UNIVERZA V LJUBLJANI

Biotehniška fakulteta

Oddelek za živilstvo

VAJE IZ MIKROBIOLOGIJE

(delovna verzija)

Polonca Čadež, Ivan Mahne in David Stopar

Ljubljana, 2005

1

MIKROBIOLOGIJA – LABORATORIJSKE VAJE PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU 1. Pri delu z mikroorganizmi obravnavaj mikroorganizme kot pogojno patogene in zato

ves čas dela z mikroorganizmi uporabljaj aseptično tehniko. 2. Pred in po vsaki vaji si umij roke z razkužilom (detergent z biocidnim delovanjem). 3. Delovni pult razkuži pred in po uporabi mikrobne kulture (alkohol, Incidur). 4. V primeru manjših nezaščitenih ran na koži ne začni dela z mikrobnimi kulturami

brez dodatne zaščite (zaščitne rokavice, respiratorna maska) in predhodnega pogovora z asistentom oziroma predpostavljenim.V primeru večjih odprtih ran na koži je delo z mikrobnimi kulturami prepovedano.

5. Nikoli ne pipetiraj kulture mikroorganizmov z usti. Vedno uporabljaj mehansko napravo.

6. V primeru razlitja mikrobne kulture preliješ razlito kulturo z razkužilom (alkohol, 5% lizol) in nemudoma obvesti asistenta oziroma predpostavljenega. Če je prišlo do razlitja po telesu, inficirano mesto razkužimo in speremo s toplo vodo in milom. Če je prišlo do poškodbe kužnino odstranimo, iztisnemo kri v posodo z razkužilom in mesto poškodbe razkužimo ter rano sterilno obvežemo. V kolikor pridejo mikrobi v usta jih izpljunemo v posodo z razkužilom ter usta izpiramo z 0.2 % solno kislino.

7. Mikrobnih kultur nikoli ne odnašaj iz laboratorija. 8. Ves uporabljen material na vajah mora biti jasno in nedvoumno označen (vrsta

mikroorganizma, ime študenta, datum, vrsta vzorca, razredčitev) in odložen na dogovorjeno mesto.

9. S plinskim gorilnikom delaj zelo previdno. Če imaš dolge lase morajo biti povezani ali zaščiteni z zaščitno kapo. Plinski gorilec ugasni takoj po končanem delu in preveri ali je plinska napeljava zaprta.

10. Optični material (leče, objektivi) očisti pred in po uporabi. Leče čisti izključno s staničevino.

11. Po uporabi vse reagente in opremo (epruvete, petrijevke, pipete, mikroskop) vrni na dogovorjeno mesto. Material, ki je bil v stiku z mikrobno kulturo je potrebno sterilizirati in zato ločiti od ostalega materiala.

12. Nesreče pri delu (opekline, urezi, razlitje mikrobioloških kultur) takoj javi asistentu ali nadrejenemu.

2

MORFOLOGIJA MIKROORGANIZMOV Morfologija mikroorganizmov se ukvarja s proučevanjem celičnih in znotrajceličnih

struktur. Običajno si pri tem pomagamo s svetlobnim mikroskopom. Zaradi slabega kontrasta mikroorganizmov od njihovega okolja pred mikroskopskim pregledom mikroorganizme običajno obarvamo (metilensko modro, kristal vijolično, safranin). V pomoč pri identifikaciji mikroorganizmov so dodatna sestavljena barvanja in biokemijski testi (barvanje po Gramu, barvanje bičkov, endospor, kapsul in citoplazemskih vključkov, substratna specifičnost, encimski testi).

Sodobna morfologija mikroorganizmov zajema poleg klasičnega opisa mikrobne celice tudi proučevanje znotrajceličnih struktur. V ta namen celice razbijemo in celični material razstavljamo. Izolirane celične strukture uporabimo za proučevanje morfoloških lastnosti, poleg tega pa še za proučevanje biokemijskih, biofizikalnih in genetskih lastnosti. Pomembno je, da je celična frakcija homogena. Za preverjanje čistosti in homogenosti celične frakcije se največ uporablja elektronski mikroskop. Identifikacijo znotrajceličnih struktur olajša uporaba protiteles narejenih proti antigenom posameznih celičnih struktur. Protitelesa lahko fluorescenčno označimo zaradi lažje vidnosti, ali pa na protitelo konjugiramo encim in preverimo prisotnost encimske reakcije. V primeru uporabe elektronskega mikroskopa protitelesa označimo s koloidnim zlatom.

Morfološke lastnosti mikroorganizma (npr. oblika, površina, barva) so pomembne pri njegovi identifikaciji in klasifikaciji. Novejše klasifikacije mikroorganizmov poleg morfoloških in fizioloških znakov upoštevajo tudi molekularne karakteristike mikroorganizmov. Molekularno identifikacijo mikroorganizma omogoča antigenska sestava površine mikroorganizma (serološki testi, fagotipizacija). Zaradi vrstno specifične zastopanosti proteinov in lipidov v mikrobni celici lahko mikroorganizme identificiramo tudi s pomočjo proteinskega ali lipidnega profila mikrobne celice. Filogenetsko sorodnost med mikroorganizmi v novejšem času določamo z analizo DNA in RNA proučevanih mikroorganizmov (DNA hibridizacija, analiza 16S rRNA).

Pri preiskovanem mikroorganizmu proučimo fenotipske in genotipske lastnosti ter ga na podlagi ujemanja teh lastnosti z lastnostmi poznanih mikroorganizmov uvrstimo v sistematsko (taksonomsko) skupino. Glavna vodila pri sistematiki mikroorganizmov so fenotipska in genotipska podobnost pa tudi namembnost sistema. Pri tradicionalni taksonomiji mikroorganizme uvrščamo v skupine predvsem na osnovi podobnosti njihovih fenotipskih lastnosti. Poznavanje genotipskih lastnosti, posebej gradnje 16S RNA, pa omogočajo uvrščanje mikroorganizmov v skupine na osnovi njihove filogenetske (sorodstvene) povezanosti. Zaradi rutinske uporabe molekularnih tehnik v mikrobioloških laboratorijih temelji moderna klasifikacija vse bolj na molekularnih identifikacijskih znakih, ki pokažejo evolucijsko sorodnost mikroorganizmov in manj na klasičnih morfoloških znakih.

!!! Obnovi znanje o delovanju svetlobnega mikroskopa ter o osnovnih tehnikah optične mikroskopije (svetlo polje, temno polje, fazni kontrast in fluorescenca)

Skupna značilnost mikroorganizmov je njihova fizična majhnost. Morfološke značilnosti mikroorganizmov opisujemo na dveh nivojih: makromorfološki nivo (strukture, ki jih običajno vidimo s prostim očesom; npr. morfologija mikrobnih

3

kolonij) in mikromorfološki nivo (strukture, ki jih običajno ne moremo videti s prostim očesom; npr. morfologija posameznih celic in znotrajceličnih struktur).

Oblika mikroorganizmov je zelo različna in lahko ostane v času podvojevanja mikroorganizma nespremenjena ali pa se zaradi genetskega potenciala in vplivov okolja spreminja (npr. sporulacija).

Mikroorganizmi nimajo enotne velikosti. Okvirna velikost najpomembnejših skupin mikroorganizmov je:

virusi 30 - 300 nm mikoplazme 100 - 300 nm bakterije 0.1 - 5 µm kvasovke 1 - 5 µm alge 2 - 200 µm glive mm do nekaj metrov

Način rasti organizma je odvisen od agregatnega stanja substrata, na katerem rastejo mikroorganizmi. V tekočem gojišču opazimo rast mikroorganizma kot pojav motnosti, usedline, mrenice. Na trdnem substratu je najpogostejša oblika rasti kolonija. Kolonija je morfološka struktura, ki nastane z delitvijo ene ali več celic. Vse celice v koloniji, ki je zrasla iz ene celice, so v genetskem sorodstvu. V naravi najdemo makromorfološke tvorbe, v katerih rastejo fizično povezane celice sorodstveno zelo oddaljenih organizmov (npr. lišaj je tvorba, v kateri povezano rasteta alga ali cianobakterija in gliva).

Makromorfološke lastnosti kolonije opredeljuje oblika, površina, prerez, čvrstost. Glede na obliko ločimo točkaste, pravilne okrogle, rizoidne, nepravilne in nitaste kolonije. Glede na rob kolonije ločimo kolonije z gladkim ali nakodranim robom. Površina kolonij je lahko gladka (označimo jo z S “smooth”) ali hrapava (označimo jo z R “rough”). Prerez kolonije je lahko ploščat, dvignjen, izbokel, ali pa popkasto dvignjen. Glede na čvrstost pa ločimo: krhke, trde, mazave, sluzaste kolonije. Makromorfološke lastnosti (velikost, barva) lahko uporabimo pri identifikaciji mikroorganizmov. Makromorfološke strukture in lastnosti kolonij večinoma vidimo s prostim očesom.

Mikromorfoloških lastnosti mikroorganizmov (posameznih celic) s prostim očesom ne moremo videti. Oblika posamezne mikrobne celice je lahko različna: kok, palčka, vibrio, spiril, spiroheta. V tekočem substratu lahko mikrobne celice po celični delitvi ostanejo povezane v obliki verižic ali poliedrov (monokoki, diplokoki, tetrakoki, sarcine, streptokoki, stafilokoki, streptobacili, slika 1).

Ena izmed glavnih težav v mikrobiologiji je ta, da mikroorganizma, ki je aktiven in opravlja določen proces, običajno ne vidimo. Ko postane prisotnost mikroorganizma vidna (npr. pojavljanje kolonij, pigmenta, sporulacija, pojav simptomov bolezni), je mikroorganizem običajno že opravil večino metabolnih transformacij. Z antropocentričnega stališča to pomeni, da je mikrob, ko ga opazimo s prostim očesom, glavni del koristi ali škode za človeka že opravil.

4

diplokoki:

streptokoki

stafilokoki

tetrade

sarcine

Slika 1: Celična ureditev mikroorganizmov po končani celični delitvi. Celice pri diplokokih se delijo v eni ravnini, celice pri streptokokih se delijo v eni ravnini in ostanejo povezane v obliki verižic, celice pri stafilokokih se delijo v treh ravninah, celice pri tetradah se delijo v dveh ravninah, celice pri sarcinah se delijo v treh ravninah in tvorijo kocke. Vaja 1: Enostavno barvanje mikroskopskega preparata

Večina neobarvanih preparatov je nekontrastnih ali pa slabo kontrastnih, zato so

celice težko opazne. Z obarvanjem preparata povečamo kontrast med celicami in ozadjem ter tako celice lažje vidimo. Opazujemo njihovo obliko, velikost, zunanjo in notranjo strukturo. S posebnim barvanjem lahko tudi ločujemo žive celice od mrtvih. Pred barvanjem preparata običajno pripravimo razmaz in ga fiksiramo.

Za opazovanje bakterijskih celic je potrebna uporaba imerzijskega olja pri mikroskopiranju. Ker ima to približno tak lomni količnik kot steklo, povečamo

5

numerično aperturo. S tem izboljšamo tudi ločljivost mikroskopa. Čim večja je NA, tem manjša je razdalja dveh točk, ki ju še vidimo ločeno. Ločljivost izboljša tudi uporaba krajše valovne dolžine pri mikroskopu (modra svetloba pri fluorescenčnem mikroskopu).

Pravila za mikroskopiranje z imerzijskim objektivom: 1. Na predmetno stekelce nanesemo kapljico imerzijskega olja. 2. V os mikroskopa postavimo imerzijski objektiv, ki ima vgraviran črn prstan. 3. Z makrometrskim vijakom spuščamo objektiv do predmetnice (pogled od strani

ne skozi okular!). 4. Gledamo skozi okular in z makrometrskim vijakom dvigamo objektiv, dokler se

ne pojavi slika. 5. Z mikrometrskim vijakom izostrimo sliko. 6. Po uporabi obrišemo objektiv.

Priprava razmaza:

Suspenzijo jogurta razmaži v tanki plasti na objektno stekelce. Razmaz posuši na zraku ob gorilniku (do 40 °C). Posušeni razmaz fiksiraj tako, da objektno stekelce z razmazom obrnjenim navzgor trikrat povlečeš skozi plamen gorilnika.

Enastavno barvanje (kontrastiranje): Fiksirani razmaz prelij z raztopino metilensko modrega barvila (5 minut). Višek barvila na preparatu speri pod tekočo vodo. Posuši (popivnaj s staničevino). Preparat opazuj pod mikroskopom z uporabo visoko zmogljivega objektiva in imerzijskega olja in si skiciraj kulturo.

metilensko modro povečava: oblika celic: barva celic:

6

Vaja 2: Sestavljena barvanja (diferencialna); barvanje bakterijske kulture po Gramu

Barvanje po Gramu je najpomembnejša tehnika diferencialnega barvanja za

bakterije. Z barvanjem po Gramu lahko vse bakterije razdelimo v dve skupini: po Gramu + in po Gramu. Tehniko je prvič publiciral Christian Gram leta 1884. Celice najprej obarvamo s kristalvijoličnim barvilom in jih nato obdelamo z raztopino joda. Preparat razbarvamo z etanolom. Po Gramu pozitivne celice ohranijo barvo, medtem ko se po Gramu negativne celice razbarvajo in jih moramo zato dodatno (diferencialno) obarvati s safraninom. Test je zasnovan na spoznanju, da majhna molekula kristalvijoličnega barvila prodre v celično steno bakterije. Po dodajanju joda postane kompleks barvilo-jod preveliko in težje zapušča celično steno. Pri Gram negativnih bakterijah, kjer je celična stena tanka, etanol deloma izpere kompleks barvilo-jod iz celične stene (razbarvanje). V primeru Gram pozitivnih bakterij, kjer je celična stena debelejša, pa etanol ne more izprati kompleksa barvilo-jod in celice ostanejo obarvane. Poznanih je več modifikacij osnovne procedure. Pomembno je, da je test standardiziran in da rezultate primerjamo z referenčno Gram + in pa Gram - kulturo. Izvedba: Postopek za barvanje po Gramu:

Dve referenčni bakterijski kulturi razmaži po objektnem stekelcu in ju fiksiraj. Preparat na objektnem stekelcu prelij s kristalvijoličnim barvilom - učinkuje naj 1

min. Odvečno barvilo speri z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). Dodaj lugol, ga odstrani in ponovno dodaj za 1 min. Speri lugol z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). Dodaj 95 % etanol za 5-15 sek, če je plast nanesene kulture tanka, oziroma za 15-60 sek, če je plast nanesene kulture debelejša. Speri etanol z vodo - 5 sek (ne direktno pod curkom vode). (Kritični korak v postopku!) Dodaj safranin - učinkuje naj 1 min. Zelo pazljivo speri safranin z vodo. Preparat osuši na zraku ali pazljivo popivnaj s papirjem. Zabeleži obarvanost celic bakterijskih referenčnih kultur.

7

referenčna kultura 1 referenčna kultura 2

reakcija po Gramu: barva celic:

8

RAST MIKROORGANIZMOV Rast mikroorganizmov na nivoju celice je večanje volumna in mase posamezne

celice ter podvojitev. Pogosteje pa rast mikroorganizmov obravnavamo na nivoju populacije ali združbe. Na tem nivoju je rast mikroorganizmov večanje števila celic oziroma mase vseh celic. Za rast je potrebna energija.

Različne vrste mikroorganizmov lahko izkoriščajo različne vrste energije: sončno energijo ali pa energijo vezano v različnih organskih spojinah. Posebnost metabolizma mikroorganizmov je njihova sposobnost izkoriščanja energije vezane v anorganskih spojinah ter elementih npr. H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-. Vsem navedenim

anorganskim skupinam in elementom je skupno, da so v relativno reduciranem stanju. Izkoriščanje energije v mikrobnih celicah je vezano na encimske oksidacijsko-redukcijske reakcije, kjer se sproščena energija porabi za produkcijo ATP-ja. Kemijsko vezana energija v obliki ATP je najbolj pogosta oblika energije, ki jo celica neposredno izkorišča pri energetsko zahtevnih biosintetskih reakcijah. Za kemijske reakcije, kjer je potrebno manj energije se lahko uporabljajo tudi drugi viri energije. Izkoriščanje energije je termodinamski proces in zato so pomembni dejavniki okolja, kjer se reakcija odvija (temperatura, pH, pritisk, prosta Gibsova energija, koncentracija reaktantov in produktov).

Poleg energije potrebuje mikroorganizem za rast ogljik in druge elemente, ki so sestavine novo sintetizirane biološke snovi. Te elemente opredeljujemo kot hranila in mikroorganizmi jih sprejemajo iz okolja v različnih oblikah. Ločimo makro-hranila (C, O, H, N, P, S, K, Mg, Na, Ca), ki jih organizem potrebuje v večjih količinah in mikro-hranila (npr. Fe, Co, Cr, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn), ki so za rast potrebna v manjših količinah. Posebnost nekaterih mikroorganizmov je zmožnost, da določeno hranilo v različnih redukcijskih stanjih, lahko uporabljajo za več namenov: za asimilativni metabolizem, to je za sintezo nove biološke snovi, kot donor elektronov oziroma vir energije (H2, H2S, NH4

+, Fe2+, So, S2O3, NO2-) ali pa kot sprejemnik elektronov pri

dihanju - disimilativni metabolizem (npr. NO3-, SO4

2-, Fe3+, So). Mikroorganizme najdemo v vseh okoljih, kjer jim je na voljo dostopen vir energije in

hranil. Okolje s svojimi biotičnimi in abiotičnimi dejavniki daje prednost mikroorganizmu, ki je okolju najbolje prilagojen. V svojem naravnem okolju mikroorganizem po pravilu ne izkoristi v celoti svojega rastnega potenciala, ker običajno vsi dejavniki okolja niso v optimalnih območjih in hranila niso prisotna v optimalnih koncentracijah in ustreznih fizikalno-kemijskih stanjih.

Naravna okolja so običajno poseljena z večjim številom različnih mikroorganizmov in tudi drugih živih entitet (združbe sestavljene iz populacij različnih organizmov). Številne biotske in abiotske interakcije še povečujejo kompleksnost in zato opazovanja pojavov neposredno v takih okoljih ne nudijo veliko možnosti za opisovanje in vrednotenje posameznega mikroorganizma in še manj za vrednotenje vzročnih povezav med vlogo posameznega organizma in spremembami v okolju.

Lastnosti posameznega mikroorganizma in tudi njegove vloge v okolju tradicionalno proučujemo v poenostavljenih laboratorijskih modelih s čistimi kulturami. Čista kultura mikroorganizma je najbolj splošno opredeljena kot rast nekega mikroorganizma v odsotnosti vseh ostalih mikroorganizmov. Čista kultura je fenotipsko in genotipsko

9

homogena. Ko so celice v čisti kulturi dokazljivo potomstvo ene same celice jo imenujemo klon. Potomstvo ene ali več enakih celic pa imenujemo sev. Seve, ki so opredeljeni po antigenskih značilnostih, imenujemo serotipe.

Substrate, ki omogočajo rast mikroorganizmov imenujemo gojišča. Za uspešno

gojitev mikroorganizmov, moramo poznati prehranske zahteve in dejavnike okolja, ki vplivajo na rast izbranega mikroorganizma. Pri dejavnikih okolja je pomembno poznavanje zahtev mikroorganizma glede temperature, prisotnosti ali odsotnosti kisika, dostopnost vode in pH. Glede na sestavo gojišča poznamo naravna gojišča (npr. mleko, sadni sok), sestavljena (pepton, mesni ekstrakt, kvasni ekstrakt), in sintetična gojišča, ki so sestavljena izključno iz kemijsko definiranih snovi, ki jih dodamo v znanih koncentracijah. Glede namembnosti ločimo hranljiva (hranljivi agar, hranljivi bujon), obogatena (dodatek krvi, rastlinskega soka), selektivna (NH4

+ kot edini vir energije) in

diferencialna gojišča (EMB, krvni agar). Glede na agregatno stanje uporabljamo tekoča gojišča, poltrdna gojišča (0.5 % agarja) in trdna gojišča (1.5 - 2 % agarja).

Rast mikroorganizmov lahko spremljamo na več načinov: s štetjem celic pod mikroskopom, z gojitvenimi števnimi metodami, s spektrofotometričnim določanjem optične gostote tekoče kulture (absorbcija pri valovni dolžini 660 nm), z merjenjem količine suhe snovi mikrobnih celic, s spremljanjem porabe substrata ali povečanja mikrobnega produkta, z merjenjem količine vgrajenega radioaktivnega substrata v mikrobno celico (npr. 3H, izotopno označen levcin), z merjenjem celičnih sestavin (DNA, proteini, biomasni ogljik in dušik, ATP). Števne metode so najbolj pogosto uporabljeni pristop za določanje velikosti mikrobne populacije. Uporabne so tako pri delu s čistimi kulturami, kot tudi za določanje velikosti mikrobnih populacij ali združb v heterogenih naravnih vzorcih (tekočih, trdnih ali plinastih). Ločimo direktne in indirektne oziroma gojitvene števne metode. Pri direktnih metodah preštejemo celice s pomočjo mikroskopa neposredno v vzorcu. Z indirektnimi - gojitvenimi prijemi pa določamo število živih celic oz. enot, ki so sposobne rasti na uporabljenih gojiščih in v razmerah inkubacije.

Za namene proučevanja lastnosti odbranega mikroorganizma je nujna njegova izolacija iz naravnega okolja. Pogosto je v postopek izolacije vključena stopnja obogatitve vzorca z odbranim mikroorganizmom. Na osnovi različnih prehranskih in okoljskih zahtev mikroorganizmov lahko z izbiro pogojev, ki pospešujejo rast odbranega mikroorganizma, le-tega številčno obogatimo glede na ostale mikroorganizme prisotne v vzorcu. Npr. fotoavtotrofni mikroorganizem lahko selektivno namnožimo v gojišču, ki ima potrebne makro in mikroelemente, vitamine, kofaktorje, nima pa vira organske ali anorganske energije. Z inkubacijo na svetlobi in ob prisotnosti CO2 kot edinega vira ogljika favoriziramo rast tistih mikroorganizmov, ki lahko izkoriščajo svetlobo kot vir energije. Selektivno obogatena kultura običajno še ni čista kultura.

Čisto kulturo lahko iz obogatene kulture izoliramo s pomočjo mikroskopa (direktna metoda). V tem primeru izberemo posamezno mikrobno celico in jo s primerno majhno kapilaro prenesemo na sterilno gojišče. Pri indirektnih metodah izoliramo celice iz posamezne kolonije (predpostavimo, da je kolonija nastala iz ene same ali maloštevilnih enakih celic) in jo aseptično prenesemo na novo gojišče. Pri izolaciji v tekočih kulturah predpostavimo, da je pri višjih razredčitvah v gojišču omejeno število mikrobnih celic

10

željenega organizma (v posebnem primeru je lahko prisotna samo ena celica). Kulturo iz teh razredčitev precepimo v sveže gojišče.

Izolirano čisto kulturo moramo obdržati nespremenjeno in čisto. Pogosti vzrok napačnih zaključkov v mikrobiologiji je prav delo s kontaminiranimi kulturami. Vzdrževanje čiste kulture zajema ohranjanje živosti, preprečevanje kontaminacije in občasno preverjanje nespremenjenosti fenotipskih in genotipskih lastnosti mikroorganizma. Za krajšo dobo kulturo lahko ohranimo živo z občasnim precepljanjem na sveže gojišče in hranjenjem pri nizkih temperaturah (+4oC). Paziti moramo, da se nam kultura ne izsuši. Nekatere kulture lahko tudi zamrznemo do -20oC in jih tako ohranimo od dveh mesecev do dveh let, odvisno od mikroorganizma. Kulture mikroorganizmov, ki sporulirajo lahko hranimo v obliki spor v suhem stanju v želatini ali na papirju. Za daljše obdobje je primerno zmrzovanje kulture pri -70oC, ali v tekočem dušiku (-196oC) oziroma v dušikovih parah (-140oC). Mikrobno kulturo lahko ohranimo tudi v liofiliziranem stanju. Liofiliziranje je postopek sušenja v zmrznjenem stanju in pri močno znižanem tlaku. V takih razmerah voda iz vzorca sublimira v ohlajeno past. Liofilizirano kulturo shranimo v vakuumiranih ampulah.

Čiste kulture mikroorganizmov hranijo v različnih splošnih in specializiranih zbirkah: ATCC (American Type Culture Collection), DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), NCTC (National Collection of Type Cultures). Obstajajo specializirane zbirke za industrijske mikroorganizme, kmetijske mikroorganizme, rastlinske patogene organizme. V Sloveniji imamo MZKI (Mikrobiološko zbirko Kemijskga inštituta). Vaja 3: Sterilizacija, aseptična tehnika

Mikroorganizmi so v naravnih okoljih splošno razširjeni. Iz tega sledi, da je potrebno za namnoževanje in proučevanje odbranega organizma v čisti kulturi, iz uporabljenih substratov predhodno odstraniti avtohtone mikroorganizme oziroma odstraniti njihovo živost. Postopkom uničenja živosti mikroorganizmov ali njihove odstranitve iz substratov pravimo sterilizacija. Zaradi svoje majhnosti in enostavnega prenosa po zraku, vodi, s prahom, s kožo ali z laboratorijsko opremo, je potrebno ves čas dela z odbranim mikroorganizmom preprečevati vnos drugih mikroorganizmov iz okolja (preprečevanje kontaminacije). Postopkom, ki preprečujejo kontaminacijo sterilnega rastnega medija z mikroorganizmi, pravimo aseptična tehnika. Aseptična tehnika zajema delo v sterilnem okolju: v aseptičnih komorah, delo ob plinskem gorilniku in uporabo sterilnega materiala.

Sterilizacija je proces, s katerim uničimo živost celic ali odstranimo vse žive celice.

Sterilnost je statistična funkcija, ki izraža verjetnost, da je populacija mikroorganizmov pri procesu sterilizacije odmrla. Načinov sterilizacije je več: suha sterilizacija (ožiganje s plamenom, vroč zrak 140-180°C za 2-3 ure); vlažna sterilizacija (standardno avtoklaviranje 1.3 bar, 121.1°C, 15 min, ali pa 110°C, 30 min), tindalizacija (100°C, 30 min, 3x v presledku 24 ur) filtracija (velikost por < 0.2 µm), zaplinjanje (formaldehid,

11

etilen oksid); radiacija (UV sevanje, γ žarki). Razen filtracije se vse ostale sterilizacijske metode dajo matematično opisati s hitrostjo odmiranja mikrobne populacije. Število mikroorganizmov se zmanjšuje eksponencialno s kinetiko reakcije prvega reda (podobno kot kemijske reakcije prvega reda, N = No . e-kt). Običajno se za matematičen opis procesa uporablja parameter D (decimalni redukcijski čas), ki pomeni čas potreben za zmanjšanje mikrobne populacije pri izbrani temperaturi za 10 krat. Vrednost D dobimo grafično, če nanesemo logaritem preživelih mikroorganizmov v odvisnosti od časa sterilizacije. O uspešni sterilizaciji govorimo tedaj, ko je verjetnost, da bomo našli preživeli organizem manjša od 10-6. Preživelost organizma določamo z gojitvenimi metodami. Včasih lahko pride do odstopanja od logaritemskega zmanjšanja mikrobne populacije (različna odpornost, agregiranost celic, sestava gojišča). V takih primerih standardizirani postopki ne bodo zagotovili sterilnega materiala in je potrebno uspešnost sterilizacije preveriti z odsotnostjo rasti mikroorganizmov. Zaradi dolgotrajnega postopka ugotavljanja preživelosti mikroorganizmov (nekaj ur do nekaj tednov) si pomagamo z indikatorji sterilnosti (negativen test z indikatorjem ni zagotovilo da je material sterilen!). Kot biološki indikator uporabimo spore mikroorganizmov, ki so toplotno zelo odporne (npr. Bacillus stearotermophilus, Bacillus subtilis). Sterilizacijo smatramo za uspešno, če spore po prenosu na izbrano gojišče ne vzkalijo in mikroorganizem ne začne rasti. Pri postopku sterilizacije z avtoklaviranjem pa lahko uporabimo kemične indikatorje, ki se talijo pri določeni temperaturi (jantarjeva kislina) ali pa spremenijo barvo pri določeni temperaturi (avtoklavirnimi trakovi).

-7-6-5-4-3-2-1012345

0 1 2 3 4 5 6

čas (min)

Log

štev

ila p

reži

velih

cel

ic

D parameter

Slika 2: Eksperimentalna določitev D parametra in verjetnost preživetja

Število živih mikroorganizmov lahko zmanjšamo tudi s postopkom pasterizacije.

Pasterizacija ni sterilizacija! Uporablja se za mleko, pivo, razne sadne napitke. Pri pasterizaciji segrejemo snov na 60 do 80 oC za nekaj sekund do nekaj minut. Na ta

12

način inaktiviramo encime in uničimo večino mikroorganizmov. Če pasteriziran material hranimo pri nižji temperaturi (4 oC) je zaradi zmanjšanega števila mikroorganizmov aktivnost zmanjšana in lahko pasterizirani substrat ohranimo dlje časa nespremenjen.

Mikrobno rast lahko kontroliramo tudi s kemijskimi sredstvi. Antimikrobna sredstva zaustavijo rast (statična sredstva) ali pa ubijejo mikroorganizme (cidna sredstva). Glede na vrsto mikroorganizma ločimo bakteristatična, fungistatična, algistatična oziroma baktericidna, fungicidna ali algicidna sredstva. Razlika med bakteristatičnim in baktericidnim sredstvom je velikokrat odvisna od koncentracije. Pri majhni koncentraciji je neko sredstvo lahko bakteristatično pri višji koncentraciji pa baktericidno.

Namen vaje je spoznavanje splošne razširjenosti mikroorganizmov v okolju in pridobivanje znanja o pojmu sterilnosti. a) Razširjenost mikroorganizmov v okolju

Z uporabo trdnega gojišča v petrijevkah, ki vsebuje pepton, kvasni ekstrakt in agar (gojišče PKE), bomo poskušali pokazati prisotnost in raznolikost mikroorganizmov v različnih okoljih: zrak, voda, tla, koža in rastline.

Izvedba

Pred začetkom dela si umij roke z detergentom z biocidnim delovanjem in površino na kateri boš delal razkuži z alkoholom. Vse postopke izvajaj z upoštevanjem aseptične tehnike z uporabo plinskega gorilnika. Pri delu s plinskim gorilnikom upoštevaj navodila za varno delo.

Vodno okolje: vzorec nacepi s pomočjo cepilne zanke na ploščo z gojiščem. Preden uporabiš cepilno zanko jo prežari v plamenu gorilnika in jo v bližini gorilnika ohladi (štej do deset). Cepilno zanko omoči v vodi, odpri pokrov petrijeve posodice in nacepi vzorec po površini trdnega PKE gojišča. Pri tem cepilne zanke ne utiraj v gojišče, ampak z njo drsiš po površini. Talno okolje: najprej pripravi talno suspenzijo (10 g tal v 90 ml fiziološke raztopine) in jo stresaj 1 uro na stresalniku (100 nihajev/min). S cepilno zanko nacepi vzorec tekoče faze po površini trdnega gojišča. Zrak: petrijevo posodico odpri in jo 30 minut izpostavi zraku. Koža: odpri petrijevo posodico v bližini plinskega gorilnika in se trdnega gojišča dotakni s prstom. Po dotiku petrijevo posodico takoj zapri. Rastline: uporabi zelene dele rastline (listi, steblo). S testiranim delom rastline se dotakni trdnega gojišča. Delaj v bližini gorilnika. Po končanem nacepljanju petrijevke obrni s pokrovom navzdol in aerobno inkubiraj

1 teden pri 28oC.

13

Po končanem delu si umij roke z detergentom z biocidnim delovanjem in razkuži z etanolom površino mize, na kateri si delal.

Po enotedenski inkubaciji ugotavljaj prisotnost kolonij na ploščah in opiši njihove značilnosti. Vodno okolje Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Talno okolje Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Zrak Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij:

14

Koža Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Rastline Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij: Okolje po izbiri Oblika kolonij: Rob kolonij: Površina kolonij: Profil kolonij: Konzistenca kolonij:

15

b) Sterilizacija vzorcev

Pred nacepljanjem z alkoholom razkuži površino mize, na kateri boš delal. Ves čas delaj blizu plinskega gorilnika.

Uporabi tekoča gojišča PKE in čisto kulturo mikroorganizma. Izvedba:

S pomočjo avtomatskih pipet nacepi epruvete, ki vsebujejo po 5 ml gojišča PKE z 0,1 ml testne čiste kulture

Nacepljena gojišča nadalje obdeluj: a) epruveto z nacepljeno čisto kulturo inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; b) epruveto z nacepljeno čisto kulturo avtoklaviraj v avtoklavu 1.3 bar, 121 oC, 15

min in jo po končanem avtoklaviranju inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 0C; c) epruveto z nacepljeno čisto kulturo pasteriziraj 30 sek v vodni kopeli na 60 oC in

jo po končani pasterizaciji inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; d) epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 60 sek v vodni kopeli ogreti na 100

oC in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC; e) epruveto z nacepljeno čisto kulturo segrevaj 5 min v vodni kopeli ogreti na 100 oC

in jo nato inkubiraj aerobno 7 dni pri 28 oC;

f) vsebino iz epruvete z nacepljeno čisto kulturo filtriraj skozi sterilni 0.2 µm filter v sterilno epruveto. Filtrat aseptično zamaši in inkubiraj aerobno 7 dni na 28 oC.

Po inkubaciji preveri, kje je prišlo do pojava rasti (motnost gojišča). Razloži rezultate.

Tabela 1: Rast mikroorganizmov v gojišču PKE, po predhodni termični ali mehanski obdelavi vzorcev. Obdelava vzorca

avtoklaviranje

filtriranje

pasterizacija 60oC

segrevanje 100oC

kontrola

16

Vaja 4: Minimalna inhibitorna koncentracija protimikrobne snovi

Z minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK) vrednotimo protimikrobno aktivnost kemijskega sredstva. Ugotavljamo najmanjšo količino snovi, ki je potrebna za preprečevanje rasti testnega organizma. MIK ni absolutna vrednost, ampak je odvisna od testnega organizma, sestave gojišča ter dejavnikov okolja kot so temperatura, pH in prezračevanje.

Izvedba:

Uporabi tekoča gojišča PKE (6 epruvet 16 x 160 mm, po 4 ml). V epruvete s tekočim gojiščem aseptično dodaj 1 % raztopino Izosana G

(dezinfekcijsko sredstvo) tako, da je končna koncentracija Izosana G v gojišču 0.2 %, 0.1 %, 0.05 %, 0.025 %, 0.0125 % in 0 %.

Gojišča nacepi z avtomatsko pipeto z 0.1 ml testnega mikroorganizma (S. marcescens).

Nacepljeno in označeno serijo gojišč z različno koncentracijo Izosan G inkubiraj 7 dni pri 28 oC.

Po končani inkubaciji ugotovi, kje je prišlo do rasti mikroorganizmov (motnost) in določi minimalno inhibitorno koncentracijo protimikrobne snovi.

Tabela 2: Rast S. marcescens na gojišču PKE z različnim odstotnim deležem (%)Izosan G. % Izosan G 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125 0.0000

ml 1% Izosana G 1 0,4 0,2 0,1 0,05 0

rast bakterije

Vaja 5: Rast mikroorganizmov na selektivnih trdnih gojiščih.

Na selektivnih gojiščih poskušamo v združbi heterotrofnih mikroorganizmov

preferenčno namnožiti ožjo skupino mikroorganizmov, ki jo opredeljuje skupna fiziološka posebnost. Uporabili bomo naslednja trdna gojišča: PKE (splošno), selektivno gojišče za rast aktinomicet, selektivno gojišče za bakterijo Azotobacter, selektivno gojišče za laktobacile in selektivno gojišče za koliformne bakterije.

17

Izvedba: Pripravi talno suspenzijo (razredčitev 10-1), rečno vodo in suspenzijo rastlinskega

tkiva (razredčitev 10-1). Dno petrijevke razdeli z označevalnim peresom na tretjine. S cepilno zanko aseptično nacepi inokulum na različna gojišča: Prvo tretjino plošče nacepi s talno suspenzijo, drugo tretjino z rečno vodo in tretjo

tretjino s suspenzijo rastlinskega tkiva. Petrijevke obrni s pokrovom navzdol in inkubiraj pri 28oC. Po enem tednu preglej obseg rasti na različnih gojiščih. Ali se isti mikroorganizmi

pojavljajo na vseh ploščah? gojišče PKE

rečna voda

rastlina

tla Obseg rasti tla: rastlina: rečna voda: Barva kolonij: Oblika kolonij: Selektivno gojišče za aktinomicete

rečna voda

rastlina

tla Obseg rasti tla: rastlina : rečna voda: Barva kolonij. Oblika kolonij:

18

Selektivno gojišče za azotobacter

rečna voda

rastlina

tla Obseg rasti tla : rastlina: rečna voda: Barva kolonij: Oblika kolonij: Selektivno gojišče za laktobacile

rečna voda

rastlina

tla Obseg rasti tla: rastlina: rečna voda : Barva kolonij: Oblika kolonij: Selektivno gojišče za koliformne bakterije

rečna voda

rastlina

tla Obseg rasti tla: rastlina: rečna voda: Barva kolonij: Oblika kolonij:

19

Vaja 6: Izolacija amilolitičnega mikroorganizma iz mešane kulture mikroorganizmov

Pri izolaciji čiste kulture na trdnem gojišču je običajno potrebno zmanjšanje

začetnega števila mikroorganizmov. Posamezne celice na trdnem gojišču morajo biti dovolj daleč narazen, da dobimo rast prostorsko ločenih kolonij. Izvedba:

Selektivno trdno gojišče z agarjem in škrobom kot virom energije (1.5 g/l) segrej na 95oC in ga aseptično (ob plinskem gorilniku) nalij v petrijevke (∼15 ml/petrijevko). Počakaj, da se gojišče ohladi in strdi.

Dno petrijevke razdeli z označevalnim peresom na tretjine. Prvo tretjino plošče nacepi s talno suspenzijo s pomočjo cepilne zanke. Cepilno

zanko pred uporabo prežari v plamenu gorilnika in ohladi v bližini plamena (10 sekund). Cepilno zanko omoči v talni suspenziji in v cik-cak gibanju z zanko po površini gojišča nacepi vzorec po prvi tretjini petrijevke.

Cepilno zanko prežari v plamenu gorilnika, ohladi in se dotakni razmazane kulture v prvi tretjini petrijevke. Z zanko nato nacepi kulturo po drugi tretjini petrijevke.

Kulturo prenesi na enak način iz druge tretjine v tretjo tretjino. Nacepljene petrijevke obrni s pokrovom navzdol in jih inkubiraj aerobno 7 dni pri

28oC.

Po končani inkubaciji preglej rast na trdnem gojišču. Dobro ločene kolonije aseptično precepi na sveže trdno gojišče v petrijevko, kjer si

površino razdelil z označevalnim peresom na osem delov. V vsakega nacepi drugo kolonijo tako, da potegneš z zanko krajše ravne črte po sredini izbrane osmine.

Petrijevke obrni s pokrovom navzdol in jih inkubiraj aerobno 7 dni pri 28oC. Rast amilolitičnega mikroorganizma

20

Vaja 7: Potrditev amilolitične aktivnosti izoliranih mikroorganizmov Namen vaje je potrditi ali izolirani mikroorganizem izloča hidrolitični ekstracelularni

encim, ki je sposoben razgraditi škrob.

Izvedba: Na ploščah iz vaje 6 preglej rast izolatov in nato: a) Vseh osem izolatov aseptično precepi na sveže gojišče v petrijevko na kateri si

predhodno označil radialne osmine površine. Pazi, da ne zamešaš oznak. b) Po končanem precepljanju testiraj originalne izolate na hidrolitično aktivnost, tako

da petrijevko preliješ z raztopino lugola. Počakaj 30 sekund in odlij višek lugola. Preglej izolate mikroorganizmov: prisotnost svetlin okrog kolonij dokazuje prisotnost mikroorganizmov, ki hidrolizirajo škrob. Med precepljenimi izolati na novo gojišče v petrijevki (pod a) označi tiste ki imajo sposobnost razgradnje škroba. Izolatu, ki kaže največjo hidrolitično aktivnost z občasnim precepljanjem ohranjamo živost.

Amilolitična aktivnost izolatov

21

Vaja 8: Šteje mikroorganizmov s pomočjo mikroskopa Celice v vzorcu preštejemo s pomočjo mikroskopa v majhnem alikvotu posušenega

ali tekočega vzorca. Pomanjkljivosti direktnih števnih metod so: ne ločimo živih in mrtvih celic, majhna natančnost, primerne so le za vzorce z večjim številom celic > 106/ml, zaradi slabega kontrasta mikrobne celice težje opazimo.

Izvedba: a) štetje mikroorganizmov v posušenem razmazu vzorca

Znani volumen vzorca (0.01 ml jogurta) razmaži po objektnem stekelcu na površino

1cm2. Razmaz posuši na zraku. Preparat fiksiraj s plamenom in obarvaj z metilenskim modrim (barvilo naj učinkuje

5 minut), speri z vodo in osuši. Z mikroskopom preštej mikrobne celice v več naključno izbranih vidnih poljih (5-20,

odvisno od gostote celic). Iz povprečnega števila mikrobnih celic na eno vidno polje izračunaj število celic v 1

ml vzorca:

N = X ⋅FM ⋅100

kjer je N število celic/ml, X je število celic/vidno polje, 100 je faktor alikvotnega dela vzorca in FM je faktor mikroskopa. Faktor mikroskopa je:

FM = P/ πr2

kjer je P površina razmaza (1 cm2) in r polmer vidnega polja. Pri šolskih mikroskopih, razmazu na površini 1 cm2 in uporabi 100X objektiva ter 10X okularja je FM v območju od 2000 do 2500.

Število celic v jogurtu (celic/ml):

b) štetje mikroorganizmov v tekočem vzorcu s števno komoro (Thoma, Neubauer)

22

Števna komora je posebej oblikovano objektno steklo, ki ima na poglobljenem delu

vgravirano mrežo kvadratov. Globina špranje med dnom komore in krovnim stekelcem je 0.1 mm. Mreža števne komore je razdeljena na kvadrate:

- površina večjega kvadrata je 1/25 mm2, - površina manjših kvadratov je 1/400 mm2. Na vgravirano mrežo števne komore nanesi kapljico vzorca (suspenzija kvasovk). Vzorec na mreži prekrij s krovnim stekelcem. Počakaj 5 min, da se celice usedejo. Preštej celice na več (5) kvadratih (1/25 mm2) v diagonali mreže. Izračunaj povprečno število celic na en kvadrat. Izračunaj število celic v mililitru vzorca s pomočjo naslednje zveze

N = X ⋅ 25 ⋅ 104

kjer je X povprečno število celic na en kvadrat, 25 je število kvadratov na mm2, 104 je faktor za preračunavanje na 1 ml vzorca.

Število celic v suspenziji kvasovk (celic/ml):

Slika 3: Mrežica števne komore po Neubauerju s povečanim sredinskim kvadratom (levo)

23

Vaja 9: Določanje števila mikroorganizmov na ploščah agariziranega gojišča (Štetje na ploščah)

Namen vaje je seznanjanje z najpogosteje uporabljeno metodo za ugotavljanje števila

živih celic v vzorcu. Ugotavljamo število enot (CFU- Colony Forming Units), ki na trdnem gojišču tvori kolonije. Kolonijo lahko tvori samo živa celica. Število kolonij je odvisno od velikosti nacepljenega vzorca, sestave gojišča, razmer med inkubacijo (temperatura, kisik, trajanje inkubacije). S to metodo odkrijemo aerobne heterotrofne mikroorganizme, kar predstavlja samo 0.1 - 10 % vseh mikroorganizmov v tleh in 1 - 20 % vseh organizmov v vodnem okolju (v mleku 80%). Ploščo lahko nacepimo z razmazovanjem vzorca (0.1 ml) po površini trdnega gojišča ali pa z vmešavanjem vzorca (0.1 - 1.0 ml) v raztaljeno gojišče (45 °C).

Izvedba: a) Priprava razredčin:

Vzorec tal, potočne vode in vodovodne vode najprej razredči (pripravi zaporedne razredčitve od 10-1 do 10-6 za tla, 10-1 do 10-5 za potočno vodo in 10-1 do 10-2 za vodovodno vodo) v sterilni fiziološki raztopini. Delamo aseptično ob plamenu plinskega gorilniku.

Aseptično odpipetiraj 1 ml vzorca in ga prenesi v 9 ml fiziološke raztopine. Označi razredčitev z 10-1 (desetkratna razredčitev).

Pripravljeno razredčitev dobro premešaj (uporabi mešalec ali pa epruveto vrti med dlanmi).

Naslednjo razredčitev pripravi tako, da 1ml razredčitve 10-1 preneseš v 9 ml fiziološke raztopine s čisto sterilno pipeto. Dobro premešaj in označi razredčitev z 10-2 (stokratna razredčitev).

Na enak način pripravi še ostale razredčitve. Ko si pripravil razredčitve vzorca v fiziološki raztopini pripravi sterilne petrijevke in

jih označi enako kot razredčitve (vzorec, razredčitev, ime, datum).

b) Gojišče Pripravljeno gojišče z agarjem (PKE) v epruvetah najprej segrej na 95 oC in ga nato

v vodni kopeli termostatiraj na 45 oC.

c) Nacepljanje: S pipeto aseptično prenesi 1 ml najvišje razredčitve (10-5) v prazno sterilno

petrijevko z oznako 10-5.Na enak način nacepi še dve manjši razredčitvi. Nacepljaj z isto pipeto. Termostatirano gojišče (45 oC) aseptično nalij v petrijevke s pripravljenimi

razredčitvami vzorca. Gojišče in vzorec v petrijevki dobro premešaj tako, da s

24

petrijevko izmenično krožiš v smeri urinega kazalca in obratno po površini mize. Počakaj, da se gojišče strdi.

Nacepljene plošče inkubiraj s pokrovom navzdol. Inkubacija traja toliko časa, da se število kolonij ne spreminja več (običajno 8-14

dni). Preštej kolonije na števni plošči. Števne so plošče s 30 do 300 kolonij. Rezultat izrazimo v CFU/ml ali CFU/g; CFU je enota, ki zraste v kolonijo in je lahko

ena ali več celic.

Tabela 3: Število mikroorganizmov v vzorcu izraženo v CFU enotah/ml. Vzorec razredčitev: razredčitev: razredčitev:

tla

rečna voda

vodovodna voda

Vaja 10: Ugotavljanje najbolj verjetnega števila mikroorganizmov (MPN)

Namen vaje je seznanjanje z gojitveno metodo za ugotavljanje najbolj verjetnega

števila živih mikroorganizmov v tekočem gojišču. Metodo uporabljamo v tistih primerih, ko mikroorganizmov ni možno gojiti na trdnem gojišču ali, če je kinetika rasti med mikrobnimi vrstami zelo različna in obstoja nevarnost preraščanja kolonij. Zlasti pa jo uporabljamo takrat, ko želimo v kompleksnem sistemu določiti številčno zastopanost izbrane skupine mikroorganizmov. V teh primerih uporabljamo selektivno gojišče, ki omogoča rast samo določeni skupini mikroorganizmov. Lahko uporabimo tudi diferencialna gojišča, v katerih razpoznavamo prisotnost ožje skupine mikroorganizmov preko spremenjene rasti, tvorbe specifičnega produkta ali s preverjanjem porabe substrata. Izvedba:

Vzorec tal, potočne vode in vodovodne vode vode razredči kot je opisano pri vaji 9, le razredčitve pripravi od 10-1 do 10-8 za tla, 10-1 do 10-7 za potočno vodo in 10-1 do 10-4 za vodovodno vodo.

Razredčitve vzorca nacepljamo v epruvete s tekočim gojiščem PKE v treh ponovitvah (dobro označi ponovitve in razredčitve). Nacepljaš tako, da s sterilno pipeto odpipetiraš 1 ml razredčitve 10-7 v gojišče z oznako 10-7. Na enak način narediš vse tri ponovitve.

Ko si trikrat nacepil 10-7 razredčitev z isto pipeto odpipetiraj 1 ml razredčitve 10-6 v gojišče z oznako 10-6 ter to ponovi še dvakrat.

25

Nacepljanje ostalih razredčitev opravi po enakem postopku. Nacepljene vzorce in kontrolno nenacepljeno gojišče inkubiraj 7 dni pri 28°C. Po inkubaciji ugotovi rast mikrobov v posameznih nacepitvah. Znaki rasti v tekočem

gojišču so: motnost, usedlina, mrenica, sprememba barve, sprememba pH vrednosti gojišča (pokaže jo dodani pH indikator). Spremembe v nacepljenih gojiščih ugotavljaj na osnovi primerjave s kontrolnimi nenacepljenimi gojišči. Primere z znaki rasti označimo kot pozitivne (+), tiste, kjer je rast izostala pa negativno (-). Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število, ki je trimestno pri izvedbi s tremi ponovitvami.

Karakteristično število je sestavljeno iz števila pozitivnih primerov v rangu

razredčitev od vseh pozitivnih ponovitev do vseh negativnih ponovitev (glej primer): Primer:

ponovitve razredčitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

a + + + - - - b + + + + + - c + + + + - - 3 2 1 (karakteristično število)

Najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu določimo na osnovi karakterističnega števila in z uporabo primernih statističnih tabel (npr. Mc Crady-jeva tabela).

Vrednost v tabeli nam pove verjetno število mikroorganizmov v razredčitvi, kjer je prva številka trimestnega karakterističnega števila. Z upoštevanjem te razredčitve določimo najbolj verjetno število mikrobov v 1 ml vzorca. Za prikazani primer je tabelarična vrednost 15 za razredčitev 10-3; torej je MPN 15x103/ml = 1,5x104/ml

Rezultat: Število mikroorganizmov v vzorcu tal:

potočne vode: vodovodne vode:

26

Vaja 11: Dejavniki okolja Namen vaje je prikazati vpliv temperature, pH in kisika na rast mikroorganizmov. Za

vsakega od omenjenih dejavnikov ima mikroorganizem svoj minimum, optimum in maksimum. Pod minimalno temperaturo rast mikroorganizma ni možna, ker je transport snovi prepočasen, membrane želirajo, ali pa je kinetika kemijskih reakcij upočasnjena. Nad maksimalno temperaturo rast ni možna, ker pride do denaturacije proteinov in propada plazemske membrane. Glede na temperaturna območja, v katerih so encimske reakcije in rast optimalna, ločimo: obligatne psihrofile, ki najbolje rastejo pri temperaturi 15oC, psihrofile, ki rastejo najbolje pri temperaturah od 20 oC do 30 oC, mezofile, rastejo v območju 20-40oC (rastlinski saprofiti imajo T optimum pri 20-30 oC, toplokrvni gostitelji pa od 35-40 oC) in termofile, ki najbolje rastejo v območju 45-50oC (v naravi so taka okolja tudi zgornja plast tal poleti, kompost in silaža). Extremni termofili imajo temperaturni optimum pri 80oC.

Glede pH območja, v katerem mikroorganizmi optimalno uspevajo, ločimo acidofile (pH 2-5, paradižnik, kislo zelje, kisla tla), pH nevtralne (~ pH 7) in alkalofile (pH 10-11, tla z visoko vsebnostjo karbonatov).

Mikroorganizmi se razlikujejo glede na tolerantnost oz. potrebo po kisiku. Kisik je eden najpomembnejših regulacijskih dejavnikov pri usmerjanju metabolizma celice. Organizmi, ki uporabljajo kisik kot končni sprejemnik elektronov iz dihalne verige, so aerobni mikroorganizmi. Organizmi, ki ne morejo uporabiti kisika kot končnega sprejemnika elektronov iz dihalne verige so anaerobni mikroorganizmi. Če anaerobni mikroorganizmi tolerirajo kisik, jih imenujemo aerotolerantne, če pa je kisik za mikroorganizem toksičen jih imenujemo obligatne ali striktne anaerobe. Če mikroorganizem lahko raste tako ob prisotnosti, kot tudi v odsotnosti kisika ga imenujemo fakultativni aerob ali pa fakultativni anaerob, odvisno od prednostnega načina rasti. Npr. fakultativni anaerob preferenčno raste aerobno. Mikroaerofili rastejo v mikroaerobnem okolju, kjer je kisik prisoten v nižjih koncentracijah kot v atmosferi.

Izvedba: a) Vpliv temperature

Na trdno gojišče PKE z dodatkom škroba (1.5 g/l) nacepi čisto kulturo bakterije

Serratia marcescens, čisto kulturo bakterije Pseudomonas fluorescens in izolat amilolitičnega mikroorganizma, ki si ga izoliral iz talne suspenzije (vaja 7).

Petrijevko razdeli na tretjine in v vsako tretjino nacepi s cepilno zanko po en mikroorganizem. Nacepitve opravi v treh ponovitvah od katerih po eno petrijevko inkubiraj pri 4oC, 20oC in 37oC.

Po končani inkubaciji preveri rast mikroorganizmov.

27

Tabela 4: Vpliv temperature na rast S. marcescens, P. fluorescens in amilolitični izolat Organizem 4oC 20oC 37oC

S. marcescens P. fluorescens

amilolitični izolat

b) Vpliv kisika

V trdno gojišče PKE z dodatkom glukoze (1.5 g/l) nacepi čisto kulturo Clostridium

sporogens, Saccharomyces cerevisiae in Serratia marcescens. Petrijevko razdeli na tretjine in v vsako tretjino nacepi s cepilno zanko po en

mikroorganizem. Nacepljanje opravi v dveh ponovitvah. Eno petrijevko inkubiraj aerobno pri 28 oC. Drugo petrijevko inkubiraj anaerobno pri 28 oC v vakumskem loncu, kjer si

atmosfero zraka zamenjal z dušikom. Po končani inkubaciji preglej, kje je prišlo do rasti mikroorganizmov.

Tabela 5: Vpliv kisika na rast C. sporogens, S. cerevisiae in S. marcescens Organizem aerobno anaerobno C. sporogens

S. cerevisiae S. marcescens

c) Vpliv pH V tekoča gojišča PKE , ki imajo pH 5, pH 7, in pH 9 aseptično s cepilno zanko

nacepi Pseudomonas fluorescens. Kulture inkubiraj aerobno pri 28oC. Po končani inkubaciji opazuj motnost v posameznih gojiščih Tabela 6: Vpliv pH na rast amilolitičnega izolata (A660 nm). Organizem pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 Pseudomonas fluorescens

MIKROB IN NJEGOVO OKOLJE

28

Mikroorganizmi se nahajajo v ekosistemu povsod tam, kjer lahko prihaja do

energetskih transformacij (npr. vodna okolja, tla, globokomorska okolja, hidrotermalni vrelci, arktična območja). V naravnem okolju so mikroorganizmi izmenično v stanju energetskega preobilja ali pa energetske lakote, daljša obdobja eksponencialne rasti so redka. Večina mikroorganizmov poseduje več možnosti za izrabo energije in s tem sposobnost za rast na različnih energetskih virih in v različnih razmerah. Posamični mikroorganizem običajno najdemo v večjem številu v naravnem okolju le na taki lokaciji (ekološki niši), kjer lahko izrablja svojo prednost pred ostalimi mikroorganizmi zaradi svojih posebnosti v prehranjevanju in posebnosti okolja. Okolje vedno izbere najbolje prilagojen mikroorganizem.

Pogosto nas bolj kot vrstna zastopanost zanima kakšna je aktivnost mikroorganizmov v naravnem okolju. Za merjenje aktivnosti v naravnem okolju uporabljamo radioaktivne izotope, stabilne izotope in mikroelektrode. Merjenje mikrobiološke aktivnosti v okolju otežuje raznosmernost procesov, kot tudi sočasne abiotske kemične in fizikalne pretvorbe spojin in elementov. Doprinos abiotičnih pretvorb skušamo vrednotiti s kontrolami, v katerih preprečimo biološko aktivnost (uporaba sterilnega vzorca). Zagotovitev sterilnosti je v naravnem okolju zelo težavna naloga. Sterilizacija tal npr. z avtoklaviranjem lahko poruši fizikalne lastnosti vzorca, kot je struktura mineralov glin, agregiranost. Kljub temu, da je tak material sterilen, ni več primerljiv z materialom iz naravnega okolja mikroorganizma. Avtoklaviranje takega vzorca poveča dostopnost organske snovi za mikrobno razgradnjo. Če proučujemo mineralizacijo organskega ogljika in dušika, bo lahko ocena za obseg neto mineralizacije v takšnem vzorcu napačna - prevelika. Drugi večji problem pri merjenju aktivnosti mikroorganizmov v naravnem okolju je hitrost spreminjanja okolja. Mikrookolje, ki je v začetnem času merjenja aerobno, lahko zaradi metabolizma mikroorganizmov hitro preide v anaerobno okolje vsaj na mikrolokacijah. Zaradi hitrega spreminjanja stanja v naravnih sistemih so smiselni samo tisti podatki o aktivnosti mikroorganizmov, ki so dobljeni v obdobju znotraj relativne stabilnosti okolja. Pomembno je tudi poznavanje fizikalno-kemijskih lastnosti površine delcev, na katere so adsorbirana hranila in mikroorganizmi. Običajno je aktivnost mikroorganizmov bistveno večja na površini delcev kot pa v raztopini (prisotnost hranil, ugodnejše fizikalno-kemijske lastnosti).

Mikroorganizmi so pomembni pri pretoku energije in pri kroženju številnih kemijskih elementov (C, O, N, P, S, Fe, Mn, Hg) v ekosistemu. S kroženjem elementov v naravi razumemo oksidacijsko-redukcijske pretvorbe; prehod elementa iz reducirane oblike v oksidirano obliko in ponovno v reducirano obliko. Zajema pa tudi premeščanje elementov v samih ekosistemih in med njimi. Oksido-redukcijske pretvorbe lahko potekajo s pomočjo organizmov ali pa kemično. V splošnem lahko trdimo, da je pri danih pogojih na našem planetu hitrost kroženja tistih elementov, kjer v pretvorbah niso vključeni mikroorganizmi, majhna. To pa seveda ne izključuje posameznih fizikalno-kemijskih pretvorb. V primerih, ko je mogoča kemijska in biološka pretvorba, pride med obema do kompeticije. Končni produkti in količina porabljene ali sproščene energije pri biološki in kemijski oksidaciji so enaki. Bistvena razlika pa je v načinu sproščanja energije. Živa celica lahko del sproščene energije zajame za sintezo celičnega materiala. Ker vse reakcije, pri katerih se sprošča energija, zahtevajo aktivacijsko energijo, je hitrost reakcij v veliki meri odvisna od uporabe katalizatorjev.

29

Če bi pustili, da reakcije potekajo brez katalizatorjev, bi se hitrost nastajanja produktov bistveno upočasnila. Encimsko vodene reakcije v celici , kjer sta reaktanta prisotna v koncentraciji 10 mM in ob predpostavki, da sta reakciji za oba reaktanta prvega reda, so približno 1010 krat hitrejše od iste reakcije, ki poteka brez prisotnosti encima pri standardnih pogojih. Zaradi vsesplošne prisotnosti mikroorganizmov (biokatalize) v okolju je torej razumljivo, da je pri danih pogojih na planetu običajno prednostno biološko kroženje snovi.

Vaja 12: Kroženje ogljika

V naravi je redoks stanje ogljika v mejah od 4+ do 4-, npr.: CO2 4+ C6H12O6 0 CH4 4- Ogljik v drugih ogljikovih spojinah je v redoks stanju med obema mejnima

vrednostima. Enostaven primer za kroženje ogljika je naslednji: CO2 iz zraka v procesu fotosinteze asimilira zelena rastlina, in ga v anabolnih procesih prevede do celuloze. Po odmrtju rastline celulozo razgradijo celulolitični mikroorganizmi. Produkt aerobne razgradnje ogljika v celulozi je ogljik v CO2 in ogljik v novo nastali biomasi (∼ 50:50). Na ta način je le del ogljika (ogljik v CO2) naredil kompleten krog. Običajno je kroženje dušika v naravi precej daljše in bolj zamotano.

Procesi pri kroženju ogljika, pri katerih so udeleženi mikroorganizmi, so naslednji: fotosinteza, respiracija, metanogeneza, oksidacija metana, fermentacija, razgradnja polimerov, sinteza polimerov.

a) Vloga hranil pri razgradnji celuloze

Celuloza je visokomolekularni v vodi netopni polimer glukoze, ki je v naravi vedno

vezana z drugimi substancami (npr. lignini). Prva stopnja razgradnje v aerobnih ali anaerobnih razmerah je depolimerizacija celuloze. Prvi vodotopni produkt je disaharid celobioza. Presnova celuloze in nanjo vezana rast mikrobov je mogoča v okolju, ki ob viru energije in ogljika nudi tudi druga hranila za sintezo nove mikrobne biomase.

30

Izvedba: Znano količino zračno suhe ( ∼2 g z.s.) modelne celulozne snovi (filter papir

10x10cm) inkubiraj aerobno v epruvetah 20 x 200 mm ob različni založenosti s hranili. Varianta A: celuloza + 7 ml deionizirane vode + 1.5 ml talne suspenzije (razredčitev

10-1

) Varianta B: celuloza + 2 ml deionizirane vode + 5 ml 10x razredčene raztopine soli

(Winogradsky) z dodanimi mikroelementi + 1.5 ml talne suspenzije (10-1

) Varianta C: celuloza + 1 ml deionizirane vode + 5 ml 10x razredčene raztopine soli z

mikroelementi + 1 ml raztopine NH4NO3 + 1.5 ml talne suspenzije (10-1

)

Varianta D: enaka varianta kot C, le da jo avtoklaviramo Osnovna raztopina soli po Winogradskem:

K2HPO4 5.0 g MgSO4 x 7H2O 5.0 g NaCl 2.5 g Fe2(SO4)3 x H2O 50 mg MnSO4 x 4H2O 50 mg deionizirana voda 1000 ml

Raztopina NH4NO3: 3.75 mg (NH4 + NO3)-N/ml Po nekaj tedenski inkubaciji pri 28°C v temi ostanek celuloznega materiala posuši

(do z.s. stopnje) in ugotovi spremembo teže med inkubacijo v posameznih variantah

Tabela 7: Razlika v teži zračno suhega filter papirja (z.s.) med težo na začetku in koncu inkubacije pri različnih variantah razgradnje filter papirja.

Vzorec Začetna teža snovi

Končna teža snovi

∆ g delež mineralizirane

(g z.s.) (g z.s.) snovi (%)

A

B

C

D

31

b) Produkcija CO2 pri razgradnji celuloze

Izvedba: V infuzijske steklenice vstavi filter papir (10x10cm) in dodaj 5 ml vode, 25 ml 10x

razredčene raztopine soli (po Winogradskem) z dodanimi mikroelementi, 5 ml raztopine NH4NO3 in 2.5 ml talne suspenzije (razredčitev 10-1) Posode zapri s plinotesnim gumijastim zamaškom.

Varianta A: 550 ml steklenica - plinska faza je zrak Varianta B: 150 ml steklenica - plinska faza je N2

Da zagotoviš aerobne razmere med inkubacijo v varianti A večkrat izmenjaj plinsko fazo z zrakom po predhodni kvantifikaciji CO2 v steklenici. Po nekaj tedenski inkubaciji izmeri v obeh variantah količino nastalega CO2 v plinski fazi s plinsko kromatografijo (pri A dobimo kumulativo).

Z upoštevanjem raztopljenega CO2 izračunaj celotno količino nastalega CO2:

M = Cg ⋅ (Vg + Vl ⋅ α)

M - celotna količina CO2 v posodi Cg - izmerjena koncentracija CO2 v plinski fazi Vg - volumen plinske faze Vl - volumen tekoče faze

α - Bunsenov koeficient topnosti plinov, ki pri 25°C znaša 0.758. molska masa celuloze (C6H10O5)x = 162

1 mmol plina zavzema pri 25°C 24,5 ml

Tabela 8: Produkcija CO2 pri aerobni in anaerobni inkubaciji.

% substratnega C v CO2-C inkubacija (dnevi)

aerobno (% CO2)

anaerobno (% CO2) aerobno anaerobno

32

c) Velikost združbe amilolitičnih mikroorganizmov v vzorcu tal Škrob je sestavljen iz amiloze in amilopektina, ki je razvejana molekula. Prva

stopnja razgradnje škroba je depolimerizacija z amilazami in α-glukozidazo. Število mikrobov z amilolitično sposobnostjo v vzorcu tal bomo določili z MPN metodo.

Izvedba:

Selektivno gojišče z amilozo kot edinim virom energije nacepi v treh ponovitvah s po 1 ml razredčene suspenzije tal (razredčitve od 10

-1 do 10

-9). Ne pozabi na kontrolni

vzorec. Gojišče za amilolitične mikroorganizme:

50.0 ml talni ekstrakt 10.0 ml amiloza 1.5 g NH4NO3 1.0 g

razt. mikroelementov 1.0 ml deionizirana voda 1000 ml

Nacepljeno gojišče inkubiraj aerobno nekaj tednov (2-3) pri 28°C. Odčitavanje: test z jodovico pokaže pozitivne primere (ni modre obarvanosti - škrob

je porabljen) Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z

upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu tal.

Tabela 9: Določevanje števila amilolitičnih mikroorganizmov z MPN metodo

(razpored + in - primerov porabe škroba). ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

a b c

Karakteristično število: Število amilolitičnih mikroorganizmov na g z.s. tal:

33

d) Velikost združbe proteolitičnih mikroorganizmov Modelna snov je protein želatina. Protein je mikrobni celici vir energije, C, N, in S.

Prva stopnja razgradnje želatine je depolimerizacija. Izvedba:

Selektivno gojišče z želatino kot edinim virom energije nacepimo v treh ponovitvah z 1 ml razredčene suspenzije tal (razredčitve od 10

-1 do 10

-8). Ne pozabi na kontrolo!

Gojišče za proteolitične mikroorganizme:

razt. soli (Winogradsky) 50.0 ml želatina 30.0 g razt. mikroelementov 1.0 ml deionizirana voda 1000 ml

Nacepljena gojišča inkubiraj aerobno nekaj tednov pri 28°C v temi. Po inkubaciji odčitaj pozitivne primere. Pozitivni primeri so utekočinjena gojišča pri

temperaturi pod 22 °C in očitni znaki rasti. Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z

upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu tal.

Tabela 10: Določitev proteolitičnih mikroorganizmov v vzorcu tal z MPN metodo. ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

a

b

c

Karakteristično število: Število proteolitičnih mikroorganizmov na g z.s. tal:

e) Energetski izplen porabe škroba (amiloze)

34

Gojišče z znano količino amiloze kot edinega energetskega substrata nacepimo s

talnim inokulumom in po inkubaciji merimo prirast biomase. Energetski izplen mikrobne razgradnje amiloze bomo ugotavljali v aerobnih in anaerobnih razmerah. Mera za izkoristek bo količina nastale biomase. Izvedba:

- aerobna presnova amiloze: 50 ml gojišča (5g škroba/l) v 250 ml erlenmajerici z vatnim zamaškom nacepi z 1 ml

suspenzije tal (10-1) in inkubiraj na stresalniku do popolne porabe amiloze. - anaerobna presnova amiloze: 50 ml gojišča (5g škroba/l) v 150 ml serumski steklenici nacepi z 1 ml suspenzije tal

(10-1). Nacepitev opravi s pomočjo injekcijske brizge skozi plinotesni gumijasti zamašek. Atmosfero zraka v steklenici zamenjaj z atmosfero N2. Nacepljeni vzorec inkubiraj na stresalniku do popolne porabe amiloze.

Prisotnost amiloze v gojiščih preverjamo z jodovico v aseptično odvzetih vzorcih (0.1ml)

Določanje mikrobne biomase z biuretno reakcijo Ko je porabljen ves organski substrat, določimo količino nastale mikrobne biomase v

vsaki varianti z merjenjem celičnega proteina z biuretno reakcijo: - kulturo homogeniziraj z ultraturaksom - celice iz 30 ml kulture odcentrifugiraj: 15000 obr./min, 10 min - celice v usedku operi s 5 ml 0.9% NaCl in ponovno centrifugiraj - usedek resuspendiraj v 5 ml 0.9% NaCl - 1 ml suspenzije odpipetiraj v 10 ml stekleno centrifugirko in dodaj 1 ml vode;

vzporedno delaj slepo probo, ki vsebuje 2 ml H2O - dodaj 1 ml 3N NaOH - segrevaj 5 min v vodni kopeli pri 100 oC - ohladi - dodaj 1 ml 2.5% CuSO4

- inkubiraj 5 min pri sobni T - centrifugiraj 10 min pri 3000 obr./min - izmeri absorbanco supernatanta pri A555 proti slepi probi

Tabela 11: Količina biomase pri aerobni in anaerobni inkubaciji.

35

Varianta inkubacije količina biomase (mg proteina/50ml)

aerobno

anaerobno

Molska masa škroba (C6H10O5) = 162 Iz podatkov o novonastali biomasi in porabljeni količini substrata izračunaj

učinkovitost izrabe substrata in jo izrazi v: - mg biomasnega proteina na mg substrata:

- mg suhe snovi biomase na mg substrata (upoštevaj, da je delež proteina ∼ 50 % v suhi snovi biomase):

- mg suhe snovi v biomasi na mg substratnega ogljika:

- mg biomasnega ogljika na mg substratnega ogljika (upoštevaj, da je v suhi snovi biomase delež ogljika ∼50 %):

36

Vaja 13: Kroženje dušika

V naravi je redoks stanje dušika v mejah od 5+ do 3-, npr.: NO3

- 5+ N2 0 NH4

+ 3- Mikrobni procesi pri kroženju dušika so: asimilacija dušika, mineralizacija

(amonifikacija), nitrifikacija, denitrifikacija in biološka fiksacija dušika. Asimilacija dušika je proces vezave anorganskega dušika (amonij, nitrat) v organsko

snov npr. aminokisline in poteka v aerobnih in anaerobnih razmerah. Mineralizacija je proces sproščanja organsko vezanega dušika v anorgansko obliko.

Proces poteka v aerobnih in anaerobnih razmerah. Imenujemo ga tudi amonifikacija, ker je produkt amonijev ion. Na anorganski nivo sproščeni dušik predstavlja višek za rastne potrebe mikroba, količina le tega je odvisna od C : N razmerja.

Ožja skupina kemoavtotrofnih aerobnih bakterij izrablja amonijev ion kot energetski vir za rast. V procesu nitrifikacije substrat oksidirajo do nitrita in nitrata. Ločimo: nitritacijo (Nitrosomonas spp.) NH4

+ → NO2- in nitratacijo (Nitrobacter spp.) NO2

-→ NO3

-

Skupina fakultativno anaerobnih bakterij lahko uporablja nitrat v anaerobnih razmerah kot alternativni prevzemnik elektronov (dihajo z nitratom). Nitrat se postopno reducira preko nitrita in NO do plinskih produktov N2O in N2 (denitrifikacija).

Biološka fiksacija dušika je redukcija N2 do NH4+ z encimom nitrogenazo in nato

vgradnja v organsko snov. Sinteza nitrogenaze je vezana izključno na prokariontski genom. Fiksacijo dušika lahko vršijo prostoživeči fiksatorji, asociativni fiksatorji in simbiontski fiksatorji. Proces lahko merimo na več načinov: merimo razliko v skupnem dušiku v nodulirani in nenodulirani (referenčni) rastlini, 15N izotopna metoda in z acetilenskim testom - ARA (acetylene reduction assay).

37

a) Velikost združbe mineralizatorjev dušika - amonifikatorjev

Izvedba: Gojišče z argininom kot virom organskega N nacepi v treh ponovitvah z 1 ml

razredčene suspenzije tal (razredčitve od 10-1

do 10-8

). Ne pozabi na kontrolni vzorec! Gojišče za mineralizatorje dušika:

razt. soli (Winogradsky) 50.0 ml arginin 0.2 g razt. mikroelementov 1.0 ml deionizirana voda 1000 ml

Nacepljena gojišča aerobno inkubiraj nekaj tednov pri 28°C v temi. Z Nesslerjevim reagentom dokaži pojavljanje amonijevega iona. Pozitivni primeri so

vzorci z dokazanim amonijevim ionom (pojav oranžne obarvanosti oz. oranžnorjave oborine).

Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število mikrobov, ki so udeleženi v mineralizaciji argininskega N.

Tabela 12: Določitev mineralizatorjev dušika v vzorcu tal z MPN metodo. ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

a

b

c

Karakteristično število: Število mineralizatorjev dušika na g z.s. tal:

38

b) Velikost združbe nitrifikatorjev

Izvedba: Mineralno gojišče z amonijevim ionom nacepi v treh ponovitvah z 1 ml razredčene

suspenzije tal (razredčitve od 10-1

do 10-5

). Ne pozabi na kontrolni vzorec! Gojišče za nitrifikacijo:

(NH4)2SO4 raztopina 10.0 ml 0,2M KH2PO4 7.5 ml CaCl2 x 2H2O razt. 1.0 ml MgSO4 x 7H2O razt. 1.0 ml kelirano železo 1.0 ml raztopina mikroelementov 1.0 ml bromtimol modro 5.0 ml deionizirana voda 970 ml

Nacepljena gojišča aerobno inkubiraj nekaj tednov (3-4) pri 28°C v temi. S specifičnim reagentom za nitrit SA + NEDA (sulfanilamid in naftiletilendiamin)

dokaži nastanek nitrita. Prisotnost nitrita kaže roza obarvanost. Ker z dodatkom Zn v prahu poteče kemijska redukcija nitrata do nitrita, lahko po dodatku Zn dokažemo tudi nitrat. Najprej dodaj SA +NEDA, šele nato dodaj Zn. Prisotnost nitrita oz. nitrata (roza obarvanost) kaže pozitivne primere.

Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število nitrifikacijskih bakterij v vzorcu tal. Tabela 13: Določitev števila nitrifikatorjev v vzorcu tal z MPN metodo. ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

a

b

c

Karakteristično število: Število nitrifikatorjev na g z.s. tal:

39

c) Vpliv kisika na nitrifikacijo

Izvedba: Enako gojišče kot pri vaji b), vendar v epruvetah za anaerobno gojenje. Gojišče nacepi s suspenzijo tal (1 ml), plinotesno zapri in atmosfero zamenjaj s He.

Kontrola je enako nacepljeno gojišče, inkubirano v prisotnosti zraka.

Po nekaj tednih (3-4) inkubacije pri 28°C preveri nastanek nitrita in/ali nitrata (reagent SA+NEDA) v anaerobnih vzorcih in aerobni kontroli.

Nitrifikacija pri inkubaciji v - aerobiozi: - anaerobiozi:

d) Velikost združbe denitrifikatorjev

Izvedba: Gojišče z glukozo in nitratom nacepi v treh ponovitvah z 1 ml razredčene suspenzije

tal (razredčitve od 10-2

do 10-8

). Ne pozabi na kontrolni vzorec! Gojišče za denitrifikatorje:

razt. soli (Winogradsky) 50.0 ml KNO3 2.0 g (NH4)2SO4 1.0 g glukoza 10.0 g CaCO3 5.0 g razt. mikroelementov 1.0 ml deionizirana voda 1000 ml

Nacepljena gojišča inkubiraj v anaerobnem loncu v atmosferi N2 nekaj tednov (2-3)

pri 28°C v temi. Z SA+NEDA reagentom, dokaži pojavljanje nitrita. V vzorcih, kjer nitrit ni

dokazljiv, preveri prisotnost nitrata z dodatkom Zn v prahu, ki reducira nitrat do nitrita (prisotnost nitrata indicira rožnata obarvanost).

Pozitivni primeri so vzorci z nitritom in vzorci kjer ni niti nitrita niti nitrata. Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z

upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število mikrobov v vzorcu tal. Tabela 14: Določitev števila denitrifikatorjev v vzorcu tal z MPN metodo.

40

Ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

a

b

c

karakteristično število: število denitrifikatorjev na g z.s. tal:

e) Vpliv kisika na denitrifikacijo

Izvedba:

Enako gojišče kot pri vaji e), nacepi s suspenzijo tal v variantah: A: 50 ml gojišča v 250 ml erlenmajerici nacepi z 1 ml suspenzije tal. Aerobno

inkubiraj na stresalniku pri 28°C v temi 7-14 dni. B: 50 ml gojišča v 150 ml penicilinki nacepi z 1 ml suspenzije tal. Plinsko fazo

zamenjaj z N2 in anaerobno inkubiraj na stresalniku 7-14 dni pri 28°C v temi. Po inkubaciji ugotovi pojavljanje nitrita (reagent SA+NEDA). Preostanek nitrata

dokaži z dodatkom Zn v prahu ob že prisotnostnem reagentu SA+NEDA. Denitrifikacija v vzorcu - A: - B:

41

Vaja 14: Kroženje žvepla V naravi je redoks stanje žvepla v mejah od 6+ do 2-, npr.:

SO42- 6+

S 0 H2S 2-

Mikroorganizmi so lahko udeleženi v naslednjih procesih pri kroženju žvepla: mineralizacija organskega žvepla, asimilacija žvepla, redukcija sulfatov, oksidacija sulfidov in elementarnega žvepla.

Asimilacija žvepla je proces vezave anorganskega žvepla (SO42- ) v organsko snov

(aminokisline, kofaktorji). Mineralizacija žvepla je sproščanje organsko vezanega žvepla na anorganski nivo.

Poteka aerobno ali anaerobno. Produkt aerobne mineralizacije žvepla je sulfat, anaerobne mineralizacije pa H2S.

V anaerobnih razmerah skupina striktno anaerobnih bakterij (sulfatni respiratorji) uporablja sulfat kot prevzemnik elektronov iz dihalne verige. Sulfat se pri tem reducira do H2S. Energetski vir so H2 in nizkomolekularne organske snovi (acetat, laktat, etanol).

V aerobnih razmerah se pri nevtralnem pH sulfid hitro kemično oksidira. Zaradi spontane oksidacije sulfida lahko mikroorganizmi izkoriščajo sulfid samo na interfazi med aerobnim in anaerobnim področjem.

a) Velikost združbe mikroorganizmov za anaerobno mineralizacijo organskega žvepla

Izvedba: Gojišče, ki vsebuje organsko vezano žveplo (cistein) in železov amon citrat nacepi v

treh ponovitvah z 1 ml razredčene suspenzije tal (razredčitve od 10-1

do 10-5

). Ne pozabi na kontrolo!

Gojišče za anaerobno mineralizacijo žvepla: NH4Cl 1.0 g K2HPO4 0.5 g CaCl2 x 2H2O 0.13 g Na-laktat 50% 6.2 ml cistein 1.0 g Fe-amonijski citrat 0.5 g talni ekstrakt 20.0 ml deionizirana voda 1000 ml

42

Nacepljena gojišča inkubiraj v anaerobnem loncu v atmosferi N2 nekaj tednov pri 28°C v temi.

Po končani inkubaciji pojav črne oborine železovega sulfida kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z

upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število mikrobov, ki mineralizirajo žveplo v anaerobiozi do H2S v vzorcu tal.

Tabela 15: Določanje anaerobnih mineralizatorjev žvepla v vzorcu tal z MPN metodo. Ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

a

b

c

Karakteristično število: Število anaerobnih mineralizatorjev žvepla na g z.s. tal:

b) Velikost združbe sulfatnih respiratorjev Izvedba:

Gojišče z laktatom in sulfatom nacepi v treh ponovitvah z 1 ml razredčene suspenzije tal (razredčitve od 10

-1 do 10

-5). V vsako epruveto aseptično dodaj risalni žebljiček, ki si

ga predhodno ožgal v plamenu. Ne pozabi na kontrolo! Gojišče za sulfatne respiratorje:

NH4Cl 1.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 x 7H2O 4.1 g CaCl2 x 2H2O 0.13 g Na-laktat 50% 6.2 ml deionizirana voda 1000 ml

Inokulirana gojišča anaerobno inkubiraj nekaj tednov pri 28°C.

43

Pojav črne oborine železovega sulfida na žebljičku kaže pozitivne primere. Iz razporeda + in - znakov določi karakteristično število in iz Mc Crady-jeve tabele z

upoštevanjem razredčitve odčitaj najbolj verjetno število sulfatnih respiratorjev v vzorcu tal.

Tabela 16: Določanje števila sulfatnih respiratorjev v vzorcu tal z MPN metodo.

ponovitve 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

a

b

c

Karakteristično število: Število sulfatnih respiratorjev na g z.s. tal:

c) Vpliv kisika na sulfatno respiracijo

Namen vaje je preveriti možnost vzpostavljanja sulfatne respiracije v razmerah “standardne aerobne inkubacije” na stresalniku. Test izvedemo z uporabo enakega gojišča kot pri vaji b). Izvedba:

Varianti: A: V 250 ml erlenmajerico dodaj 50 ml gojišča, nacepi z 1ml suspenzije tal in dodaj

risalni žebljiček, ki si ga predhodno ožgal v plamenu. Posodo zapri z vatiranim zamaškom. Inkubiraj aerobno nekaj tednov na stresalniku pri 28°C v temi.

B: V 150 ml penicilinko dodaj 50 ml gojišča nacepi z 1ml suspenzije tal in dodaj risalni žebljiček, ki si ga predhodno ožgal v plamenu. Posodo zapri z plinotesnim gumijastim zamaškom in Al-pokrovčkom. Zračno atmosfero zamenjaj z N2 in inkubiraj na stresalniku pri 28°C v temi.

Po nekaj tednih (3-4) inkubacije opazuj pojavljanje črne oborine fero sulfida. Rezultate primerjaj z rezultati podobnega testa za vzpostavljanje denitrifikacije v razmerah “standardne aerobne inkubacije”.

Sulfatna respiracija v vzorcu - A: - B: Dodatek:

44

Mc Crady-jeva tabela za 3 ponovitve

Karakter. št.

Št. mikrobov

Karakter. št.

Št. mikrobov

Karakter. št.

Št. mikrobov

000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110.0 130 1.6 300 2.5 333 140.0 200 0.9 301 4.0

45

RAZPORED VAJ ZA KROŽENJE C, N, S Skupina A B C D E C a,b c d e N a c,e b d S a,b c Skupina A: Vloga hranil pri razgradnji celuloze Produkcija CO2 pri razgradnji celuloze

Velikost združbe mineralizatorjev dušika (MPN 10-1 - 10-8) Skupina B: Velikost združbe m.o. za mineralizacijo organskega žvepla

(MPN 10-1- 10-5) Velikost združbe sulfatnih respiratorjev (MPN 10-1 - 10-5) Skupina C: Velikost združbe amilolitičnih mikroorganizmov

(MPN 10-1 - 10-9) Vpliv kisika na nitrifikacijo Vpliv kisika na denitrifikacijo Skupina D: Velikost združbe proteolitičnih mikroorganizmov

(MPN 10-1 - 10-8) Velikost združbe nitrifikatorjev (MPN 10-1 - 10-5) Skupina E: Energetski izplen porabe škroba Velikost združbe denitrifikatorjev (MPN 10-1 - 10-6) Vpliv kisika na sulfatno respiracijo

46