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MAURO ANTONIO DALL AGNOL
CONCENTRAÇÃO DE FLUORETO NO ESMALTE E NO BIOFILME
DENTAL EM FUNÇÃO DO TEMPO DE MANUTENÇÃO DO VERNIZ-F
SOBRE OS DENTES: ESTUDO CLÍNICO
PIRACICABA
2016
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
MAURO ANTONIO DALL AGNOL
CONCENTRAÇÃO DE FLUORETO NO ESMALTE E NO BIOFILME
DENTAL EM FUNÇÃO DO TEMPO DE MANUTENÇÃO DO VERNIZ-F
SOBRE OS DENTES: ESTUDO CLÍNICO
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia
de Piracicaba da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutor em
Odontologia, na Área de Cariologia.
Orientador: Prof. Dr. Jaime Aparecido Cury
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA
TESE DEFENDIDA PELO ALUNO MAURO ANTONIO
DALL AGNOL E ORIENTADA PELO PROF. DR. JAIME
APARECIDO CURY.
PIRACICABA
2016
DEDICATÓRIA
A Deus por estar sempre iluminado meu caminho e por ter me dado saúde е força para
superar as dificuldades.
Ao meu filho Guilherme e minha esposa Luciara, por dividirem comigo os momentos de
renúncia e de superação.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Prof. Dr. Jaime Aparecido Cury pela orientação, apoio е confiança. Agradeço pela
paciência e dedicação. Levarei sempre comigo cada um dos seus ensinamentos.
À Profª. Dra. Livia Maria Andaló Tenuta, a quem tenho profunda admiração, pela pronta
disponibilidade, pelo apoio e incentivo em todas as fases do trabalho.
À Profaª. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury pela amizade, acolhida e
ensinamentos.
À colega de pós-graduação Carla Battiston, pela amizade, convívio e auxilio incondicional.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, por meio do seu Magnífico Reitor, Prof.
Dr. José Tadeu Jorge.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba - FOP/UNICAMP, em nome do diretor Prof. Dr.
Guilherme Elias Pessanha Henriques.
À Universidade Comunitária da Região de Chapecó – UNICAMP, por meio do seu Magnífico
Reitor, Prof. Dr. Claudio Alcides Jacoski.
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia (PPG-O) da FOP/UNICAMP, em nome do
coordenador Prof. Dr. Marcelo de Castro Meneghim.
Aos Professores: Prof. Dr. Fausto Medeiros Mendes, Prof.ª Dra. Branca Heloísa de
Oliveira Martins Vieira, Prof.ª Dra. Carolina Steiner Oliveira Alarcon, Prof.ª Dra.
Vanessa Cavalli Gobbo, Prof. Dr. Celso da Silva Queiroz, Prof.ª Dra. Carolina Patrícia
Aires e Profª. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury por prontamente terem aceitado o
convite para a banca de defesa dessa tese e por todas as suas contribuições.
Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Ricomini Filho pelas contribuições para este trabalho.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen pelo apoio e dedicação ao convênio celebrado entre a
Unochapecó e a FOP/UNICAMP.
À Profª. Silvana Muraro Wildner, Vice-Reitora e Ensino, Pesquisa e Extensão da
Unochapecó pelo apoio, compreensão e suporte durante minhas ausências.
Aos voluntários pela valiosa participação, colaboração e dedicação a este estudo.
Aos técnicos do laboratório de Bioquímica oral da FOP/UNICAMP, Waldomiro Vieira
Filho e José Alfredo da Silva pela amizade construída ao longo desses anos, pela ajuda e
atenção indispensáveis.
Aos colegas de pós-graduação Diego Figueiredo Nóbrega e Lina Marin Gallon pelo
companheirismo e auxilio ao longo de toda essa trajetória.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
O efeito anticárie do verniz fluoretado é baseado em evidências. No entanto, não há consenso
sobre quanto tempo o verniz aplicado deve permanecer sobre os dentes antes de ser
mecanicamente removido. O objetivo do presente estudo clínico randomizado e controlado
(ClinicalTrials.gov: NCT02486458) foi avaliar in vivo o efeito do tempo de manutenção do
verniz sobre os dentes na concentração de fluoreto no esmalte e no biofilme dental.
Voluntários (n=51, idade 18-30) foram randomicamente alocados em três grupos (n=17):
Controle (sem aplicação de verniz); Verniz-4h e Verniz-24h (aplicação de verniz Duraphat®
sobre todas as superfícies dos dentes após uma profilaxia dental e remoção mecânica após 4 e
24 h, respectivamente). As variáveis de resposta estudadas foram a concentração de fluoreto
no esmalte e no biofilme dental (fluido e sólidos) em função do tempo decorrido desde a
aplicação do verniz. Para análise do fluoreto no esmalte foram feitas biópsias ácidas em
regiões distintas dos incisivos centrais superiores antes da aplicação (baseline), imediatamente
após a remoção do verniz e após 7 e 28 dias da aplicação do verniz. O biofilme foi coletado
antes (baseline) e após 3, 7, 14 e 28 dias da aplicação do verniz para análise do fluoreto no
fluido e nos sólidos. Os voluntários ficaram 24 h sem escovar os dentes antes de cada coleta
de biofilme e nesse período utilizaram goma de mascar açucarada para padronizar o consumo
de sacarose. A concentração de fluoreto nas amostras de esmalte e biofilme foi determinada
por meio de eletrodo íon-específico. Os resultados foram analisados por ANOVA - 2 vias
considerando os fatores tratamento (Controle, Verniz-4h e Verniz-24h) e tempo (antes da
aplicação (baseline) e após a remoção do verniz e nos tempos estabelecidos para as biópsias
do esmalte e coletas de biofilme), seguido pelo pós-teste de Tukey. Para a concentração de
fluoreto no esmalte foi observado efeito significativo para os fatores tratamento e tempo e sua
interação (p<0,0001). Diferenças significativas (p<0,0001) na concentração de fluoreto no
esmalte somente foram encontradas no tempo após a remoção do verniz. A maior média (±
DP) de concentração (µg F/ cm2) foi encontrada no grupo Verniz-24h (1,83 ± 0,49), seguido
do Verniz-4h (1,05 ± 0,25) e do Controle (0,59 ± 0,26). Com relação à concentração de
fluoreto no fluido e nos sólidos do biofilme não foi encontrado efeito significativo para os
fatores isolados ou sua interação (p > 0,05). Conclui-se que um maior tempo de manutenção
do verniz aplicado sobre a superfície dentária aumenta a reatividade do fluoreto com o
esmalte, porém sem reflexo na concentração de fluoreto no biofilme.
Palavras-chave: Fluoretos; Fluoretos Tópicos; Fluoreto de Cálcio.
ABSTRACT
The anticaries effect of fluoride varnish is based on evidence. However, there is no consensus
about the time that varnish should be maintained on enamel surfaces without it being
mechanically removed. The aim of this randomized controlled clinical trial
(ClinicalTrials.gov: NCT02486458) was to in vivo evaluate the effect of the maintenance time
of the applied varnish in the fluoride concentration on enamel and dental biofilm. Volunteers
(n=51, ages 18-30) were randomly allocated in three groups (n=17): Control (no varnish
application) and groups Varnish-4h and Varnish-24h (varnish (Duraphat®
) application onto
every dental surface after a dental prophylaxis and mechanical removal after 4 and 24 h,
respectively). The response variables studied were the fluoride concentration on the enamel
and dental biofilm (fluid and solids) as a function of the time elapsed since the application of
the varnish. For the analysis of the fluoride in the enamel, etching acid biopsies were made in
different regions of the upper central incisors prior to the varnish application (baseline),
immediately after the removal of the varnish and after 7 and 28 days of the application of the
varnish. Biofilm was collected before and after 3, 7, 14 and 28 days of the varnish application
for fluoride analysis in fluid and solids. The volunteers stayed without brushing their teeth for
24 h before each biofilm collection and in that period they used sugary chewing gum to
standardize the consumption of sucrose. Fluoride concentration on enamel and biofilm
samples was determined through ion specific electrode. Results were analyzed through
ANOVA – Two way considering treatment factor (Control, Varnish-4h e Varnish-24h) and
time (prior to application (baseline) and after the varnish removal and on other established
times for the collections of biofilm and enamel samples), followed by Tukey’s post hoc test.
For enamel’s fluoride concentration a significant effect was observed for the treatment and
time factors and their interaction (p<0.0001). Significant differences (p<0.0001) on enamel’s
fluoride concentration were only found in time after the varnish removal. The highest average
(± SD) of concentration (µg F/ cm2) was found in the Varnish-24h group (1,83 ± 0,49),
followed by Varnish-4h (1,05 ± 0,25) and Control (0,59 ± 0,26). Regarding the fluoride
concentration on fluid and solids of biofilm there was no significant effect found to the
isolated factors or their interaction (p > 0.05). It concludes that a longer maintenance time of
the applied varnish on the dental surface increases fluoride’s reactivity with enamel, but
without any reflexes in biofilm’s fluoride concentration.
Key Words: Fluorides; Fluorides, Topical; Calcium fluoride.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Linha do tempo (dias) da fase clínica do experimento ........................................... 39
Figura 2 – Aleatorização dos voluntários nos grupos experimentais ....................................... 40
Figura 3 - Sequência dos locais onde as biópsias foram realizadas nos incisivos centrais
superiores. ................................................................................................................................. 42
Figura 4 – Fluxo de participantes no estudo ............................................................................. 46
Figura 5 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µg F/cm2) no esmalte antes e após a
remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do verniz, de acordo com os
grupos/ tratamentos .................................................................................................................. 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µg F/cm2) no esmalte antes e após a
remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do verniz, de acordo com os
grupos/ tratamentos .................................................................................................................. 47
Tabela 2 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µmol/l) no fluido do biofilme antes e
depois da aplicação do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos .................................... 48
Tabela 3 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µmol/g proteína) nos sólidos do biofilme
antes e depois da aplicação do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos ........................ 48
Tabela 4 - Médias (± DP) da espessura da camada de esmalte removida pela biópsia (µm)
antes e após a remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do verniz, de
acordo com os grupos/ tratamentos .......................................................................................... 48
Tabela 5 - Comparativo entre as médias (± DP) da espessura da camada de esmalte removida
pela biópsia (µm) a concentração de fluoreto no esmalte (µg F/cm2) no tempo após a remoção
do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos .................................................................... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APF - Aplicação profissional de fluoretos
ºC - Grau Celsius
Ca - Cálcio
“CaF2” - Fluoreto de cálcio
DP - Desvio padrão
F- - Fluoreto
HA - Hidroxiapatita
h - Hora
FA - Fluorapatita
M - Molar
min - Minuto
mol/l - Mol por litro
mmol/l - Milimol por litro
µmol - Micromol
n - Número de amostras
pH - Potencial hidrogeniônico
Pi - Fósforo inorgânico
ppm - Partes por milhão
TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
RPM - Rotações por minuto
TISAB - Total ionic strenght adjustment buffer
μg F/cm2 - Micrograma de fluoreto por centímetro quadrado
μg F/mL - Micrograma de fluoreto por mililitro
Verniz-F - Verniz fluoretado
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 16
3 PROPOSIÇÃO ...................................................................................................................... 37
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 38
5 RESULTADOS ..................................................................................................................... 46
6 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 50
7 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 53
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 54
APÊNDICES ............................................................................................................................ 62
APÊNDICE 1: Kit de higiene bucal (escova, fio dental e dentifrício sem F-) e goma de
mascar açucarada fornecido aos voluntários......................................................................... 62
APÊNDICE 2: Folhetos de orientações aos voluntários ...................................................... 63
APÊNDICE 3: Sequência de procedimentos das biópsias de esmalte ................................. 64
APÊNDICE 4: Procedimentos de coleta de biofilme ........................................................... 65
ANEXOS .................................................................................................................................. 66
ANEXO 1: Comprovante de registro do estudo no ClinicalTrials.gov ................................ 66
ANEXO 2: Parecer consubstanciado do CEP ....................................................................... 69
ANEXO 3: Relatório estatístico ........................................................................................... 70
14
1 INTRODUÇÃO
A cárie dental é uma doença biofilme-açúcar dependente que leva a uma
destruição progressiva e localizada da estrutura mineral dos dentes. Isso ocorre devido às
constantes quedas de pH induzidas pelos ácidos provenientes do metabolismo bacteriano
quando o biofilme é exposto à carboidratos fermentáveis. Essas quedas do pH acarretam no
desequilíbrio físico-químico do estado de saturação do fluido do biofilme em relação ao
mineral do dente e este tende a se dissolver (Fejerskov e Kidd, 2011).
A presença do fluoreto nesse contexto, na sua forma livre e solúvel (Valk et al.,
1985), mesmo em baixa concentração reduz a desmineralização e ativa a remineralização,
constituindo-se num fator de proteção à doença (ten Cate, 1997). O fluoreto pode ser
fornecido por meio de dentifrícios, enxaguatórios bucais ou incorporado à água de
abastecimento (todos com menos de 1500 ppm de F-). Também pode ser pela aplicação
profissional de produtos fluoretados (APF) em alta concentração (de 9000 a 56000 ppm F-),
como os géis e vernizes - verniz-F (Tenuta e Cury, 2010).
A APF tem seu efeito anticárie baseado em evidências (Marinho et al., 2013,
Marinho et al., 2015). O mecanismo de ação é atribuído à reatividade do fluoreto em alta
concentração nos produtos com os íons cálcio do dente, formando reservatórios minerais tipo
fluoreto de cálcio (por ser um material semelhante ao fluoreto de cálcio, daqui em diante será
referido como “CaF2”) - flúor fracamente ligado (Rölla et al., 1993). Por sua vez, o “CaF2”
formado poderá permanecer por diversos dias na superfície do dente e liberar o fluoreto
lentamente para o biofilme para interferir com o processo de cárie (Ögaard, 2001). A APF
também aumenta a quantidade de fluorapatita no esmalte - flúor fortemente ligado
(Richardson, 1967) e com isso a sua resistência a desmineralização (Takagi et al., 2000).
A formação do “CaF2” aumenta com o tempo de contato dos agentes fluoretados
com a superfície dental (Saxegaard e Rölla, 1988), com a concentração de fluoreto disponível
para reação (Larsen et al., 1981) e com a diminuição do pH (Rölla, 1988). Nesse sentido o
verniz-F possui algumas vantagens, pois além de possuir uma alta concentração de fluoreto,
permanece aderido à superfície dental por um tempo após a sua aplicação (Petersson, 1993).
Contudo, como a maior parte do fluoreto (NaF) do verniz-F encontra-se insolúvel e ligado a
uma matriz hidrofóbica de colofônia, apenas uma pequena parcela está disponível para reação
imediata (Dijkman e Arends, 1988). Dessa forma, uma retenção prolongada do produto sobre
os dentes tem sido clinicamente sugerida para permitir que o fluoreto possa se solubilizar nos
fluidos bucais e reagir de forma mais completa com o esmalte.
15
No entanto, não há consenso sobre quanto tempo o verniz deve permanecer
aplicado sobre os dentes sem ser mecanicamente removido. As recomendações dos estudos
variam de 4 h (Du et al., 2012, Ritwik et al., 2012), 12 h ou mais (Ripa, 1990) e 24 h após a
aplicação (Weintraub et al., 2006, Gugwad et al., 2011, Arruda et al., 2012). O próprio
fabricante do Duraphat® (Colgate-Palmolive, New York) recomenda que o paciente não coma
alimentos duros ou escove os dentes por, pelo menos, 4 h após a aplicação.
Essas divergências podem ser atribuídas às limitações metodológicas dos estudos
realizados para estabelecer um tempo preciso de manutenção verniz-F sobre as superfícies
dentais. Assim, Retief et al. (1980) mostraram que a incorporação do fluoreto foi aumentada
quando o tempo de contato do verniz-F com o esmalte foi prolongado (de 1 até 24 h) e que a
retenção do fluoreto foi diminuída pela exposição em saliva artificial. Todavia, neste estudo
apenas a concentração total de flúor foi medida e não os reservatórios de flúor fracamente
ligado ao esmalte. Além disso, a utilização da saliva artificial como marcador não é adequada
para avaliar a eficácia anticárie do verniz-F (Bolis et al., 2015). Bruun e Givskov (1991) não
observaram diferenças na reatividade do verniz Duraphat® com o esmalte quando mantido
sobre os dentes por 6 ou 18 h, porém não realizaram uma simulação do clearance salivar. Isso
pode ter mascarado os resultados, pois os níveis de fluoreto podem ficar saturados após um
determinado tempo se não houver renovação da saliva.
Em contrapartida, um estudo conduzido sem as limitações metodológicas dos
citados anteriormente, demonstrou in vitro que o verniz Duraphat® formou significativamente
uma maior concentração de fluoreto no esmalte quando mantido de forma prolongada sobre a
superfície dental, com um pico máximo às 24 h após a aplicação (Fernández et al., 2014).
Com isso, foi sugerido que um tempo de retenção mais longo do que o geralmente utilizado
nos estudos clínicos poderia aumentar o efeito anticárie do verniz, porém ainda sem dados
clínicos a esse respeito.
Além disso, apesar de já ter sido demonstrado que a quantidade de fluoreto no
biofilme é proporcional à quantidade de “CaF2” formado na superfície dental após APF e isso
melhora o efeito anticárie (Tenuta et al., 2008), também ainda não está clinicamente
estabelecida a relação entre a capacidade de retenção desses reservatórios formados após a
aplicação do verniz-F e a cinética de liberação do fluoreto com consequente enriquecimento
do biofilme dental, o que é relevante para avaliar o efeito anticárie do produto.
Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar clinicamente a
concentração de fluoreto no esmalte e no biofilme dental em função do tempo de manutenção
do verniz-F sobre os dentes.
16
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Cárie: definição e fatores etiológicos envolvidos
O termo cárie é usado para descrever os resultados – sinais e sintomas – de uma
dissolução química da estrutura dental causada pelos eventos metabólicos que ocorrem no
biofilme que recobre a área afetada. É considerada uma doença biofilme-açúcar dependente
por levar a uma destruição progressiva e localizada da estrutura mineral dos dentes pelos
ácidos produzidos pelo metabolismo bacteriano quando da exposição frequente a açúcares
fermentáveis da dieta, especialmente se ocorrer com uma frequência elevada (6x/ dia ou mais)
(Fejerskov e Kidd, 2011). Assim, somente irá ocorrer em superfícies onde há o acúmulo de
biofilme (fator necessário) e se houver exposição frequente a carboidratos (açúcares)
fermentáveis da dieta (fator determinante negativo). Ainda nesse contexto, a saliva e a
presença de fluoreto são considerados fatores determinantes positivos para a doença, pois
constituem-se em agentes de proteção (Tenuta e Cury, 2010). Adicionalmente, se for
considerada a natureza multifatorial da doença, fatores sociais e comportamentais também
podem modificar a sua evolução (Fejerskov e Manji, 1990).
A cárie ocorre como um desequilíbrio físico-químico entre os íons presentes no
dente e nos fluidos bucais. Em condições fisiológicas, a saliva e o fluido do biofilme
encontram-se supersaturados em relação à hidroxiapatita presente na estrutura dental,
equilibrando o processo de troca iônica (desmineralização e remineralização) e impedindo a
sua dissolução. Contudo, na presença de biofilme e açúcar, ocorre um desequilíbrio dinâmico
e progressivo nesses processos de perda e ganho de minerais entre o dente e o fluido do
biofilme, o qual, se não controlado resultará na formação de uma lesão ou cavitação clínica,
considerada a fase terminal da perda mineral crônica. Por outro lado, quando o biofilme é
parcialmente ou totalmente removido, a perda mineral pode ser interrompida ou mesmo
revertida para o ganho mineral porque a saliva está supersaturada em relação à apatita do
esmalte. Isso resultará na interrupção a progressão da doença, e até mesmo poderá implicar
em alguma deposição de minerais na superfície dentária (remineralização) (Kidd e Fejerskov,
2004).
O consumo frequente de açúcares é considerado um fato de risco para a cárie
(Moynihan e Kelly, 2014). Seu metabolismo pelas bactérias resulta na produção de ácidos, o
que faz com que o pH do fluido decline rapidamente para valores entre 4,5 e 5,5. Nesse caso o
equilíbrio do sistema é deslocado para a dissolução mineral da estrutura dental
17
(desmineralização) devido ao aumento da solubilidade da hidroxiapatita nessa condição (a
solubilidade da apatita aumenta 10 vezes com uma redução de uma unidade de pH). No
esmalte dentário, em um pH inferior a 5,5 a hidroxiapatita se dissolverá (pH crítico para o
esmalte), o que ocorrerá na dentina em pH inferior a 6,5 (pH crítico para dentina) (Dawes,
2003). Quando o pH está acima do nível crítico ocorre precipitação (remineralização) da fase
mineral (Cury e Tenuta, 2009). Dentre os carboidratos (açúcares) da dieta, a sacarose é
considerado o mais cariogênico por ser capaz de alterar a composição da matriz do biofilme,
servindo de substrato para a produção de polissacarídeos extracelulares pelas bactérias. Por
sua vez, esses polissacarídeos aumentam a cariogenicidade do biofilme alterando suas
propriedades de permeabilidade e aderência (Dibdin e Shellis, 1988).
Já foi estabelecido que o consumo de sacarose em altas frequências está
diretamente relacionado com o desenvolvimento de cárie. Em um estudo in situ com 12
voluntários, foi gotejada uma solução de sacarose a 20% por 0, 2, 4 e 8 vezes ao dia sobre
blocos de esmalte humano acoplados a dispositivos acrílicos intrabucais durante 28 dias. Os
resultados mostraram uma maior formação de lesões de mancha branca em dentes expostos a
sacarose 4x e 8x/dia, quando comparado ao controle (0x/dia) e 2x/dia. Além disto, o biofilme
formado na presença de sacarose 8x ao dia apresentou 3x mais glucanos insolúveis (Cury et
al., 1997). Em outro estudo in situ, o biofilme formado na presença de sacarose também foi
mais cariogênico que aquele formado na presença de glicose e frutose e resultou em maior
perda mineral do esmalte, além de apresentar maior concentração de glucanos insolúveis
(Cury et al., 2000).
Diante do exposto, as medidas mais efetivas para o controle da cárie, assim como
em qualquer outra doença, devem estar direcionadas aos fatores etiológicos envolvidos, no
caso, a remoção ou desorganização do biofilme (Axelsson et al., 2004) e o aconselhamento
dietético com disciplina no consumo de carboidratos fermentáveis (Feldens et al., 2010).
Entretanto, a medida de maior impacto para o controle do desenvolvimento da cárie tem sido
o uso de fluoretos. Embora o uso isolado de Flúor não seja capaz de interferir nos fatores
responsáveis pela doença e impedir sua ocorrência, é extremamente efetivo em reduzir e
controlar sua progressão (ten Cate, 2013), mesmo em baixas concentrações (Tenuta e Cury,
2010).
18
2.2 Mecanismo de ação do Flúor
Ainda antes da metade do século passado, publicações indicavam a possibilidade
de que flúor poderia ser utilizado no combate à cárie dentária humana, contudo ainda havia
uma forte discussão se o seu mecanismo de ação seria local ou sistêmico. Estudos apontavam
a importância da água como responsável pela incorporação do F- nos ossos e dentes. Um
trabalho realizado por Cheyne (1942) já demonstrava a preocupação em esclarecer isso. Em
seu estudo com crianças de 4-6 anos, divididas em dois grupos: teste (aplicação de F:
KF2H2O) e controle (profilaxia), os resultados indicaram que após um ano as crianças do
grupo controle tiveram mais cárie do que as do grupo teste. O total de superfícies com novas
lesões/criança foi de 6,04 para o controle 3,09 para o teste. O autor concluiu que o F- age na
prevenção de novas lesões e retarda o progresso da cárie.
Anos depois, Fejerskov et al. (1981) publicaram uma revisão sugerindo que os
programas de prevenção em saúde bucal fossem baseados no conhecimento da atualidade
sobre os possíveis mecanismos cariostáticos do F-. Mostravam que a ciência colocava em
dúvida a relação entre a experiência de cárie e o conteúdo individual de fluoreto do esmalte.
Além disso, afirmavam que o conteúdo de F- no esmalte superficial entre dentes
desenvolvidos em áreas baixas e "ótima" concentração de F- era muito pequeno para explicar
qualquer efeito significativo sobre a taxa de dissolução do esmalte. Indicavam que a principal
explicação para o efeito cariostático do F- deveria ser procurada em seu efeito local no
ambiente oral, discutidos os possíveis efeitos sobre a colonização da placa, composição e
atividades metabólicas. Descreveram o efeito do F- sobre a dissolução do esmalte na fase
líquida, mesmo em baixas concentrações e assim concluíam que o principal efeito cariostático
da fluoretação da água, dentifrícios e enxaguatórios bucais poderia ser atribuído a aumentos
regulares na atividade de íons de fluoreto nos fluidos orais. Terminavam sugerindo também
que o efeito de concentrações elevadas de soluções tópicas de fluoreto poderia estar
relacionado a uma dissolução lenta de fluoreto de cálcio depositado nas lesões de cárie
iniciais, fazendo com que o aumento da concentração do F- fosse mantido localmente por
longos períodos de tempo.
Pelo exposto, durante muito tempo acreditou-se que o mecanismo de ação do F-
era exclusivamente sistêmico e que o F- incorporado aos dentes na forma de FA os tornaria
menos suscetíveis à dissolução mineral e, portanto mais resistentes à cárie. Contudo,
atualmente se sabe que no desenvolvimento dentário apenas 5% a 10% de flúor é incorporado
nos cristais presentes na superfície do esmalte, por substituição parcial da HA por FA. Além
19
disto, foi observado por Fejerskov (2004) que mesmo nas camadas mais ricas em fluoretos,
como os 50 μm mais externos do esmalte, a concentração de flúor não ultrapassa 3000 ppm,
valor muito inferior ao necessário para formar um mineral composto exclusivamente por FA
(aproximadamente 38000 ppm F-), que seria de fato um mineral menos solúvel.
Assim, atualmente há consenso de que o efeito do F- incorporado ao dente é
secundário e que o seu principal efeito anticárie ocorre quando estiver presente localmente
(fluido do biofilme e saliva) na sua forma livre e solúvel e no momento adequado (exposição
à sacarose) para interferir nos eventos de desmineralização e remineralização, sendo eficaz até
mesmo em baixas concentrações (Cury e Tenuta, 2009). Isso pode ser explicado pela menor
solubilidade da FA em relação à HA presente na estrutura dental. Sendo um mineral menos
solúvel, a FA é que tende a se precipitar mais facilmente do que a HA em meio contendo
cálcio e fosfato inorgânico presentes na saliva e biofilme dental. Desta forma, quando o F-
estiver presente na cavidade bucal, toda perda mineral que estiver ocorrendo sob o biofilme
dental cariogênico tenderá a ser parcialmente revertida pela precipitação da FA no dente, com
consequente reposição de parte dos minerais perdidos. Com isso, o mecanismo de ação do
fluoreto no controle da cárie pode ser atribuído à redução da perda mineral liquida pela sua
capacidade de diminuir a desmineralização e ativar a remineralização do esmalte e da dentina
(Tenuta e Cury, 2010).
Nessa perspectiva, como o principal efeito do F- no controle de cárie é pós-
eruptivo, qualquer meio de utilização de F-, para ser considerado eficaz, deve ser capaz de
fornecer e manter a sua concentração na cavidade bucal. Dessa forma, o F- pode ser entregue
ao meio bucal em veículos que contenham baixa concentração (<1.500 ppm F-), como, por
exemplo os dentifrícios fluoretados e enxaguatórios bucais ou mesmo incorporado a água de
abastecimento. Ainda pode ser aplicado profissionalmente por meio de produtos que
contenham alta concentração (de 9.000 a 56.000 ppm F-), como os géis, mousses e vernizes
(ten Cate, 2004). Fatores como concentração de fluoreto, solubilidade, frequência de
aplicação e tempo de contato com a superfície dental podem ter influência na eficácia do
produto (Tenuta e Cury, 2010).
20
2.3 Reatividade do fluoreto com o esmalte dental
A aplicação profissional de produtos fluoretados em alta concentração (APF), na
forma de géis e vernizes, forma reservatórios de fluoreto de cálcio - “CaF2” (flúor fracamente
ligado), cuja formação pode iniciar imediatamente após a aplicação desses produtos, já nos
primeiros 20 segundos (Petzold, 2001). Esse mineral se forma pelo contato do fluoreto, em
alta concentração no produto, com íons cálcio disponíveis na cavidade bucal e funciona como
um reservatório de fluoreto, liberando o íon para o meio bucal para interferir com o processo
de cárie (ten Cate, 1997). De maneira adicional aumenta a quantidade de fluorapatita no
esmalte (flúor fortemente ligado) e consequentemente a sua resistência a desmineralização
(Takagi et al., 2000),
Os estudos sobre a formação de depósitos de “CaF2” após a aplicação de produtos
fluoretados remontam a antes da metade do século passado.
Cheyne (1942) estudaram de maneira combinada (in vivo e in vitro) a formação
de “CaF2” e FA após a aplicação de solução fluoretada sobre os dentes. No estudo in vivo
foram utilizados quatro pré-molares com extração indicada. Um dos dentes foi classificado
como controle e os demais receberam diferentes tratamentos, com diferentes concentrações de
fluoreto e pH. As extrações dos dentes foram realizadas após 5 min e após 14 dias dos
tratamentos. A partir dos dentes extraídos, blocos de esmalte foram confeccionados e a
concentração de F- nos blocos foi determinada após extração ácida. No estudo in vitro, blocos
de esmalte humano foram tratados com soluções de fluoreto em diferentes concentrações e
pH, sendo que alguns blocos receberam ataque ácido previamente ao tratamento. Os blocos
foram colocados em água por oito dias e a concentração de Ca, fósforo (P) e F- foi
determinada na solução. Os resultados demonstraram que após a aplicação de solução
fluoretada sobre os dentes e os blocos houve a formação de “CaF2” e FA. Entretanto, a maior
parte do “CaF2” formado foi perdido em algumas horas e apenas a FA foi retida no esmalte,
mas em uma concentração pequena. Dessa forma sugeriram de que o “CaF2” formado após
aplicação tópica de fluoreto é perdido em poucas horas e, portanto, teria pouca relevância no
controle da cárie, com base no conceito da época, de que a formação de FA era a única
responsável pelo efeito anticárie do fluoreto.
McCann e Bullock (1955) investigaram a reação entre o fluoreto com o esmalte e
a dentina pulverizada a partir de várias concentrações de F-. Demonstraram que quando da
utilização de uma alta concentração de F- (> 2.000 ppm F
-) a formação de “CaF2” era
favorecida e que concentrações de 100 ppm ou menos favoreciam a formação de FA.
21
Também sugeriram que a aplicação tópica de F- forma “CaF2”, o qual pode ser convertido em
FA.
A formação de glóbulos de “CaF2” e a precipitação de FA no esmalte após a
aplicação tópica de produtos fluoretados foi demonstrada através de raios-X e elétron difração
por Brudevold et al. (1967) em um estudo onde espécimes de esmalte foram imersos em
solução aquosa de fluoreto de sódio (NaF) a 4% durante um mês. Os pesquisadores
concluíram que os depósitos de “CaF2” formados após aplicação tópica de fluoreto conferiram
proteção ácida ao esmalte quando realizado ataque ácido com HCl por 10 s. Também
relataram que a exposição prolongada em solução neutra de NaF aparentemente causou a
dissolução da HA e a precipitação da FA no esmalte.
Richardson (1967) investigou uma maneira de aumentar a fixação do “CaF2”
produzido à partir do F- aplicado topicamente e seus resultados sugeriram que um prolongado
tempo de retenção resultaria em uma maior fixação do fluoreto na superfície dental.
Retief et al. (1980) determinaram in vitro a incorporação, distribuição e retenção
do F- pelo esmalte humano após aplicação dos produtos: FFA, Verniz Duraphat® e Flúor
Protector®. Após 3 min da aplicação todos os dentes tratados foram colocados em saliva
artificial por 1 ou 24 h. Os resultados demonstraram que nos dentes tratados com vernizes
após as 24 h de exposição na saliva aumentaram a concentração de F-. Os autores sugeriram a
importância do contato entre o verniz-F e a superfície do dente por um longo período,
simulando a situação clínica de 24 h. Entretanto, à medida que os dentes foram ficando na
saliva os resultados também indicaram que o F- adquirido no esmalte não foi retido
permanentemente, mas diminuiu gradativamente. Após uma APF com verniz-F e FFA, a
incorporação, distribuição e retenção do F- se mostrou geralmente maior nos dentes tratados
com o verniz-F e por último com o FFA. Concluíram que a incorporação e distribuição do F-
são aumentados quando o tempo de contato do verniz-F com o esmalte é aumentado e que a
retenção do F- é diminuída pela exposição em saliva artificial.
Larsen et al. (1981) realizaram um estudo in situ para investigar a reatividade dos
produtos a base de NaF 0,2% e 2% e FFA a 2,73% pH 3,0 com o esmalte bovino. Observaram
que após a aplicação dos produtos houve formação de “CaF2” sobre o esmalte pré-
desmineralizado e hígido, dependente do tipo de solução do tratamento. A concentração de F-
e o pH foram os principais fatores que influenciaram a formação de “CaF2”. A dissolução do
“CaF2” variou com o tratamento dos dentes e o tipo de solução tópica e dessa forma diminuiu
rapidamente no esmalte hígido. Porém, quando o F- foi aplicado ou foi usado em esmalte pré-
desmineralizado, o “CaF2” persistiu por longo período de tempo.
22
Benediktsson et al. (1982) testaram in vitro o efeito do tempo de contato entre o F-
na reatividade com o esmalte. Blocos de esmalte polido com áreas de superfície conhecidas
foram obtidos de incisivos inferiores humanos. FFA foi aplicado durante 4 min e lavado
depois de tempos de contato adicionais de 0, 2, 6 e 24 h, respectivamente. A concentração de
fluoreto no esmalte foi determinada em três profundidades sucessivas, antes e depois de
extração em 1 M de KOH durante 24 h. O produto da reação predominante foi “CaF2”, com
maior formação em um tempo de contato FFA-esmalte de 2 h. A concentração do fluoreto
fortemente ligado como FA atingiu o maior nível após um tempo de contato de 6 h.
Nelson et al. (1983) mostraram que o “CaF2” formado durante o tratamento do
esmalte com F- organiza-se na forma de microcristais de 4 a 15 nm, com a interposição de
uma matriz amorfa de composição desconhecida. Além disso, demonstraram que o fluoreto
fortemente ligado (FA) situava-se abaixo da camada de “CaF2”, o qual consistia em camadas
de superficiais ricas em F- no esmalte.
Sëppa (1983) estudou a influência da profilaxia prévia a aplicação do verniz-F
Duraphat® na incorporação de F
- pelo esmalte dental em incisivos centrais de 55 crianças
(idade entre 14 e 16 anos). Amostras de esmalte foram obtidas por meio de biópsia ácida antes
(baseline) e após três semanas da aplicação do verniz e mostraram que houve um aumento
significativo do teor de F- no esmalte dental sem diferenças significativas entre os grupos com
profilaxia prévia ou com os dentes recobertos de placa. O estudo sinalizou que é
desnecessário realizar profilaxia previamente à aplicação do verniz-F.
Dijkman et al. (1983) estudaram in situ e in vitro a quantidade de fluoreto
incorporada a blocos de esmalte dental após aplicação e FFA e vernizes Duraphat® e Fluor
Protector®. Concluíram através de biópsias de esmalte periódicas (1, 4 e 12 semanas) no
experimento in situ que o fluoreto incorporado no esmalte foi perdido em todos os três
tratamentos durante a primeira semana a uma taxa de cerca de 20 µg/cm2. Os dados in situ
também revelaram que a quantidade de F- incorporada ao esmalte foi insignificante após uma
semana do tratamento com APF-gel ou Duraphat®. Apenas a aplicação de Fluor Protector
®
mostrou uma incorporação de fluoreto notável por até um mês após o tratamento.
Ögaard et al. (1984) avaliaram in vivo a retenção de “CaF2” e FA no esmalte
hígido e desmineralizado de pré-molares que seriam extraídos por motivo ortodôntico após
duas semanas da aplicação de verniz Duraphat®
. A desmineralização do esmalte foi induzida
pelo uso de bandas ortodônticas para os pré-molares durante um período de quatro semanas
antes da aplicação de fluoreto. As bandas também permaneceram nos dentes durante e após a
aplicação de fluoreto (duas semanas) para manter um ambiente cariogênico. Três camadas de
23
esmalte consecutivas (cerca de 5 µm) foram posteriormente examinadas por meio da
microscopia eletrônica de varredura (MEV), a qual mostrou que as três camadas consecutivas
de esmalte sofreram desmineralização. Uma significante adsorção de F- foi encontrada na
primeira e segunda camada do esmalte sadio e nas três camadas do esmalte desmineralizado.
Uma maior quantidade de F- foi encontrada no esmalte desmineralizado e uma alta proporção
desse F- foi encontrada na forma insolúvel, comparada com o F
- do esmalte sadio. O padrão
de desmineralização diferiu dentro da área atacada. Foi sugerido que a variação no padrão de
desmineralização pode ser devido às diferenças na orientação dos cristais e a morfologia
superficial original.
Valk et al. (1985) investigaram a retenção do F- após aplicação com solução de
FFA e neutra em esmalte bovino hígido e desmineralizado. Os espécimes foram tratados por 4
min e deixados em água corrente por 0, 1, 2, 4 e 8 semanas. Foi então determinada por biópsia
a concentração de F- retido no esmalte. Os resultados indicaram que a perda do F
- retido
ocorreu principalmente durante a primeira semana, sendo que durante as semanas seguintes
nenhuma mudança significante na concentração do F- pode ser observada. Confirmaram que a
formação de “CaF2” depende mais da concentração de F- livre e do baixo pH do que a
concentração de F- total na solução.
Holmen et al. (1986) estudaram in vivo o efeito da aplicação de verniz Duraphat®
sobre lesões de cárie produzidas experimentalmente em pares homólogos de pré-molares.
Após quatro semanas de desafio cariogênico, um dente de cada par foi extraído e guardado
como controle e o homólogo recebeu uma aplicação do verniz, permanecendo com o desafio
cariogênico por mais duas semanas, antes de ser extraído. Os dentes controles mostraram
características clássicas de lesões incipientes subsuperficiais ativas. As lesões tratadas com
Duraphat® mostraram um aumento na porosidade superficial em relação ao seu controle,
enquanto a porosidade subsuperficial foi drasticamente reduzida. Quando examinado no
microscópio eletrônico de varredura, a superfície correspondente apareceu lisa, com um
nivelamento das irregularidades superficiais originais. O microscópio revelou uma rede de
espaços intercristalinos distintos. A aplicação de Duraphat® antes do restabelecimento do
desafio cariogênico aparentemente aumentou a redistribuição dos minerais nas lesões iniciais
de cárie.
Hattab et al. (1988) estudaram a aparência morfológica do esmalte humano
tratado com agentes fluoretados tópicos. Aparelhos acrílicos com blocos de esmalte foram
usados por 24 h após 5 min de aplicação de gel neutro NaF, FFA e verniz Duraphat®.
Encontraram, em todos os tratamentos, superfícies recobertas por F- em forma de glóbulos,
24
sugestivos de deposição de “CaF2”. O tamanho dos glóbulos variou de acordo com os
diferentes produtos (agentes de F-) e, em geral foram inferiores a 1 µm de diâmetro. Os
glóbulos formados após a aplicação de NaF neutro e FFA eram esféricos, enquanto que
aqueles produzidos por Duraphat® eram achatados. Concluíram que a retenção prolongada de
revestimentos de superfície ricos em F- pode atuar como um reservatório suplementar para o
microambiente do esmalte, o que contribui para a sua remineralização.
Rölla (1988) confirmaram a formação do “CaF2” sobre o esmalte após aplicação
tópica com solução de NaF a 0,2% por 10 min, com variação do pH de 3 a 7, através de
microscopia eletrônica e elétron difração. Observaram a influência do pH na solução na
formação de “CaF2”, pois quanto menor foi o pH da solução, maior foi a formação de “CaF2,
atribuindo a liberação do cálcio (Ca) mais rapidamente do dente para reagir com o fluoreto. A
superfície de esmalte tratada com solução de NaF em pH 3 ficou quase completamente
coberta com pequenos cristais, os quais obliteraram completamente a estrutura do dente.
Saxegaard e Rölla (1988) avaliaram in vitro a aquisição de fluoreto pelo esmalte
durante a aplicação tópica de produtos fluoretados, após intervalos de tempo diferentes, em
diferentes concentrações e pH. Também avaliaram a disponibilidade de íons cálcio realizada
por meio de um pré-tratamento com solução de cloreto de cálcio a 200 mmol/L por 5 min e
ácido fosfórico a 37% por 1 min. Em seus resultados verificaram que após uma aplicação
tópica com NaF houve a formação de “CaF2” sobre o esmalte e FA no esmalte. O “CaF2” foi
principal produto da reação do esmalte com o meio tópico de aplicação do flúor (> 70%). A
formação do “CaF2” aumentou com o tempo, com a concentração e com a diminuição do pH.
No entanto, o maior fator de impacto na formação do fluoreto de cálcio no estudo foi o tempo.
Os autores relacionaram o longo tempo de manutenção do verniz sobre o esmalte com o seu
efeito cariostático, formando mais “CaF2” e aconselharam o uso de formulações aciduladas de
fluoreto, que em média possui um pH ácido em torno de 3,5, ao invés de soluções neutras por
permitirem maior formação do “CaF2”.
Dijkman e Arends (1988) investigaram in situ a importância do “CaF2”
depositado no esmalte depois da aplicação de FFA gel e vernizes fluoretados Duraphat® e
Flúor Protector®. A quantidade de “CaF2” foi determinada pela extração com KOH e o F
-
incorporado ao esmalte (flúor insolúvel) através da biópsia ácida após vários tratamentos com
F- e depois do uso de blocos de esmalte em próteses por um período de uma semana. Os
resultados do trabalho mostraram que quando são comparados os três agentes de fluoretação,
apenas o Fluor Protector® mostrou uma quantidade mensurável de “CaF2” após uma semana.
Os valores do “CaF2” após uma aplicação indicaram um efeito pior do FFA e do Duraphat®
25
(semelhantes) e menores se comparados ao Fluor Protector®. Muito provavelmente, o F
- sofre
lixiviação através da película, com um coeficiente de difusão de cerca de 10-6cm2.s
-1. Os
dados mostraram que, após FFA ou aplicação de Duraphat®, uma quantidade substancial de
flúor insolúvel é removida após uma semana, o que não foi observado no caso do Fluor
Protector®. Concluíram que a eficiência dos agentes de fluoretação é provavelmente
determinada pelo período de aplicação e disponibilidade de fluoreto. Para FFA gel, Duraphat®
e Fluor Protector®, respectivamente cerca de 5%, 1% e 44% de fluoreto estão disponíveis e
participam no processo de fluoretação.
Saxegaard e Rölla (1989) realizaram dois experimentos in situ para: (1) avaliar a
cinética da aquisição de fluoreto de cálcio no esmalte a partir do uso diário de uma solução de
fluoreto de sódio a 0,023%; (2) avaliar a perda de fluoreto de cálcio a partir de blocos de
esmalte que tinham sido topicamente tratados com uma solução neutra, contendo fluoreto de
sódio a 0,9%. Blocos de esmalte foram utilizados na boca por seis voluntários por oito dias
em ambos os experimentos. Os resultados foram: (1) Durante bochechos quantidades
moderadas de F- foram adquiridas pelo esmalte sem condicionamento, mais como “CaF2” do
que FA, enquanto que no esmalte condicionado, mais flúor foi depositado como FA. Em
esmalte condicionado houve também uma tendência para que a deposição de “CaF2”
estabilizasse enquanto a incorporação de flúor total continuou. Isto pode indicar que o “CaF2”
foi transformado em FA, provavelmente através de remineralização durante ciclagem de pH
na placa que cobre o esmalte condicionado. (2) Após aplicação tópica única, verificou-se que
esmalte condicionado inicialmente possuía mais “CaF2” do que o esmalte sem
condicionamento, mas também perdeu mais durante o primeiro dia de exposição in vivo. A
perda de “CaF2” ocorreu depois de 1-2 dias, 70% sobre o esmalte condicionado e 40% no sem
condicionamento. Sugeriu-se que o aumento das quantidades de FA é proveniente do “CaF2”
no esmalte, e que este é uma fonte importante e clinicamente significativa de fluoreto. Ainda
revelaram que uma camada de proteínas e fosfato recobre esses depósitos de “CaF2”, os
estabilizando e permitindo uma lenta liberação do F-, o que o atribuiu um importante efeito
protetor em relação à cárie.
Rölla e Saxegaard (1990) revelaram evidências de que a maior parte do fluoreto
retido sobre os dentes durante a aplicação tópica é na forma de “CaF2”, e que este material é
relativamente estável na boca. Também afirmaram que a formação de “CaF2” a partir de
agentes de aplicação tópica deve ser aumentado e não reduzido, como se acreditava no
passado. O aumento da deposição de “CaF2” pode ser conseguido com o aumento do tempo
26
de reação entre o F- e esmalte, reduzindo o pH da solução, o aumento da concentração ou pré-
tratamento com cálcio.
Bruun e Givskov (1991) avaliaram in vitro a formação de “CaF2” no esmalte com
e sem lesões de cárie de esmalte depois do tratamento com 2% de NaF neutro ou Duraphat®.
Lesões de cárie semelhantes foram criadas pela exposição ao FFA gel (pH 4,5) em uma área
exposta de 0,07 cm2. A mesma área de foi usada em série (n = 10) durante a aplicação de NaF
durante 1 ou 5 min, ou durante 18 h ou Duraphat® durante 6 ou 18 h. O “CaF2” foi extraído
com KOH 1 M durante 24 h, e fluoreto foi determinado por cromatografia em fase gasosa. As
aplicações de curto prazo de NaF produziram apenas quantidades insignificantes de “CaF2”.
Concluíram que o tratamento convencional de 5 min com NaF produziu a mesma quantidade
do “CaF2” como quando houve a exposição ao Duraphat® por 6 ou 18 h.
Rölla et al. (1993) publicaram uma revisão sobre a aplicação tópica de fluoretos
nos dentes, abordando novos conceitos. Nela reforçaram que o “CaF2” parece ser o único
produto que é formado sobre o esmalte, dentina ou cemento durante tratamentos tópicos com
flúor ou o uso contínuo de dentifrício fluoretado. Relataram que o “CaF2” é estável no
ambiente bucal, ao contrário do que se acreditava anteriormente e que a atuação dinâmica
desse “CaF2” formado ocorre durante o desafio cariogênico em função da queda do pH do
biofilme, onde a camada protetora do “CaF2” é dissolvida, levando à sua exposição e
solubilização parcial.
Skold-Larsson et al. (2000) mensuraram o teor de F- no biofilme de trinta
adolescentes saudáveis com idade média de 14,1 anos (15 meninos, 15 meninas, idade 12-17
anos), todos em tratamento com aparelhos ortodônticos fixos. Fizeram isso após uma única
aplicação tópica de vernizes fluoretados com diferentes níveis de F-, Todos os vernizes
aumentaram a concentração de flúor no biofilme em comparação ao baseline. Comparado
com o grupo controle, os aumentos mais significativos foram registrados para o Bifluride®
após 3 dias e 7 dias e Duraphat® após 3 dias, enquanto não houve diferenças significativas
para o Flúor Protector®. A concentração de flúor no biofilme voltou aos níveis basais para
todos os participantes do grupo Duraphat® após sete dias, quando alguns indivíduos no
Bifluride® e grupos Fluor Protector
® ainda registravam ligeiro aumento nos níveis de F
- após
30 dias.
Takagi et al. (2000) pesquisaram in vitro o efeito do fluoreto fortemente ligado ao
dente (FA) sobre a formação de cáries do esmalte, isolando o efeito do flúor fracamente
ligado (“CaF2”). Utilizaram 18 amostras de esmalte fino, preparados a partir da lingual ou
superfícies vestibulares de molares humanos extraídos, os quais foram incluídos em resina
27
acrílica com as superfícies de esmalte expostas. Após os ciclos de tratamento, as secções
foram lavadas em uma solução constante para remover o F- fracamente ligado. Em seguida
submeteram as amostras a ciclos de desmineralização (6 h) e a remineralização (18 h) cada
dia durante 5 dias, para produzir lesões de cárie como nas amostras. Os resultados indicaram
que a perda mineral foi significativamente diferente entre os diferentes grupos (p < 0,05) e
mostraram que a resistência do esmalte à formação de lesões aumentou com o teor de F-
fortemente ligado ao dente.
Petzold (2001) estudaram in vitro a intensidade de deposição e a microestrutura
do fluoreto fracamente ligado ao esmalte dental após aplicação tópica de produtos fluoretados
à base de fluoreto de amina, fluoreto de sódio e monofluorfosfato de sódio. Concluíram que
sob certas condições houve formação de glóbulos de “CaF2” dentro de um tempo de início de
menos de 20 s e que a intensidade da deposição pareceu ser dependente da disponibilidade de
íons Ca e F na superfície dentária. Também revelaram a formação de uma microestrutura
cristalina de “CaF2” com a incorporação de fósforo e oxigênio, em função do tempo de
tratamento.
Castillo e Milgrom (2004) realizaram um estudo para avaliar o F- liberado de
vernizes fluoretados aplicados em dois diferentes protocolos. Para isso aplicaram verniz sobre
blocos de esmalte de dentes molares decíduos ou em uma única aplicação (cinco amostras) ou
três vezes em uma única semana (cinco amostras) com verniz-F (Duraphat®, Colgate-
Palmolive). As amostras foram imersas em uma solução tamponada de fosfato de cálcio (pH
6), para simular ambiente oral e a quantidade de fluoreto liberado foi medido durante um
período de seis meses. Os resultados indicaram que uma liberação de F- total foi
significativamente maior no esquema de três aplicações (34,9 µMol) do que na aplicação
única (23,7 µMol) e que a taxa de liberação foi mais lenta usando o regime de três aplicações.
Hayacibara et al. (2004) em um estudo in vitro avaliaram a reatividade da
aplicação tópica profissional dos produtos: I - FFA gel a 1,23% F; II – Espuma para APF
(1,23% F) e III – Verniz-F (2,26% F) com o esmalte bovino. Os produtos FFA foram
aplicados por 4 min e o verniz por 24 h sobre os blocos mantidos em ambiente úmido e sua
remoção foi realizada com espátula e acetona. Os resultados demonstraram que todos os
produtos fluoretados foram capazes de formar “CaF2” sobre o esmalte. Uma maior reatividade
em relação à concentração de “CaF2” nos blocos bovinos foi encontrada na espuma, seguido
do gel e verniz. Os autores atribuem os resultados obtidos ao pH e ao veículo dos produtos
utilizados do que a concentração de F- encontrada nos produtos.
28
Tenuta et al. (2008) realizaram um experimento in situ de curta duração, duplo-
cego e cruzado. Blocos de esmalte bovino foram previamente tratados com uma solução não
fluoretada (grupo controle negativo) ou uma solução de NaF 0,5 M (pH 3,5). Para que o
esmalte apresentasse diferentes concentrações de “CaF2”, os blocos tratados com F foram: não
envelhecidos, ou envelhecidos precocemente por 6 h e 48 h em fluxo contínuo de saliva
artificial. Em duas fases experimentais, dez voluntários utilizaram um dispositivo palatino
contendo 8 blocos de esmalte com microdureza de superfície pré-determinada (quatro blocos
de cada tratamento em cada lado), cobertos por uma ‘placa teste’ de S. mutans IB1600. Aos
30 min de uso, a ‘placa teste’ em contato com dois blocos de cada tratamento foi coletada. Os
blocos restantes foram submetidos a um desafio cariogênico, realizado com solução de
sacarose a 20%, e após 45 min a ‘placa teste’ e os blocos foram coletados para análises. Os
resultados desse estudo demonstraram haver relação de dose resposta entre as diferentes
concentrações de fluoreto de cálcio no esmalte, a liberação de fluoreto para o fluido do
biofilme e o efeito da inibição da desmineralização. Assim os autores concluíram que efeito
anticárie da aplicação de F- profissional deve ser atribuída a liberação de
F- dos reservatórios
de “CaF2” do esmalte para o fluido do biofilme.
Santos et al. (2009) avaliaram o efeito da aplicação de produtos fluoretados no
desenvolvimento de lesões cariosas em esmalte de dentes decíduos extraídos, que foram
divididos entre os grupos: 1- controle (tratamento com dentifrício sem flúor); 2- tratamento
com FFA gel (1,23% F-, FFA, Dentsply); 3- tratamento com verniz-F Duraflur® (2,26% F,
NaF, Dentsply); 4- verniz-F Duraphat® (2,26% F-, NaF, Woelm & Pharma Co.); 5- verniz-F
Fluorniz® (2,26% F, 5% NaF, SS White); 6- verniz-F Fluorphat
® (2,26% F-, 5% NaF,
Inodon); 7- verniz-F Duoflurid® (2,71% F-, NaF, 6% CaF2, FGM); 8- Cariestop
® (12%
diaminofluoreto de prata, Biodinâmica); 9- dentifrício fluoretado para crianças (500 ppm F-,
Colgate-Palmolive). Os produtos testados foram aplicados nas amostras de acordo com as
recomendações de cada fabricante, e logo após as amostras foram submetidas a 10 ciclos de
alternância de pH, com imersão em solução desmineralizante (pH 4,3, 3h) e solução
remineralizante (pH 7,0, 21h), durante 14 dias. Após o experimento, a profundidade da lesão
cariosa das amostras foi analisada através de microscopia de luz polarizada, e mediante aos
resultados obtidos, os autores concluíram que todos os produtos testados promoveram uma
redução na profundidade das lesões (entre 28% a 58%), porém nenhum dos produtos foi
eficaz em prevenir completamente as lesões cariosas artificiais. O melhor efeito cariostático
foi atingido pelo verniz-F Duraphat® e o mais baixo, pelo dentifrício fluoretado.
29
Ritwik et al. (2012) compararam in vitro a taxa de liberação de flúor de vernizes
fluoretados no período de 48 h e visaram determinar o momento em que ocorreu um patamar
de liberação. Para isso utilizaram quatro vernizes fluoretados disponíveis no comercio,
Premier esmalte ProVarnish® (EP), Colgate Prevident
® (PB), Omni Varnish
® (OV) e Omni
VarnishXT® (OVXT). Os vernizes foram aplicados em 40 dentes humanos permanentes, onde
dez dentes serviram como controles. Os dentes foram imersos em saliva artificial e nas 1, 2, 4,
8, 12,24 e 48 h foram sequencialmente transferidos para novos frascos. TISAB III e eletrodo
íon-seletivo foram usados para medir a concentração de flúor nas amostras e ferramentas
estatísticas foram usadas para comparar as taxas de liberação de flúor e determinar o patamar
de sua liberação. Os resultados mostraram um patamar de liberação de flúor após 4 h para os
grupos CP, EP e OV. O grupo OVXT não mostrou uma mudança significativa na liberação de
flúor em qualquer ponto do tempo e o EP teve a maior liberação de flúor presente nas
primeiras 8 h. Os autores concluíram que os vernizes CP, EP e OV apresentaram uma taxa
máxima de liberação de flúor nas primeiras 4 h enquanto o verniz OVXT não apresentou um
período de platô. Os vernizes estudados liberaram diferentes concentrações de flúor, apesar do
fato de todos eles conterem fluoreto de sódio a 5%.
Maas et al. (2013) avaliaram in vitro a formação de “CaF2” no esmalte e o efeito
anticárie de sete vernizes à base de resina sob desafio cariogênico. Blocos de esmalte foram
submetidos a ciclos de pH, simulando desafio cariogênico. Os grupos experimentais
receberam aplicação de verniz fluoretado, o controle positivo recebeu aplicação tópica de
flúor gel, e o controle negativo não recebeu qualquer tratamento. A dureza superficial (SH1) e
a perda da dureza da subsuperfície (DKHN) foram então determinadas. Foi mensurada a
quantidade de F- liberada na solução de desmineralização/remineralização (DE-RE) utilizadas
na ciclagem de pH. A concentração de F- foi determinada 24 h após aplicação dos produtos no
esmalte como flúor fracamente ligado ou o flúor total. Os resultados mostraram quantidades
maiores de depósitos de flúor fracamente ligado para os vernizes Duofluorid®, seguido por
Biophat®
. Duraphat®, Bifluorid
®, Durafluor
® e Duofluorid
®. Porém nenhuma diferença foi
observada nos valores de SH1 e DKHN, com a perda mineral menor em comparação com os
outros grupos. O Bifluorid® e o Duofluorid
® liberaram quantidades elevadas de F
- nos ciclos
DE-RE, sendo a diferença estatisticamente significativa para os demais. Os autores
concluíram que o efeito anticárie não mostrou correlação com quantidades mais elevadas de
fluoreto depositadas, tipo de resina, ou a fonte de fluoreto - vernizes ou gel.
Mohammed et al. (2013) demonstraram in vitro que a formação de flúor--
hidroxiapatita e de “CaF2” estão relacionados com a concentração de F- na fase solúvel do
30
sistema. Abaixo de 45 ppm o F- substitui a estrutura mineral do esmalte como flúor-
hidroxiapatita. Aos 45 ppm formam-se FA e “CaF2” em quantidades similares e acima dos 45
ppm ocorre uma maior formação de “CaF2” na superfície do esmalte.
Fernández et al. (2014) realizaram um estudo in vitro para testar a reatividade do
verniz Duraphat® com esmalte formando reservatórios de “CaF2” em função do tempo. Foi
avaliada a contribuição relativa do verniz solúvel e insolúvel do flúor para reagir e formar
produtos no esmalte. Para isso, todo o verniz com fluoreto solúvel e insolúvel (concentração
total de fluoreto de 23699 ± 384 ug de F / g), ou centrifugado, contendo apenas o fluoreto
solúvel (concentração de flúor de 258 ± 97 mg F / g), foram aplicados de um modo
normalizado sobre blocos de esmalte (n = 8 / grupo de verniz / h), que eram imersos em saliva
artificial continuamente renovada por até 36 h. Reservatórios de “CaF2” formados no esmalte
por aplicação de verniz foram extraídos com 1 M KOH e a concentração de fluoreto foi
medida com eletrodo específico. Os resultados foram expressos como ug F /cm² de área de
esmalte. O verniz total formou significativamente uma maior concentração de F no esmalte do
que o verniz centrifugado, atingindo uma máxima concentração às 24 h (22,0 ± 4,5 g F/cm²).
O verniz centrifugado alcançou concentração máxima em 6 h (3,20 ± 0,81 mg F / cm²). Em
conclusão, um tempo de retenção mais longo do que o geralmente recomendado pode
melhorar o efeito anticárie do verniz Duraphat®, permitindo que as partículas de NaF,
inicialmente insolúveis na matriz de verniz, prolonguem a reatividade com o esmalte.
Bolis et al. (2015) investigaram a captação de F- pelo esmalte após a aplicação de
vernizes fluoretados comparando com a liberação de flúor em saliva artificial. A hipótese
testada foi que a incorporação de F- é maior para os produtos que apresentam liberação mais
rápida de F-. Os resultados indicaram que o tempo de retenção do verniz sobre o esmalte foi
um fator que afetou a incorporação de F-. Embora nenhum aumento significativo foi
observado para o Duraphat® entre 1 e 4 h, aumentou depois de 24 h, corroborando com
estudos que indicam a reação com dependente do tempo. Por outro lado, concluíram que a
absorção de fluoreto pelo esmalte não pode ser prevista a partir da taxa de liberação de
fluoreto de um produto e que a liberação de fluoreto em saliva artificial não pode ser usada
como medida para a eficácia de um verniz fluoretado.
Bonetti e Clarkson (2016) investigaram in vivo, a concentração de F- no esmalte
após aplicações semianuais com verniz-F Duraphat® (2,2% F) e Flúor Protector
® (0,7% F) e
compararam a concentração de F- no dente tratado com a eficácia dos vernizes F
- na
reatividade. Após seis meses da última aplicação (cinco aplicações totais) foi realizada a
determinação da concentração de F- e observaram que houve um aumento na concentração de
31
F- no esmalte para ambos os tratamentos. Os autores reconheceram que devido às análises
serem realizadas após seis meses do estudo a composição de F- solúvel no esmalte foi
“removida” e que o aumento na concentração de F- achada representou principalmente FA.
2.4 Verniz-F
2.4.1 Histórico, utilização e toxicidade
O verniz-F (verniz fluoretado) foi desenvolvido nos anos 1960 como coadjuvante
aos meios de aplicação tópica de fluoretos para a prevenção e controle da cárie, com o
diferencial de prolongar o contato entre o F- e o esmalte dental na presença de saliva. Contém
5% de fluoreto de sódio (22600 ppm de F) em uma base natural ou sintética e quando
aplicado sobre o dente tem a propriedade de aderir à superfície permitindo a liberação
contínua de fluoreto para o esmalte, placa e saliva (Blinkhorn e Davies, 1998) . Os
reservatórios de fluoreto “CaF2” quimicamente formados no esmalte pela reação do fluoreto
solúvel presente no verniz são considerados responsáveis pelo mecanismo de ação anticárie
(ten Cate, 1997), e já foi sugerido que essa reação é dependente do tempo de manutenção do
verniz em contato com o dente (Bruun e Givskov, 1991, Fernández et al., 2014).
O Duraphat®
foi o primeiro verniz-F lançado no mercado europeu, criado na
Alemanha, em 1964 e produzido pela A. Natherman & Cie. O produto é composto de uma
resina natural (colofônia), que contém 5% de fluoreto de sódio (NaF) ou 22.600 ppm de F-.
Somente foi aprovado pela Food na Drug Admnistration (FDA) em 1994 para tratamento da
hipersensibilidade dentinária e forramento cavitário (Vaikuntam, 2000).
Em contato com a saliva, o verniz se solidifica na superfície dentária formando
uma fina camada que permanece por um maior período de tempo quando comparado a outros
meios de uso de fluoretos (ten Cate, 2013). Para aplicá-lo recomenda-se a escovação dentária
prévia, apesar de já ter sido demonstrado que não existe necessidade da realização de uma
profilaxia dental prévia e que a captação de flúor pelo esmalte não é reduzida pela presença de
biofilme dental (Seppa, 1983). Também recomenda-se que após a limpeza por escovação, os
dentes sejam isolados com roletes de algodão e secos com ar e a aplicação seja feita com o
auxílio de hastes com ponta de algodão, escovas ou pincéis (Blinkhorn e Davies, 1998).
O uso de fluoreto tendo como meio o verniz apresenta algumas vantagens, que
incluem o menor tempo clinico exigido (quando comparado com os fluoretos em forma de gel
ou espuma) e a facilidade de aplicação, especialmente em crianças pequenas. Além disso,
32
oferecem segurança e são bem tolerados, com relatos muito raros de alguma reação de
hipersensibilidade atribuída ao seu uso (Marinho et al., 2003). A dose provavelmente tóxica
(DPT) estimada para os fluoretos é de 5mg/Kg de peso e em uma aplicação de verniz-F em
crianças pré-escolares e escolares utiliza-se aproximadamente 0,5 ml do produto, o que
corresponde a 11mg de flúor. Es quantidade é inferior à DPT, que na idade de 1 a 5 anos
variaria entre 50mg e 100mg de flúor. Além disso, a ingestão de flúor decorrente da aplicação
do verniz ocorre lentamente, o que evita um episódio de intoxicação aguda (Cury e Tenuta,
2008).
Conforme a especificação do fabricante (Colgate-Palmolive, New York), o verniz-
F Duraphat® é contraindicado em pacientes que possuam gengivite ulcerativa, estomatite ou
sensibilidade à colofônia ou a algum outro ingrediente da fórmula. Em casos raros de alergia
ao produto pode ocorrer o aparecimento de edema, náusea e dispnéia em crianças asmáticas.
Contudo, apesar dos efeitos adversos relacionados ao uso dos vernizes fluoretados serem
considerados pouco frequentes, eles deveriam ser mais bem investigados (Marinho et al.,
2002).
Ekstrand et al. (1980) investigaram o nível de flúor no plasma e na urina de
crianças saudáveis, com idades variadas (4, 5, 12 e 14 anos), que receberam aplicações de
verniz-F. A concentração mais elevada de F- encontrada no plasma variou de 60 a 120 ng/ml,
sendo maior nas 2 h após a aplicação. Foi confirmado também que as concentrações retornam
aos valores iniciais (baseline) após 24 h. Durante as 12 h subsequentes à aplicação, uma
elevada excreção de F- foi encontrada em todos os participantes quando comparada com os
valores basais. Os autores concluíram que não ocorrerão efeitos tóxicos quando as
quantidades máximas de verniz-F são respeitadas no momento da aplicação.
2.4.2 Ação anticárie
O efeito anticárie do verniz-F é baseado em evidências e vários trabalhos
contribuíram para essa afirmação:
Marinho et al. (2002) por meio de uma revisão sistemática da literatura
selecionaram ensaios clínicos aleatorizados, cegos, que compararam o verniz-F ao verniz
placebo ou controle (sem tratamento) em crianças de até 16 anos de idade com
acompanhamento de pelo menos um ano. O principal desfecho estudado foi o incremento da
cárie, medido pela variação do decréscimo de superfícies dentarias cariadas, perdidas ou
obturadas. Após a avaliação da literatura, nove estudos foram incluídos, envolvendo 2.709
33
crianças, sendo que destes, sete estudos contribuíram com os principais dados para as análises
realizadas na revisão. Os estudos selecionados mostraram uma estimativa de
aproximadamente 46% de redução na incidência de lesões cariosas, através da avaliação do
índice CPOS (superfícies cariadas, perdidas e obturadas), concluindo que a aplicação de
verniz-F duas vezes por ano mostrou-se eficaz na redução de cárie dentária na dentição
permanente e na dentição decídua, com uma média de redução de 33% (IC 95%: 11 a 48%)
para esta última.
Marinho et al. (2004) realizaram uma nova revisão de literatura com o objetivo de
comparar a efetividade das formas de aplicação tópica de fluoretos, quando utilizadas para
prevenção de cárie dentária em crianças. Foram incluídos 15 ensaios clínicos aleatorizados e
cegos realizados em crianças de até 16 anos de idade com duração de pelo menos um ano, em
que foram comparados vernizes, géis, enxaguatórios e dentifrícios fluoretados. O método de
análise empregado foi o índice CPOS. Os autores observaram que a eficácia dos dentifrícios
fluoretados não foi estatisticamente diferente da dos géis e enxaguatórios e que os resultados
apresentados por único ensaio, onde foi comparado dentifrício com verniz, verniz com gel e
gel com enxaguatórios, foram inconclusivos. Os autores concluíram que os dentifrícios
fluoretados parecem ter efeitos similares aos dos enxaguatórios em relação à prevenção da
cárie dentária. Não houve nenhuma sugestão clara de que os vernizes fluoretados são mais
efetivos que os enxaguatórios e foram inconclusivas as evidências em relação à diferença de
efetividade dos vernizes e géis, e de enxaguatórios e géis, quando comparados entre si.
Weintraub et al. (2006) realizaram um ensaio clínico controlado randomizado
duplo-cego na cidade de São Francisco, nos EUA com 376 crianças pré-escolares, livres de
cárie e com média de idade de 1,8 anos que foram alocadas em três grupos: um recebeu verniz
Duraphat® uma vez ao ano, outro recebeu verniz-F duas vezes ao ano, e o terceiro grupo não
recebeu qualquer aplicação do produto. Um inesperado desvio de protocolo fez com que
algumas crianças recebessem um número menor de aplicações de verniz-F do que havia sido
previsto. Além disso, nesse estudo ocorreu uma perda elevada de participantes e a exclusão
intencional da pesquisa de crianças que desenvolveram cárie ao longo do período de
seguimento. As análises por intenção de tratamento mostraram um efeito protetor do verniz-F,
sendo o incremento de cárie no grupo teste de 0,7 e no grupo controle de 1,7 e uma fração
preventiva de 58%.
Azarpazhooh e Main (2008) realizaram uma revisão sistemática no MEDLINE e
outras bases de dados, onde foram pesquisados trabalhos realizados com seres humanos,
publicados entre 2000 e 2007. De um total de 105 artigos identificados pela pesquisa
34
bibliográfica, sete estudos originais preencheram os critérios de inclusão e estes artigos foram
lidos e analisados de forma independentemente por dois revisores, tendo os dados de
evidência extraídos para a revisão sistemática. As recomendações foram desenvolvidas com
base nas evidências disponíveis: 1) Para as populações de alto risco, o verniz-F deve ser
aplicado duas vezes por ano, a menos que o indivíduo não tenha nenhum risco de cárie,
indicado pelo histórico atual e passado de cárie. Este calendário de aplicação proporciona um
selamento que deve ser verificado semestralmente. 2) Embalagens de dose única de verniz-F
devem ser usadas para crianças, o verniz em tais embalagens deve ser agitado vigorosamente
antes da aplicação, para assegurar que o fluoreto precipitado seja novamente dissolvido. 3) Há
boas evidências da eficácia complementar de estratégias preventivas, tais como selantes e
vernizes, bem como escovação e orientação nutricional, saúde bucal e os programas de
atendimento devem, portanto, incluir o maior número possível de estratégias complementares.
Gugwad et al. (2011) avaliaram a eficácia de aplicações intensivas de verniz de
fluoreto de sódio na prevenção de cárie em molares de crianças com idade entre 6 e 7 anos e o
estado de cárie em molares antes e depois da aplicação de verniz fluoretado. Duzentos e
cinquenta crianças (6-7 anos) foram randomizadas em grupos verniz e controle. O grupo
verniz recebeu verniz-F três vezes durante uma semana (uma vez a cada 2 dias). Exames
clínicos e radiográficos foram realizados antes da primeira aplicação de verniz em todas as
crianças e um ano mais tarde. Para a avaliação e comparação, todos os dados obtidos foram
submetidos a análise estatística que mostrou, ao final do período de um ano, o grupo verniz
com 27,7% de reversão de cárie na dentição decídua, o que foi estatisticamente significativo.
Embora tenha havido uma diminuição do incremento de cárie na dentição permanente, esta
não foi estatisticamente significativa. Os autores concluíram que a aplicação de verniz-F
durante três vezes por semana, uma vez por ano na dentição permanente ou decídua, está
associada com a redução substancial no incremento de cárie.
Arruda et al. (2012) determinaram a eficácia da aplicação de verniz de fluoreto de
sódio (NaF) a 5% na redução incremental de cárie na dentição permanente de crianças de
escolas rurais brasileiras ao longo de 12 meses, através de um estudo duplo-cego,
randomizado, controlado por placebo e realizado com 379 crianças com idade entre 7-14
anos, em três escolas no Brasil, entre janeiro 2006 e dezembro de 2007. Durante este período,
cada escola foi visitada quatro vezes no intervalo de seis meses para o recrutamento, exames
odontológicos e aplicações de verniz-F. As crianças recrutadas foram randomicamente
designadas para um tratamento com verniz (n = 198) ou um grupo controle (placebo, n =
181). Entrevistadores treinados coletaram dados sobre os hábitos de saúde bucal e
35
características sócio demográficas das crianças. Informações sobre a dieta da criança foram
coletadas através de um diário de frequência alimentar. Exames de cárie foram realizados
utilizando o ICDAS. Do total da amostra (n = 379), 210 (55,4%) crianças completaram o
tratamento, incluindo uma ou duas aplicações de verniz ou placebo. No exame inicial, as
crianças em tratamento e o grupo controle apresentaram, em média, 6,2 e 5,6 DFS,
respectivamente (P <0,001). Após 12 meses, as crianças do grupo verniz mostraram índices e
incremento de carie significativamente mais baixo que as crianças do grupo controle (10,8
contra 13,3, P <0,007), com PF de 40% (IC 95%: 34,3-45,7%; P <0,0001). Os resultados
sugeriram que aplicações de verniz-F (NaF a 5%) podem ser recomendadas como uma
medida de saúde pública para reduzir a incidência de cárie na população de alto risco de cárie.
Du et al. (2012) determinaram a eficácia do verniz Duraphat® na reversão de
lesões de mancha branca (WSLs) após tratamento ortodôntico fixo através de um estudo
clinico randomizado controlado (utilizado soro fisiológico para o grupo controle). 110
participantes com 12 a 22 anos de idade - idade média de 16,6 anos (± 3,2 anos) - foram
distribuídos aleatoriamente para o grupo de teste (grupo 1) ou o grupo controle (grupo 2). A
aplicação de verniz-F ou solução salina foi efetuada sobre as superfícies dos dentes com cada
WSLs mensalmente durante os primeiros seis meses após a descolagem. Após seis meses, 96
pacientes com um total de 209 dentes de estudo (47 indivíduos, 104 dentes do grupo 1; 49
indivíduos, 105 dentes do grupo 2) permaneceram no estudo. A analise com DIAGNOdent®
revelou a presença de WSLs na proporção de 17,66 ± 5,36 em grupo 1 e 16,19 ± 5,70 no
grupo 2 na baseline, que diminuiu 5,78 e 2,44, respectivamente, na visita de acompanhamento
de 3 meses e diminuiu 7,56 e 3,09, respectivamente, na visita de acompanhamento de 6
meses.
Tellez et al. (2013) avaliaram criticamente todas as provas relacionadas com a
eficácia de métodos preventivos não cirúrgicos para deter ou reverter a progressão da lesões
de cárie não cavitada (NCCLS) em uma busca detalhada do Medline (Via OVID), Cochrane
Collaboration, Scielo e EMBASE, onde identificaram 625 publicações. Após analise das
publicações, 103 foram selecionados para nova revisão, e 29 foram finalmente incluídas no
estudo. As publicações finais avaliadas reportavam os seguintes tratamentos: fluoretos (F) em
veículos variados (pasta de dentes, gel, verniz, enxaguatório bucal, e combinações),
clorexidina (CHX) sozinha ou em combinação com F-, infiltração de resina (I), selantes (S),
xilitol (X), em diferentes veículos (pastilhas, gomas, ou em combinação com F e / ou xilitol),
CPP-ACP ou em combinação com fosfato de fluoreto de cálcio. Todos os estudos incluídos
foram ensaios clínicos randomizados e foram conduzidos em seres humanos com NCCLS
36
naturais. A qualidade dos estudos foi avaliada por três métodos diferentes (ADA, Cochrane, o
consenso do autor). Os resultados indicaram que o tamanho da amostra para estes ensaios
variaram entre 15 e 3903 sujeitos, com uma duração entre 2 semanas a 4 anos. De maneira
geral os autores concluíram que os estudos apresentavam muitas fragilidades metodológicas.
Concluíram que as intervenções com fluoretos (vernizes, géis e cremes dentais) parecem
mostrar um benefício mais consistente na diminuição da progressão e incidência de NCCLS.
Estudos utilizando xilitol, CHX, e veículos de CPP-ACP, isoladamente ou em combinação
com fluorterapia são muito limitados em número e na maioria dos casos não mostraram uma
redução estatisticamente significativa, bem como estudos com selantes e de infiltração de
resina.
Marinho et al. (2013) realizaram uma revisão sistemática da literatura para
determinar a eficácia e a segurança dos vernizes fluoretados na prevenção da cárie dentária
em crianças e adolescentes e os fatores que potencialmente modificam seu efeito. Concluíram
na revisão atualizada de maneira semelhante às revisões realizadas anteriormente pelos
mesmos autores, ou seja, as evidências permanecem às mesmas daquelas publicadas pela
primeira vez. A revisão sugere um substancial efeito do verniz-F na inibição de cáries tanto
em dentes permanentes como em decíduos. Contudo, a qualidade das evidências foi avaliada
como moderada, pois incluem principalmente estudos de alto risco de viés, com considerável
heterogeneidade.
37
3 PROPOSIÇÃO
Avaliar in vivo o efeito do tempo de manutenção (4 ou 24 h) do verniz-F aplicado
sobre os dentes na concentração de fluoreto no esmalte e no biofilme dental.
38
4 MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo é parte de outro maior registrado no ClinicalTrials.gov pelo
identificador NCT02486458 (Anexo 1), cujo objetivo é a avaliação clínica da capacidade dos
produtos utilizados para aplicação profissional de fluoretos (APF) - géis e vernizes - na
formação de reservatórios de fluoreto no esmalte e aumento da concentração de fluoreto no
fluido do biofilme dental. Foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Odontologia de Piracicaba – FOP/UNICAMP, protocolo 031/2014 (Anexo 2).
A importância, objetivos, riscos e benefícios do estudo foram explicitados no
momento do recrutamento dos voluntários e aqueles que concordaram em participar o fizeram
mediante assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido - TCLE, atendendo a
Resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde (Brasil, 2013).
4.1 Delineamento experimental
Foi conduzido um estudo in vivo, aleatorizado, controlado e cego (análises
laboratoriais), cuja fase clínica teve 31 dias de duração (figura 1). Voluntários (n=51, idade
18-30) foram aleatoriamente distribuídos em três grupos (n=17): Controle (sem aplicação de
verniz) e grupos Verniz-4h e Verniz-24h (aplicação de verniz e remoção após 4 e 24 h,
respectivamente). Os voluntários utilizaram dentifrício sem flúor e foram instruídos a não usar
enxaguatórios ou outros produtos de higiene bucal com flúor durante todo o período
experimental. Depois de 72 h de utilização exclusiva de dentifrício sem flúor (washout) e após
uma profilaxia dental, verniz-F (Duraphat®
) foi aplicado sobre todas as superfícies dos dentes
dos voluntários dos grupos Verniz-4h e Verniz-24h. Foi recomendado aos voluntários desses
grupos que suspendessem a escovação por 4 ou 24 h, respectivamente. Após esse tempo o
verniz foi removido e foram feitas biópsias ácidas para determinar a concentração de fluoreto
formado no esmalte. As biópsias foram feitas nos incisivos centrais superiores antes da
aplicação do verniz (disto-vestibular do 11), imediatamente após a remoção do verniz (mésio-
vestibular do 11) e após 7 e 28 dias da aplicação do verniz (na mésio-vestibular e disto-
vestibular do 21, respectivamente). A concentração de fluoreto no esmalte antes da aplicação
do verniz foi determinada como controle (baseline). O biofilme foi coletado antes (baseline) e
após 3, 7, 14 e 28 dias a aplicação de verniz para análise do fluoreto no fluido e na parte
sólida. Para essas coletas os voluntários ficaram 24 h sem escovar os dentes e nesse período
utilizaram goma de mascar açucarada para padronizar o consumo de sacarose. A concentração
39
de fluoreto no esmalte e no biofilme foi determinada por meio de eletrodo íon-específico. Os
resultados foram analisados por ANOVA considerando os fatores tratamento (Controle,
Verniz-4h e Verniz-24h) e tempo (antes da aplicação do verniz (baseline) e após a remoção do
verniz, nos tempos estabelecidos para as biópsias do esmalte e coletas de biofilme), seguido
pelo pós-teste de Tukey.
Figura 1 – Linha do tempo (dias) da fase clínica do experimento
* Suspensão da escovação dentária (24 h antes) e utilização de goma de mascar açucarada (3x) até o momento
da coleta de biofilme.
4.2 Seleção da amostra
O estudo partiu do recrutamento de 150 voluntários adultos (47 homens e 103
mulheres, idade entre 18–32 anos), os quais foram submetidos à anamnese e exame clínico
intrabucal para avaliação dos critérios de exclusão e inclusão.
Foram excluídos: gestantes, usuários de medicamentos que reduzem o fluxo
salivar, portadores doenças crônicas, fumantes, usuários de aparelhos ortodônticos ou próteses
dentárias, com relato de história de hipersensibilidade ao verniz-F, com evidências de cárie
ativa ou doença periodontal, com menos de cinco dentes presentes em qualquer hemi-arcada
dentária ou sem os quatro incisivos superiores hígidos. A partir desses critérios, 18
voluntários foram excluídos e restaram 132.
// // //
0 Washout - 72h
Antes
(Baseline)
* * * * *
7
Cole
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e b
iofi
lme
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malt
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+4h
+24h
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e b
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lme
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malt
e
3 -3 14 28
Dias
40
Dos 132 voluntários remanescentes, permaneceram no estudo apenas os 68 que
atenderam ao critério de inclusão: apresentaram ao exame clinico intrabucal um acúmulo de
biofilme visível na superfície dental após suspensão da escovação dentária por 24 h - com
escore 3 ou 4, categorizados segundo os critérios do índice (plaque index system) proposto por
Silness e Loe (1964).
4.3 Aleatorização
Os 68 voluntários selecionados foram divididos aleatoriamente e
proporcionalmente em quatro grupos experimentais (n=17). A distribuição ocorreu de
maneira estratificada e levou em consideração a concentração de flúor no fluido do biofilme.
Para isso, o biofilme dos voluntários foi coletado após utilizarem exclusivamente dentifrício
sem flúor durante três dias (whashout). A coleta foi efetuada no início da manhã, em jejum
após 24 h da suspensão da escovação. Durante essas 24 h os voluntários utilizaram goma de
mascar açucarada (3x) para padronizar os níveis de consumo de sacarose.
A concentração de flúor no fluido do biofilme foi determinada e os indivíduos
foram ordenados de forma crescente (do menor para o maior valor apresentado). Em seguida
foram distribuídos por sorteio, de quatro em quatro, e cada voluntário foi sendo alocado em
um dos quatro grupos experimentais (Figura 2).
Figura 2 – Aleatorização dos voluntários nos grupos experimentais
41
O procedimento de aleatorização foi cego. Para cada sujeito selecionado para
participação no estudo foi atribuído um único código de identificação. Indivíduos que foram
removidos do estudo na fase pós-randomização não foram substituídos.
Após a composição dos quatro grupos experimentais somente três foram
utilizados no presente estudo, determinando um tamanho amostral de 51 voluntários (16
homens e 35 mulheres, com idade entre 18-30 anos) (figura 3).
4.4 Tratamentos/ Aplicação e remoção do verniz
A aplicação do verniz foi efetuada após os voluntários utilizarem exclusivamente
dentifrício sem flúor por 72 h (washout). Nesse momento uma profilaxia dental com taça de
borracha e pedra pomes foi realizada em todos os dentes de todos os voluntários. Os dentes
foram posteriormente lavados com jatos de água e secos com jatos de ar. Em seguida foi
efetuado isolamento relativo com rolos de algodão em ambas as arcadas dentárias e uma
camada uniforme de verniz de NaF a 5% (Duraphat®, Colgate-Palmolive Co., New York -
Lote N °. 051302) foi aplicada com hastes flexíveis com pontas de algodão (Cotonetes ®
Johnson & Johnson) sobre a superfície de todos os dentes dos voluntários dos grupos verniz-
4h e Verniz-24h. O grupo Controle não recebeu aplicação de verniz.
Os voluntários que receberam verniz foram instruídos a evitar mastigar alimentos
duros ou abrasivos e suspender a escovação por 4 h (grupo Verniz-4h) ou 24 h (grupo Verniz-
24h) (Apêndice 2). Decorridos os tempos estabelecidos, o verniz foi removido mecanicamente
por meio de escovação dentária e raspagem com curetas de pontas plásticas (IMPLACARE®
,
Hu-Friedy, Chicago, IL, USA).
4.5 Coletas de amostras de esmalte
Amostras de esmalte para análise do fluoreto foram coletadas no terço médio da
superfície vestibular dos incisivos centrais superiores por meio do procedimento de biópsia
ácida, modificado para o presente estudo a partir do proposto por Brudevold et al. (1975).
Foi efetuado isolamento relativo com rolos de algodão e os incisivos centrais
superiores foram cuidadosamente limpos com jatos de água e com um disco de algodão
embebido com uma pequena quantidade de acetona. Os dentes foram secos e uma fita adesiva
(Scotch Magic Tape, 3M, EUA) com uma perfuração de 2 mm de diâmetro foi fixada na
superfície vestibular, de modo a deixar exposta apenas uma região de formato circular regular
42
e área de 3,14 mm2. Em seguida foram depositados 5 µl da solução de HCl 1,6 M preparada
em 70% de glicerol (v/v), a qual foi mantida no local por 30 segundos sob agitação, aspirada
e transferida para um tubo de amostra contendo 100 µl de TISAB II (Total Ionic Strenght
Adjustor Buffer) + 100 µl de água ultrapura (obtida por osmose reversa). Imediatamente na
sequência foram efetuadas duas deposições sucessivas de 5 ul de TISAB II na mesma região,
cada uma mantida por 15 segundos sob agitação, aspirada e transferida para o mesmo tubo de
amostra. A deposição de TISAB II serviu para neutralizar a solução ácida anteriormente
depositada na região e para coletar o remanescente do conteúdo biopsiado. Na sequência a fita
adesiva foi removida e os dentes foram lavados com jatos de água.
Foram efetuadas quatro bióspias em cada voluntário. A biópsia realizada antes da
aplicação do verniz (baseline) ocorreu na região disto-vestibular do dente 11 e a
imediatamente após a remoção do verniz na mésio-vestibular desse mesmo dente. As biópsias
realizadas após 7 e 28 dias da aplicação do verniz foram feitas na mésio-vestibular e disto-
vestibular do dente 21, respectivamente (figura 4).
Figura 3 - Sequência dos locais onde as biópsias foram realizadas nos incisivos centrais
superiores.
1: antes da aplicação do verniz; 2: imediatamente após a remoção do verniz; 3 e 4: após 7 e 28 dias da
aplicação do verniz, respectivamente.
4.6 Coletas de biofilme
O biofilme foi coletado antes (baseline) e após 3, 7, 14 e 28 dias da aplicação do
verniz (figura 1) para análise do fluoreto no fluido e sólidos. Para essas coletas os voluntários
ficaram 24 h sem escovar os dentes e utilizaram goma de mascar açucarada (Apêndice 1) por
3x no período, com a finalidade de padronizar o consumo de sacarose.
O biofilme foi coletado pelo deslizamento de uma espátula plástica (Apêndice 4)
sobre as superfícies de todos os dentes (exceto anteriores inferiores) e imediatamente
armazenado por imersão em ponteiras de pipeta de 10 μl vedadas na extremidade e
preenchidas com óleo mineral extrapesado (Drake Oil N. 35, Penreco, Butler, PA). As
43
ponteiras foram adaptadas a um tubo de micro centrífuga de 1,5 ml e em seguida o conjunto
foi centrifugado durante 5 min a 21000 g, 4 °C, para separar o fluido da parte sólida. O fluido
foi aspirado com micropipetas de vidro pré-fabricadas, sob visualização microscópica (Vogel
et al., 1997, Tenuta et al., 2006) e transferido para outra ponteira de pipeta com ponta vedada
e preenchida de óleo mineral, para armazenamento. A parte sólida foi armazenada por
congelamento.
4.7 Análises do esmalte
A concentração de fluoreto das amostras de esmalte foi determinada em duplicata
por um eletrodo combinado íon especifico (Orion 96-06; Thermo Scientific, EUA), associado
a um potenciômetro (Orion EA-940; Thermo Scientific, EUA). O eletrodo foi previamente
calibrado (R= 0,99988) com soluções padrão em concentrações de 0,05, 0,10, 0,20, 0,40,
0,80, 1,00 e 2,00 μg F/ml. As análises foram efetuadas de maneira cega.
Adicionalmente, para calcular a espessura da camada de esmalte removida em
cada biópsia foi dosada a concentração de fósforo inorgânico (Pi) das amostras (a
concentração de Pi no esmalte é estimada em 17,4% (Lazzari, 1976)). Para isso foi utilizado o
método colorimétrico com o reagente verde de malaquita (Hess e Derr, 1975, Vogel et al.,
1983). As análises foram efetuadas em microplacas de 96 poços e a absorbância foi lida a 650
nm em espectrofotômetro (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, EUA) previamente
calibrado com blanks e padrões contendo 0,032, 0,08, 0,16, 0,24 e 0,32 mM de fósforo.
4.8 Análises do biofilme
4.8.1 Fluido
A concentração de fluoreto no fluido do biofilme foi determinada em triplicata por
um eletrodo invertido íon seletivo (Orion 94-09, Thermo Scientific, EUA), adaptado para
microanálise (Vogel et al., 1997) e previamente calibrado com padrões de fluoreto em
concentração conhecida (Tenuta et al., 2006). Um microeletrodo de referência foi utilizado
em contato com cada uma das amostras para fechar o circuito. Todas as amostras foram
previente tamponadas com TISAB III (total ionic strenght adjustment buffer) na proporção de
10 partes de amostra para uma de TISAB III, sob microscópio. A concentração de flúor no
fluido foi expressa em µmol/l. As análises foram feitas de maneira cega.
44
4.8.2 Parte sólida
A concentração de fluoreto na parte sólida do biofilme foi determinada após
extração ácida. Para a extração, as ponteiras de pipeta com amostras dos sólidos do biofilme
tiveram a sua ponta cortada e foram adaptadas a um tubo de centrifuga de 1,5 ml contendo
150 µl de HCl 0,5 M (Vogel et al., 1997). Em seguida o conjunto foi centrifugado por 60
segundos para incorporar as amostras ao HCl. A solução resultante foi então transferida para
um tubo de centrifuga de 0,6 ml e agitada a temperatura ambiente em um rotor de tubos a uma
velocidade de 30 RPM durante 3 h. Nesse período, foram feitas três agitações adicionais em
agitador vórtex (a cada 60 min).
A dosagem da concentração de fluoreto foi determinada em triplicata no
sobrenadante da solução resultante da extração ácida. Para isso o sobrenadante foi coletado,
neutralizado com a adição de NaOH 2,5 M e tamponado com TISAB III (10 partes de amostra
para 1 de TISAB III). Em seguida as amostras foram depositadas na superficie de um eletrodo
invertido íon seletivo (Orion 94-09, Thermo Scientific, EUA), adaptado para microanálise
(Vogel et al., 1997) e previamente calibrado com padrões de fluoreto em concentração
conhecida (Tenuta et al., 2006). Um microeletrodo de referência foi utilizado em contato com
cada uma das amostras para fechar o circuito. As análises foram feitas de maneira cega.
O biofilme coletado não teve seu peso aferido e a concentração de fluoreto na
parte sólida não pode ser expressa em razão do volume de biofilme. Dessa maneira, foi
efetuada a dosagem da concetração de proteínas para estimar a biomassa coletada, permitindo
expressar a concentração de fluoreto em µmol F /g proteína do biofilme.
A dosagem de proteínas foi efetuada no remanescente das amostras dos sólidos do
biofilme após a remoção do sobrenadante para dosagem do fluoreto (de acordo com os
procedimentos descritos anteriormente). Para isso foram adicionados 200 μl de NaOH 1 M
(extração alcalina) e a suspensão foi vortexada até tornar-se homogênea. Em seguida foi
incubada por 15 min sob agitação (100 °C/ 750 rpm) em um aquecedor à seco programável/
dry block (ThermoStat; Eppendorf, Germany). Posteriormente a suspensão foi centrifugada
durante 3 min (10.000 g, a 4 ° C) e o sobrenadante foi coletado para dosagem das proteínas.
A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Lowry (Lowry et al.,
1951) utilizando um kit comercial (Total protein kit-TP03001KT, Sigma Aldrich, MO, USA).
A microanálise foi realizada em microplacas de 96 poços e a absorbância foi lida a 750 nm
em espectrofotômetro (Multiskan Spectrum, Thermo Scientific, EUA) previamente calibrado
com blanks e padrões contendo 150, 200, 250 e 300 ug de proteína.
45
4.9 Análise estatística
As pressuposições de equidade de variâncias e normalidade foram testadas
considerando-se as variáveis de resposta e os dados que não satisfizeram estes pressupostos
foram transformados para análise. Os valores da concentração de fluoreto no esmalte foram
transformados para raiz quadrada e os de concentração de fluoreto no fluido e nos sólidos do
biofilme sofreram uma transformação logarítmica.
Os resultados foram analisados por ANOVA - 2 vias considerando os fatores
tratamento (Controle, Verniz-4h e Verniz-24h) e tempo (antes da aplicação do verniz
(baseline), após a remoção do verniz e nos demais tempos estabelecidos para as coletas de
amostras de biofilme e esmalte), seguido pelo pós-teste de Tukey.
Todas as análises foram executadas no software SAS (versão 9.4; instituto SAS,
Cary, N.C., USA) com nível de significância estabelecido em 5% (anexo 3).
46
5 RESULTADOS
O recrutamento dos voluntários e os procedimentos clínicos e laboratoriais ocorreram
de julho de 2015 a abril 2016. Não foram relatados eventos adversos durante o período
experimental e não houve alterações nos protocolos metodológicos planejados.
Completaram o estudo 48 dos 51 voluntários alocados (94,11%). Um indivíduo iniciou
o tratamento ortodôntico (grupo Controle) e dois desistiram de participar no estudo (Grupo
Verniz-24h). No entanto, como as exclusões ocorreram antes do início do experimento isto
não afetou os resultados. As análises foram realizadas considerando um tamanho amostral de
48 voluntários (Figura 4).
Figura 4 – Fluxo de participantes no estudo
Grupo I (n=1)
Iniciou tratamento
ortodôntico
Grupo II (n=0) Grupo III (n=2)
Desistiram
Inclusão Avaliados para elegibilidade (n=150)
Excluídos (n=82)
Não atendem aos critérios de inclusão (n=18);
Não apresentaram biofilme visível após
suspensão da escovação por 24 h (n=64).
Randomizados (n=68)
Alocação
Grupo I
(controle)
(n=17)
Seguimento
Análise
Analisados (n=48)
• Excluídos da análise (perdidos antes da fase clínica) (n=3)
Alocação para a intervenção (n=51) Não alocados para
intervenção – participaram
de outro estudo (n= 17 )
Grupo II
(Verniz-4h)
(n=17)
Grupo III
(Verniz-24h)
(n=17)
Grupo IV
(n=17)
Perda de seguimento (n=3)
47
Para a concentração de fluoreto no esmalte foi observado efeito significativo para os
fatores tratamento, tempo e interação tratamento x tempo (p < 0,0001). Diferenças
significativas (p < 0,0001) na concentração de fluoreto no esmalte somente foram encontradas
no tempo após a remoção do verniz (Tabela 1 e Figura 5). A maior média (± DP) de
concentração (µg F/ cm2) foi encontrada no grupo Verniz-24h (1,83 ± 0,49), seguido do
Verniz-4h (1,05 ± 0,25) e do Controle (0,59 ± 0,26).
Tabela 1 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µg F/cm2) no esmalte antes e após a
remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do verniz, de
acordo com os grupos/ tratamentos
Grupos/
Tratamentos
Aplicação do verniz Tempo (dias) após a aplicação
do verniz
Antes
(baseline)
Após a remoção
do verniz 7 28
Controle (n=16) *0,59 ± 0,26aA
*0,59 ± 0,26aA
0,61 ± 0,26aA
0,53 ± 0,17aA
Verniz-4h (n=17) 0,50 ± 0,18aA
1,05 ± 0,27bB
0,67 ± 0,17aA
0,54 ± 0,17aA
Verniz-24h (n=15) 0,38 ± 0,13aA
1,83 ± 0,46cB
0,77 ± 0,19aA
0,54 ± 0,11aA
Letras minúsculas distintas representam diferenças entre os tratamentos; letras maiúsculas distintas representam
diferenças entre os tempos de coleta (p < 0,0001). Os valores apresentados são os originais. Para análise
estatística os dados foram transformados à raiz quadrada. * Análise feita uma única vez (valores iguais).
Figura 5 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µg F/cm2) no esmalte antes e após a
remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do verniz, de
acordo com os grupos/ tratamentos
b = baseline; 0 = aplicação do verniz nos grupos Verniz-4h e Verniz-24h; + 4 h = após 4 h da aplicação do
verniz; + 24h = após 24 h da aplicação do verniz.
ug
F/c
m2
Dias
Controle
Verniz-4h
Verniz-24h
+ 24 h
0
2,5
1,5
0,5
7 28
+ 4 h
b
48
Com relação à concentração de fluoreto nos fluido e porção sólida do biofilme não
foi encontrado efeito significativo para os fatores isolados ou sua interação (p > 0,05)
(Tabelas 2 e 3).
Tabela 2 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µmol/l) no fluido do biofilme antes e
depois da aplicação do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos
Grupos/Tratamentos Antes
(baseline)
Após a aplicação do verniz (dias)
3 7 14 28
Controle (n=16) 6,1 ± 4,7 6,4 ± 3,2 6,9 ± 3,2 7,2 ± 3,6 7,7 ± 3,5
Verniz-4h (n=17) 9,6 ± 10,0 9,2 ± 6,0 10,6 ± 11,0 7,6 ± 3,5 6,0 ± 2,3
Verniz-24h (n=15) 6,5 ± 4,4 6,9 ± 1,8 6,6 ± 2,1 7,0 ± 1,2 7,8 ± 3,9
Não foram encontradas diferenças estatísticas (p > 0,05). Os valores apresentados são os originais.
Tabela 3 - Médias (± DP) da concentração de flúor (µmol/g proteína) nos sólidos do biofilme
antes e depois da aplicação do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos
Grupos/Tratamentos Antes
(baseline)
Após a aplicação do verniz (dias)
3 7 14 28
Controle (n=16) 3,9 ± 4,5 5,7 ± 6,1 4,0 ± 6,6 2,5 ± 3,1 5,2 ± 12,0
Verniz-4h (n=17) 3,2 ± 2,8 4,8 ± 3,9 2,8 ± 3,0 2,7 ± 2,6 3,6 ± 3,1
Verniz-24h (n=15) 3,4 ± 4,4 11,5 ± 19,2 3,7 ± 2,8 3,2 ± 4,3 3,4 ± 2,1
Não foram encontradas diferenças estatísticas (p > 0,05). Os valores apresentados são os originais.
De maneira adicional foi realizada a análise da espessura da camada de esmalte
removida em cada biópsia (Tabela 4), a qual foi comparada com os valores encontrados para a
concentração de fluoreto no esmalte (Tabela 5).
Tabela 4 - Médias (± DP) da espessura da camada de esmalte removida pela biópsia (µm)
antes e após a remoção do verniz, e nos tempos (7 e 28 dias) após a aplicação do
verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos
Grupos/
Tratamentos
Aplicação do verniz Tempo (dias) após a aplicação
do verniz
Antes
(baseline)
Após a remoção
do verniz 7 28
Controle (n=16) 0,66 ± 0,10aA
0,66 ± 0,10aA
0,62 ± 0,12aA
0,60 ± 0,11aA
Verniz-4h (n=17) 0,66 ± 0,12bA
0,70 ± 0,11bA
0,69 ± 0,14bA
0,69 ± 0,14bA
Verniz-24h (n=15) 0,67 ± 0,11aA
0,55 ± 0,15aA
0,67 ± 0,15aA
0,61 ± 0,14aA
Letras minúsculas distintas representam diferenças entre os tratamentos; letras maiúsculas distintas representam
diferenças entre os tempos de coleta (p<0,05). Os valores apresentados são os originais.
49
Tabela 5 - Comparativo entre as médias (± DP) da espessura da camada de esmalte removida
pela biópsia (µm) a concentração de fluoreto no esmalte (µg F/cm2) no tempo
após a remoção do verniz, de acordo com os grupos/ tratamentos
Grupos/
Tratamentos
Espessura da camada de
esmalte removida (µm)
Concentração de fluoreto
no esmalte (µg F/cm2)
Controle (n=16) 0,66 ± 0,10 0,59 ± 0,26
Verniz-4h (n=17) *0,70 ± 0,11 1,05 ± 0,27
Verniz-24h (n=15) 0,55 ± 0,15 *1,83 ± 0,46
* Maiores valores em cada coluna. Uma menor camada de esmalte removido apresentou uma maior
concentração de fluoreto. Os valores apresentados são os originais.
Apesar de ter havido uma diferença significativa (p < 0,05) para a espessura de
esmalte removido nas biopsias ácidas entre os grupos Verniz-4h e Verniz-24h e Verniz-4h e
controle (tabela 4), isso não comprometeu os resultados. O grupo que apresentou a maior
concentração de fluoreto no esmalte foi aquele com a menor espessura de camada de esmalte
removida (Tabela 5) e isso indica que a diferença encontrada entre os grupos e em favor do
grupo Verniz-24h no tempo após a remoção do verniz (Tabela 4) poderia ser ainda mais
significativa.
50
6 DISCUSSÃO
O verniz-F Duraphat® contém 5% em peso de NaF ou 2,26% (22600 ppm de F
-)
numa base de resina natural neutra (colofônia) (Vaikuntam, 2000). Quando aplicado adere à
superfície dos dentes e libera íons fluoreto para o esmalte, os quais irão reagir com os íons
cálcio formando reservatórios de “CaF2” (Ögaard et al., 1984). Por sua vez estes depósitos
irão liberar o fluoreto para o fluido do biofilme interferindo na dinâmica da cárie e atuando
como um fator de proteção à doença (Tenuta et al., 2008).
Foi sugerido em estudos in vitro e in situ que a incorporação do fluoreto pelo
esmalte é dependente do tempo de contato com o verniz-F (Retief et al., 1980, Bruun e
Givskov, 1991, Fernández et al., 2014) e isso foi comprovado clinicamente no presente
estudo. Uma diferença significativa (p < 0,0001) na concentração de fluoreto no esmalte no
momento imediatamente após a remoção do verniz foi encontrada em favor do verniz mantido
por mais tempo (24 h) sobre a superfície dos dentes.
A concentração total de fluoreto representada nos resultados corresponde ao flúor
fracamente ligado (“CaF2”) e ao fortemente ligado (FA). No entanto, é possível estimar que
aproximadamente 90% do fluoreto foi incorporado ao esmalte na forma de “CaF2” (Saxegaard
e Rölla, 1988) e isso sugere que o maior tempo de manutenção do verniz sobre os dentes
também melhora seu efeito anticárie. Até porque já foi demonstrada in situ uma relação dose-
resposta entre a concentração de “CaF2” no esmalte e o fluoreto libertado para o fluido do
biofilme, com respectivo efeito anticárie (Tenuta et al., 2008).
Os resultados também sugerem um aumento do efeito terapêutico do verniz-F
quando o seu tempo de manutenção sobre os dentes for prolongado, pois com essa conduta
uma maior quantidade de fluoreto estará disponível para promover a remineralização da
estrutura dental. Em reforço a esse argumento, vários estudos já comprovaram a eficácia do
verniz-F na remineralização de lesões de cárie cavitadas ou não cavitadas (Santos et al., 2009,
Du et al., 2012, Tellez et al., 2012).
Entretanto, os valores para a concentração de fluoreto no esmalte retornaram aos
níveis basais após sete dias da aplicação do verniz e nenhuma diferença significativa entre os
fatores tempo, tratamento e sua interação (p > 0,05) foi observada a partir desse período. Esse
dado é contraditório, pois sugere que a maior incorporação de F- decorrente da manutenção
prolongada do verniz-F sobre os dentes talvez não potencialize o seu efeito preventivo para a
cárie. Dessa forma, como o fluoreto incorporado foi rapidamente perdido e a ação preventiva
está intimamente relacionada com a sua presença constante na cavidade bucal, não haveria
51
mais F- disponível para interferir no curso da doença após uma semana da aplicação do
verniz, mesmo mantido de forma prolongada sobre os dentes (24 h). Na mesma direção, o
fluoreto liberado para a cavidade bucal a partir da solubilização do verniz-F também não teria
qualquer impacto significativo preventivo na desmineralização do dente, pois sua presença
também é transitória (24 h).
Em contrapartida, o conhecimento atual indica que o fluoreto exerce um papel
preventivo para a cárie mesmo em baixas concentrações (Cury e Tenuta, 2009). Assim, apesar
de já ter sido demonstrado que cerca de 90% do “CaF2”
formado é perdido nas primeiras 24h
(Koch et al., 1982, Dijkman et al., 1983, Rølla e Saxegaard, 1990), o que parece ter ocorrido
também no presente estudo, é possível que uma quantidade residual de verniz-F ou mesmo de
produtos de reação do fluoreto com o esmalte tenha permanecido sobre retenções
microscópicas na estrutura dental por um tempo maior que aquele mensurado pelos métodos
analíticos utilizados. Isso daria suporte às evidências do efeito anticárie do verniz-F (Marinho
et al., 2013) quando utilizado por 2 a 4 vezes/ano (Marinho et al., 2002). Da mesma forma
permite apresentar a hipótese de que a manutenção prolongada do verniz-F poderia ter
demonstrado um melhor efeito preventivo para a cárie se esses pequenos valores incrementais
na concentração de fluoreto no esmalte ao longo do tempo pudessem ter sido quantificados.
Também já está consolidado que o principal efeito anticárie do fluoreto ocorre
quando ele estiver presente localmente (fluido do biofilme) na sua forma livre e solúvel e no
momento adequado (exposição à sacarose) para interferir nos eventos de desmineralização e
remineralização (Cury e Tenuta, 2009). Dessa forma, para justificar o aumento do efeito
anticárie do verniz com o prolongamento do tempo de sua manutenção sobre os dentes, era
esperado um aumento da concentração de fluoreto no biofilme (fluido e sólidos) no momento
após a remoção do verniz-F, correspondente aquele observado para o esmalte. Contudo, nas
análises do biofilme não foram encontrados efeitos significativos nos fatores em estudo -
isolados ou sua interação (p > 0,05).
Isso pode ter ocorrido devido à pequena diferença observada na concentração do
fluoreto no esmalte entre os grupos experimentais. O grupo onde o verniz foi mantido por 24
h apresentou apenas o dobro da concentração do grupo onde o produto foi mantido por 4 h e
essa diferença pode não ter sido expressada no biofilme. Outra explicação pode ser porque as
amostras de biofilme foram coletadas apenas três dias após a aplicação do verniz, o que pode
ter contribuído para uma menor liberação dos reservatórios formados na superfície dental para
o biofilme. Ou mesmo que nessa coleta de biofilme (três dias após a aplicação do verniz) os
52
reservatórios de fluoreto já tivessem sido perdidos, de forma semelhante ao encontrado por
Skold-Larsson et. al. (2000).
Outro fato a ser considerado é que as amostras de esmalte coletadas nos incisivos
superiores podem ter sido um fator limitante. Essa região da cavidade bucal tem acesso
facilitado aos procedimentos de higiene oral e esses dentes podem ter sofrido um maior atrito
mecânico da alimentação ou da escovação dental. Esses elementos podem ter contribuído para
a remoção precoce do verniz-F aplicado ou dos depósitos de fluoreto formados. De fato esses
argumentos são reforçados na comparação dos valores encontrados com os de outros estudos
in vitro, como o realizado por Dijkman et al. (1983). Os autores observaram que a
incorporação do fluoreto no esmalte pelo verniz-F foi 20x superior ao controle o que é bem
maior ao encontrado no presente estudo (2x). Ainda nesse raciocínio, se capacidade de reação
dos produtos fluoretados com o esmalte se restringe à região ao entorno da sua aplicação
(Rölla et al., 1993), a coleta de amostras de esmalte somente em dentes anteriores não
permitiu a avaliar a concentração de fluoreto no esmalte dos dentes posteriores, que pode ter
sido maior nessa região.
Embora o presente trabalho tenha mostrado clinicamente alguns aspectos até
então somente demonstrados in vitro ou in situ, os resultados indicam que ainda há muitos
elementos que necessitam ser mais bem estudados para explicar o mecanismo anticárie do
verniz-F. Estudos adicionais devem ser realizados em voluntários com maior desafio
cariogênico ou mesmo delineados de maneira a quantificar o efeito residual do verniz-F sobre
as superfícies dentárias ao longo do tempo, o qual parece ser o caminho para esclarecer o seu
comprovado efeito anticárie (Marinho et al., 2013).
53
7 CONCLUSÃO
Conclui-se que um maior tempo de manutenção do verniz aplicado sobre a
superfície dentária aumenta a reatividade do fluoreto com o esmalte, porém sem reflexo na
concentração de fluoreto no biofilme.
54
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62
APÊNDICES
APÊNDICE 1: Kit de higiene bucal (escova, fio dental e dentifrício sem F-) e goma de
mascar açucarada fornecido aos voluntários
63
APÊNDICE 2: Folhetos de orientações aos voluntários
64
APÊNDICE 3: Sequência de procedimentos das biópsias de esmalte
Legenda: 1 e 2: Materiais utilizados; 3: Isolamento dental com rolos de algodão; 4: limpeza da superfície dental
com disco de algodão e acetona; 5: secagem dos dentes com jatos de ar; 6: delimitação da área de biópsia com
fita adesiva perfurada; 7: aplicação da solução ácida; 8: transferência da amostra coletada para o tubo.
❶ ❷
❸ ❹
❺ ❻
❼ ❽
65
APÊNDICE 4: Procedimentos de coleta de biofilme
Legenda: 1 e 2: Coleta do biofilme da superfície dos dentes; 3 e 4: Transferência do biofilme coletado para o
tubo de armazenamento.
❶ ❷
❸ ❹
66
ANEXOS
ANEXO 1: Comprovante de registro do estudo no ClinicalTrials.gov
67
68
69
ANEXO 2: Parecer consubstanciado do CEP
70
ANEXO 3: Relatório estatístico
RELATÓRIO ESTATÍSTICO Data: 17/05/2016
Estudo: Mauro
Análise realizada por: Livia Tenuta
Programa: SAS v9.4
I. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Fatores em estudo
Método de aplicação tópica de F (TRAT), em 3 níveis
Controle
Verniz 4 h
Verniz 24 h
Tempo (TEMPO), em 4 ou 5 níveis dependendo da variável resposta:
Baseline
Pós-tratamento (PT) (presente em F no dente e camada removida)
3 dias (presente nas variáveis de biofilme)
7 dias
14 dias (presente nas variáveis de biofilme)
28 dias
Variáveis resposta:
Concentração de F no dente
Camada de esmalte removida
Concentração de F no fluido do biofilme
Concentração de F nos sólidos do biofilme
Delineamento experimental:
Um delineamento fatorial 3 x 4 (ou 5) foi considerando na análise estatística, embora o efeito
de TEMPO devesse ser estimado por uma análise de "medidas repetidas". O n experimental
varia entre os diferentes grupos de TRAT, sendo próximo de 15 por grupo (de 14 a 17).
Modelo Matemático:
Yij = µ + TRATi + TEMPOj + TRATi*TEMPOj + eijk
Yij: média geral da variável resposta submetida ao i-ésimo nível de TRAT, no j-ésimo
TEMPO
µ: média geral do experimento
TRATi: efeito do i-ésimo nível de TRAT TEMPOj: efeito do j-ésimo nível de TEMPO
TRATi*TEMPOj: efeito da interação entre TRAT e TEMPO eijk: erro aleatório ou resíduo
71
1. Concentração de F no esmalte
Pressuposições do modelo: As pressuposições de homocedasticidade e normalidade dos
resíduos foram checadas e atendidas após a transformação dos dados à raiz quadrada.
Fdente = dados transformados a RAIZ QUADRADA.
Portanto, houve efeito significativo de TRAT, TEMPO e da INTERAÇÃO
TRAT*TEMPO nos resultados de F no esmalte. Neste caso, prevalece o estudo da
interação, cujo desdobramento está apresentado a seguir:
Dentro do grupo controle, não há efeito de tempo, porém dentro dos grupos V4h e V24h
há.
72
Dentro do tempo baseline e PT, há diferenças entre os grupos de TRAT; já dentro dos
tempos 7 dias e 28 dias, não há diferenças entre os grupos de TRAT.
Para determinar quais grupos diferem de quais dentro de cada nível de TRAT ou TEMPO,
usa-se as tabelas abaixo.
Para comparar os tempos dentro de verniz 4 h ou verniz 24 h, observar as comparações entre
os números 5 e 8, ou 9 e 12; para comparar os tratamentos dentro dos tempos baseline ou PT,
observar as comparações entre 1, 5 e 9, ou 2, 6 e 10.
73
74
2. Camada removida
Pressuposições do modelo: As pressuposições de homocedasticidade e normalidade dos
resíduos foram checadas e atendidas sem a necessidade de transformação dos dados
Camada = dados originais.
Portanto, houve efeito significativo de TRAT nos resultados de camada. Para checar as
diferenças entre grupos, foi utilizado o teste de Tukey.
Portanto, houve diferença significativa entre os grupos controle e verniz 4h, e entre
verniz 4 h e 24 h.
75
3. F no fluido do biofilme
Pressuposições do modelo: As pressuposições de homocedasticidade e normalidade dos
resíduos foram checadas e atendidas após a transformação logarítmica dos dados. Além disso,
um outlier foi removido.
Ffluido = log10 (Ffluido)
Outlier removido: V56, verniz 4h, 3 dias, valor = 158,8 uM
(Os missing values referem-se ao outlier removido, dados não coletados ou perdidos, e dados
deliberadamente retirados por apresentarem erros identificados durante a dosagem (não
deveriam ter sido dosados)).
Portanto, não houve efeito significativo de TRAT, TEMPO ou da interação entre eles
nos resultados de F no fluido do biofilme.
76
4. F na porção sólida do biofilme
Pressuposições do modelo: As pressuposições de homocedasticidade e normalidade dos
resíduos foram checadas e atendidas após a transformação logarítmica dos dados.
Ffluido = log10(Ffluido)
(Os missing values referem-se a dados não coletados ou perdidos, e dados deliberadamente
retirados por apresentarem erros identificados durante a dosagem (não deveriam ter sido
dosados)).
Portanto, não houve efeito significativo de TRAT, TEMPO ou da interação entre eles
nos resultados de F no sólido do biofilme.
77
II. LISTA DE DADOS PARA CHECAGEM
BIÓPSIA
Obs VOL TRAT TEMPO FDENTE CAMADA RAIZFDENTE
1 3 Controle 4-28d 0.5251 0.8035 0.72464
2 3 Controle 3-7d 0.5016 0.4359 0.70824
3 3 Controle 1-Baseli 0.5074 0.6426 0.71232
4 3 Controle 2-PT 0.5074 0.6426 0.71232
5 11 Controle 4-28d 0.6710 0.7766 0.81915
6 11 Controle 3-7d 0.7904 0.8457 0.88904
7 11 Controle 1-Baseli 1.1846 0.6011 1.08839
8 11 Controle 2-PT 1.1846 0.6011 1.08839
9 13 Controle 4-28d 0.5676 0.6409 0.75339
10 13 Controle 3-7d 0.6419 0.7811 0.80119
11 13 Controle 1-Baseli 0.8246 0.7536 0.90807
12 13 Controle 2-PT 0.8246 0.7536 0.90807
13 14 Controle 4-28d 0.6379 0.5226 0.79869
14 14 Controle 3-7d 1.1398 0.8116 1.06761
15 14 Controle 1-Baseli 0.8771 0.7855 0.93654
16 14 Controle 2-PT 0.8771 0.7855 0.93654
17 15 Controle 4-28d 0.8216 0.5222 0.90642
18 15 Controle 3-7d 0.3587 0.4936 0.59892
19 15 Controle 1-Baseli 0.3830 0.7689 0.61887
20 15 Controle 2-PT 0.3830 0.7689 0.61887
21 17 Controle 4-28d 0.6504 0.6811 0.80647
22 17 Controle 3-7d 0.6544 0.5386 0.80895
23 17 Controle 1-Baseli 0.3245 0.6836 0.56965
24 17 Controle 2-PT 0.3245 0.6836 0.56965
25 18 Controle 4-28d 0.1969 0.4783 0.44373
26 18 Controle 3-7d 0.2083 0.6782 0.45640
27 18 Controle 1-Baseli 0.6345 0.6838 0.79656
28 18 Controle 2-PT 0.6345 0.6838 0.79656
29 23 Controle 4-28d 0.4857 0.5140 0.69692
30 23 Controle 3-7d 0.5544 0.6548 0.74458
31 23 Controle 1-Baseli 0.3098 0.6586 0.55660
32 23 Controle 2-PT 0.3098 0.6586 0.55660
33 25 Controle 4-28d 0.4288 0.4504 0.65483
34 25 Controle 3-7d 0.4434 0.5127 0.66588
35 25 Controle 1-Baseli 0.2656 0.5711 0.51536
36 25 Controle 2-PT 0.2656 0.5711 0.51536
37 26 Controle 4-28d 0.6429 0.6861 0.80181
38 26 Controle 3-7d 0.6880 0.6726 0.82946
39 26 Controle 1-Baseli 0.7205 0.8324 0.84882
40 26 Controle 2-PT 0.7205 0.8324 0.84882
41 53 Controle 4-28d 0.4206 0.5116 0.64854
42 53 Controle 3-7d 0.5874 0.4517 0.76642
43 53 Controle 1-Baseli 0.4250 0.5489 0.65192
44 53 Controle 2-PT 0.4250 0.5489 0.65192
45 57 Controle 4-28d 0.3628 0.6293 0.60233
46 57 Controle 3-7d 0.2506 0.5762 0.50060
47 57 Controle 1-Baseli 0.3122 0.5092 0.55875
48 57 Controle 2-PT 0.3122 0.5092 0.55875
49 70 Controle 4-28d 0.2265 0.5776 0.47592
50 70 Controle 3-7d 0.4383 0.5188 0.66204
51 70 Controle 1-Baseli 0.6012 0.5837 0.77537
52 70 Controle 2-PT 0.6012 0.5837 0.77537
53 76 Controle 4-28d 0.5588 0.6049 0.74753
78
54 76 Controle 3-7d 0.7289 0.6703 0.85376
55 76 Controle 1-Baseli 0.5397 0.6671 0.73464
56 76 Controle 2-PT 0.5397 0.6671 0.73464
57 81 Controle 4-28d 0.7512 0.7372 0.86672
58 81 Controle 3-7d 0.6933 0.6294 0.83265
59 81 Controle 1-Baseli 0.6152 0.5364 0.78435
60 81 Controle 2-PT 0.6152 0.5364 0.78435
61 101 Controle 4-28d 0.5810 0.5037 0.76223
62 101 Controle 3-7d 1.1095 0.5995 1.05333
63 101 Controle 1-Baseli 0.8636 0.7247 0.92930
64 101 Controle 2-PT 0.8636 0.7247 0.92930
65 5 V24h 4-28d 0.4476 0.6723 0.66903
66 5 V24h 3-7d 0.7431 0.5759 0.86203
67 5 V24h 1-Baseli 0.2338 0.6185 0.48353
68 5 V24h 2-PT 1.0747 0.6921 1.03668
69 7 V24h 4-28d 0.5878 0.6360 0.76668
70 7 V24h 3-7d 0.6960 0.5665 0.83427
71 7 V24h 1-Baseli 0.2233 0.6195 0.47255
72 7 V24h 2-PT 2.3139 0.4507 1.52115
73 16 V24h 4-28d 0.5878 0.7168 0.76668
74 16 V24h 3-7d 0.7843 0.8871 0.88561
75 16 V24h 1-Baseli 0.3859 0.7362 0.62121
76 16 V24h 2-PT 2.4435 0.7497 1.56317
77 43 V24h 4-28d 0.4857 0.5405 0.69692
78 43 V24h 3-7d 0.5523 0.4953 0.74317
79 43 V24h 1-Baseli 0.2970 0.6508 0.54498
80 43 V24h 2-PT 1.3522 0.2977 1.16284
81 44 V24h 4-28d 0.7600 0.6227 0.87178
82 44 V24h 3-7d 0.9328 0.8936 0.96582
83 44 V24h 1-Baseli 0.7693 0.7011 0.87710
84 44 V24h 2-PT 1.7347 0.4119 1.31708
85 45 V24h 4-28d 0.6256 0.4577 0.79095
86 45 V24h 3-7d 0.9186 0.6714 0.95844
87 45 V24h 1-Baseli 0.2868 0.7756 0.53554
88 45 V24h 2-PT 1.8462 0.7808 1.35875
89 46 V24h 4-28d 0.5230 0.4705 0.72319
90 46 V24h 3-7d 0.8246 0.7690 0.90807
91 46 V24h 1-Baseli 0.4752 0.6326 0.68935
92 46 V24h 2-PT 2.0429 0.7129 1.42930
93 49 V24h 4-28d 0.3771 0.4990 0.61408
94 49 V24h 3-7d 0.9186 0.5525 0.95844
95 49 V24h 1-Baseli 0.2981 0.5189 0.54599
96 49 V24h 2-PT 1.1527 0.5291 1.07364
97 55 V24h 4-28d 0.4494 0.6203 0.67037
98 55 V24h 3-7d 0.6394 0.8386 0.79962
99 55 V24h 1-Baseli 0.3771 0.6126 0.61408
100 55 V24h 2-PT 1.5079 0.5034 1.22797
101 73 V24h 4-28d 0.3489 0.6072 0.59068
102 73 V24h 3-7d 0.6620 0.5581 0.81363
103 73 V24h 1-Baseli 0.4698 0.6273 0.68542
104 73 V24h 2-PT 1.6750 0.6584 1.29422
105 74 V24h 4-28d 0.4511 0.9427 0.67164
106 74 V24h 3-7d 1.1224 0.8493 1.05943
107 74 V24h 1-Baseli 0.3615 0.9298 0.60125
108 74 V24h 2-PT 1.7347 0.4001 1.31708
109 77 V24h 4-28d 0.6135 0.6672 0.78326
110 77 V24h 3-7d 0.6827 0.6452 0.82626
111 77 V24h 1-Baseli 0.4417 0.6561 0.66461
112 77 V24h 2-PT 1.9046 0.5447 1.38007
113 104 V24h 4-28d 0.6159 0.4665 0.78479
79
114 104 V24h 3-7d 0.9960 0.5618 0.99800
115 104 V24h 1-Baseli 0.3771 0.7944 0.61408
116 104 V24h 2-PT 2.6932 0.4729 1.64110
117 113 V24h 4-28d 0.6479 0.8024 0.80492
118 113 V24h 3-7d 0.3491 0.7122 0.59085
119 113 V24h 1-Baseli 0.3491 0.6674 0.59085
120 113 V24h 2-PT 1.8319 0.6126 1.35348
121 114 V24h 4-28d 0.5050 0.4288 0.71063
122 114 V24h 3-7d 0.7965 0.4603 0.89247
123 114 V24h 1-Baseli 0.3685 0.4644 0.60704
124 114 V24h 2-PT 2.1911 0.4187 1.48024
125 1 V4h 4-28d 0.6280 0.9041 0.79246
126 1 V4h 3-7d 0.6594 0.8390 0.81203
127 1 V4h 1-Baseli 0.2478 0.5763 0.49780
128 1 V4h 2-PT 0.7810 0.6851 0.88374
129 2 V4h 4-28d 0.5720 0.6298 0.75631
130 2 V4h 3-7d 0.7123 0.8578 0.84398
131 2 V4h 1-Baseli 0.4845 0.6920 0.69606
132 2 V4h 2-PT 0.7871 0.7326 0.88719
133 6 V4h 4-28d 0.6017 0.7317 0.77569
134 6 V4h 3-7d 0.5587 0.5102 0.74746
135 6 V4h 1-Baseli 0.7095 0.8543 0.84232
136 6 V4h 2-PT 1.1800 0.7146 1.08628
137 8 V4h 4-28d 0.8410 0.8652 0.91706
138 8 V4h 3-7d 0.9080 0.7976 0.95289
139 8 V4h 1-Baseli 0.7576 0.9163 0.87040
140 8 V4h 2-PT 0.8642 0.6584 0.92962
141 19 V4h 4-28d 0.4857 0.4887 0.69692
142 19 V4h 3-7d 0.6129 0.6649 0.78288
143 19 V4h 1-Baseli 0.7723 0.7329 0.87881
144 19 V4h 2-PT 0.9750 0.7566 0.98742
145 28 V4h 4-28d 0.1731 0.6089 0.41605
146 28 V4h 3-7d 1.1224 0.7975 1.05943
147 28 V4h 1-Baseli 0.3183 0.4617 0.56418
148 28 V4h 2-PT 0.7310 0.6541 0.85499
149 29 V4h 4-28d 0.4618 0.7237 0.67956
150 29 V4h 3-7d 0.5459 0.6076 0.73885
151 29 V4h 1-Baseli 0.3208 0.4985 0.56639
152 29 V4h 2-PT 0.6256 0.6547 0.79095
153 30 V4h 4-28d 0.7396 0.6353 0.86000
154 30 V4h 3-7d 0.9150 0.5358 0.95656
155 30 V4h 1-Baseli 0.6544 0.6957 0.80895
156 30 V4h 2-PT 1.0831 0.8131 1.04072
157 32 V4h 4-28d 0.3228 0.5042 0.56815
158 32 V4h 3-7d 0.4752 0.8126 0.68935
159 32 V4h 1-Baseli 0.2656 0.7920 0.51536
160 32 V4h 2-PT 1.1800 0.7713 1.08628
161 42 V4h 4-28d 0.4030 0.6659 0.63482
162 42 V4h 3-7d 0.6176 0.9099 0.78588
163 42 V4h 1-Baseli 0.3412 0.5841 0.58412
164 42 V4h 2-PT 1.1001 0.8340 1.04886
165 47 V4h 4-28d 0.7114 0.9990 0.84345
166 47 V4h 3-7d 0.5418 0.6445 0.73607
167 47 V4h 1-Baseli 0.3438 0.6009 0.58634
168 47 V4h 2-PT 1.3788 0.8537 1.17422
169 50 V4h 4-28d 0.5149 0.8181 0.71757
170 50 V4h 3-7d 0.5335 0.7575 0.73041
171 50 V4h 1-Baseli 0.4863 0.7011 0.69735
172 50 V4h 2-PT 1.0622 0.8511 1.03063
173 56 V4h 4-28d 0.4407 0.7140 0.66385
80
174 56 V4h 3-7d 0.5674 0.4525 0.75326
175 56 V4h 1-Baseli 0.7904 0.5615 0.88904
176 56 V4h 2-PT 1.4113 0.5908 1.18798
177 60 V4h 4-28d 0.6305 0.6238 0.79404
178 60 V4h 3-7d 0.5459 0.5759 0.73885
179 60 V4h 1-Baseli 0.4520 0.6765 0.67231
180 60 V4h 2-PT 1.7213 0.6939 1.31198
181 111 V4h 4-28d 0.3816 0.7364 0.61774
182 111 V4h 3-7d 0.6224 0.7294 0.78892
183 111 V4h 1-Baseli 0.4644 0.6402 0.68147
184 111 V4h 2-PT 1.0418 0.5683 1.02069
185 112 V4h 4-28d 0.6606 0.5604 0.81277
186 112 V4h 3-7d 0.8027 0.5719 0.89594
187 112 V4h 1-Baseli 0.6152 0.5759 0.78435
188 112 V4h 2-PT 1.0020 0.5856 1.00100
189 115 V4h 4-28d 0.5459 0.5938 0.73885
190 115 V4h 3-7d 0.6723 0.7355 0.81994
191 115 V4h 1-Baseli 0.4555 0.6318 0.67491
192 115 V4h 2-PT 0.9827 0.4892 0.99131
81
BIOFILME
Obs VOL TRAT TEMPO FFLUIDO FSOLIDO LOGFFLUIDO LOGFSOLIDO
1 3 Controle 0-Baseli 5.1620 0.6234 0.71282 -0.20523
2 3 Controle 1-3d 6.0046 0.3129 0.77848 -0.50459
3 3 Controle 2-7d 4.9874 0.6092 0.69787 -0.21524
4 3 Controle 3-14d 5.8359 0.3655 0.76611 -0.43711
5 3 Controle 4-28d 8.4710 0.5618 0.92793 -0.25042
6 11 Controle 0-Baseli 4.0098 1.9101 0.60312 0.28106
7 11 Controle 1-3d 1.0643 1.0607 0.02706 0.02559
8 11 Controle 2-7d 5.6973 1.9839 0.75567 0.29752
9 11 Controle 3-14d 5.8336 1.6693 0.76594 0.22253
10 11 Controle 4-28d 8.8431 1.5450 0.94660 0.18893
11 13 Controle 0-Baseli 7.4156 0.2820 0.87015 -0.54975
12 13 Controle 1-3d 6.0823 4.6075 0.78407 0.66347
13 13 Controle 2-7d 12.2378 0.5964 1.08770 -0.22446
14 13 Controle 3-14d 4.1024 2.7338 0.61304 0.43677
15 13 Controle 4-28d 7.0921 0.2690 0.85077 -0.57025
16 14 Controle 0-Baseli 5.8898 15.7478 0.77010 1.19722
17 14 Controle 1-3d 5.6848 17.9573 0.75472 1.25424
18 14 Controle 2-7d 6.2495 25.9727 0.79585 1.41452
19 14 Controle 3-14d 6.3743 11.5511 0.80443 1.06262
20 14 Controle 4-28d 7.4939 49.2599 0.87471 1.69249
21 15 Controle 0-Baseli 4.6622 0.6431 0.66859 -0.19172
22 15 Controle 1-3d 8.8887 19.0031 0.94884 1.27882
23 15 Controle 2-7d 3.0631 1.3491 0.48616 0.13004
24 15 Controle 3-14d 5.6492 5.8218 0.75199 0.76506
25 15 Controle 4-28d 11.0346 8.7951 1.04276 0.94424
26 17 Controle 0-Baseli 4.1342 1.3416 0.61639 0.12762
27 17 Controle 1-3d 8.4970 7.4026 0.92927 0.86938
28 17 Controle 2-7d 6.6967 0.7764 0.82586 -0.10991
29 17 Controle 3-14d 6.2819 0.9123 0.79809 -0.03986
30 17 Controle 4-28d 7.2836 2.1532 0.86235 0.33308
31 18 Controle 0-Baseli 5.8147 1.6059 0.76453 0.20572
32 18 Controle 1-3d 13.1188 7.3708 1.11789 0.86751
33 18 Controle 2-7d 5.8041 0.5480 0.76373 -0.26122
34 18 Controle 3-14d 6.1705 1.0232 0.79032 0.00996
35 18 Controle 4-28d 6.3711 2.0987 0.80421 0.32195
36 23 Controle 0-Baseli 3.2629 8.0180 0.51360 0.90407
37 23 Controle 1-3d 6.0359 0.2039 0.78074 -0.69058
38 23 Controle 2-7d 7.0072 0.6665 0.84554 -0.17620
39 23 Controle 3-14d 5.5262 0.4816 0.74243 -0.31731
40 23 Controle 4-28d 5.9894 5.7943 0.77738 0.76300
41 25 Controle 0-Baseli 6.6529 0.5457 0.82301 -0.26305
42 25 Controle 1-3d 7.0235 1.1484 0.84655 0.06009
43 25 Controle 2-7d 6.6327 0.7316 0.82169 -0.13573
44 25 Controle 3-14d 5.4394 0.6066 0.73555 -0.21710
45 25 Controle 4-28d 6.0345 0.6708 0.78064 -0.17341
82
46 26 Controle 0-Baseli 22.9464 7.2585 1.36071 0.86085
47 26 Controle 1-3d 6.4862 7.9132 0.81199 0.89835
48 26 Controle 2-7d 6.1941 6.3828 0.79198 0.80501
49 26 Controle 3-14d 5.7327 66.6417 0.75836 1.82375
50 26 Controle 4-28d 15.5421 0.9055 1.19151 -0.04311
51 53 Controle 0-Baseli 3.9157 8.1759 0.59281 0.91254
52 53 Controle 1-3d 5.7202 1.2651 0.75741 0.10212
53 53 Controle 2-7d 4.9787 0.9740 0.69712 -0.01144
54 53 Controle 3-14d 7.0072 1.1539 0.84554 0.06217
55 53 Controle 4-28d 7.3487 1.9394 0.86621 0.28767
56 57 Controle 0-Baseli 2.5578 8.9740 0.40787 0.95299
57 57 Controle 1-3d . 10.8258 . 1.03446
58 57 Controle 2-7d 8.3269 12.2890 0.92048 1.08952
59 57 Controle 3-14d 6.3142 6.0447 0.80032 0.78137
60 57 Controle 4-28d 7.4059 6.0446 0.86958 0.78137
61 70 Controle 0-Baseli 7.1596 0.2445 0.85489 -0.61172
62 70 Controle 1-3d 6.2013 1.0525 0.79248 0.02222
63 70 Controle 2-7d . 0.6839 . -0.16501
64 70 Controle 3-14d 7.0904 2.2629 0.85067 0.35467
65 70 Controle 4-28d 2.0480 0.7090 0.31133 -0.14935
66 76 Controle 0-Baseli 3.7908 0.2964 0.57873 -0.52812
67 76 Controle 1-3d 5.3215 8.9381 0.72603 0.95125
68 76 Controle 2-7d 10.4717 2.6604 1.02002 0.42495
69 76 Controle 3-14d 14.4385 0.6344 1.15952 -0.19764
70 76 Controle 4-28d 4.9969 1.3828 0.69870 0.14076
71 81 Controle 0-Baseli 5.1345 3.5460 0.71050 0.54974
72 81 Controle 1-3d 5.3619 1.6066 0.72932 0.20591
73 81 Controle 2-7d 8.6943 5.1327 0.93923 0.71035
74 81 Controle 3-14d 17.6887 1.9332 1.24770 0.28628
75 81 Controle 4-28d . 0.8869 . -0.05213
76 101 Controle 0-Baseli 4.8496 2.9447 0.68571 0.46904
77 101 Controle 1-3d 4.9575 1.1630 0.69526 0.06558
78 101 Controle 2-7d . 2.1622 . 0.33490
79 101 Controle 3-14d 6.0263 0.8894 0.78005 -0.05090
80 101 Controle 4-28d 10.1244 0.8500 1.00537 -0.07058
81 1 V4h 0-Baseli 7.2445 2.7305 0.86001 0.43624
82 1 V4h 1-3d 7.6354 0.4135 0.88283 -0.38352
83 1 V4h 2-7d 7.2412 0.3283 0.85981 -0.48373
84 1 V4h 3-14d 6.8257 0.5782 0.83415 -0.23792
85 1 V4h 4-28d 2.9413 0.4649 0.46854 -0.33264
86 2 V4h 0-Baseli 4.7376 0.7201 0.67556 -0.14261
87 2 V4h 1-3d 5.1639 2.8276 0.71298 0.45142
88 2 V4h 2-7d 5.7409 2.7923 0.75898 0.44596
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239 114 V24h 3-14d 7.9369 . 0.89965 .
240 114 V24h 4-28d 6.5207 2.8316 0.81429 0.45203
