin düştüğü gözlenmiştir.

4.2. Fitaz Aktivitesine Ait Bulgular

32


Fitaz aktivitesinin yorumlanması için 0.01µM/ml’den 0.06µM/ml’e kadar

değişen aralıklarda KH2PO4 çözeltileri hazırlanıp 625 nm’deki absorbans değerleri

tespit edilmiştir. Şekil 4.4’te KH2PO4 konsantrasyonları ve absorbans değerleri

arasındaki doğrusal ili şki verilmiştir.

0,20

0,18

0,16

0,14

0,12

0,10

0,08

0,06 Y = 2.79X +0.0079

0,04

0,02

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07

KO NS ANTR AS YO N

Şekil 4.4. KH2PO4 Konsantrasyonlar ı

4.3. Enzimin Sıcaklık Akti viteler i

6 nolu izolatın farklı sıcaklıklardaki fitaz aktivitesi (%) Çizelge 4.3’te

verilmiştir.

Çizelge 4.3. Bacillus sp.’den Đzole Edilen Fitaz Enziminin Akti vitesi (%)

33


Sıcaklık (°C) Absorbans % Aktivite

20 0.089 15.5

25 0.210 36.6

35 0.380 66

45 0.470 82

55 0.535 93

65 0.572 100

75 0.515 90

85 0.382 67

90 0.190 33

Çizelgede de görüldüğü üzere 20°C’de absorbans değeri 0.089 ve enzimin

aktivite yüzdesi 15.5 olarak ölçülmüştür. Bu değer sıcaklık 65°C’ye gelinceye kadar

artmıştır.65°C’de absorbans değeri 0.572 olarak ölçülmüştür. 65°C sıcaklıktan sonra,

sıcaklık değeri arttıkça absorbans değeri ve enzimin aktivite yüzdesi

düşmüştür.90°C’de absorbans değeri 0.190 ve enzimin yüzde aktivitesi 33 olarak

ölçülmüştür.

Standart enzimin farklı sıcaklıklardaki fitaz aktivitesi Çizelge 4.4’te

verilmiştir.

(%) Çizelge 4.4. Standart Enzimin Farklı Sıcaklıklardaki En zim Aktivitesi

Sıcaklık (°C) Absorbans % Aktivite

20 0.040 6

25 0.055 8.5

35 0.069 10.7

45 0.488 76

55 0.641 100

65 0.595 92.8

75 0.570 88.9

85 0.340 53

90 0.230 35.8

34


Buğdaydan elde edilen ticari fitaz standart enzim olarak kullanılmıştır.

Standart enzimin absorbans değeri 20°C’de 0.040 ve aktivite yüzdesi 6 olarak

bulunmuştur.6 nolu Bacillus sp.suşundan farklı olarak standart enzim 55°C’de

maksimum aktivite göstermiştir.Bu sıcaklık değerindeki absorbans değeri 0.641

olarak ölçülmüştür. 55°C’den sonra absorbans değerleri giderek azalmıştır. 90°C

sıcaklıkta absorbans değerinin 0.230 ve aktivite yüzdesinin 35.8 olduğu gözlenmiştir.

120

100

80

60

40

20

0

20 25 35 45 55 65 75 85 90

Sıcaklık (°C)

Şekil 4.5. Sıcaklığa Bağlı Enzim Aktivite si (■ Bacillus sp.’den izole edilen fitaz, ♦ Standart enzim)

Şekil 4.5’te Bacillus sp’den izole edilen fitaz enzimi ve standart enzimin

sıcaklığa bağlı aktivite yüzdeleri karşılaştırılmıştır. Bakteri ve bitki kökenli

enzimlerin farklı sıcaklık değerlerinde maksimum aktivite verdiği görülmektedir.

4.4. Enzimin pH Aktiviteleri

6 no’lu suşun 65°C sıcaklıkta farklı pH’lardaki enzim aktivitesi Çizelge

4.5’te gösterilmiştir.

35


Çizelge 4.5. Bacillus sp.’ den Đzole Edilen Fitaz Enziminin Fark lı pH’lardaki Aktivitesi (%)

pH Absorbans % Aktivitesi

3 0.070 12

4 0.270 47.6

5 0.402 71

6 0.567 100

7 0.548 96.6

8 0.380 67

9 0.096 17

Bacillus sp.’den izole edilen fitaz enziminin pH 3’de absorbans değeri 0.070

olarak ve aktivite yüzdesi 12 olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi pH 3’ten sonra

pH 6’ya kadar giderek artmıştır. Enzim enyüksek aktivitesini pH 6’da göstermiştir.

pH 6’da enzimin absorbans değerinin 0.576 olduğu görülmüştür. pH 7’de enzim

aktivitesinin azaldığı ama bu azalışın çok fazla olmadığı görülmektedir. pH 7’den

sonra enzim aktivitesi hızlı bir şekilde düşmüştür. pH 9’da absorbans değerinin 0.096

ve aktivite yüzdesinin 17 olduğu görülmüştür.

Standart enzimin 55°C sıcaklıkta farklı pH’lardaki enzim aktivitesi Çizelge

4.6’da gösterilmiştir.

Çizelge 4.6. Standart Enzimin 55°C Sıcaklıkta Fark lı pH’larda kiaktivitesi (%)

pH Absorbans % Aktivitesi

3 0.074 11.8

4 0.390 62.6

5 0.623 100

6 0.580 93

7 0.430 69

8 0.206 33

9 0.092 14.7

36


Standart enzimin pH 3’de absorbans değeri 0.074 ve aktivite yüzdesi 11.8

olarak hesaplanmıştır. Enzim aktivitesi pH 3’den pH 5’e kadar giderek artmıştır. pH

5’de enzimin absorbans değerinin 0.623 olduğu görülmüştür. pH 5’den sonra enzim

aktivitesi giderek düşmüştür. pH 9’da enzimin absorbans değerinin 0.092 ve aktivite

yüzdesinin 14.7 olduğu görülmüştür.

120

100

80

60

40

20

0

3 4 5 6 7 8 9

pH

Şekil 4.6. pH Bağlı Enzim Aktivitesi (♦ Bacillus sp.’den izole edilen fitaz, ■ Standart enzim)

Şekil 4.6’da Bacillus sp.’den izole edilen fitaz enziminin ve standart enzimin

farklı pH değerlerindeki aktivite yüzdeleri karşılaştırılmıştır. Her iki enzimin de

farklı pH değerlerinde maksimum aktivite verdiği görülmektedir.

4.5. SDS-PAGE Elektroforez Bulguları

SDS-PAGE elektroforez sonuçlarına göre 60kDa ve 53 kDa olmak üzere iki

bant gözlenmiştir. Bantların görüntüleri Şekil 4.7 görülmektedir.

37


Şekil 4.7. SDS-PAGE Elektroforez Jel Görüntüsü

38

5. TARTIŞMA VE SONUÇ Esen BĐLGĐN

5. TARTI ŞMA VE SONUÇ

Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara

sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında

kullanılabilmesi için işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal

koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan

en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması,

alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olması gerekir

(Sarıkaya,1995).

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikroorganizma

kökenli olmakla birlikte ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan izole edilmektedirler.

Bunun nedeni, mikroorganizma kaynaklı enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek

olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları,

büyük boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmesi gibi avantajlara sahip olmasıdır

(Wiseman, 1987; Horikoshi, 1996).

Fitazlar; (myo-inositol-hexakis fosfat fosfohidrolazlar) asit fosfataz

enzimleridir; etkili olarak fitik asitten fosfatı ayırır ve myo-inositol ve inorganik

fosfat oluştururlar (Mitchell ve ark., 1997).

Fitazlar son 15 yıldır biyoteknoloji, çevresel koruma, besin alanlarında hem

bilim adamları hem de girişimcilerin ilgisini çekmektedir (Lei ve Stahl, 2001).

Domuz ve kümes hayvanlarının basit yapılı midelerinden dolayı (Bitar ve

Reinhold, 1972), bu hayvanlar, yemlerinde kullanılan tohumlardaki fitat fosfatını

kullanamazlar ve diyetlerine inorganik fosfat eklenmesi oldukça pahalıdır. Ayrıca

diyetteki kullanılmamış fitat fosforu bu hayvanlar tarafından dışkı ile atılır ve bu da

fosfor kirliliğine neden olur (Sweeten, 1992). Hindistan’da hayvan yemlerine

dikalsiyum fosfat (DCP) eklenmektedir ve fitazın %50-60 DCP’nin yerini aldığı

görülmüştür.10 kg DCP’nin 250 gr fitaz enzimine karşılık geldiği tahmin

edilmektedir.

Bunların yanı sıra fitazlar, fitatların parçalanmasıyla oluşan spesifik ürünlerin

ekonomik olarak üretimi için önemlidir. Fitazlar, myo-inositol-hexafosfat’ın sıralı

hidrolizini gerçekleştirerek, myo-inositol fosfat üretimini sağlarlar (Greiner ve

Konietzy, 1999).

39


Son yıllarda endüstriyel öneminden dolayı hem bilim adamları, hem de

girişimcilerin ilgisini çektiği için çalışmalarımızda fitaz enzimi üretimi amacıyla

Bacillus sp. örnekleri izole edilerek, bunlardan en iyi sonucu veren suş kullanılmıştır.

Bu amaçla Çukurova Üniversitesi kampusünden Legüm bitki köklerinin bulunduğu

topraklardan izole edilen Bacillus sp. bakterisinin fitaz enzim aktivitesi analizleri

yapılmıştır.Liu ve ark. (1998), legüminöz bitkilerinin olduğu topraklardan bazı

bakteriyal strainleri izole etmişlerdir.

Liu ve ark. (1998) fitazın moleküler ağırlığının organizma türlerine bağlı

olarak 35-700 kDa arasında değiştiğini belirtmişlerdir. Tambe ve ark. (1994)

Klebsiella aerogenes fitazının moleküler ağırlığının 700 kDa; Greiner ve ark. (1997)

Klebsiella terrigera fitazının moleküler ağırlığının 40 kDa olduğunu bulmuşlardır.

Shimuzi (1992) Bacillus subtilis’e ait fitazın moleküler ağırlığının 38 kDa olduğunu

rapor etmişlerdir. Powar ve Jagannathan (1982) Yaptıkları çalışmada, Bacillus

subtilis’den izole ettikleri fitazda birbirine yakın iki protein bandı bulmuşlardır.Her

iki bandın da fitaz aktivitesi verdiğini görmüşlerdir. Bu iki izozimin bakteri

tarafından üretilebileceğini düşünmüşlerdir. Kim ve ark. (1998) Bacillus

amyloliquefaciens tarafından üretilen fitazın 44 kDa olduğunu tespit etmişlerdir.

Çalışmada Bacillus sp.’den izole edilen fitazın SDS_PAGE analizi sonucu moleküler

ağırlığı 60kDa ve 53 kDa olarak saptanmıştır (Şekil 4.7).

Enzim karakterizasyonunda bir diğer parametre enzimin aktivite gösterdiği

pH aralığının saptanması ve optimum pH’ın belirlenmesidir. Fitazların optimum

pH’ları 2,2’den 8’e kadar değişmektedir. Çoğu mikrobiyal fitazlar, özellikle de

fungal orijinliler 4,5 ile 5,6 arasında değişen optimum pH’a sahiptir. Çoğu fungal

fitazlara zıt olarak Aspergillus fumigatus fitazı geniş bir aralıkta optimum pH’a

sahiptir.Bu suşlarda pH 4.0 ve 7.3 arasında yüksek aktivite gözlenmiştir.Bazı

bakteriyel fitazlar özellikle Bacillus suşlarından elde edilenler, 6.5-7.5 pH

optimumuna sahiptirler (Kerovuo, 2000).Yaptığımız çalışmada Bacillus sp.’ye ait

fitazın pH 3-9 arasındaki aktiviteleri incelenmiştir. Spektrofotometrik analizler

sonucunda pH 6’da enzimin maksimum aktiviteye sahip olduğu gözlenmiştir.

Benzer sonuçlar farklı araştırmacılar tarafından bildirilmiştir. Powar ve Jagannathan

(1982) Bacillus subtilis’ten izole edilen fitazın optimal pH aralığının 6-6.5 olduğunu,

40


Kim ve ark. (1998) Bacillus sp. DS 11’e ait fitazın pH 7.5’te maksimum aktiviteye

sahip olduğunu bulmuşlardır. Buğdaydan elde edilen hazır fitazda ise pH 5’te

maksimum aktivite gözlenmiştir. Lim ve ark. (1973) buğday unundan elde ettikleri

fitazın maksimum pH’ının 5.6 olduğunu bulmuşlardır. Bitki tohumu fitazlarındaki

optimum pH 4.0-7.5 arasındadır. Çoğu ise 4.0 ve 5.6 arasında değişen optimum pH’a

sahiptir. Zambak poleni (Hara ve ark. 1985), ve legüm tohumunda (Scot, 1999)

yaklaşık pH 8’de maksimum aktivite gösteren 2 alkali bitki fitazı bulunmuştur.

Fitazların optimum sıcaklık değerleri 45-77 0C arasında değişmektedir. Wyss

ve ark. (1998) fungal orijinli bazı fitazların (Aspergillus fumigatus ve Aspergillus

niger) sıcaklığa bağlı enzimatik aktivitesini belirlemişlerdir ve bunların termostabil

olmadığını göstermişlerdir. Greiner ve ark. (1993) Klebsiella terrigera ‘dan izole

edilen fitazın 58 0C ‘de maksimum aktivite gösterdiğini belirtmiştir.Kim ve ark.

(1998) Bacillus sp. DS 11’den izole edilen fitazın 70 0C’de , Shimizu (1992) Bacillus

subtilis’ten izole edilen fitazın 60 0C ‘de maksimum aktivite gösterdiğini

belirtmişlerdir.Yaptığımız çalışmada izole ettiğimiz suşa ait enzimin 65 0C’de

maksimum aktivite gösterdiğini bulduk. Ayrıca buğdaydan elde edilen ticari fitazın

55 0C’de maksimum aktivite gösterdiğini gözlemledik.

Endüstriyel alanda kullanılan enzimler çok çeşitli biyolojik kaynaklardan

üretilmektedirler..Bunların yaklaşık %60’ı filamentöz fungi, %24’ü bakteriler, %6’sı

hayvanlar, %4’ü mayalar ve %2’si streptomyces tarafından üretilmektedir (Lowe,

2001).

Görüldüğü üzere enzimlerin büyük kısmı mikroorganizmalardan izole

edilmektedir. Bunun nedeni mikrobiyal enzimlerin katalitik aktivitelerinin yüksek

olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, büyük

boyutlarda ve yüksek saflıkta elde edilmeleri gibi avantajlara sahip olmalarıdır.

Son yıllarda enzim izolasyonu ve üretimi için çok ilginç ve yeni teknolojileri

olan birçok yeni şirket açılmıştır. Enzim üretiminin %60’ı Avrupa’da, %15’i

ABD’de ve %15’i Japonya’da olmaktadır (Lowe,2001).

Endüstriyel enzimler gıda, deterjan, tekstil, deri, kağıt endüstrisi gibi birçok

alanda kullanılmaktadır (Lowe,2001).

41


Fermentasyon teknolojisi ve daha sonraki yıllarda tanişılan genetik

mühendisliği ile 1960’lardan sonra enzim üretimi hızla artmıştır. Rekombinant

mikroorganizmalar artık enzimlerin temel kaynağı olmaya başlamışlardır. Bu akım

gelecekte daha da artacak ve enzim teknolojisi gelişecektir (Lowe, 2001).

Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının

çeşitlili ği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin

endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem

kazanmaktadır. Yaptığımız çalışma sonunda izole ettiğimiz enzimi 60C0’de, pH 6’da

maksimum aktivite göstermiştir. Sentezlediğimiz enzimin özellikleri ve birçok

alanda uygulanabilir olması açısından, elde edilen ürünün ekonomik alanda

değerlendirilmesinin büyük önemi olduğu kanısına varılmıştır.

42

KAYNAKLAR

BAE, H.D., YANKE, L.J., CHENG, K.J., SELİNGER, L.B. (1999) A novel staining

method for detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods.

39, 17-22.

BATES, R.G., BOWER, V.E. (1956) Alkaline solutions for pH control. Anal. Chem.

28, 1322-1324.

BILLINGTON, D. C. (1993) The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and

Biological Significance . Verlag Chemie, Weinheim.

BITAR, K., REINHOLD, J.G., (1972) Phytase and alkaline phosphatase activities in

intestinal mucosae of rat, chicken, calf and man. Biochim. Biophys. Acta

268:442-452.

BOLLAG, D.M, ve EDESISTEIN, S.J., 1991. Proteins Methods. Viley-Liss Press,

USA, Sayfa: 180

CASEY A., WALSH G. (2003). Purification and characterization of extracellular

phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresource Technology 86

(2003) 183-188.

CASEY, A., WALSH, G. (2004). Identification and characterisation of phytase of

potential commercial interest. Journal of Biotechnol. Volume:110, Issue: 3,

313-322.

CHERYAN, M. (1980) Phytic acid interactions in food systems.CRC Crit. Rev.

Food Sci. Nutr. 13, 297-335.

CRACTON, A., CAFFREY, J. J., BURKHART, W., SATRANY, S. T. AND

SHEARS S. B. (1997) Molecular cloning and expression of a rat hepatic

multiple inositol polyphosphate phosphatase. Biochem. J. 328, 75-81.

DELLUCA, A. J., DISCHINGER, C. and ULLAH, A. H. J. (1992) Identification of

phytase from Citrobacter freundii. Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92

meet. 385.

DEMİRSOY, A. 1989. Yaşamın Temel Kuralları (Genel Biyoloji/Genel Zooloji).

Cilt 1/Kısım 1. Meteksan Matbaacılık.

43

DVOROKOVA, J. (1998) Phytase: Sources, Preparation and Exploitation. Folia

Microbipl. 43,323-338.

FISKE, C.H. and SUBBAROW, Y.P., 1925. The Colorimetric Determination of

Phosphorus. J. Biol. Chem. 66, 375-410.

FREUND, W. D., MAYR, G., TIETZ, C. and SCHULTZ. J. E. (1992) Metabolism

of inositol phosphates in the protozoan Paramecium. Eur. J. Biochem. 207,

359-367.

GAUTAM, P., SABU, A., PANDEY, A., SZAKACS, G., SOCCOL, C.R. (2002)

Microbial production of extra-cellular phytase using polystyrene as inert solid

support. Bioresource Technology. 83, 229-233.

GHAREIB, M. (1990) Biosynthesis, purification and some properties of extracellular

phytase from Aspergillus Carneus. Acta Microbiol. Hung. 37, 412-418.

GIBSON, D. M. and ULAH, A. H. J. (1988) Purification and characterization of

phytase from cotyledons of germinating soybean seeds. Arch. Biochem.

Biophys. 260, 503-513.

GOMORI, G. KAPLAN, N.O.(eds) (1955). Preparation of buffers for use in enzyme

studies. In:Methods in Enzymology, s.p. Vol 1:138-146.

GREAVES, M. P., ANDERSON, G. and WEBLEY, D. M. (1967) The hydrolysis of

inositol phosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim. Biophys. Acta 132,

412-418.

GREINER, R., HALLER, E., KONIETZNY, U. and JANY, K. D. (1997)

Purification and characterization of phytase from Klebsiella terrigena. Arch.

Biochem. Biophys. 341, 201-206.

GREINER, R., KONIETZNY, U. (1999) İmproving enzymatic reduction of myo-

inositol phosphates with inhibitory effects on mineral absorbtion in black

beans (Phaseolus vulgaris var.preto). Journal of Food Processing and

Preservation 23:249-261

HARA, A., EBINA, S., KONDO, A. and FUNAGUMA, T. (1985) A new type of

phytase from polen of Typha latifolia L. Agric. Biol. Chem. 49, 3539-3544.

HORIKOSHI, K., (1996) Alkoliphiles from an industrial point of viev. Fems

Microbiol. Rew., 18, pp. 259-270.

44

HOWSON, S. J. and DAVIS, R. J. (1983) Production of phytate-hydrolising enzyme

by fungi. Enzyme Microbiol. Technol. 5, 377-382.

IRVING, G. C. J. and COSGROVE, D. J. (1971) Inositol phosphate phosphatase of

microbial origin. Observations on the nature of the active center of a bacterial

(Pseudomanas sp. ) phytase. Austral. J. Biol. Sci. 24, 1559-1564.

JAREONKITMONGOL, S., OHYA, M., WATANABE, R., TAKAGI, H. and

NAKAMORI, S. (1997) Partial purification of phytase from a soil isolate

bacterium, Klebsiella oxytoca MO-3. J. Ferment. Bioeng. 83, 393-394.

JONGBLOED, A.W., MROZ, Z., WEIJ-JONGBLOED, R., KEME, P.A. (2000).The

effects of microbial phytase, organic acids and their interaction in diets for

growing pigs. Livestock Production Science 67 (2000) 113-122.

KEROVNO, J. (2000) A novel phytase from Bacillus. Characterization and

production of the enzyme. Doktora Tezi, Helsinki 2000.

KEROVUO, J., LAPPALAINEN, I., REINIKAINEN, T. (2000). The metal

dependence of Bacillus subtilis phytase. Biochemical and Biophysical

Research Communications 268, 365-369.

KEROVUO, J., LAURAEUS, M., NURMINEN, P., KALKKINEN, N. and

APAJALAHTI, J. (1998) İsolation, Characterisation, Molecular Gene

Cloning, and Sequencing of a Novel Phytase from Bacillus subtilis Applied

and Environmental Microbiology. 2079-2085.

KIM, Y. O., KIM, H. K., YU, J. H. and OH, T. K. (1998) Purification and properties

of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS 11. Enzyme Microbiol.

Technol. 22, 2-7.

KIM, Y. O., LEE, J. K., KIM, H. K., YU, J. H. and OH, T.K. (1998) Cloning of the

thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS 11 and its

overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 162, 185-191.

LABOURE, A. M., GAGNON, J. and LESCURE, A. M.(1993) Purification and

characterization of a phytase (myo-inositol hexakisphosphate

phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during

germination. Biochem. J. 295, 413-419.

45

LAMBRECHTS, C., BOZE, H., MOULIN, G., GALZY, P. (1992) Utilization of

phytate by some yeast. Biotechnol. Lett. 14, 61-66.

LAUMEN,K. and GHISALBA, O. (1994) Preparative scale chemo-enzymatic

synthesis of optically pure D-myo-inositol 1-phosphate. Biosci. Biotech.

Biochem. 58, 2046-2049.

LEHNINGER, A.L., 1984. Prinsible of Biochemistry, USA, Sayfa: 149-164.

LEI, X.G., STAHL, C.H., (2001) Biotechnological development of effective

phytases for mineral nutrition and environmental protection. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 57:474-481.

LIM, P.E. AND TATE, M.E., (1973) Properties of phytase fractions F1 and F2 from

wheat bran and the myo-inositol phosphatase produced by fraction F2. Bio

chim. Biophys. Acta 302, 316-328.

LIU, B., RAFIQ,A.,TZENG, Y. and ROB A. (1998) The İnduction and

characterization of phytase and beyond. Enzyme and Microbial Technology

22:415-424.

LOPEZ, H.,W., VALLERY, F., LEVRAT-VERNY, M.,A., COUDRAY, C.,

DEMİGNE, C., REMESY, C. (2000). Dietary phytic acid and wheat bran

enhance mucosal phytase activity in rat small intestine. J. Nutr. 130: 2020-

2025.

LOWE, D.A., (2001). Basic Biotechnology. (Ed: Ratledge C. and Kristionsen B.),

Second Edition, Cambridge University Pres.

MITCHELL, D.B., VOGEL, K., WEIMANN, B.J., PASAMONTES, L., VON

LOON, A.P.G.M., (1997) The phytase subfamily of histidine acid

phosphatases, isolation of genes for two novel phytases from the fungi

Aspergillus terreus and Myceliophthora. Microbio. UK 143, 245-252.

MOCHIZIKU, D. and TAKAHASHI, H. (1999) Method for producing phytase.

Patent application EP 0931837-A.

NAYİNİ, N. R. and MARKAKİS, P. (1984) The phytase of yeast. Food Sci.

Technol. 17, 126-132.

PALLAUF, J. and RİMBACH, G. (1996) Nutritional significance of phytic acid and

phytase. Arch. Anim.Nutr. 50, 301-319

46

PASAMONTES, L., HAIKER, M. HENRIQUEZ-HUECAS, M., MITCHELL, D. B.

and VON LOON, A. P. G. M. (1997) Cloning of the phytase from Emericella

nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus. Biochim.

Biophys. Acta 1353, 217-223.

PFEFFER, M. (1872) Comprehensive study of aleurone grains, identification of

globoid and approximation of its chemical nature. Johrb. Wiss. Bot. 8:429-

574.

POWAR, V. K. and JAGANNATHAN, V. (1982) Purification and properties of

phytate-spesific phosphatase from Bacillus subtillis. J. Bacteriol. 151, 1102-

1108.

QUAN, C.,S., FAN, S., ZHANG, L., WANG, Y., OHTA, Y. (2002) Purification and

properties of phytase from Candida krusei WZ-001. Journal of Bioscience

and Bioengineering Vol.94, No:5, 419-425.

REDDY, N. R., PIERSON,M. D., SAHTE, S. and SALUNKHE, D. K. (1989)

Phytates is cereals and legumes. CRC Pres, Inc., Boca Raton,Fla.

ROSE, A. R. (1912) A resume of the literature on inosite-phosphoric acid with

special reference to the relation of that substance to plants. Biochem. Bull. 2:

21-49.

SCHULZE, E. and WINTERSTEIN, E. (1896) Physiol. Chem. 40:120??????

SCOTT, J. J. (1991) Alkaline phytase activity in nonionic detergent extracts of

legume seeds. Plant Physiol. 95, 1298-1301.

SHAH, V. and PAREKH, L. J. (1990) Phytase from Klebsiella sp. No. PG-2;

Purification and properties. Indian J. Biochem. Biophys. 27, 98-102.

SHIEH, T. R. and WARE, J. H. (1968) Survey of microorganisms for the production

of extracellular phytase. Appl. Microbiol. 16, 1348-1351.

SHIEH, T. R., WODZINSKI, R. J. AND WARE, J. H. (1969) Regulation of the

formation of acid phosphatase by inorganic phosphate in Aspergillus ficuum.

J. Bacteriol. 100, 1161-1165.

SHIMIZU, M. (1992) Purification and characterization of phytase from Bacillus

subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56, 1266-1269.

47

SHIMIZU, M. (1993) Purification and characterization of phytase and acid

phosphatase by Aspergillus oryzae K1. Biosci. Biotech. Biochem. 57, 1364-

1365.

SIMELL, M., TRUNEN, M., PIIRONEN, J. and VARA, T. Feed and food

applications of phytase.Lecture at 3rd Meet.İndustrial Applications of

Enzymes, Barcelona, Spain. 1989.

SIMON, O., IGBASAN, F. (2002) Invitro properties of phytases from various

microbial origins. International Journal of Food Science and Technology. 37,

813-822.

SUTARDI, M. and BUCKLE, K. A. (1998) Characterization of extra-and

intracellular phytase from Rhizopus oligosporus used in tempeh production.

Int. J. Food Microbiol. 6, 67-69.

SWEETEN, J.M. (1992) Livetock and poultry waste management: a national

overview in:BLAKE, J.D., MAGETTE, W.(eds) National livestock, poultry

and aquaculture waste management. Amer Soc. Agric. Eng. St Joseph,

Minnesota, pp:4-15.

TAMBE, S. M., KAKLIJ, G. S., KELKAR, S.M. and PAREKH, L. J. (1994) Two

distinct molecular forms of phytase from Klebsiella aerogenes; evidence for

unusually small active enzyme peptide. J.Ferment. Bioeng. 77, 23-27.

VATS, P., BANERJEE, U.C. (2002). Studies on the production of phytase by a

newly isolated strain of Aspergillus niger vat teigham obtained from rotten

wood-logs. Process Biochemistry 38 (2002) 211-217.

VOLFOVA, O., DVORAKOVA, J., HANZLİKOVA, A. and JANDERA, A. (1994)

Phytase from Aspergillus niger. Folia Microbiol. 39, 481-484.

WISEMAN, A. (1987) The application of enzymes in industry. Handbook of

Enzyme Biotechnology. Second edition.Chapter 3.

WODZINSKI, R. J. and ULAH, A. H.J. (1996) Phytase.Adv. Appl. Microbiol.42,

263-302

YAMADA, K., MİNODA, Y. and YAMAMOTO, Y. (1968) Phytase from

Aspergillus terrus. Production, prufication and some general properties of the

enzyme. Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282.

48

YANG, W. J., MATSUDA, Y. SANO, S., MASUTANI, H. and NAKAGAWA

(1991) Purification and characterization of phytase from rat intestinal

mucosa. Biochim. Biophys. Acta. 1075, 75-82.

YOON, S. J., CHOI, Y. J., MIN, H. K., CHO, K. K., KIM, J. W., LEE, S. C. and

JUNG, Y. H. (1996) Isolation and identification of phytase-producing

bacterium, Enterobacter sp. 4, and enzymatic properties of phytase enzyme.

Enzyme Microbiol. Technol. 18, 449-454.

49

ÖZGEÇMİŞ

1981 yılında İçel’in Tarsus ilçesinde doğdum. İlköğretim ve lise

öğrenimlerimi Tarsus’da tamamladım. 1999 yılında. Ege Üniversitesi Fen Edebiyat

Fakültesi Biyoloji Bölümünü kazandım ve bu bölümden 2004 yılında mezun oldum.

2004 yılında Çukurova Ünivesitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünde

Yüksek Lisans programında öğrenimime başladım. Halen Biyoloji Anabilim Dalında

Yüksek Lisans Programına devam etmekteyim.

50

Documents

ÇUKUR OVA Ü NĐVERSĐTES ĐLĐMLER Đ ENST ĐTÜSÜ YÜKSEK … · Çukur ova Ü nĐversĐtes Đ fen b ĐlĐmler Đ enst ĐtÜsÜ yÜksek lĐsans te zĐ esen bĐlg Đn toprak bakter