Upload
doankhanh
View
229
Download
9
Embed Size (px)
Citation preview
Univerza v LjubljaniBiotehniška fakulteta Študij mikrobiologije
Seminarska naloga pri predmetu IDENTIFIKACIJA IN TAKSONOMIJA – GLIVE:
�lani projekne skupine: Jelka Pohar
Matej Sko�aj Brigita Radovan
3. letnik
Mentor:
Ljubljana, 3.1.2006 asist. mag. Polona Zalar, univ. dipl. biol.
Glive na sladki in slani hrani
2
UVOD ...................................................................................................................3
HIPEROSMOLARNA OKOLJA............................................................................4
VODNA AKTIVNOST ...........................................................................................4
KOMPATIBILNI TOPLJENCI...............................................................................8
PRIPRAVA IN POTEK SEMINARSKE NALOGE ..............................................12
Material in metode dela.................................................................................................. 12
REZULTATI........................................................................................................14
Glive na hrani z nizko vodno aktivnostjo:.................................................................... 14
Opisi gliv:......................................................................................................................... 16 Penicillium spp. (pri našem poskusu najve�krat izolirani predstavniki) ...................... 16 Cladosporium spp. ........................................................................................................ 18 Clonostachys spp. ......................................................................................................... 18 Fusarium spp................................................................................................................. 19 Aspergillus spp.............................................................................................................. 20 Rhizopus spp................................................................................................................. 21 Trichoderma spp. .......................................................................................................... 22
Komentar rezultatov....................................................................................................... 23
MIKOTOKSINI....................................................................................................24
ZAKLJU�EK ......................................................................................................26
VIRI.....................................................................................................................27
Glive na sladki in slani hrani
3
UVOD
Ljudje konzerviramo in shranjujemo živila na tak ali druga�en na�in že od pradavnine.
Spoznali smo, da živila ostanejo dalj �asa sveža, �e jih shranimo v zelo slanem ali
sladkem okolju. Tako eskimi še vedno svoj ulov iz morja shranjujejo preprosto tako, da
ga mo�no nasolijo. Slane ribe ostanejo tako užitne in primerne za prehrano še dolgo
potem, ko so bile ulovljene. Hrano pa lahko shranimo tudi v okolju z visoko vsebnostjo
sladkorja. Hrana ostane tako dalj �asa uporabna in primerna za prehrano.
Taka živila so ve�ini mikroorganizmov nedosegljiva, saj imajo nizko vodno aktivnost,
kar prepre�uje njihovo kolonizacijo. Med bolj uspešnimi pri koloniziranju teh
negostoljubnih okolij so nekatre glive. Deloma zaradi celi�ne stene in evkariotskega
izvora, deloma zaradi pretkanih mehanizmov izogibanja negativnih u�inkov takšnih
okolij. O tem v nadaljevanju.
V tej seminarskinalogi bomo skušali pojasniti, zakaj so takšna okolja neprijazna za rast in
razmnoževanje mikroorganizmov, kako so se nekatere glive prilagodile na takšna okolja
ter katere so te glive.
Glive na sladki in slani hrani
4
HIPEROSMOLARNA OKOLJA
Celica, ki je v okolju z znižano vodno aktivnostjo zaradi visoke koncentracije NaCl ali
drugih topljencev, se soo�a z hiperosmolarnim okoljem (posledi�no sledi prehajanje vode
iz citoplazme v okolje) in z vdorom Na + in Cl - ionov v citoplazmo in njihovo
potencialno toksi�nostjo.
Citoplazma ima nižjo vodno aktivnost od okolice. Zaradi teh prilagoditev pride do motenj
v intracelularnih procesih in do podiranja struktur, ki temeljijo na vodikovih vezeh.
Zaradi sprememb v citoplazmi proteini zavzamejo druga�no terciarno strukturo, pride pa
tudi do zmanjšane encimske aktivnosti v citoplazmi. Na novo sintetizirani proteini se
tako ne morejo pravilno zviti, kar privede do pove�anja koncentracije metabolitov, ki so
za celice lahko tudi toksi�ni. Celice se zaradi sprememb v aktivnosti in rasti prenehajo
deliti in pridejo v fazo prilagajanja na nove pogoje.
VODNA AKTIVNOST
Vodna aktivnost (aw) ozna�uje dostopnost vode za hidratacijo oz. metabolne procese v
celici. �e voda interagira s topljenci ali površino, ni na voljo za druge pocese. Definirana
je kot:
0pp
xa www == λ
�w – aktivnostni koeficient. Aktivnostni koeficient ni konstanta in v odvisnosti od
koncentracije raztopine zavzema vrednosti od 0 do 1. Odvisen je od koncentracije
topljenca v raztopini.
xw- molski delež vode
p – parcialni tlak vode nad raztopino
p0 – parcialni tlak �iste vode pri isti temperaturi
�ista voda ima vodno aktivnost 1, vse raztopine imajo aw manjšo od 1. Visoke
koncentracije topljencev v vodnih raztopinah zmanjšujejo dostopnost vode organizmom,
ki se nahajajo v takšnih okoljih. Dostopnost vode (ne pomeni isto kot koli�ina vode) za
Glive na sladki in slani hrani
5
organizme v okolju lahko opišemo na ve� na�inov – kot vodni potencial, kemijski
potencial vode, osmotski tlak, v zvezi z mikroorganizmi pa najpogosteje uporabljamo
vodno aktivnost. Za vlažne sisteme so vrednosti za vodno aktivnost višje od 0'80, za suhe
sisteme pa manjše od 0'70 (graf 1). �e povišamo temperaturo ali tlak, se poviša tudi
vodna aktivnost in obratno.
Podobno kot pri vseh ravnotežjih, voda prehaja iz podro�ij z višjo koncentracijo na
podro�ja z nižjo koncentracije vode. �e je celica v hipertono�nem okolju, ima citoplazma
višjo vodno aktivnost od okolice, zato voda prehaja iz celice. Zaradi teh prilagoditev
pride do motenj v intracelularnih procesih in do podiranja struktur, ki temeljijo na
vodikovih vezeh. Proteini zavzemajo druga�no terciarno strukturo. Posledi�no se
zmanjšana encimske aktivnosti. Novo sintetizirani proteini pa ne morejo pravilno zviti,
kar privede do pove�anja koncentracije metabolitov, ki pa so lahko za celice tudi
toksi�ni. Celice se zaradi sprememb v aktivnosti in rasti prenehajo deliti in pridejo v fazo
prilagajanja na nove pogoje.
Na vodno aktivnost pa vpliva tudi vsebnost vlage v ozra�ju, ki je obi�ajno med 50 in 80%
(aw= 0,50 – 0,80). Snovi z nižjo vodno aktivnostjo bodo vodo prevzele, snovi z višjo pa
bodo vodo izgubile in se izsušile zaradi težnje po izena�enju potencialov.
Graf 1: Izoterma vodne aktivnosti v odvisnosti od prisotne vlage (adsorbcija - ali desorbcija - sušenje) ter od spremembe pritiska in temperature
Glive na sladki in slani hrani
6
Kontrola vodne aktivnosti je zelo pomembna v prehrambeni industriji. Po eni strani zato,
da hrana med pripravo ohrani obliko, �vrstost, vonj in okus. Živila moramo v ta namen
hraniti v primernih prostorih ter na primerni temperaturi in vlagi, da se vodna aktivnost
ne spremeni. Drugi razlog pa je, ker nizka aktivnost prepre�uje mikrobno rast (tudi
patogenih mikroorganizmov) oz. kvarljivost. Visoko kvarljiva živila imajo vrednosti aw
med 0,99 in 0,95, kar omogo�a rast veliki ve�ini mikroorganizmov. Rast ve�ine (razen
tistih, ki so ustrezno prilagojene) bakterij je inhibirana pod aw= 0,91 (Tabela 2). Pod to
mejo rastejo predvsem glive. Ve�ina kvasovk raste na hrani z vodno aktivnostjo nižjo od
0,87. Ve�ina plesni ne raste pod aw 0,88. Rast gliv lahko prepre�imo, �e vodno aktivnost
spustimo pod 0, 65 aw in jo zadržimo pod to mejo. �e temperatura v živilu ali izdelku ni
enotna se lahko vodna aktivnost lokalno dvigne zaradi vlage na hladnejših podro�jih, kar
vodi v razrast glive. Meja za mikrobno rast je vodna aktivnost 0,60. Najbolj osmofilna
organizma Monascus bisporus in Saccharomyces rouxii lahko rasteta tudi pri vodnih
aktivnostih 0,62 oz. 0,61. Pod to vrednostjo pride namre� že do denaturacije DNA.
Da ohranimo primerno vodno aktivnost v hrani oz. njeno uporabnost do roka uporabe, jo
moramo shranjevati na primernem prostoru, ki ga predlaga proizvajalec. To je ponavadi
temen, suh in hladen prostor. Iz grafa 1 lahko vidimo, da sta prisotnost vlage v zraku in
temperatura klju�na dejavnika, ki vplivata na spremembe vrednosti vodne aktivnosti.
Tabela 1: Vrednosti vodne aktivnost aw za posamezna živila
Glive na sladki in slani hrani
7
Tabela 2: Minimalna inhibitorna aw za rast naštetih mikroorganizmov na hrani
Pri seminarski nalogi, smo želeli ugotoviti, kakšne glive rastejo na sladki in slani hrani.
Ta hrana ima veliko koncentracijo sladkorja oz. soli in tako nizko vodno aktivnost.
Pri�akovali smo, da bodo zrasle glive, ki tolerirajo nižje koncentracije vode v okolju
(osmotolerantne oz. kserotolerantne). Med predstavniki, ki so nam zrasli na slani in
sladki hrani nismo dobili nobenega zna�ilnega osmofilnega organizma, za katerega bi
bila visoka koncentracija topljencev (soli oz. glukoze) ali nizka aw pogoj za njegovo rast.
Voda difundira iz obmo�ij z višjo koncentracijo na podro�ja z nižjo v procesu osmoze.
�e je v celici raztopljenih ve� snovi, kot v okolju, potem voda vdre v celice.
�e se celica znajde v okolju z nižjo vodno aktivnostjo, potem voda odteka iz celice.
Celice se morajo v takih okoljih primerno zavarovati, da ne po�ijo oz. izgubijo vode za
metabolne procese.
Ti organizmi imajo posebne sisteme s katerimi se varujejo pred morebitnimi poškodbami
nastalimi zaradi prisotnosti NaCl.
Glive na sladki in slani hrani
8
KOMPATIBILNI TOPLJENCI
Kot prvi odgovor na prilagoditve na spremenjene pogoje celice v vodni aktivnosti je
sinteza kompatibilnih topljencev. To so nizkomolekularne snovi, ki sodelujejo pri
izena�itvi zunanjega osmotskega tlaka in v fizioloških koncentracijah ne vplivajo na
metabolne procese v celici. Organizmi jih lahko sami sintentizirajo in kopi�ijo znotraj
citoplazme, izven celice pa so prisotni le v sledeh. Celica z njihovo hitro sintezo zaustavi
izgubljanje vode. S pomo�jo takšnega »odgovora« teži k izena�itvi prvotnega volumna in
oblike.
V celicah so lahko prisotni tudi v velikostnem razredu molarnih koncentracij, so relativno
inertni glede na intracelularni metabolizem in služijo predvsem zniževanju intracelularne
aw, nekatere pa tudi š�itijo celi�ne strukture pred negativnimi vplivi nizke vodne
aktivnosti.
Med najbolj znane kompatibilne topljence sodijo: glicerol, arabitol, glicin betain, prolin,
ektoin, trehaloza. Uporabljajo jih evkariontski organizmi, cianobakterije, ve�ina bakterij
in manjša skupina arhej. Halofilne, kserofilne ter osmofilne glive uporabljajo glicerol in
arabitol; alge glicerol; cianobakterije uporabljajo saharozo, treharozo, glukozilglicerol oz.
glicin betain; halofilne anoksigene bakterije glicin betain; halofilne metanogene arheje
prav tako glicin betain; pri halofilnih heterotrofnih bakterijah pa je glavni kompatibilni
topljenec ektoin.
Kompatibilni topljenci se lahko kopi�ijo v halofilnih, ksenotolerantnih in osmotolerantni
organizmih. Halofili živijo v hipersalinih okoljih, osmofilom najbolj ustrezajo okolje s
povišanimi osmotskimi pritiski in kserofilni, ki preferirajo nizke vodne aktivnosti svojega
okolja.
Kot glavni intracelularni topljenec služi glicerol. Ta je deloma lipofilen in v primerjavi z
drugimi kompatibilnimi topljenci zelo u�inkovito prehaja skozi biološke membrane. V
citoplazmi ima funkcijo zaš�ite v citoplazmi topnih proteinov. Glicerol je skoraj idealen
kompatibilni topljenec, saj glede na koli�ino energije (potrebne za njegovo sintezo)
Glive na sladki in slani hrani
9
u�inkovito zniža aw in inertnost do celi�nih komponent. Njegova uporaba je omejena smo
na evkariotske halofilne vrste, saj steroli specifi�no uravnavajo prepustnost membran za
glicerol. Prokarionti (v ve�ino ne vsebujejo sterolov) morajo uporabljati druge,
energetsko dražje in manj u�inkovite kompatibilne topljence.
Slika 1: glicerol
Glicerol je klju�na snov, ki pomaga celicam preživeti v hiperosmolarnih pogojih. Kot
kompatibilni topljenec zmanjšuje intracelularno vodno aktivnost in pomaga vzpostavljati
pozitiven celi�ni turgor. Meritve ekstracelularne in celokupne koncentracije glicerola pri
kulturah v razli�nih koncentracijah soli v gojiš�u so pokazale, da kadar celice rastejo v
okolju brez soli, so koncentracije glicerola v njihovi notranjosti in v okolici pod mejo
detekcije. Ob pove�anih slanostih gojiš�a intracelularna koncentracija glicerola naraš�a
sorazmerno s koncentracijo NaCl v celi�nem okolju do 10%NaCl. To pomeni, da za�no
celice ob pove�ani slanosti okolja uravnavano sintetizirati glicerol. Ekstracelularna
koncentracija glicerola ostaja konstantno zelo nizka, kar pomeni, da celice zadržujejo
glicerol znotraj celic ali pa ga privzemajo nazaj iz okolja.
Pri koncentracijah NaCl v gojiš�u nad 17% se intracelularna koncentracija glicerola
bistveno ne pove�uje ve� bistveno, takrat se za�ne pove�evati njegova ekstracelularna
koncentracija. Verjetno je proizvodnja glicerola pri teh pogojih inducirana, vendar pa ga
celice ne morejo ve� zadrževati in zato je morda motena njihova homeostaza. Druga
možnost pa je, da celice za�nejo celice sintetizirati dodatne kompatibilne topljence in da
glicerol izgublja na pomenu kot klju�ni kompatibilni topljenec. Znano je, da glicerol ob
Glive na sladki in slani hrani
10
previsokih koncentracijah (nad 50%) ne deluje ve� zaš�itno, ampak inhibitorno na
biološke strukture.
Ve�ina preu�enih mikroorganizmov izgublja glicerol v okolje in morajo zato vzdrževati
stalno pove�ano sintezo glicerola. To zmanjša pretok metabolitov skozi glikolizo, hkrati
pa je za sintezo glicerola potreben ATP in posledi�no se za celico spremeni energetska
bilanca.
Glicerol sam tudi zaš�iti strukturo v citoplazmi topnih proteinov, še blagodejnejši vpliv
na biološke strukture pa ima disaharid trehaloza (zaš�ito intracelularnih struktur pred
razli�nimi stresnimi dejavniki, katere koncentracija se prav tako pove�a). Za mezofilne
organizme obstaja meja, nad katero tudi opisani mehanizmi niso ve� dovolj, da bi
omogo�ili nadaljnjo rast. Ta meja je dolo�ena s toksi�nostjo Na+ oz. je posledica dejstva,
da je zadrževanje glicerola znotraj celic dokaj neu�inkovito. V laboratorijskih pogojih,
kjer so gostote celic relativno zelo visoke, lahko namre� celice s produkcijo glicerola in
njegovim uhajanjem v zunajceli�ni prostor bistveno znižajo tudi zunanjo aw, kar jih vodi
v za�arani krog in v celi�no smrt.
Slika 2: Trehaloza
Pomembna sestavina membran imajo pri evkariontskih halofilnih organizmih steroli. Le
ti imajo eno klju�nih funkcij v prilagoditvi na hipersalino okolje. Nekateri organizmi s
spremembo vsebnosti sterolov v plazmalemi uravnavajo prehajanje glicerola iz celic,
Glive na sladki in slani hrani
11
poleg tega pa membranski steroli vplivajo na transport Na+ v celico. Glavni glivni sterol
je ergosterol, njegova biosinteza pa zelo podobna sintezi holesterola pri živalih.
Drugi pristop za izena�enje hiperosmolarnega okolja je kopi�enje visokih intracelularnih
koncentracij ionov, in sicer molarnih koncentracij K+ in Cl-, kar omogo�i izotoni�no
oziroma celo nekoliko hipertoni�no citoplazmo, hkrati pa zahteva od makromolekularnih
struktur – predvsem so s tega stališ�a preu�ene strukture proteinov – prilagojenost na
pogoje mnogo višjih ionskih jakosti, kot so prisotne v obi�ajnih vodnih raztopinah in
kakršne nastopajo v citoplazmi mezofilnih organizmov. Takšen tip prilagoditve je znan
samo pri prokariontskih organizmih, in sicer pri arhejah iz reda Halobacteriales ter pri
bakterijah iz reda Haloanaerobiales.
Glive na sladki in slani hrani
12
PRIPRAVA IN POTEK SEMINARSKE NALOGE
Material in metode dela
21. 11. 20005
Poskus smo nastavili tako, da smo sladko in slano hrane položili v vlažne komore
(petrijevke). Najprej smo nanje dali filter papir, nanj kanili nekaj kapljic vode, kar je
glivam omogo�ilo primerno vlago za rast ter položili vanjo še koš�ek hrane. Sladka in
slana hrana ima nizko vodno aktivnost, tako na takih vrstah produktov rastejo le glive, ki
so se zelo prilagodile takemu na�inu življenja, a o tem pozneje. Spodaj je navedena
hrana, ki smo jo porabili za poskus.
Hrana v petrijevkah:
• Beli sladkor • Rjavi sladkor • Suhe marelice • Suhe slive (doma�e & kupljene) • Kokos • Suh ananas • Suha papaja • Suhe banane • Rozine • Kompot (hruška & ribez) • Med • Marmelada • Kakav • Plesen iz marmelade • Kakav • �okolada • Slane pal�ke • Slana riba • Pršut • �ips • Gobe v slanici • Sojina omaka na MEA
Glive na sladki in slani hrani
13
Zatem smo ob navedenih datumih preverili rast na hrani, ter tudi izolirali zrasle glive.
Vsaki�, ko smo pregledali rast na hrani, smo pregledali tudi filter papir�ke, �e so bili
dovolj vlažni. �e niso bili, smo jih ovlažili, da je bilo v komori dovolj vlage.
24. 11. 2005
Prvi� smo pregledali preparate. Na hruškovem kompotu smo opazili 2 plesni, ki smo ju z
agarsko iglico nacepili na MEA gojiš�e.
28. 11. 2005
Najprej smo pregledali vlažne komore. Kjer je bilo potrebno navlažiti filter papir, smo
navlažili. Opazili smo nastanek plesni na kokosu, pršutu, ribi, gobah v slanici, slanih
pal�kah, bananah, in kakavu.
1. 12. 2005
Na MEA gojiš�e smo z agarsko iglico nacepili plesni s suhih banan, sojine omake, pršuta,
suhe ribe, gob v slanici, �ipsa, kokos, slane pal�ke in kakava.
Vse tri vrste gliv zrasle na suhi ribi in glive s pršuta smo nacepili smo nacepili še na slano
gojiš�e. Ugotovili smo, da je na kokosu zrasel Aspergillus, pršutu pa Penicillium.
6. 12. 2005
Pregledali smo nacepljena gojiš�a. Na �ipsu sta zrasla Penicillium in Cladosporium.
7. 12. 2005
Namo�ili smo nekatere filter papirje in nekatere kolonije precepili na gojiš�a MEA.
12. 12. 2005
Izbrali smo 4 vrste penicilijev iz banan, gob v slanici (2x), marmelade in �ipsa. Z iglo
smo jih to�kovno nacepili (na tri to�ke) na gojiš�e MEA in CREA ter inkubirali pri 25°C.
Glive, ki so zrasle na gojiš�ih je bilo potrebno izolirati v �isti kulturi, da so tako na
razpolago za nadaljnje preiskave in za v zbirko.
Glive na sladki in slani hrani
14
REZULTATI
Glive na hrani z nizko vodno aktivnostjo:
• Eurotium chevalieri • Eurotium echinulatum • Eurotium repens • Eurotium rubrum • Eurotium herbariorum • Eurotium amstelodami • Wallemia sebi • Alternaria restrictus • Ermascus albus • Ermascus fertilis • Xeromyces bisporus • Scopulariopsis halophilica • Chrysosporium inopus • Chrysosporium farinicola • Chrysosporium fastidium • Chrysosporium xerophilum • Polypaecilum pisce
Tabela 3: Rodovi, ki smo jih dobili na posamezni vrsti hrane in razli�na gojiš�a HRANA ROD IZGLED GOJIŠ�E RAST Kompot (hruška)
Rhizopus Bele hife, �rne bunkice
MEA
Penicillium Temno zelena, rumen reverz
MEA, MEA + 10%. CREA
++ +
Cladsporium Temno zelena kolonija, šrn reverz.
MEA
Suhe banane
Penicillium Temno zelena kolonija, rumenkast reverz.
MEA, CREA
Sojina omaka Cladosporium Temno zelena kolonija, sivo zelen reverz.
MEA
Pršut Clonostachys Bele kolonije, oranžen
MEA, MEA+10%
++ +
Glive na sladki in slani hrani
15
reverz. Marmelada 2x Penicillium Zelena
kolonija. MEA, CREA
Kokos Aspergillus �rne hife s �rnimi glavicami.
MEA
kvasovka Bela mazava kolonija.
MEA,
MEA + 10%
++ +
Suha riba
Penicillium Temno zelena, siv reverz.
MEA,
MEA +10%,
CREA
++ + Zelo rumeno, dobra rast.
2x Penicillium Svetlo modre, peš�ene in sive kolonije, temen reverz.
MEA, CREA
Cladosporium Olivno zelene barve, žametna struktura, �rn reverz.
MEA
�ips
Trichoderma Bela in rumeno-zelena kultura, ki je prerasla celo gojiš�e
MEA
kvasovka Bele mazave kolonije
MEA
Fusarium Bela kultura, ki je prerasle celo gojiš�e
MEA
Penicillium Temno zelena, bela obroba
MEA, CREA
Gobe v slanici
Basidiomycetae Bela kultura prerasla �ez vse gojiš�e.
MEA
Slane pal�ke Aspergillus �rne hife s �rnimi glavicami.
MEA
Kakav Penicillium Svetlo sivo zeleno, reverz, peš�ene v sredini, svetlo zelena ob robu.
MEA, CREA
Glive na sladki in slani hrani
16
Ugotovili smo, da nam je zraslo precej vrst Penicillium (iz banan,marmelade, suhih rib
�ipsa, gob v slanici ter kakava), poleg tega pa se Rhizopus na kompotu iz hruške,
Cladosporium (Suhe banane, sojina omaka, �ips), Clonostachys na pršutu, Aspergillus na
kokosu in slanih pal�kah, kvasovka na suhih ribah, Trichoderma na �ipsu, Fusarium na
gobah v slanici, in Basidiomycetae, ki so tudi zrasle na gobah v slanici.
Opisi gliv:
Penicillium spp. (pri našem poskusu najve�krat izolirani predstavniki)
Taksonomska razvrstitev:
Kraljestvo : Fungi
Deblo: Ascomycota
Razred: Euascomycetes
Družina: Trichomaceae
Rod: Penicillium
Vrste Penicillium spoznamo po njihovi metlasti strukturi, ki nosi spore. Razen ene izjeme
so vsi predstavniki rodu Penicillium filamentozne glive. Najdemo jih lahko v/na zemlji,
vegetaciji, na živalih, v zraku, celulozi, preprogah in skoraj povsod, kjer se pojavljajo
organske molekule. Vrste Penicillium so kontaminantne vrste, lahko povzro�ajo razne
infekcije pri bolnikih obolelih za AIDS-om in so lahko tudi indikator bolezni AIDS.
Proizvajajo mikotoksine. Nekatere vrste vklju�ujejo telemorfne oblike.
Rod Penicillium vklju�uje kar nekaj vrst, najbolj pogosti so: P. chrysogenum, P.
citrinum, P. janthinellum, P. marneffei, P. purpurogenum. Identifikacija to ravni vrste
temelji na makroskopskem pregledu kulture in mikroskopskih karakteristikah.
Vrste penicilijev dolo�ajo s pomo�jo biokemijskih testov tako, da dolo�ajo vrsto terpena,
ki ga posamezna vrsta sitentizira na kvasnem agarju. Pomagajo si tudi z dolo�evanjem
amilaznih izoencimov, ki so zna�ilni za posamezno vrsto penicilijev. Pri dolo�itvi vrste si
lahko pomagamo tudi s preu�evanjem razvejanosti fialid.
Vrste Penicillium so ob�asni (oportunisti�ni) povzro�itelji infekcij pri �loveku, te bolezni
so znane kot peniciloze. Ve�ina oportunisti�nih bolezni je posledica imunske oslabelosti.
Vrsta Penicillium verrucosum, na primer izlo�a mikotoksin, okratoksin A, ki je
Glive na sladki in slani hrani
17
nevrotoksi�en in kancerogen obenem. Ostale oportunisti�ne vrste lahko povzro�ajo tudi
vro�ino, anemijo, hujšanje, izpuš�aje, bolezni dihal, bolezni ustne votline, itd.
Penicillium marneffei je patogena gliva, ki prizadene bolnike z AIDS-om, ki živijo v SV
Aziji. Okužbo so zaznali tudi pri maligioznih in imunsko oslabljenih bolnikih
(kemoterapija). Bolniki se okužijo aerosolno. Tros zaidejo v plju�a in tako povzro�ijo
fungemijo, od tam pa se lahko razširijo tudi v limfni sistem, jetra, ledvice, in kosti.
Bolezenski znaki se pojavijo z izpuš�aji na koži. Bolezen je pogosto usodna. Vrste iz
rodu lahko povzro�ajo tudi kvarjenje hrane, nekateri sintetizirajo mikotoksine in tako
zastrupijo hrano. Po drugi strani so nekatere vrste zelo koristne. Nekatere vrste
oplemenitijo sire, iz drugih, kot npr. Penicillium chrysogenum pa pomagajo pri
pridobivanju antibiotika penicilina.
Kolonije penicilijev rastejo zelo hitro, so ploš�ate, filamentozne in po teksturi lahko
spominjajo na bombaž, volno ter žamet. Kolonije so na za�etku bele, nato pa postanejo
lahko modro-zelene, sivo-zelene, olivno-sive, rumene ali roza barve. Reverz je ponavadi
rumenkast.
V mikroskopskem preparatu lahko opazimo konidije, fialide, metule, enostavne ali
razvejane konidiofore in septirane hife (1,5 do 5 �m v premeru). Na koncu konidofora
izraš�ajo fialide. Metule so sekundarni izrastki, ki se formirajo na konidoforu in nosijo
fialide. Organizacija fialid je zelo tipi�na, tvorijo grmom podoben skupek. Konidiji se
sproš�ajo iz fialid (2.5- 5 µm) so sferi�ni, unicelularni in vezikularni in se nahajajo na
vrhu fialide. Ponavadi so zelenkaste barve.
Antibakterijske u�inke penicilina je odkril Alexander Fleming leta 1929. opazil je, da so
kolonije Staphilococcus aureus, ki so bile v neposredni bližini glive lizirale. Kmalu je
spoznal, da pomembnost tega glivnega metabolita, ki bi se ga lahko uporabljalo za
kontroliranje rasti bakterij. Snovi je dal ime penicilin. Ugotovil je, da penicilin zelo dobro
u�inkuje na G+ bakterije. Vrednost v svetovnem zdravstvu in aplikativno uporabo je
penicilin doživel med drugo svetovno vojno. Takrat je Flemming skupaj še s dvema
znanstvenikoma dobil Nobelovo nagrado, penicilin pa je dobil ime »�udežno zdravilo«.
Glive na sladki in slani hrani
18
Cladosporium spp.
Kraljestvo: Fungi
Deblo: Ascomycota
Razred: Ascomycetes
Poddeblo: Ascomycotina
Rod: Cladosporium
Pogosto jih najdemo v onesnaženih okoljih. Pojavlja se v sivi do �rni ali v temno zeleni
barvi in ima »pudrasto« teksturo. Ta rod vklju�uje preko 30 vrst. Najbolj pogosti so: C.
elatum, C. herbarum, C. sphaerospermum in C. cladosporoides. Predstavniki rod so
pigmentirane glive, ki se razširjajo preko zraka, pojavljajo pa se predvsem v
(sub)tropskem pasu. Nekateri kladosporiji pa so bili izolirani tudi iz rib, kjer so
parazitirali. So zelo preu�ene glive, saj povzro�ajo alergije, spore se prenašajo po zraku
in so tako pogost vzrok respiratornih bolezni. Lahko so tudi paraziti kože in mehkih tkiv
na nohtih. Je pogost povzro�itelj astme.
So najbolj pogosto identificirane glive v naravi. Njihovo število se pozimi zmanjša.
Najdemo jih na odmrlih rastlinah, (pokvarjeni) hrani, zemlji in tekstilu.
Najbolje raste na krompirjevem dekstroznem agarju pri 25°C. Tekstura je puhasto-
prašnato-pudrasta. Ve�ina jih raste pri T nižji od 35°C.
Pri mikroskopskem pregledu opazimo rjave hife, dvignjene in pigmentirane konidoforje
ter unicelulerne konidije.
Clonostachys spp.
Deblo: Ascomycota
Razred: Hypomycetes
Red: Hypocreales
Družina: Bionectriaceae
Rod: Clonostachys
Nekatere vrste so patogene za žuželke (mikoparaziti). Clonostachys spp. So izolirali iz
zemlje, iz živih ali odmrlih listov razli�nih rastlin. Zna�ilni so cilindri�ni konidiji. Na
Glive na sladki in slani hrani
19
agarju tvorijo bele kolonije. Poznanih je ve� vrst: npr. C. rosea (zna�ilen rožnat reverz)
in C. compactiuscula.
Fusarium spp.
Kraljestvo: Fungi
Deblo: Ascomycota
Red: Hypocreales
Družina: Hypocreaceae
Rod: Fusarium
Spada med filamentozne glive. Živi predvsem na rastlinah in v zemlji. Je del naravne
mikoflore. �eprav je najbolj pogosta v (sub)tropskih krajih, jo najdemo tudi v hladnejših
podro�jih. Nekatere oblike imajo tudi telomorfno obliko. Rod vsebuje ve� kot 20
razli�nih vrst.
Poleg tega, da je pogost patogen rastlin, je povzro�itelj razli�nih obolenj tudi pri ljudeh.
Te bolezni obravnavamo kot fusarioze. Napadejo predvsem imunsko oslabljene ljudi (pri
malignih obolenjih in kemoterapiji). Povzro�ajo lahko keratitis, infekcije dihal,
endokarditis, artritis. Spore te glive se lahko prenašajo z vodo in tako okužijo imunsko
oslabljene bolnike v bolnicah. Nekateri njihovi toksini so tudi alergeni.
Najbolje rastejo na dekstroznem agarju pri 25°C. Njihove kolonije so volnasto-bombažne
ter ploš�ate. Kolonije so lahko bele, kremne, oranžne, rumene, rde�e, vijoli�ne ali
rožnate. Hife lahko opazujemo makroskopsko in jih prepoznamo po temno modri barvi.
V mikroskopskem preparatu opazimo septirane hife, konidofori, fialide, makrokonidiji in
mikrokonidije lahko opazujemo s pomo�jo svetlobnega mikroskopa. Fialide so
cilindri�ne, lahko pa najdemo tudi mikro in makrofialide (v glavicah ali verigah).
Makrokonidiji (3-8*11-70µm) izraš�ajo iz fialid, te pa iz septiranih ali neseptiranih
konidoforov. So 2 ali ve� celi�ni, s tanko steno ter gladke na videz. Mikrokonidiji (2-4*4-
8µm) izraš�ajo iz na dolgih ali kratkih preprostih konidoforjih. Pove�ini so enoceli�ni in
gladki. �e so chlamidospore prisotne so le-te v parih, grozdih ali verižicah, imajo tanke
stene.
Glive na sladki in slani hrani
20
Aspergillus spp.
Kraljestvo: Fungi
Deblo: Ascomycota
Razred: Ascomycetes
Red: Eurotiales
Družina: Trichocomaceae
Rod: Aspergillus
Rod, ki obsega približno 200 vrst. Najdemo jo v zemlji, na propadajo�ih rastlinah,
ruševinah, naplavinah, skladiš�enem žitu. Najpogosteje se širi z suhimi sporami, s
pomo�jo vetra. Raste pri 37°C in je vrsta, ki ni zelo zahtevna glede potrebnega substrata
za rast. Raste lahko na velikem obsegu podlag. Navadno pa je za rast potrebna vodna
aktivnost med 0.71 - 0.94, ki pa variira med vrstami . Za gojenje se navadno uporablja
splošni glivni medij, na katerem dobro raste.
Spore so brezbarvne in ovalne in so zelo podobne sporam rodu Penicillium.
Aspergillus je eden izmed najbolj pogostih glivnih rodov po svetu. Med najbolj pogoste
vrste pa spada A. fumigatus. Poleg njega pa sem sodijo tudi: A. fumigatus, A. flavus, A.
niger, A. ustus, A. versicolor in drugi.
To glivo se lahko uporablja tudi v industrijske namene pri proizvodnji hrane (A. oryzae
fermentira sojo za nastanek sojine omake, A. terreus proizvaja mevinolin, ki se ga
uporablja za znižanje krvnega holesterola, A. niger se uporablja v industriji piva in
kruha.
Kot mnoge druge glive, lahko tudi ta v svojo okolico izlo�a toksi�ne produkte kot so:
aflatoksina B1 in B2, oksali�no kislino, ciklopiazoni�no kislino (cyclopiazonic acid),
koji�no kislino (kojic acid), ergotne alkaloide, fumiglaklavine, gliotoksin, fumigatoksin,
fumigilin in druge spojine.
V medicini je poznan tudi kot alergen, ki povzro�a alergije, za katere so zna�ilne visoke
vro�ine, vlaženje plju� in astma. Kot patogen in oportunisti�en organizem, ga opisujejo v
dihalih, na koži in roženici, kjer navadno povzro�a driske, nosno sinusne rane, itd.
Glive na sladki in slani hrani
21
Rhizopus spp.
Kraljestvo: Fungi
Deblo: Zygomycota
Razred: Zygomycetes
Red: Mucorales
Družina: Mucoraceae
Rod: Rhizopus
Rhizopus je kozmopolitski rod, ki je navzo�a povsod po svetu in vsebuje 12 vrst.
Navadno ga najdemo v gozdu in na obdelani zemlji, gnilem sadju in zelenjavi, živalskem
gnoju in kompostu. Rhizopus lahko raste na razli�nih podlagah. Najpogosteje na
pokvarjeni hrani in manj pogosto na notranjih površinskih podlagah. Vrednost vodne
aktivnosti na kateri se pojavljajo se navadno giblje okoli 0.93. Rhizopus dobro raste na
splošnem glivnem mediju in pogosto zapolni celotno petrijevko. Njegove vrste pa lahko
prerastejo tudi druge vrste in inhibirajo njihovo rast.
Širi se s pomo�jo suhimi sporami in vetra. Spore so pomembna za dolo�anje vrst, prav
tako pa so spore in sporulirajo�e strukture bistvene za razlo�evanje. Nekatere vrste
proizvajajo oglate, pigmentirane spore z brazdami.
To glivo se lahko uporablja tudi v industrijske namene. Lahko jo uporabljamo v
produkciji sirov, fermentaciji sadja, za proizvodnjo alkoholov in organskih kislin ter v
proizvodnji papirja.
Pri tem rodu do sedaj še niso odkrili morebitnih toksi�nih produktov. Odkrili pa so
alergene u�inke. Alergije navadno povzro�ajo visoko vro�ino, astmo, poškodbe plju� in
plju�nico. Lahko je tudi parazitski rastlinski patogen na krompirju, bombažu in razli�nem
sadju. Predstavniki rodu Rhizopus so tudi povzro�itelji zigomikoz (zygomycosis) pri
pacientih, ki trpijo za diabeti�ni ketoacidozami, podhranjenostjo, hudimi opeklinami.
Glive na sladki in slani hrani
22
Trichoderma spp.
Kraljestvo: Fungi
Deblo: Ascomycota
Razred: Euascomycetes
Red: Hypocreales
Družina: Hypocreaceae
Rod: Trichoderma
Trichoderma sp. je razširjen, ubikvitaren in kozmopolitanski rod, ki vsebuje približno 20
vrst. Nahaja se lahko v severnem gorskem in v tropskih podro�jih; v zemlji, trohne�em
lesu, žitih, citrusih, sladkem krompirju, papirju, tekstilu in vlažni volni. Širi se navadno z
vlažnimi sporami, ki jih prenašajo dež, insekti in suh veter. Za njegovo gojenje
uporabljamo splošni glivni mediju na katerem zrasejo bele puhaste kolonije. Konidiji
trichoderme so podobne oblike in velikosti kot Penicillium in Aspergillus, vendar pa tvori
lepljive skupke konidijev z zna�ilnim zelenim pigmentom, ki je zna�ilen le za to vrsto.
To glivo uporabljajo tudi v industriji. T. viride razgrajuje celulozo in izdeluje
hemicelulaze, ki se uporabljajo v proizvodnji piva, vina in prehrambnega procesiranja.
Lahko tudi pove�a aromo �aja in glivnih produktov.
Nekatere vrste rodu Trichoderma izdelujejo tudi toksi�ne produkte kot trihotecene,
(trichothecene) in cikli�ne peptide; gliotoksin, izocianide, T-2 toksin, trihodermin
(trichodermin).
Znana je tudi njihova alergena vloga, saj povzro�ajo vro�ino, seneni nahod, astmo,
plju�nico. �e okuži �loveka lahko povzro�i infekcijo plju�, vnetje potrebušnice in
nevarne infekcije pri pacientih s presaditvijo ledvic in tistih, ki potrebujejo dializo.
Glive na sladki in slani hrani
23
Komentar rezultatov
Iz tabele 1 je razvidno, kakšne vrednosti vodne aktivnosti imajo posamezna živila. Spodaj
so navedena, živila iz katerih smo izolirali glive z odgovarjajo�imi vodne aktivnosti.
Marmelada – aw med 0,90 in 0,80 in tudi med (bolj sladka) 0,70 in 0,60
Slana riba – aw med 0,80 in 0,70
Suho sadje (papaje, jagode, ananas, rozini, suhe banane, suhe slive, kokos) – aw med 0,70
in 0,60
Kompot (hruške in ribez) – aw med 1,00 in 0,95
Kakav – aw okoli 0,4
�ips – aw okoli 0,30
Pršut – aw med 0,95 in 0,90
Slano pecivo (slane pal�ke) – aw okoli 0,30
Gobe v slanici – aw med 1,00 in 0,95
Na teh živilih v �asu trajanja poskusa nismo zasledili rasti gliv.
�okolada – aw med 0,60 in 0,50
Med - aw med 0,60 in 0,50
Od suhega sadja ni v �asu trajanja poskusa ni zraslo ni� na koš�kih ananasa, suhih slivah,
suhih marelicah.
Kot vidimo, smo uporabili nekaj ve� sladke kot slane hrane.
Opazimo lahko, da so glive zrasle tudi na hrani, kjer je vodna aktivnost, ki je primerna za
rast precej nižja od 0,6 (�ips slane pal�ke kakav – pogojno tudi suho sadje, marmelada in
slana riba). To lahko pojasnimo s tem, da smo vsa živila imeli v vlažnih komorah, kjer je
bila vsebnost vlage ve�ja kot v zraku. �e je vlažnost ve�ja kot vodna aktivnost, bodo
vodne molekule iz zraka prehajale v živilo. Posledi�no zviša vodna aktivnost.
Na �okoladi, medu in nekaj vrstah suhega sadja, ni zraslo ni�. Suho sadje, ki je bilo
kupljeno v trgovini, je bilo tretirano s konzervansi, ki onemogo�ajo oz. zelo uspešno
Glive na sladki in slani hrani
24
prepre�ujejo rast mikroorganizmov in tako tudi gliv. �eprav smo tudi ta živila imeli v
vlažnih komorah, smo suhe marelice in slive imeli v ve�jih petrijevkah in škatlicah, kjer
se je filtrirni papir hitreje sušil in posledi�no vlažnost ni bila zadostna, da bi se živilu
pove�ala vodna aktivnost, kar je poleg konzervansov prepre�ilo rast. Ni� nam ni zraslo
tudi na sladkorju, medu, �okoladi. To je verjetno zaradi neugodne vodne aktivnosti.
Nekatera živila bi morali inkubirati dalj �asa (npr, koš�ke �okolade). Sladkor in med pa
imata precej nižjo vodno aktivnost oz. tudi ob vlagi v okolici, ne prevzameta toliko vode,
da bi se vodna aktivnost tako povišala, da bi bila ugodna za rast gliv. Med vsebuje tudi
H2O2, ki pa inhibitorno deluje predvsem na bakterije.
MIKOTOKSINI
Iz opisov gliv lahko vidimo, da so v ve�ini rodov (Penicillium spp., Trichoderma spp.,
Rhizopus spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Cladosporium spp.) prisotni tudi
patogeni predstavniki. Ti povzro�ajo bolezni, alergije ali pa izlo�ajo mikotoksine, ki se
akumulirajo v živilih.
Mikotoksini so sekundarni, toksi�ni produkti plesni, ki so škodljivi za živali in ljudi.
Obolenja, povzro�ena z mikotoksini imenujemo mikotoksikoze, za razliko od mikoz, ki
nastanejo zaradi infekcije živali s plesnimi. Mikotoksini dospejo v organizem
prvenstveno z zauživanjem hrane, poznana pa je tudi inhalacija in dermalna pot
njihovega vnosa. Ve�je koli�ine mikotoksinov lahko povzro�ijo akutne zastrupitve, ki
utegnejo biti letalne, dolgotrajnejše zauživanje manjših koli�in mikotoksinov pa je
povezano s kroni�nimi boleznimi, vklju�no z nastankom tumorjev. Bolezenski znaki so
odvisni od koli�ine in vrste mikotoksina, dejavnikov okolja ter zdravstvenega stanja
bolnikov. Razmnoževanje plesni pospeši višja vodna aktivnost in višja relativna vlaga
zraka kot 70%, temperature nad 130C in aerobni pogoji skladiš�enja hrane.
Mikotoksini kažejo razmeroma veliko stopnjo v specifi�nosti delovanja na posamezna
tkiva in organe. Najpogosteje so prizadeta prebavila, jetra in ledvica. Poleg tega pa
delujejo škodljivo še na krvotvorne organe, krvožilni in živ�ni sistem ter spolovila.
Glive na sladki in slani hrani
25
V žitih in drugih koncentratih so za zdravje ljudi najpomembnejši aflatoksini, fumonizini,
zearalenon (F-2), deoksinivalenol (DON) in ergotalkaloidi, nekoliko manj problemati�ni
pa so T-2 toksin in drugi trihoteceni, ohratoksini in citrinin. Živila predstavljajo medij za
organizme in indukcirajo sintezo toksinov. Zato je pomembno, da rast gliv na hrani
kontroliramo. Hrano moramo ustrezno shranjevati, da ne pride do razrasti gliv, ki lahko
poslabšajo zdravstveno stanje predvsem imunsko oslabljenih ljudi in tistih, ki so nagnjeni
k alergijam.
Mikotoksine v vzorcu lahko ugotavljamo na razli�ne na�ine:
1. kemijske metode:
- tankoslojna kromatografija (TLC)
- plinska kromatografija
- visokotla�na teko�inska kromatografija (HPLC)
- masna spektroskopija
- nuklearna magnetna resonanca
2. mikološka preiskava (determinacija izoliranih plesni, preiskus na toksigenost)
3. mikrobiološka preiskava (inhibicija rasti bakterij na trdnem gojiš�u)
4. biološki poskusi (npr. estrogeni u�inek F-2 na juvenilne podgane)
5. imunoencimske metode (ELISA, RIA)
Glive na sladki in slani hrani
26
ZAKLJU�EK Hipresladka in hiprerslana okolja so neprimerna za rast ve�ine mikroorganizmov.
Mikroorganizmi ne uspevajo zaradi prenizke koncentracije dostopne vode, ki tako ni na
voljo za metabolne procese. Problem hipreslanih okolij je v tem, da ioni, ki so v visokih
koncentracijah v raztopini, vdirajo v celice zaradi težnje po izena�itvi koncentracij na
obeh straneh membrane (v in izven celice). Primarni kolonizatorji teh okolij so nekatere
vrste gliv. V svoji citoplazmi akumulirajo višje koncentracije kompatibilnih topljencev.
To so predvsem sladkorji. Delujejo tako, da zmanjšujejo intracelularno vodno aktivnost
in pomagajo vzpostaviti pozitivni celi�ni tugor. Najbolj razširjena kompatibilna topljenca
sta trehaloza in glicerol.
Na gojiš�ih nam je zraslo precej vrst gliv. Dobili pa nismo nobenega tipi�nega
osmofilnega predstavnika, ki kot pogoj za rast zahteva hiperslano/ sladko okolje.
Življenje vedno najde pot za preživetje. Vedno preživijo najbolj pretkani in prilagodljivi,
kar glive vsekakor so.
Glive na sladki in slani hrani
27
VIRI
• Madigan, M.T., Martinko, J.M. and Parker, J. (2003) Brock – Biology of
Microorganisms, 10th ed. Prentice-Hall, Pearson Education International, London
• W. D. Grant: Life at low water activity, The Royal Society, Published online 12 July 2004, 1249-1267
• Water structure and behavior: Water Activity
http://www.lsbu.ac.uk/water/activity.html
• Doctor Fungus Search http://www.doctorfungus.org/search/query.asp
• Environmental Microbiology Laboratory
http://www.emlab.com/app/fungi/Fungi.po • http://gimvic.org/projekti/timko/2002/2b/alkohol/glicerol.htm • http://www.ars.usda.gov/main/ (agricultural research service)
• http://www.aspergillus.man.ac.uk/indexhome.htm
• http://www.botany.utoronto.ca/ResearchLabs
• Mikotoksini
http://www.virtuni.net/?page_name=vu&article_id=3999