UNIVERZA V LJUBLJANI - ffa.uni-lj.si · PDF fileInterpretacija gelske kartice ... E in e ter avtomatizirati prenos podatkov iz dveh laboratorijskih ... vezavo rezultata na matiþno

Barbara Guzaj: Uvedba avtomatiziranega določanja antigena K in fenotipa Rh pri dajalcih krvi

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

BARBARA GUZAJ

UVEDBA AVTOMATIZIRANEGA DOLOČANJA ANTIGENA K IN FENOTIPA RH PRI DAJALCIH KRVI

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2008

1


Diplomsko nalogo sem opravljala na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, na Centru za testiranje krvi dajalcev, na Odseku za imunohematološko testiranje dajalcev krvi. Zahvaljujem se mentorju izr. prof. dr. Borutu Božiču za nasvete in skrbno pregledovanje pisnega dela. Zahvaljujem se delovni mentorici Vesni Hrašovec, dr. med. spec. transf. med. za vodenje in pomoč pri laboratorijskem delu, številne nasvete, vzpodbude ter za skrbno pregledovanje pisnega dela. As. mag. Marjeti Maček Kvanka, dr. med. spec. transf. med. se zahvaljujem za pomoč pri začetnih težavah. Vsem sodelavkam se zahvaljujem za nesebično pomoč pri eksperimentalnem delu. Za potrpežljivost, vzpodbudo in moralno pomoč bi se rada zahvalila mojim najbližjim - Luciji, Roku in Tadeju.

Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr. Boruta Božiča in somentorstvom Vesne Hrašovec, dr. med. spec. transf. med. Barbara Guzaj Ljubljana, 03.04.2008 Predsednica diplomske komisije: prof. dr. Jana Lukač Bajalo Članica diplomske komisije: izr. prof. dr. Janja Marc

2


VSEBINA Stran KAZALO SLIK ----------------------------------------------------------------- 5 KAZALO PREGLEDNIC----------------------------------------------------- 5 KAZALO GRAFOV------------------------------------------------------------ 6 POVZETEK ---------------------------------------------------------------------- 7 SEZNAM OKRAJŠAV -------------------------------------------------------- 8 1. UVOD -------------------------------------------------------------------------- 9 1.1. Varna transfuzija -------------------------------------------------------- 9 1.2. Krvne skupine ------------------------------------------------------------ 10 1.2.1. Krvni sistem Rh ------------------------------------------------------------------------ 10 1.2.2. Krvni sistem Kell ---------------------------------------------------------------------- 12 1.3. Protitelesa ----------------------------------------------------------------- 12 1.4. Aglutinacija eritrocitov ------------------------------------------------ 16 1.4.1. Aglutinacija na ploščici --------------------------------------------------------------- 17 1.4.2. Aglutinacija v epruveti ---------------------------------------------------------------- 18 1.4.3. Aglutinacija na mikrotitrski ploščici ------------------------------------------------ 18 1.4.4. Tehnika kolonske aglutinacije -------------------------------------------------------- 19 1.5. Informacijski sistem ---------------------------------------------------- 20 2. NAMEN DELA -------------------------------------------------------------- 22 3. MATERIALI IN METODE ----------------------------------------------- 23 3.1.1. Materiali ------------------------------------------------------------------- 23 3.2. Reagenti ------------------------------------------------------------------- 23 3.3. Oprema -------------------------------------------------------------------- 24 3.4. Biološki vzorci ------------------------------------------------------------ 24 3.5. Postopki ------------------------------------------------------------------- 24 3.5.1. Ugotavljanje fenotipa Rh v epruveti ------------------------------------------------- 24 3.5.2. Ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi reagenti --- 25 3.5.3. Ugotavljanje fenotipa Rh na prazni mikrotitrski ploščici ------------------------- 27 3.5.4. Ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi

reagenti ---------------------------------------------------------------------------------- 28 3.5.5. Ugotavljanje antigena K na gelski kartici ------------------------------------------- 30 3.5.6. Ročno ugotavljanje fenotipa Rh na gelski kartici ---------------------------------- 31 3.5.7. Ročno ugotavljanje antigena K na gelski kartici ----------------------------------- 31 3.5.8. Prenos rezultatov testiranja iz čitalca mikrotitrskih ploščic oz. iz čitalca gelskih

kartic v informacijski sistem ---------------------------------------------------------- 32

3


4. REZULTATI IN RAZPRAVA ------------------------------------------- 33 4.1. Primerjava treh načinov ugotavljanja antigenov C, c, E in e ---- 34 4.2. Primerjava dveh načinov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e 38 4.3. Rezultati ugotavljanja antigena K na gelski kartici ---------------- 40 4.4. Prenos rezultatov iz čitalca mikrotitrskih ploščic in iz čitalca

gelskih kartic v informacijski sistem ---------------------------------- 41 5. SKLEP ------------------------------------------------------------------------- 43 6. LITERATURA -------------------------------------------------------------- 44 7. PRILOGE --------------------------------------------------------------------- 45

4


KAZALO SLIK Stran Slika 1: Robot Tecan RSP 8051-ID ----------------------------------------------------- 19 Slika 2: Shema računalniške povezave na Odseku za imunohematološko testiranje

dajalcev krvi---------------------------------------------------------------------- 21 Slika 3: Ugotavljanje fenotipa Rh v epruveti ------------------------------------------ 25 Slika 4: Mikrotitrska ploščica Biotest Erytype Rh+K 16-single -------------------- 25 Slika 5: Stresanje mikrotitrskih ploščic na stresalcu ---------------------------------- 26 Slika 6: Reagenti Ecoclone -------------------------------------------------------------- 27 Slika 7: Ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone na

robotu Tecan Genesis RSP 200 ------------------------------------------------ 28 Slika 8: Mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16-single na robotu -------- 29 Slika 9: Interpretacija gelske kartice DiaMed DiaClon Anti–K v čitalcu

ID–Reader SA ------------------------------------------------------------------- 30 Slika 10: Gelska kartica DiaMed RhD+Phenotype ------------------------------------ 31 Slika 11: Gelska kartica DiaMed DiaClon Anti–K ------------------------------------- 31 Slika 12: Čitanje mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16–single v čitalcu

Tecan SLT Spectra s pomočjo programa Medusa -------------------------- 39

KAZALO PREGLEDNIC Stran Preglednica I: Parameter, ki ga moramo preveriti pri validaciji reagentov za

ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh ---------------------------------- 10 Preglednica II: Kontrola kakovosti pri ugotavljanju krvnih skupin -------------------- 10 Preglednica III:Shematski prikaz RhD pozitivnih in RhD negativnih oseb------------ 11 Preglednica IV:Genska kombinacija pri RhD pozitivnih in RhD negativnih osebah- 12 Preglednica V: Število imunizacij Kell in Rh od 1999 do 2006 na ZTM -------------- 14 Preglednica VI:Fenotip Rh vzorcev uporabljenih za pozitivno in negativno

kontrolo ---------------------------------------------------------------------- 26 Preglednica VII:Cenovna primerjava ugotavljanja antigenov na dveh različnih

mikrotitrskih ploščicah ----------------------------------------------------- 36 Preglednica VIII: Primerjava števila napak na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype

S Rh-Pheno single in v epruveti z reagenti Ecoclone ------------------ 37 Preglednica IX: Časovna primerjava ugotavljanja fenotipa Rh v epruveti in na

mikrotitrski ploščici -------------------------------------------------------- 38 Preglednica X: Število lažnih rezultatov v epruveti in na mikrotitrski ploščici ------ 40

5


KAZALO GRAFOV Stran Graf 1: Skupno število imunizacij od 1999 do 2006 na ZTM ------------------------- 14 Graf 2: Primerjava ugotavljanja protiteles v letih 2000 in 2005 v Splošni Bolnišnici

Maribor ------------------------------------------------------------------------------ 15 Graf 3: Delež testiranih dajalcev za posamezni antigen v letu 2003 in v letu

2004 na ZTM ----------------------------------------------------------------------- 16 Graf 4: Neovrednoteni rezultati (»?«) na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype

S Rh-Pheno single ------------------------------------------------------------------ 34 Graf 5: Primerjava lažno negativnih rezultatov ali neovrednotenih rezultatov (»?«)

na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi reagenti in na prazni mikrotitrski ploščici ------------------------------------------------------------------------------- 35

6


POVZETEK Na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino izdajamo kri skladno v krvni skupini AB0 in RhD. S povečanjem obsega predtransfuzijskega testiranja in z občutljivejšimi tehnikami dela se povečuje število senzibiliziranih pacientov, s tem pa potreba po izdaji krvi skladne tudi v drugih eritrocitnih antigenih. Za hitrejše iskanje skladne krvi, je potrebno pretestirati bazo dajalcev krvi na eritrocitne antigene, pri katerih najpogosteje prihaja do senzibilizacije in katera protitelesa so klinično pomembna. Krvni skupini AB0 in RhD se avtomatizirano ugotavljajo na mikrotitrski ploščici, medtem ko se ostali antigeni (K, C, c, E, e in k) ugotavljajo ročno v epruveti. Z večanjem števila preiskav prihaja tudi do večanja števila napak, ki so posledica človeškega dejavnika. Namen našega dela je bil avtomatizirati metodo ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e ter avtomatizirati prenos podatkov iz dveh laboratorijskih robotov v čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra oz. v čitalec gelskih kartic DiaMed ID-Reader SA ter nato preko vmesne podatkovne baze v hišni informacijski sistem DATEC. S tem bi se povečala odzivnost pri iskanju antigen negativne krvi (K, C, c, E, e) pri urgentnih naročilih za senzibilizirane paciente, predvsem tiste z multipnimi aloprotitelesi. Postopno bi se pretestirala baza dajalcev krvi za razširitev indikacij tako za transfuzije Kell in tudi Rh (DCcEe) skladne krvi. Z vpeljavo avtomatiziranega ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e se bi povečala sledljivost, varnost in kakovost dela, kar je velika pridobitev za pacienta. Najprej smo primerjalno ročno ugotavljali antigene C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone ter avtomatizirano na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single in na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone. Ugotovili smo, da je avtomatizirana metoda na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single najhitrejša in racionalnejša metoda. Za potrebe izdaje Kell skladne krvi smo uvedli 2 različni avtomatizirani metodi ugotavljanja prisotnosti antigena K. Ugotavljali smo pravilnost testiranja antigena K na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single in na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K. Pri obeh avtomatiziranih metodah smo preverili pravilnost prenosa rezultatov in vezavo rezultata na matično številko dajalca v informacijskem sistemu DATEC. Sistem avtomatizacije ugotavljanja prisotnosti antigenov K, C, c, E in e omogoča popolno sledljivost postopkov. Interpretacija rezultatov s čitalcem mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in čitalcem gelskih kartic DiaMed ID-Reader SA je enaka interpretaciji s prostim očesom. Podatki iz računalniškega programa Medusa in Maestro se po prenosu preko vmesnika v informacijski sistem DATEC ne spremenijo. Vse te podatke se da arhivirati in s tem je sledljivost ugotavljanja prisotnosti antigenov K, C, c, E in e trajna, česar pri ročnem testiranju v epruveti ni mogoče doseči. Glede na pridobljene rezultate in zbrane podatke podpiramo uvedbo ugotavljanja prisotnosti antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single za hitrejše iskanje antigensko skladne krvi v teh antigenih. Prav tako podpiramo uvedbo ugotavljanja prisotnosti antigena K na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single in na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K za izdajo antigensko skladnih enot eritrocitov v antigenu K. V prihodnosti načrtujemo pripraviti eritrocitne komponente za izdajo krvi poleg skladnosti v antigenu K tudi skladno v antigenih C, c, E in e.

7


SEZNAM OKRAJŠAV

AHG - Antihumani globulin AK - Amino kislina DCP - Dvojna celična populacija DTT - Ditiotreitol ICT - Indirektni Coombsov test IS - Informacijski sistem Ko - Ravnotežnostna ali afinitetna konstanta reakcije MTP - Mikrotitrska ploščica NTD - Neskladni rezultat PC - Osebni računalnik ZTM - Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino

8


1. UVOD

1.1. Varna transfuzija Zdravljenje s transfuzijo krvi je v preteklosti temeljilo v največji meri na uporabi polne krvi. Komponente krvi so tiste sestavine krvi, ki jih je mogoče pripraviti s centrifugiranjem, filtriranjem in zamrzovanjem. Pacientom moramo dati tisto komponento, ki je potrebna za odpravo specifičnega pomanjkanja. S tem se izognemo nepotrebnemu in morda škodljivemu vnosu odvečnih sestavin krvi. Iz polne krvi lahko pripravimo naslednje komponente krvi: koncentrirane eritrocite, filtrirane koncentrirane eritrocite, koncentrirane eritrocite z odstranjeno levkocitno maso (eritrociti z odstranjenim t.i. buffy coat-om), oprane eritrocite, koncentrirane trombocite, sveže zamrznjeno plazmo in v redkih primerih granulocite pridobljene z granuloferezo (1). Za varno transfuzijo je potrebno opraviti preiskave, s katerimi ugotovimo skladnost krvi prejemnika in dajalca, ter preprečimo prenos bolezni s krvjo. Ukrepi za zagotavljanje varne krvi se izvajajo na vseh področjih transfuzijske medicine od izbire dajalcev krvi, predelave, imunohematološkega testiranja krvi (ugotavljanje krvnih skupin AB0 in RhD, ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh ter ugotavljanja prisotnosti nepričakovanih protiteles (Indirektni Coombsov test - ICT), testiranja krvi na označevalce bolezni, ki se prenašajo s krvjo, shranjevanja in izdaje komponent krvi in njihove pravilne uporabe (1). Z takšnimi ukrepi se želimo izogniti neželenim učinkom transfuzije. Vsaka transfuzija krvi je v bistvu presaditev tujega tkiva. Imunski učinki ob vnosu tujih antigenov so lahko razvoj protiteles, alergična reakcija, hemoliza ali celo reakcija presadka proti gostitelju. Najhujša posledica transfuzije neustrezne krvi je akutna hemolitična reakcija (2). Akutna hemolitična transfuzijska reakcija nastane po transfuziji AB0 neskladnih eritrocitov ali plazme, ko pacientova eritrocitna protitelesa hemolizirajo dodane eritrocite v ožilju. Protitelesa proti eritrocitnim antigenom nastanejo kot odgovor po transfuziji krvi ali nosečnosti. Cilj vsakega laboratorija za transfuzijo krvi je, da izvaja pravi test, na praven vzorcu in pridobi prave rezultate. S tem si zagotovi, da izda pravo komponento krvi za pravega pacienta (1). Za predanalizne postopke je potrebno zagotoviti in dokumentirati uporabo pravih reagentov, ki so v roku uporabnosti in so bili pred uporabo shranjeni v skladu s specifikacijami. Vzorci morajo biti pravilno označeni in primerni za analizo. Za analizne postopke moramo zagotoviti, da se interne kontrole izvajajo z vsako serijo testov in da kontrolne reakcije dosežejo specifikacije pred validacijo vsake serije testov (1). Reagenti za ugotavljanje krvnih skupin so uvrščeni v skupino pripomočkov za diagnostiko in vitro in morajo nositi oznako CE. Direktiva EU 98/79EC uvršča ABO Rh, Kell testni serum, A B celice, HIV, HTVL, hepatitis B, C teste za presejalno testiranje na listo A. Proizvajalec mora imeti uveden sistem kakovosti, certifikat zanj izda pooblaščena ustanova in mora predložiti vlogo, ki vsebuje vse kontrolne rezultate za vse reagente iz prej navedenih skupin. Pri oceni reagentov za krvne skupine upoštevamo standarde, ki določajo minimalno učinkovitost (Preglednica I) (1).

9


Preglednica I: Parameter, ki ga moramo preveriti pri validaciji reagentov za ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh Zahtevana kakovost

Pojavnost Ni precipitata, delcev ali gelskih formacij, vidnih s prostim očesom

Reaktivnost in specifičnost

Odsotna je imunohemoliza, ni prosto vidnega tvorjenja rolojskih formacij ali prozonskega pojava; jasne reakcije z eritrociti, ki imajo šibko izražene odgovarjajoče antigene, brez lažnih reakcij

Učinkovitost

Nerazredčen serum naj da aglutinacijo, ocenjeno z vrednostjo 3 do 4 »križi« v predvidenem testu za vsak serum in titer 32 za anti–D in titer 16 za anti–C, anti–E, anti–c, anti–e in anti–CDE z uporabo primernih heterozigotnih eritrocitov

Opremo, ki se uporablja v transfuzijski serologiji, kot so centrifuge, vodne kopeli, inkubatorji, hladilniki in zamrzovalniki, moramo redno kontrolirati. Tudi opremo za avtomatsko ugotavljanje krvnih skupin moramo sistematično preverjati v skladu z navodili proizvajalca. Kadar je zagotovljeno, da kakovost opreme in reagentov ustreza našim zahtevam, so lažni rezultati zaradi same tehnike. Bodisi zaradi njene neustreznosti ali še bolj pogosto zaradi »operativnih napak«, ki so posledica nenatančne izvedbe ali napačne razlage (Preglednica II) (1). Preglednica II: Kontrola kakovosti pri ugotavljanju krvnih skupin

Parameter, ki ga moramo

preveriti

Minimalne zahteve za testiranje

Kontrolni vzorci Pogostost kontrole

Fenotip Rh in fenotip drugih krvnih skupin

Uporabimo specifične reagente

Pozitivna kontrola: heterozigotni eritrociti Negativna kontrola: eritrociti brez testiranega antigena

Monoklonska protitelesa in humani serumi enkrat dnevno

1.2. Krvne skupine Leta 1900 je Landsteiner odkril prve krvne skupine, ki jih je poimenoval AB0. Na površini eritrocitov in tudi drugih telesnih celic se nahajajo polimorfne molekule, ki tvorijo 29 sistemov krvnih skupin, v katerih je preko 500 različnih antigenov. Nekateri antigeni so prisotni na eritrocitih skoraj vseh ljudi, drugi pa so zelo redki. Med posameznimi rasami in narodi so razlike v pogostosti posameznih antigenov velike. Vsak od teh antigenov lahko izzove po transfuziji eritrocitov drugi osebi, ki tega antigena nima, imunski odziv in nastanek ustreznih eritrocitnih aloprotiteles, ki aglutinirajo eritrocite s temi antigeni (3).

1.2.1.Krvni sistem Rh Levine in Stetson sta leta 1939 v serumu ženske, ki je rodila mrtvega otroka, odkrila protitelo, ki je aglutiniralo eritrocite njenega moža. Leto dni kasneje sta Landsteiner in

10


Wiener po imunizaciji zajcev in buder z eritrociti opice odkrila, da ta protitelesa imuniziranih zajcev in buder ne aglutinirajo samo opičjih eritrocitov, temveč tudi eritrocite približno 80 % prebivalcev New Yorka. Tako sta razdelila ljudi na Rh pozitivne in Rh negativne. Kmalu po prvih spoznanjih o sistemu Rh so ugotovili, da ne obstaja samo antigen Rh, ampak še cela vrsta drugih (4). Krvni sistem Rh je drugi najpomembnejši in najbolj polimorfen krvoskupinski sistem. Predstavljata ga dva proteina: RhD in RhCE (5,6). Antigeni sistema Rh so lipoproteini, ki so v skupkih nameščeni kot hidrofobni membranski proteini in vsebujejo proste sulfhidrilne skupine. Zrel protein Rh se sestoji iz enojne polipeptine verige sestavljene iz 416 aminokislin, ki prečkajo membranski dvosloj 12 do 13–krat (7). Obstajajo trije pari antigenov, ki sestavljajo sistem Rh: Cc, Dd in Ee. Kasnejše študije genoma DNA so pokazale, da je lokus Rh vsakega haplotipa D pozitivnega kromosoma sestavljen iz dveh, tesno povezanih struktur genov RHD in RHCE. Celotni gen RHD manjka pri RhD negativnih osebah. Gen RHD kodira polipeptid, gen RHCE pa oba, C/c in E/e proteina, ki verjetno nastaneta po mehanizmu alternativnega cepljenja (Preglednica III). Izsledki raziskav kažejo, da sta C/c in E/e konformacijsko odvisni strukturi (4). Gena RhD in RhCE se nahajata na lokusu RH in sta homologna v 93,3 %. V Sloveniji je 80,81 % RhD pozitivnih in 19,19 % RhD negativnih prebivalcev (7). Preglednica III: Shematski prikaz RhD pozitivnih in RhD negativnih oseb

Gen

RHD

protein D

Ni proteina D

RHCE

protein Cc in Ee

protein Cc in Ee

RhD-POZ RhD-NEG

Obstajata dve teoriji dedovanja v sistemu Rh. Po Fisher-Raceovi teoriji obstajajo trije pari alelnih genov, katerih neposredni produkti so antigeni sistema Rh. Geni so ozko nameščeni na treh lokusih prvega kromosoma in se dedujejo od vsakega starša. Otrok deduje od staršev tri pare genov, od vsakega starša tri gene. Wienerjeva teorija pa predpostavlja, da se deduje od vsakega starša en gen Rh (Preglednica IV) (8).

11


Preglednica IV: Genska kombinacija pri RhD pozitivnih in RhD negativnih osebah

Fischer - Race Winer Genska pogostost (%)

DCe R1 40

DcE R2 16

Dce R0 2

Rh

pozi

tivn

i

DCE Rz 0.08

ce r 38

Ce r1 ׳

cE r1 ״

Rh

nega

tivn

i

CE ry zelo redek

1.2.2.Krvni sistem Kell Krvni sistem Kell obsega okrog 23 identificiranih antigenov (K, k, Kpa, Kpb, …). Najprej ugotovljena antigena tega sistema sta antigen K (Kell) (1984) in antigen k (Cellano). Prekurzor antigena K je Kx substanca na eritrocitih in levkocitih, ki je kodirana z genom KX na kromosomu X. Antigeni sistema Kell so rezultat genskega zapisa na 7. kromosomu. 2,5 baznih parov sekvenca napoveduje 732 AK protein. Antigen K veže atome cinka, je encim iz družine Zn-metaloproteaz, substrat pa je še neznan. Antigen K uniči delovanje sulfidrilnih reagentov kot so ditiotreitol (DTT), glicin-HCl-EDTA, ZZAP-mešanica DTT in papaina. Antigen K je prisoten že na fetalnih eritrociotih v 11. tednu nosečnosti. Antigen K je prisoten pri 9 % populacije, njegov alelni produkt k (Cellano) pa pri 99,8 %. Antigen K je močno imunogen. Protitelesa anti-K so ponavadi razreda IgG, redko razreda IgM. Nastanek anti-K protiteles sproži transfuzija Kell pozitivne krvi pacientu, ki antigena K nima ali pa pride do senzibilizacije v nosečnosti, ko Kell negativna mati nosi Kell pozitivnega otroka. Anti-K protitelesa so pogosta, povzročajo hemolitično transfuzijsko reakcijo in hemolitično bolezen ploda in novorojenčka. Anti-k so klinično in serološko pomembna kot anti-K, vendar so redkejša, ob njihovi prisotnosti pa je težje najti kri za transfuzijo, saj je samo 1 oseba od 500 k (Cellano) negativna (homozigot KK) (7).

1.3. Protitelesa Ob transfuziji krvi lahko oseba prejme tuje eritrocite z antigeni, ki jih sama nima, zato lahko proti njim tvori protitelesa, kar imenujemo alosenzibilizacija (7). Ob ponovni transfuziji eritrocitov z enakimi antigeni lahko protitelesa z njimi reagirajo in pride do hemolitične transfuzijske reakcije, življenjska doba eritrocitov se skrajša (3). Do senzibilizacije lahko pride tudi pri ženskah v času nosečnosti ali poroda zaradi fetomaternalne krvavitve (eritrociti plodu lahko nosijo dominantno izražene očetove

12


krvnoskupinske antigene), posledica tega pa je hemolitična bolezen ploda in novorojenčka (3). Materina protitelesa prehajajo preko plancete v otroka, se vežejo z antigeni na otrokovih eritrocitih in skrajšajo njihovo življenjsko dobo. Obolenje se lahko prične že intrauterino in lahko povzroči smrt plodu ali novorojenčka. V krvi dajalcev ugotavljamo nepričakovana eritrocitna protitelesa, da preprečimo njihov pasivni vnos v pacienta in s tem možnost hemolitične transfuzijske reakcije. S testiranjem pri pacientu pa želimo odkriti vsa klinično pomembna protitelesa. To so tista, ki reagirajo pri 37C in imajo sposobnost uničenja transfundiranih eritrocitov, na katerih je prisoten odgovarjajoči antigen. Kadar tako protitelo odkrijemo, moramo ugotoviti njegovo specifičnost s poznanimi eritrociti z določenimi kombinacijami najpomembnejših antigenov (specifikacija protiteles). AB0 je edini sistem, v katerem so protitelesa konstantno in predvidljivo prisotna v serumu večine ljudi, čeprav niso bili izpostavljeni humanim eritrocitom. Protitelesa AB0 nastanejo kot imunski odziv na AB0-podobne antigene iz okolja. Bakterije s podobnimi antigeni so zelo razširjene v okolju, njihova prisotnost v flori prebavil, prahu, hrani in drugih agensih pa zagotavlja konstantno izpostavljenost oseb A– in B– podobnim antigenom (7). Protitelesa Rh niso normalno prisotna v serumu, kot je to pri sistemu krvnih skupin AB0. Ponavadi so posledica predhodne senzibilizacije organizma s temi antigeni (transfuzija, nosečnost) (5,6). Več kot 80 % RhD–negativnih pacientov po transfuziji 1 komponente RhD pozitivnih koncentriranih eritrocitov tvori protitelesa anti–D (7). Protitelesa sistema Rh so večinoma razreda IgG in ne vežejo komplementa. Za hudo obliko hemolitično bolezen ploda in novorojenčka so najpogosteje odgovorna protitelesa anti–D. Poleg teh lahko povzročijo hemolitično bolezen ploda in novorojenčka še številna druga protitelesa; najpogosteje so to protitelesa specifičnosti anti–A, anti–B, sledijo anti–K, anti–c, anti–E, in anti–C protitelesa. Zmerno hemolitično bolezen ploda in novorojenčka lahko povzročajo tudi protitelesa anti–e, anti–k, anti–Cw, anti-Fya, anti–Jka. Protitelesa, ki ponavadi ne povzročijo hemolitično bolezen ploda in novorojenčka, so anti-Lea, anti–Leb, anti–Lua, anti–Lub , anti–P, anti–N, anti–Xg (7). Resnost hemolitično bolezen ploda in novorojenčka je odvisna od specifičnosti, agresivnosti in koncentracije vpletenih protiteles. Povzročijo jo lahko številna protitelesa razreda IgG, reaktivna na 37C, ki prehajajo posteljico. Večina senzibilizacij Kell pri nosečnicah je posledica transfuzije eritrocitov K-pozitivnih dajalcev krvi. Za njihovo preprečevanje so se v nekaterih razvitih državah (Anglija, Nemčija, Nizozemska, Avstrija in Francija) odločili za rutinske transfuzije ne le AB0 in RhD skladnih eritrocitov, ampak tudi Kell skladnih eritrocitov vsaj deklicam in ženskam v rodni dobi, pa tudi ostalim pacientom (9). Na ZTM smo pri dajalcih krvi dne 13.12.2006 uvedli obvezno ugotavljanje antigena K pri prvih štirih odvzemih in obvezno ugotavljanje fenotipa Rh pri prvih dveh odvzemih. Z 16.12.2007 pa smo začeli izdajati Kell skladno kri vsem pacientom. Število senzibiliziranih pacientov se veča. K temu prispeva tako tehnika dela, povečano število transfuzij, kot tudi obseg predtransfuzijskega testiranja (Graf 1) (10).

13


0

50

100

150

200

250

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Graf 1: Skupno število imunizacij od 1999 do 2006 na ZTM Po podatkih iz literature do 20 % pacientov, ki so prejemali transfuzije, razvije klinično pomembna protitelesa proti eritrocitnim antigenom. Anti–E. Anti–D in anti–K so najpogosteje prisotna protitelesa, sledita anti-C, anti-M, anti-Fya in anti-Jka. Porast senzibilizacije beležimo na ZTM (Preglednica V) (10), pa tudi v Splošni Bolnišnici Maribor so v zadnjih 5 letih ugotovili porast senzibilizacij zlasti v krvoskupinskem sistemu Kell in Rh (Graf 2 ) (11). Preglednica V: Število imunizacij Kell in Rh od 1999 do 2006 na ZTM

Število imunizacij

IMUNIZACIJA 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 Skupaj

anti-K 35 33 34 34 31 21 50 32 270

anti-E 55 42 48 60 59 40 57 43 404

anti-c 8 12 11 13 18 8 13 8 91

anti-e 1 1 1 3 4 7 3 4 24

anti-D 16 11 11 11 17 9 32 21 128

anti-C 16 15 17 22 16 14 17 17 134

anti-Cw 5 11 6 11 11 14 21 18 97

Skupaj 136 125 128 154 156 113 193 143 1148

14


0

5

10

15

20

Anti-D

Anti-E

Anti-C

Anti-c

Anti-K

Anti-M

Anti-Jk

a

Anti-F

ya

Ostala

Leto 2000 Leto 2005

Graf 2: Primerjava ugotavljanja protiteles v letih 2000 in 2005 v Splošni Bolnišnici Maribor V Splošni bolnišnici Izola so v zadnjih 10 letih ugotovili največ protiteles iz krvne skupine Rh (anti-D 20,5 %, anti-C 7,6 %, anti-E 21,5 %, anti-c 4,7 %, anti-e 0,5 % in anti-Cw 2,1 %) in krvne skupine Kell (anti-K 20,5 %), medtem ko so ostala protitelesa redkeje zastopana (anti-Fya 4,5 %, anti-M 4,5 %, anti-Jka 3,4 %, anti-S 2,3 %, anti-Lua 1,8 % in anti-Lea 1,8 %. Protitelesa iz krvne skupine Rh so prisotna kar v 56,9 % vseh ugotovljenih protiteles, če pa prištejemo še anti-K, predstavljajo dobre ¾ vseh najdenih protiteles (77,4 %) (12). Na Strokovnem svetu ZTM februarja 2005 so bile podane indikacije za uporabo eritrocitov skladnih v antigenih K in/ali CcEe. Obligatorno naj bi se izdajale antigensko negativne enote eritrocitov senzibiliziranim pacientom. Kell negativnim deklicam in Kell negativnim ženskam v rodni dobi naj bi se izdajali Kell negativne enote eritrocitov, ter vse enote eritrocitov za intrauterine transfuzije naj bi bile Kell negativne. Priporoča se transfuzije eritrocitnih enot skladnih v antigenih K in/ali v CcEe pri pacientih z avtoimunsko hemolitično anemijo, aloimuniziranih pacientih, predvsem tisti s protitelesi Rh, kronično transfundirani pacienti (hemato–onkološki pacienti, dializni pacienti,…) in pri bolnih otrocih. Priporočeno je bilo, da bi deklice in ženske v rodni dobi prejemale eritrocitne enote skladne tudi v antigenih CcEe (10). V Veliki Britaniji so pri dajalcih krvi že leta 2002 pri vsakem prvem odvzemu dvakrat ugotovili antigene K, C, c, E in e. Rezultati testiranja so natisnili na nalepko komponente krvi. Pri vsakemu naslednjemu odvzemu krvi so ponovno ugotovili antigene K, C, c, E in e (13). Leta 2002 je bilo v Franciji 75 % transfundiranih enot eritrocitov tipiziranih na prisotnost antigenov AB0, RhD, K in CcEe (10). V Nemčiji so leta 2000 pri vsakem prvem in pri vsakem drugem odvzemu krvi dajalca ugotovili tudi antigene K, C, c, E in e ter rezultate primerjali med seboj (14). Na Nizozemskem prvič odvzamejo dajalcu krvi le vzorec in v vzorcu ugotovijo poleg krvne skupine AB0 RhD tudi antigene K in CcEe. Pri naslednjem odvzemu ponovno ugotovijo KS AB0 RhD ter antigene K, C, c, E in e, rezultate primerjajo z rezultati prvega vzorca. Rezultate testiranj krvnih skupin AB0 RhD,

15


K in CcEe označijo na vrečko komponente krvi. V ZDA dajalci krvi niso testirani v antigenu K in fenotipu Rh (10). Na ZTM smo do leta 2006 ugotavljali antigen K in fenotip Rh izvajali ročno v epruveti. Antigem K smo testirali pri vsakem odvzemu, fenotip Rh pa le pri RhD negativnih dajalcih in pri nekaterih naključno izbranih RhD pozitivnih dajalcih (Graf 3).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

K k C c E e

Antigen

% te

stir

anih

daj

alce

v

Leto 2003 Leto 2004

Graf 3: Delež testiranih dajalcev za posamezni antigen v letu 2003 in v letu 2004 na ZTM

1.4. Aglutinacija eritrocitov Aglutinacijo je prvi opisal leta 1869 študent medicine Adolf Creite v Gottingenu, ki je opisal, »da serumski proteini lahko zlepijo ali razkrojijo tuje eritrocite«. To opažanje je poglobil njegov rojak Leonard Landois, ki je leta 1875 natančneje opisal pojav lize ter aglutinacije celic, dokončno pa je aglutinacijo razložil, ter jo kot diagnostično metodo uveljavil Karel Landsteiner (15). Reakcija protiteles z antigenom lahko da vrsto opazljivih rezultatov, od katerih v serologiji krvnih skupin najpogosteje opazujemo aglutinacijo, hemolizo in precipitacijo. Aglutinacija je s protitelesi povzročeno združevanje delcev, ki na svoji površini izražajo ustrezen antigen. Do aglutinacije pride zaradi vezave molekul protiteles na antigenske determinante dveh ali več sosednjih eritrocitov, kar jih združi v vidne skupke – aglutinate. Aglutinacija je končni rezultat večine preiskav ugotavljanja eritrocitnih antigenov in je ponavadi vidna z prostim očesom, zaradi česar je še po več kot sto letih od odkritja zelo uporabna kot imunohematološka metoda (7). Aglutinacije povzročijo protitelesa razredov IgG, IgM in IgA, vendar je količina protiteles razreda IgA krvnega sistema ABO zanemarljiva (13). Aglutinacijo eritrocitov zaradi lažjega razumevanja razdelimo v dve stopnji. Prva stopnja predstavlja vezavo protitelesa na antigen na površini eritrocita in jo imenujemo senzibilizacija. Sile, ki povezujejo antigen in protitelo, so v splošnem šibke kemične vezi in delujejo samo na kratko razdaljo. Kombinacija antigen – protitelo je reverzibilna, naključne povezave se nenehno

16


vzpostavljajo in prekinjajo, dokler ne pride do ravnovesja. Ravnotežnostna ali afinitetna konstanta (Ko) odraža stopnjo prileganja med antigenom in protitelesom, ter količino in hitrost vezave. Protitelesa z večjo Ko so klinično bolj pomembna (7). V drugi stopnji, ki jo imenujemo aglutinacija, pride do nastanka mostov med senzibiliziranimi eritrociti, pri čemer izstopijo skupki različnih oblik in velikosti, ki jih imenujemo aglutinati. Obe fazi potekata hkrati. Na stopnjo senzibilizacije vpliva razmerje med koncentracijama antigena in protitelesa, pH, ionska jakost, temperatura, čas inkubacije (7). Na stopnjo aglutinacije vplivajo lastnosti medija, kot so višja ionska jakost medija in prisotnost albumina v mediju, ter značaj antigenov in protiteles. Z encimsko obdelavo eritrocita lahko odstranimo negativni naboj, ki je na površini in s tem omogočimo, da se eritrociti zbližajo, kar pospeši nastanek aglutinacije (16). Proteolitični encimi odstranijo negativno nabite površinske glikoproteine. Molekulam protitelesa omogočijo pristop do antigenskih mest, ki so sicer nedosegljiva. Najpogosteje uporabljeni encimi so papain, bromelin, tripsin in ficin. Encimi povečajo reaktivnost z nekaterimi protitelesi (Kidd, Lewis, sistem Rh), nekaterih protiteles (MNS in Fy) pa z encimi ne odkrijemo (7). Aglutinacijo lahko ojačamo tudi z centrifugiranjem ali z magnetizacijo eritrocitov. Raztopina z nizko ionsko jakostjo (Liss) zelo poveča hitrost senzibilizacije eritrocitov s protitelesi v primerjavi s fiziološko raztopino (7). Leta 1945 so Coombs, Mourant in Race opisali postopek zaznavanje vezave protiteles, ki niso povzročale aglutinacije. Uporabili so premostitev s protitelesom proti človeškim humanim globulinom, ki ga poznamo kot antihumani globulinski test (AHG) ali Coombsov test. Molekula imunoglobulina anti–IgG se specifično povezuje z fragmentom Fc senzibilizirajoče molekule protitelesa, ne pa s katerim koli drugim epitopom na eritrocitu. Dve mesti Fab na molekuli anti–IgG tvorita mostiček med bližnjimi s protitelesi pokritimi celicami in naredijo aglutinacijo vidno (7). Metoda aglutinacije se uporablja predvsem za ugotavljanje krvnih skupin, pri indirektnem in direktnem Coombsovem testu, za ugotavljanje eritrocitnih protiteles, za ugotavljanje specifičnosti eritrocitnih protiteles, za ugotavljanja obsega fetomaternalne krvavitve ter pri navzkrižnem preizkusu. Za ugotavljanje antigenov uporabljamo testne reagente, ki vsebujejo poznana protitelesa proti posameznim eritrocitnim antigenom, za ugotavljanje protiteles pa uporabljamo znane eritrocitne panele. V našem laboratoriju uporabljamo tehniko aglutinacije pri dajalcih krvi za pravilno ugotavljanje krvne skupine AB0 in RhD, ugotavljanje nepričakovanih eritrocitnih protiteles ter za ugotavljanje antigenov K, k, C, c, E in e.

1.4.1. Aglutinacija na ploščici Prva testiranja krvnih skupin AB0 in prve navzkrižne preizkuse so izvajali na steklenih ploščicah, kasneje pa tudi na papirnatih in plastičnih ploščicah. Steklene ploščice so lahko tudi greli, s tem so zagotovili ustrezne pogoje. Rezultat reakcije med eritrocitnimi antigeni in protitelesi je lahko aglutinacija ali hemoliza, saj je v eritrocitni mešanici prisoten tudi komplement. Danes se tehnika aglutinacije na ploščici uporablja za orientacijsko ugotavljanje krvnih skupin AB0 in RhD (17).

17


1.4.2. Aglutinacija v epruveti Serološko testiranje eritrocitnih antigenov in protiteles se največkrat izvaja v steklenih ali plastičnih epruvetah z uporabo diagnostičnih reagentov. Hemoliza in aglutinacija predstavljata končno fazo reakcije med antigeni in protitelesi. Tehnika v epruvetah je uporabna za enostavne aglutinacijske teste, kot tudi za ojačitvene tehnike z AHG. Za ocenjevanje reakcije je potreben standarden vir ali optični pripomoček (konkavno ogledalo). Po obarvanosti supernatanta ocenimo, ali je prišlo do hemolize, aglutinacijo ocenjujemo po pretresanju eritrocitov v epruveti. Jakost reakcije ocenimo po resuspenziji vseh eritrocitov z vrednostjo od 1 + do 4 + (1 + po pretresanju epruvete so vidni drobni aglutinati, 4 + po pretresanju ostane v epruveti velik aglutinat, ki se ne razbije). Premočno pretresanje lahko povzroči razpad aglutinatov in lažno negativno reakcijo (17).

1.4.3. Aglutinacija na mikrotitrski ploščici Antiglobulinsko testiranje na mikrotitrskih ploščicah sta prva opisala Wegmann in Smithies (1966). Prednosti tega testa sta večja občutljivost in poraba majhnih količin reagentov in vzorcev (3). Mikrotitrska ploščica je pomanjšana kompaktna oblika 96 epruvet, združenih v 12 stolpičev in 8 vrstic. Tehnika aglutinacije na mikrotitrski ploščici je zelo primerljiva s tehniko testiranja v epruveti. Uporabniku omogoča avtomatiziran proces testiranja in interpretacije rezultatov in je dobrodošla, kadar testiramo večje število vzorcev (dajalci krvi). Mikrotitrsko ploščico pred uporabo operemo v detergentu Tween, kateri zmanjšuje površinsko napetost in s tem preprečimo vezavo eritrocitov na stene mikroepruvet na miktotitrski ploščici. Uporaba mikrotitrske ploščice za imunohematološke preiskave je povzročila velik napredek tudi v razvoju laboratorijskih robotov. Laboratorijski roboti izvedejo vse korake v testnem procesu od pipetiranja, odčitavanja črtnih kod vzorcev krvi in reagentov do avtomatske interpretacije rezultatov. Ti testni sistemi dovoljujejo opravljanje multiplih testov. Sistem kontrolira računalniški program, pozitivno identiteto vzorca zagotovijo s tehnologijo črtne kode. Računalnik je lahko integriran v laboratorijski informacijski sistem za poročanje rezultatov. Prvi popolnoma avtomatiziran laboratorijski robot za aglutinacijske preiskave na mikroploščah je predstavilo podjetje Olympus leta 1985. Kar nekaj svetovnih podjetij s področja transfuzijske medicine je kasneje razvilo polavtomatske laboratorijske robote, ki izvajajo aglutinacijske preiskave na mikroploščah (npr. firme: Hamilton, Tecan, Immucor, Biotest, Kembel, DiaMed). V našem laboratoriju robota Tecan Genesis RSP 200 in Tecan RSP 8051-ID pipetirata reagente in vzorce krvi na mikrotitrsko ploščico za ugotavljanje KS AB0 in RhD (Slika 1). Za ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh želimo začeti uporabljati mikrotitrske ploščice Biotest, na katerih so že liofilizirani reagenti. Podjetje Biotest ima različne mikrotitrske ploščice, kjer so v vsaki epruveti določena protitelesa, zato ni potrebno dodajanje reagentov in s tem je olajšana izvedba aglutinacijske preiskave. Rezultate lahko interpretiramo tudi s čitalcem Tecan SLT Spectra, kar omogoči delno avtomatizacijo postopka.

18


Slika 1: Robot Tecan RSP 8051-ID

1.4.4. Tehnika kolonske aglutinacije Razvile so se različne metode, pri katerih eritrocite filtriramo skozi stolpec, ki vsebuje medij, kjer se izbrane eritrocitne populacije ločijo. Običajno prostor na vrhu vsakega stolpca porabimo za eritrocite ali za inkubacijo eritrocitov in seruma ali plazme. Ko celica potuje skozi stolpec (običajno pri centrifugiranju), medij v stolpcu na osnovi velikosti agregatov ločuje aglutinirane od neaglutiniranih eritrocitov. Pri nekaterih testih lahko v sam medij stolpca vključimo specifični antiserum ali proteine. Celice, ki nosijo specifični antigen, se selektivno ujamejo, ko potujejo skozi medij. Pri negativnih kolonskih testih testne celice padejo na dnu stolpca. Pri pozitivnih testih se celice ujamejo na vrh ali znotraj telesa stolpca (7). Aglutinacijski test v gelu in na mikrokroglicah sta mikro aglutinacijski metodi z vnaprej pripravljenimi reagenti, vključenimi v plastične kartice, ki nam zagotavlja hitro, občutljivo in za izvajalca varno metodo testiranja. Omogoča vse oblike aglutinacijskih testov, vključno z antiglobulinsko tehniko. Metodi zahtevata nabavo standardiziranih reagentov in opreme. Metodi posebej oblikujeta dobra občutljivost za klinično pomembna protitelesa, šibke antigene in dvojne populacije eritrocitov. Za testiranje potrebujemo manjši vzorec krvi, omogoča pa tudi avtomatizacijo imunohematoloških preiskav. Ti dve tehniki sta v veliki meri nadomestila klasično tehniko testiranja v epruvetah, ker sta občutljivejši, ponovljivi in uporabni (7). Podjetje DiaMed je razvilo gelsko kartico sestavljeno iz šestih mini epruvet. Vsaka mini epruveta že vsebuje določena protitelesa (za določeno preiskavo). Pri uporabi gelskih kartic je enostavna interpretacija in arhiviranje rezultatov, rezultate pa lahko interpretiramo tudi s čitalcem ID–Reader SA, kar omogoči avtomatizacijo postopka.

19


1.5. Informacijski sistem Posledica napake v transfuzijskem laboratoriju je lahko ta, da dobi pacient AB0 neskladno transfuzijo, kar lahko povzroči akutno hemolitično reakcijo in v najslabšem primeru takojšno smrt. Teoretična verjetnost, da pride do take napake, je trenutno tudi v sodobno urejenih sistemih še vedno večja, kot je seštevek skupnih verjetnosti, da bi s transfuzijo prenesli pacientu virus HIV, humani T–celični limfotropni virus, virus hepatitisa B ali virus hepatitisa C (18). Z uvedbo laboratorijskih robotov in s tem avtomatizacije, ter z vpeljavo informacijskega sistema v laboratorij lahko dosežemo zmanjšanje napak v transfuzijskem laboratoriju. Največja izboljšava na področju varnosti transfuzije je vsekakor uvedba mrežnega informacijskega sistema in avtomatizacija laboratorijskih postopkov. Nacionalni informacijski sistem v Slovenski transfuziologiji povezuje Zavod RS za transfuzijsko medicino z Oddelki za transfuzijsko medicino ter organizacijo Rdeči križ Slovenije. Za natančno in varno izvajanje transfuzijske dejavnosti je pomemben informacijski sistem. S tem namenom so na Zavodu RS za transfuzijsko medicino zasnovali informacijski sistem v transfuziologiji, ki se imenuje DATEC. Kasneje so računalniško aplikacijo razširili s paketom za podporo zunanjih laboratorijskih storitev, ki so ga poimenovali LAST. Informacijski sistem je računalniško odprt za povezovanje z drugimi informacijskimi sistemi, vendar obstaja sistem zaščite, ki preprečuje nepooblaščen dostop do podatkov. V pripravi je posodobitev obstoječega informacijskega sistema, ki vključuje stalno in direktno računalniško povezavo slovenskih transfuzijskih ustanov s centralnim vozliščem na Zavodu RS za transfuzijsko medicino, z bolnišničnim informacijskim sistemom in Rdečim križem. V posodobitev je vključena tudi uvedba kakovosti, povezava z laboratorijskimi roboti, telekonzultacije in podpora vseh novosti, ki jih narekuje stroka ter evropska zakonodaja. DATEC je informacijski sistem za spremljanje, nadzor in izvajanje kontrol pri delovnem procesu v transfuziologiji. Informacijski sistem v transfuziološkem laboratoriju nudi računalniško podporo pri izvajanju laboratorijskih storitev in navzkrižnih preizkusov. Delo na Oseku za imunohematološko testiranje dajalcev krvi računalniško podpira projekt »Kri«. Laboratorijski rezultati se vključujejo v arhiv laboratorijskih preiskav. Robota Tecan Genesis RSP 200 in Tecan RSP 8051-ID pipetirata reagente in vzorce krvi na mikrotitrsko ploščico za ugotavljanje krvnih skupin AB0 in RhD. Robot Tecan Genesis RSP 200 pa pipetira tudi vzorce krvi na gelske kartice DiaMed Liss/Coombs, Anti-D in AB0RhD + reverse group. Podatki se prenesejo iz robotov v čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in čitalec gelskih kartic DiaMed ID–Reader SA. Čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra je že povezan z hišnim informacijskim sistemom DATEC. Rezultati prvega in drugega testiranja krvnih skupin na mikrotitrski ploščici se avtomatsko vpišejo v informacijski sistem DATEC (Slika 2).

20


TecanRSP 8051 - ID

TecanGenesisRSP 200

ID ReaderSA

Tiskalnik

IS DATEC

Tiskalnik

Medusa

Tecan SLT Spectra

Tiskalnik

Slika 2: Shema računalniške povezave na Odseku za imunohematološko testiranje dajalcev krvi

21


2. NAMEN DELA Leta 1989 so na Zavodu RS za transfuzijsko medicino začeli uporabljati polavtomatzirane metode za odčitavanje rezultatov aglutinacije na mikrotitrski ploščici, po letu 1995 pa so s pomočjo robota Tecan RSP 8051 ID začeli določati krvne skupine ABO in RhD pri dajalcih krvi na mikrotitrski ploščici. Ker se povečuje potreba po izdaji skladne krvi tudi v ostalih eritrocitnih antigenih, je nujno potrebno, da imajo eritrocitne komponente določene poleg krvne skupine ABO in RhD tudi antigene K, C, c, E in e. Namen našega dela je, da v rutinsko delo uvedemo avtomatizirano ugotavljanje antigenov K, C, c, E in e pri dajalcih krvi. Z uvedbo rutinskega avtomatiziranega ugotavljanja fenotipa Rh pri dajalcih krvi bi bila hitrejša odzivnost pri iskanju antigen negativne krvi za senzibilizirane paciente. Z uvedbo dveh različnih metod ugotavljanja antigena K pri dajalcih pa bi pripravili enote krvi za izdajo Kell skladne krvi za vse paciente. V prvem delu naloge nameravamo izbrati primerno metodo ugotavljanja fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici. Primerjali bomo izvedbo testa na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single in na mikrotitrski ploščici, katere bomo sami nakapljali z reagenti Ecoclone. Rezultate bomo primerjali z rezultati ugotavljanja fenotipa Rh v epruveti z reagenti Ecoclone po metodi, ki se uporablja v rutini. V drugem delu bomo za potrebe izdaje antigensko skladne krvi uvedli dve novi metodi ugotavljanja antigena K. Vzorce krvi bomo pipetirali na mikrotitrsko ploščico Biotest Erytype Rh+K 16-single s pomočjo robota Tecan RSP 8051-ID in na monoklonsko gelsko kartico DiaMed DiaClon Anti-K s pomočjo robota Tecan Genesis RSP 200. Ugotavljali bomo pravilnost interpretacije rezultatov z laboratorijskim čitalcem mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in čitalcem gelskih kartic ID-Reader SA. Rezultate testiranja na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single bomo primerjali z rezultati ročnega testiranja in s prostim očesom interpretiranega rezultata ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone. V tretjem delu bomo preverili zanesljivost prenosa podatkov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e v informacijski sistem DATEC. Preverjali bomo, ali so rezultati med seboj primerljivi ter ali računalniški sistem opozori na morebitno neskladje. Rezultati ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e bodo po prenosu v informacijski sistem DATEC vezani na številke krvi in na matične številke dajalcev krvi. Vsi preneseni podatki morajo biti popolnoma identični. Čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra je že povezan z informacijskim sistemom DATEC, medtem ko bo potrebno čitalec gelskih kartic ID–Reader SA smiselno povezati z obstoječim hišnim informacijskim sistemom DATEC.

22


3. MATERIALI IN METODE

3.1. Materiali

Kodne številke za mikrotitrsko pločico z oznako »Fenotip Rh« in z oznako »EryRhK« (AVE, Rogaška Slatina, Slovenija)

Mikrotitrska ploščica z U dnom Mikrotitrska ploščica za pripravo suspenzije eritrocitov Stojala za epruvete Stojala za reagente PVC epruvete PVC posodice PVC pipeta

te (DiaMed, Cressier, Švica) Polavtomatske pipe Nastavki za pipete

porabo Lateks rokavice za enkratno u Posoda za odpadno tekočino Posoda za infektivne odpadke Čistilni robčki

a ploščica Biotest Erytype S Rh–Pheno single (Biotest, Dreieich,

) ica)

ed, Cressier, Švica)

mčija)

ica)

rvaška) rich, St. Louis, ZDA)

Čistilna raztopina Tecan set–up clean (Tecan AG, Hombrechtikon, Švica)

.2. R3 eagenti

MikrotitrskNemčija)

Mikrotitrska ploščica Biotest Erytype Rh+K 16–single (Biotest, Dreieich, Nemčija Monoklonska gelska kartica DiaMed DiaClon Anti–K (DiaMed, Cressier, Šv Humana gelska kartica DiaMed RhD+Phenotype (DiaM Reagent Ecoclone anti–C (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Reagent Ecoclone anti–c (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Reagent Ecoclone anti–E (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Reagent Ecoclone anti–e (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Reagent Ecoclone anti–K (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Bromelin Biotest (Biotest, Dreieich, Ne Bromelin (ZTM, Ljubljana, Slovenija) Diluent 1 (bromelin) (DiaMed, Cressier, Šv Diluent 2 (liss) (DiaMed, Cressier, Švica) 0,9 % raztopina natrijevega klorida (fiziološka raztopina) (Pliva, Zagreb, H Tween (Sigma Ald Destilirana voda Čistilna raztopina Natrijev hipokloridbljana, Slovenija)

23


3.3. Oprema

Laboratorijski robot Tecan Genesis RSP 200 z računalniškim programom Logic (Tecan AG, Hombrechtikon, Švica)

Laboratorijski robot Tecan RSP 8051–ID z računalniškim programom BloodTyper (Tecan AG, Hombrechtikon, Švica)

Osebni računalnik z računalniškim programom Medusa, ki upravlja delovanje čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra (Tecan AG, Hombrechtikon, Švica)

Osebni računalnik z računalniškim programom Maestro verzija 2.08, ki upravlja delovanje čitalca gelskih kartic ID–Reader SA (DiaMed, Cressier, Švica)

Hišni informacijski sistem DATEC Tiskalnik HP LASERJET 1320N (Hewlett-Packard Company, Tajska) Stresalec za mikrotitrske ploščice (Biotest, Dreieich, Nemčija) Laboratorijska centrifuga PLC–322 z nosilcem za mikrotitrske ploščice (Tehtnica,

Železniki, Slovenija) Laboratorijska centrifuga z nosilcem za epruvete (Eppendorf AG, Hamburg,

Nemčija) Laboratorijska centrifuga za gelske kartice (DiaMed, Cressier, Švica) Vodna kopel (GFL, Grobburwedel, Nemčija) Inkubator (37 C) (Ehret, Emmendingen, Nemčija)

3.4. Biološki vzorci Kot biološke vzorce smo uporabili vensko kri dajalcev, odvzeto v monovette z antikoagulantom EDTA. Vzorci krvi dajalcev so bili označeni samo z številko odvzema in črtno kodo. Uporabili smo 4524 vzorcev dajalcev, za katere so bili antigeni K, C, c, E in e že rutinsko določeni v epruveti, torej je šlo za podvojitev običajnega testiranja. Skupno smo pri 4524 dajalcih primerjalno ugotovili 18696 antigenov.

3.5. Postopki

3.5.1.Ugotavljanje fenotipa Rh v epruveti Antigene C, c, E in e smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Iz računalniškega izpisa smo izbrali vzorce krvi, kateri še niso imeli ugotovljenega fenotipa Rh. Izbranim vzorcem krvi smo pripravili eritrocitne suspenzije tako, da smo 50 L koncentriranih eritrocitov dodali 2,5 mL fiziološke raztopine. Za vsak vzorec krvi smo označili 4 plastične epruvete z ustreznim antigenom (C, c, E, e). V vsako označeno epruveto smo pipetirali 50 L testnega reagenta Ecoclone anti–C, anti–c, anti–E ali anti–e in dodali 50 L eritrocitne suspenzije vzorcev (Slika 3). Stojala z nakapljanimi epruvetami smo pretresli in inkubirali v vodni kopeli (37C) 5 minut ali v inkubatorju (37C) 10 minut. Po končani inkubaciji smo epruvete centrifugirali 1 min pri 800 x g. Vsebino epruvet smo nežno pretresli in makroskopsko odčitali rezultate. Pozitiven rezultat je bil, ko je bila prisotna aglutinacija. Če pa je bila vsebina epruvete homogena, rožnata in

24


ni bilo prisotne aglutinacije, je bil rezultat negativen. Rezultate ugotavljanja antigenov C, c, E in e testiranih vzorcev smo vpisali v Celični panel informacijskega sistema DATEC.

Slika 3: Ugotavljanje fenotipa Rh v epruveti

3.5.2.Ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi reagenti Antigene C, c, E in e smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Metodo ugotavljanja fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici smo izvedli s pomočjo laboratorijskega robota Tecan Genesis RSP 200, čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in PC z računalniškim programom Medusa. Ena mikrotitrska ploščica Biotest Erytype S Rh–Pheno single je zadostovala za preiskave 24 vzorcev (Slika 4).

Slika 4: Mikrotitrska ploščica Biotest Erytype Rh+K 16-single Glede na število vzorcev smo iz hladilnika vzeli mikrotitrske ploščice Biotest Erytype S Rh–Pheno single. Mikrotitrskim ploščicam smo previdno odstranili zaščitno alufolijo, jih razporedili na ravno podlago in pustili na sobni temperaturi vsaj 30 minut. V alufolijo zaščitene mikrotitrske ploščice Biotest shranjujemo na temperaturi 2 – 8 C do roka uporabnosti. Po odstranitvi zaščitene folije je bilo potrebno mikrotitrsko ploščico uporabiti v 24 urah. Vzorce, odvzete v monovette z antikoagulantom EDTA, smo pred uporabo centrifugirali 10 minut pri 800 x g. Na robotu Tecan Genesis RSP 200 smo v računalniškem programu »Logic« izbrali metodo »ERYTYPE S Rh Pheno«. Mikrotitrske ploščice Biotest Erytype S Rh–Pheno single smo označili z zaporedno številko in z črtno

25


kodo »Fenotip Rh«. Za pripravo 1 % eritrocitne suspenzije je robot Tecan Genesis RSP 200 uporabil fiziološko raztopino z bromelinom Biotest in koncentrirane eritrocite vzorca v razmerju 1 : 20. Po končanem pipetiranju vzorcev na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh–Pheno single so se podatki kodnih številk vzorcev in mikrotitrskih ploščic avtomatsko prenesli v PC računalnika čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra. Napipetirane mikrotitrske ploščice smo stresali na stresalcu 2 minuti in inkubirali 10 minut na sobni temperaturi. Po inkubaciji smo mikrotitrske ploščice centrifugirali 1 minuto pri 590 x g. Pred vrednotenjem rezultatov v čitalcu Tecan SLT Spectra smo mikrotitrske ploščice ponovno stresali na stresalcu toliko časa, da na dnu mikroepruvet ni bilo usedlin (cca 2 minuti) (Slika 5). Vizuelno smo preverili aglutinate in po potrebi z ročnim tresenjem aglutinate stresli v sredino mikroepruvete. Prisotnost ali odsotnost aglutinacije na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh–Pheno single smo ovrednotili s pomočjo čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra.

Slika 5: Stresanje mikrotitrskih ploščic na stresalcu V primeru, da robot ni nakapljal eritrocitne suspenzije, smo ročno pripravili 1 % suspenzijo eritrocitov dajalca. Po 1 kapljico (50 L) eritrocitne suspenuije dajalca smo ročno pipetirali na mikrotitrsko ploščico, glede na mesto, kjer eritrocitne suspenzije robot Tecan Genesis RSP 200 ni pipetiral. Za kontrolne vzorce smo uporabili vzorce krvi dajalcev, kateri so že imeli določeni fenotip Rh (Preglednica VI). Preglednica VI: Fenotip Rh vzorcev uporabljenih za pozitivno in negativno kontrolo

Specifični reagent Pozitivna kontrola Negatina kontrola

Anti-C DCce, DCe DcEe, DcE, ce

Anti-c DCce, DcEe, DcE, ce DCe

Anti-E DcEe, DcE DCce, Dce, ce

Anti-e DCce, DcEe,Dce, ce DcE

26


Po testiranju fenotipa Rh na mikrotitrskih ploščicah smo rezultate primerjali z rezultati, kateri so bili testirani v epruveti in ročno vpisani v Celični panel informacijskega sistema DATEC. V primeru neskladja smo vzorec razširjeno testirali na humani gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype.

3.5.3.Ugotavljanje fenotipa Rh na prazni mikrotitrski ploščici Antigene C, c, E in e smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Reagente Ecoclone Anti–C, Anti–c, Anti–E in Anti–e, katere uporabljamo za ugotavljanje antigenov C, c, E in e v epruveti, smo po 50 l ročno pipetirali na prazne mikrotitrske ploščice (Slika 6). Prazne mikrotitrske ploščice so bile pred uporabo oprane z 0,1 % Tweenom, kateri prepreči lepljenje eritrocitov na stene mikroepruvet. Mikrotitrske ploščice z reagenti Ecoclone smo do uporabe zamrznili.

Slika 6: Reagenti Ecoclone Eritrocitne suspenzije vzorcev je pipetiral robot Tecan Genesis RSP 200 po metodi »Erytype S Rh Pheno«. Ena mikrotitrska ploščica z reagenti Ecoclone je zadostovala za preiskave 24 vzorcev. Glede na število vzorcev smo iz zamrzovalnika vzeli mikrotitrske ploščice z reagenti Eoclone. Mikrotitrske ploščice smo razporedili na ravno podlago in pustili na sobni temperaturi vsaj 30 min. Vzorce, odvzete v monovette z antikoagulantom EDTA, smo pred uporabo centrifugirali 10 minut pri 800 x g. Na robotu Tecan Genesis RSP 200 smo v računalniškem programu »Logic« izbrali metodo »ERYTYPE S Rh Pheno« (Slika 7). Mikrotitrske ploščice z reagenti Ecoclone smo označili z zaporedno številko in z črtno kodo »Fenotip Rh«. Za pripravo 1 % eritrocitne suspenzije je robot Tecan RSP 8051–ID uporabil fiziološko raztopino z bromelinom ZTM in koncentrirane eritrocite vzorca v razmerju 1 : 50. Po končanem pipetiranju vzorcev na mikrotitrsko ploščico z reagenti Ecoclone so se podatki kodnih številk vzorcev in mikrotitrskih ploščic avtomatsko prenesli v PC računalnika čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra. Mikrotitrske ploščice z vzorci smo inkubirali 10 minut na 37 C. Po inkubaciji smo jih centrifugirali 1 minuto pri 590 x g. Pred vrednotenjem rezultatov v čitalcu Tecan SLT Spectra smo mikrotitrske ploščice stresali na stresalcu toliko časa, da na dnu mikro epruvet ni bilo usedlin (cca 2 minuti). Vizuelno smo preverili aglutinate in po potrebi z ročnim tresenjem aglutinate stresli v sredino mikroepruvete.

27


Slika 7: Ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone na robotu Tecan Genesis RSP 200 Prisotnost ali odsotnost aglutinacije na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone smo ovrednotili s pomočjo čitalca Tecan SLT Spectra. V primeru, da robot ni pipetiral eritrocitne suspenzije, smo ročno pripravili 1 % suspenzijo eritrocitov dajalca. Po 1 kapljico (50 L) eritrocitne suspenuije dajalca smo ročno pipetirali na mikrotitrsko ploščico, glede na mesto, kjer eritrocitne suspenzije robot Tecan Genesis RSP 200 ni pipetiral. Za kontrolne vzorce smo uporabili vzorce dajalcev, kateri so že imeli določeni fenotip Rh (Preglednica VII ). Po testiranju fenotipa Rh na mikrotitrskih ploščicah smo rezultate primerjali z rezultati, kateri so bili testirani v epruveti in ročno vpisani v Celični panel informacijskega sistema DATEC. V primeru neskladja smo vzorec razširjeno testirali na humani gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype.

3.5.4.Ugotavljanje antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi reagenti Antigene K, C, c, E in e smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju.Metodo ugotavljanja antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici smo izvedli s pomočjo laboratorijskega robota Tecan RSP 8051–ID, čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in PC z računalniškim programom Medusa. Ena mikrotitrska ploščica Biotest Erytype Rh+K 16-single je zadostovala za preiskave 16 vzorcev. Glede na število vzorcev smo iz hladilnika vzeli mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16-single. Pred uporabo smo mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16-single razporedili na ravno podlago na sobni temperaturi vsaj 30 min. V alufolijo zaščitene mikrotitrske ploščice Biotest shranjujemo na temperaturi od 2 do 8 C do roka uporabnosti. Po odstranitvi zaščitene folije je bilo potrebno mikrotitrske ploščice uporabiti v 24 urah.

28


Vzorce, odvzete v monovette z antikoagulantom EDTA, smo pred uporabo centrifugirali 10 minut pri 800 x g. Na robotu Tecan RSP 8051–ID smo v računalniškem programu BloodTyper izbrali metodo »11 ERYRHK«. Mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16-single smo označili z zaporedno številko in z črtno kodo »EryRhK«. Za pripravo 1 % eritrocitne suspenzije je robot Tecan RSP 8051–ID uporabil fiziološko raztopino z bromelinom Biotest in koncentrirane eritrocite vzorca v razmerju 1 : 20. Po končanem pipetiranju vzorcev na mikrotitrsko ploščico Biotest Erytype Rh+K 16-single smo podatke kodnih številk vzorcev in mikrotitrske ploščice prenesli v PC računalnika čitalca Tecan SLT Spectra (Slika 8). Napipetirane mikrotitrske ploščice smo stresali na stresalcu 2 minuti in inkubirali 10 minut na sobni temperaturi. Po inkubaciji smo mikrotitrske ploščice centrifugirali 1 minuto pri 590 x g. Pred vrednotenjem rezultatov v čitalcu Tecan SLT Spectra smo mikrotitrske ploščice ponovno stresali na stresalcu toliko časa, da na dnu mikroepruvet ni bilo usedlin (cca 2 minuti). Vizuelno smo preverili aglutinate in po potrebi z ročnim tresenjem aglutinate stresli v sredino mikroepruvete. Prisotnost ali odsotnost aglutinacije na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single smo ovrednotili s pomočjo čitalca Tecan SLT Spectra.

Slika 8: Mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16-single na robotu V primeru, da robot ni pipetiral eritrocitne suspenzije, smo ročno pripravili 1 % suspenzijo eritrocitov dajalca. Po 1 kapljico (50 l) eritrocitne suspenuije dajalca smo ročno pipetirali na mikrotitrsko ploščico, glede na mesto, kjer eritrocitne suspenzije robot Tecan RSP 8051–ID ni pipetiral. Za kontrolne vzorce smo uporabili vzorce dajalcev kri, kateri so že imeli določeni antigen K in fenotip Rh (Preglednica VII). Po testiranju antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici smo rezultate primerjali z rezultati, kateri so bili določeni v epruveti in ročno vpisani v Celični panel informacijskega sistema DATEC. V primeru neskladja pri ugotavljanju fenotipa Rh smo vzorec ročno razširjeno testirali na humani gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype, v primeru neskladja pri ugotavljanju antigena K pa smo vzorec ročno razširjeno testirali na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K.

29


3.5.5.Ugotavljanje antigena K na gelski kartici Antigen K smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Metodo ugotavljanja antigena K na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K smo izvedli s pomočjo laboratorijskega robota Tecan Genesis RSP 200 in čitalca gelskih kartic ID–Reader SA z računalniškim programom Maestro. Po navodilih proizvajalca je bilo potrebno čitalec gelskih kartic ID–Reader SA prižgati vsaj 40 minut pred uporabo. Ena monoklonska gelska kartica DiaMed DiaClon Anti–K je zadostovala za preiskave 6 vzorcev. Monoklonske gelske kartice DiaMed DiaClon Anti–K shranjujemo na sobni temperaturi (18 – 25 C) do roka uporabnosti. Po odstranitvi zaščitene folije je potrebno gelsko kartico takoj uporabiti. Vzorce, odvzete v monovette z antikoagulantom EDTA, smo pred uporabo centrifugirali 10 minut pri 800 x g. Na robotu Tecan Genesis RSP 200 smo v računalniškem programu Logic izbrali metodo »Mono Anti–Kell GELCARDS 0031«. Gelske kartice DiaMed DiaClon Anti–K smo označili z zaporedno številko. Za pripravo 5 % eritrocitne suspenzije je robot Tecan Genesis RSP 200 uporabil DiaMed Diluent 2 in koncentrirane eritrocite vzorca. Po končanem pipetiranju vzorcev na monoklonske gelske kartice DiaMed DiaClon Anti–K so se podatki kodnih številk vzorcev in gelskih kartic avtomatsko prenesli v PC računalnika čitalca gelskih kartic ID–Reader SA. Po pipetiranju gelskih kartic smo rezultate ovrednotili s pomočjo čitalca gelskih kartic ID-Reader SA. Izbrali smo avtomatsko interpretacijo rezultatov, ki zajema centrifugiranje (10 minut pri 85 x g, odčitavanje in interpretacija odčitanih rezultatov aglutinacije (Slika 9).

Slika 9: Interpretacija gelske kartice DiaMed DiaClon Anti–K v čitalcu ID–Reader SA Po končanem avtomatskem centrifugiranju in odčitavanju so se na ekranu prikazale slike gelskih kartic z interpretiranimi rezultati aglutinacijskih preiskav. Rezultati aglutinacije so bili ovrednoteni na podlagi razporeditve celic v gelu v vsaki mikroepruveti z eno od šestih stopenj, to so : negativno, 1+, 2+, 3+, 4+ in DCP. Za pozitivno kontrolo smo uporabili heterozigotne antigene dajalcev (Kk) in za negativno kontrolo vzorec dajalca, pri katerem ni bilo prisotnega antigena K (kk).

30


31

3.5.6. Ročno ugotavljanje fenotipa Rh na gelski kartici Antigene K, C, c, E in e smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Na sobni temperaturi smo inkubirali 10 minut eritrocitno suspenzijo vzorca krvi, katero smo pripravili tako, da smo 0,5 mL DiaMed Diluenta 1 dodali 25 L koncentriranih eritrocitov vzorca. Po inkubaciji smo po 10 L eritrocitne suspenzije pipetirali v vsako mikroepruveto na humani gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype. Gelsko kartico smo centrifugirali v ID Centrifugi 10 minut pri 85 x g in ugotovili pravilni rezultat (Slika 10).

Slika 10: Gelska kartica DiaMed RhD+Phenotype

3.5.7. Ročno ugotavljanje antigena K na gelski kartici Antigen K smo ugotavljali s tehniko aglutinacije, po postopku, ki je opisan v nadaljevanju. Pripravili smo eritrocitno suspenzijo vzorca krvi tako, da smo 0,5 mL DiaMed Diluenta 2 dodali 25 L koncentriranih eritrocitov vzorca. V mikroepruveto na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K smo takoj pipetirali 10 L eritrocitne suspenzije vzorca krvi. Gelsko kartico smo brez inkubacije centrifugirali v ID Centrifugi 10 minut pri 85 x g in ugotovili pravilni rezultat (Slika 11).

Slika 11: Gelska kartica DiaMed DiaClon Anti–K


3.5.8. Prenos rezultatov testiranja iz čitalca mikrotitrskih ploščic oz. iz čitalca gelskih kartic v informacijski sistem Po vsakem zaključenem vrednotenjem mikrotitrskih ploščic Biotest Erytype Rh+K 16-single v čitalcu mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra smo rezultate testiranj prenesli v informacijski sistem DATEC. V računalniškem programu Medusa smo v meniju »Reporting« za prenos izbrali program »EryRhK-H«. Rezultati so se prenesli v podatkovno bazo. Prav tako smo po vsakem zaključenem vrednotenjem monoklonskih gelskih katric DiaMed DiaClon Anti–K v čitalcu gelskih kartic ID Reader SA rezultate testiranj prenesli v informacijski sistem DATEC. Računalniški program Maestro nas je, po zaključenem vrednotenjem rezultatov in shranjevanju le teh, avtomatsko vprašal, ali želimo prenesti podatke. S potrditvijo so se rezultati prenesli v podatkovno bazo. V informacijskem sistemu DATEC je bilo potrebno najprej prenesti, nato pa še vpisati rezultate iz podatkovne baze. V glavnem meniju »l – Laboratorij« smo izbrali menij »LDD – Obdelava podatkov iz laboratorijskih strojev« za prenos (menij: »PRE – Prenos podatkov iz lab. strojev«) podatkov v podatkovno bazo. Rezultate testiranj smo vpisali (menij: »VPI – Vpis podatkov iz lab. strojev«) v informacijski sistem DATEC. V primeru neskladja vpisanih rezultatov v informacijskem sistemu DATEC nam je računalniški program avtomatsko izpisal številke krvi, katerih novo vpisani rezultati se ne ujemajo s starimi podatki.

32


4. REZULTATI IN RAZPRAVA Transfuzija krvi je danes zelo varna oblika zdravljenja, toda kljub temu lahko po transfuziji krvne komponente v določenih primerih pride do neželenih učinkov. Ena izmed neželenih učinkov transfuzije je aloimunizacija proti eritrocitnim antigenom. Glede na podatke v literaturi večina Evropsko razvitih držav že izdajajo kri skladno v antigenih A, B, RhD in tudi v antigenih K, C, c, E in e (9). V Sloveniji beležimo porast senzibilizacije na antigene K, C, c, E, e. Da se izognemo vsaj nekaterim aloimunizacijam proti eritrocitnim antigenom, je potrebno izdajati skladno kri poleg v antigenu K, tudi v antigenih C, c, E in e. Dne 02.02.2007 je začel velati Pravilnik o obveznem testiranju krvi in komponent krvi. Na Odseku za imunohematološko testiranje dajalcev krvi smo želeli uvesti avtomatizirano ugotavljanje antigenov K, C, c, E in e s pomočjo laboratorijskih robotov Tecan Genesis RSP 200 in Tecan RSP 8051-ID (Tecan, Hombrechtikon, Švica). Ker je uvedba avtomatiziranega postopka v laboratorij zelo zahteven in kompleksen proces, je nujno potrebno skupinsko delo. Pri celotnem projektu so sodelovali zdravnik, specialist transfuzijske medicine, dipl. univ. ing. elektrotehnike, kateri pozna delovanje laboratorijskih robotov in informacijski sistem DATEC, ing. farmacije ali dipl. ing. laboratorijske biomedicine ter laboratorijski tehniki. Z uvedbo avtomatiziranih postopkov v laboratorij smo želeli povečati kakovost dela (sledljivost, ponovljivost, natančnost), s tem pa bi se povečala tudi varnost transfuzije. V času nastajanja diplomske naloge smo na ZTM pri dajalcih krvi dne 13.12.2006 uvedli obvezno ugotavljanje antigena K pri prvih štirih odvzemih in obvezno ugotavljanje fenotipa Rh pri prvih dveh odvzemih, Z 16.12.2007 smo začeli izdajati Kell skladno kri vsem pacientom. Za ugotavljanje krvnih skupin se najpogosteje uporablja aglutinacijska tehnika na ploščici, v epruveti, na mikrotitrski ploščici, pa tudi v karticah z gelom ali z mikrokroglicami. Prisotnost aglutinacije pomeni pozitiven rezultat (+). Pri pozitivnem rezultatu s prostim očesom vidimo večje ali manjše aglutinate v bistri tekočini (na mikrotitrsklih ploščicah) ali aglutinate razporejene po gelu. Odsotnost aglutinacije pomeni negativen rezultat (-). Pri negativnem rezultatu je vsebina mikroepruvete pri mikrotitrskih ploščicah homogena, na gelu pa so eritrociti na dnu mikroepruvete. Rezultate na mikrotitrskih ploščicah smo vrednotili s pomočjo računalniškega programa Medusa in čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra (Tecan, Hombrechtikon, Švica). V primeru, da je čitalec Tecan SLT Spectra rezultat prečital kot »?« ali NTD (neskladni rezultat), rezultate nismo shranili, pač pa smo ponovili centrifugiranje, stresanje in čitanje mikrotitrskih ploščic. Rezultate na gelskih karticah smo vrednotili s pomočjo računalniškega programa Maestro in čitalca gelskih kartic ID Reader SA (DiaMed, Cressier, Švica). V primeru, da je čitalec ID Reader SA rezultat prečital kot »?«, smo rezultat popravili na podlagi primerjave z odčitavanjem s prostim očesom in shranili. V računalniškem programu Maestro smo dobljene rezultate testiranj shranili v obliki digitalnega zapisa na trdi disk (ukaz »Back up« v računalniškem programu Maestro). Posebno pozorno smo vizuelno preverili rezultate ugotavljanja v čitalcih pri hemoliziranih in lipemičnih vzorcih. Hemolizirani vzorci in eritrociti, na katere so vezana IgG, lahko povzročijo napake v rezultatih, lipemični vzorci pa motijo avtomatično vrednotenje rezultatov. Suspenzije eritrocitov smo pripravljali le iz koncentriranih eritrocitov, saj lahko večje količine seruma oz. plazme zavira delovanje bromelina in s tem povzroči slabšo reakcijo reagentov. Vse vzorce, katerim smo ugotavljali antigen K in fenotip Rh na

33


mikrotitrski ploščici, smo primerjali z rezultati testiranja v epruveti z reagenti Ecoclone, katera metoda se je uporabljala v našem laboratoriju v rutini.

4.1. Primerjava treh načinov ugotavljanja antigenov C, c, E in e Rezultate ugotavljanja antigenov C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone (Priloga 1) smo primerjali z določitvijo teh antigenov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single in na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone. S pomočjo laboratorijskega robota Tecan Genesis RSP 200 in čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra smo na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh–Pheno single ugotovili antigene C, c, E in e 3347 dajalcem (Priloga 2). Vzporedno smo s pomočjo laboratorijskega robota Tecan Genesis RSP 200 in čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra 1150 dajalcem ugotovili antigene C, c, E in e tudi na mikrotitrskih ploščicah z reagenti Ecoclone (Priloga 3). V primeru, da se naši rezultati ugotavljanja fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici niso ujemali z rezultati v epruveti ali z že vpisanim rezultatom v informacijskem sistemu DATEC, smo vzorec testirali na gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype. Težave pri vrednotenju rezultatov na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh-Pheno so bile predvsem pri začetnih testiranjih, saj je čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra aglutinacijo v 0,94 % ovrednotil lažno negativno ali aglutinacije ni ovrednotil in je rezultat podal kot »?« (Graf 4). Kasneje smo metodo testiranja na mikrotitrskih ploščicah Biotest optimizirali s tem, da smo povečali čas centrifugiranja (1 minuta), povečali pa smo tudi centrifugiranje (iz 72 x g na 590 x g). S spremenjenim postopkom centrifugiranja smo kasneje le v 0,08 % dobili napačno ovrednotene aglutinacije.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56

Zaporedno testiranje

% n

eovr

edn

oten

ihre

zult

atov

Graf 4: Neovrednoteni rezultati (»?«) na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single Pri vrednotenju rezultatov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single je bilo 5 lažno negativnih rezultatov. Pri 2 vzorcih (0,06 %) reagent na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single ni reagiral s prisotnim antigenom C, pri 2 vzorcih (0,06 %) reagent na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single ni reagiral s prisotnim antigenom E in pri 1 vzorcu (0,03 %) reagent na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single ni reagiral s prisotnim antigenom e. Proizvajalec mikrotitrskih ploščic Biotest Erytype S Rh-Pheno single priporoča uporabo bromelina Biotest. Tekom

34


testiranja se je pokazalo, da z uporabo bromelina ZTM na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh-Pheno single nismo dobili različnih rezultatov v primerjavi z ugotavljanjem v epruveti. Skupki prisotnih aglutinacij na čitalcu mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra niso bili lažno negativno ovrednoteni, prav tako niso bili ovrednoteni kot »?«. Kljub danim ugotovitvam smo pri nadaljnjih testiranjih uporabljali bromelin Biotest. Pri določevanju antigenov na mikrotitrskih ploščicah, katere smo pipetirali z reagenti Ecoclone, smo dobili le pri 1 vzorcu (0,09 %) lažno negativen rezultat. Prav tako smo pri istem vzorcu dobili lažno negativen rezultat pri ugotavljanju antigena C v epruveti z reagenti Ecoclone. Prisotni antigen C namreč ni reagiral z reagentom Ecoclone Anti-C. Pri določevanju antigenov na mikrotitrski ploščici, katere smo napipetirali z reagenti Ecoclone, so bile aglutinacije tako slabe, da je čitalec mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra rezultate večkrat ovrednotil lažno negativno. Čitalec Tecan SLT Spectra je prisotno aglutinacijo pri antigenu C 2-krat (0,17 %) podal lažno negativno, pri antigenu E je čitalec prisotno aglutinacijo 1-krat (0,09 %) podal lažno negativno in pri antigenu e je čitalec kar 14-krat (1,22 %) podal lažno negativen rezultat. Ko smo primerjali metodo ugotavljanja antigenov C, c, E in e na mikrotitrskih ploščicah Biotest Erytype S Rh-Pheno single in na mikrotitrski ploščici, katere smo ročno pipetirali z reagenti Ecoclone, smo ugotovili, da pri metodi ugotavljanja antigenov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single dobimo pravilne rezultate v večjem deležu (Graf 5).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

Zaporedno testiranje

% la

žno

neg

ativ

nih

in

neo

vred

not

enih

rez

ult

ato v

MTP Biotest Erytype S Rh-Pheno

Reagenti Ecoclone na MTP

Graf 5: Primerjava lažno negativnih rezultatov ali neovrednotenih rezultatov (»?«) na mikrotitrski ploščici z liofiliziranimi reagenti in na prazni mikrotitrski ploščici Ročno pipetiranje reagentov Ecoclone na mikrotitrske ploščice, oprane z Tweenom, je bilo zelo zamudno. Za pipetiranje 1 mikrotitrske ploščice z reagenti Ecoclone Anti-C, Anti-c,

35


Anti-E in Anti-e smo potrebovali vsaj 4 minute. Če bi reagente Ecoclone na mikrotitrske ploščice pipetirali s pomočjo robota Tecan Genesis RSP 200, bi bile kar od 15 do 20 % izgube reagentov Ecoclone. Ker so serumi nebarvani je pipetiranje lahko zmotljivo. Čas ugotavljanja antigenov na mikrotitrskih ploščicah z reagenti Ecoclone je bil daljši, saj je bilo potrebno reagente predhodno pipetirati. Napipetirane mikrotitrske ploščice smo do uporabe zamrznili (mi smo jih uporabljali največ do 14 dni), vendar nismo imeli nobenega podatka, koliko časa so zamrznjene mikrotitrske ploščice uporabne. Na mikrotitrskih ploščicah Biotest so reagenti že liofilizirani, rok uporabe pa je 15 mesecev od dostave. Reagenti oz. mikrotitrske ploščice Biotest Erytype S Rh-Pheno single imajo certifikat CE, medtem ko reagenti Ecoclone tega certifikata še nimajo, kar pa je ena izmed priporočil Sveta Evrope pri uvajanju novih reagentov in metod v laboratorije na področju transfuzijske medicine. Metoda ugotavljanja antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single je cenovno ugodnejša (Preglednica VII) (Podatki za cene so iz leta 2005). Preglednica VII: Cenovna primerjava ugotavljanja antigenov na dveh različnih mikrotitrskih ploščicah

Proizvajalec Tehnika Cena 1 mL reagenta (€) Cena testa CcEe (€)

4 antigeni + bromelin

do 30.000 testov: 0,93 €

30. - 60.000 testov: 0,89 €

Biotest (Mediline) Erytype S Rh-pheno single

Liofilizirani reagenti. MTP

60. - 90.000 testov: 0,87 €

0,75 € (4 Ag)

0,11 € (15 % izguba reagentov)

0,06 € (MTP)

0,02 € (bromelin)

Skupno: 0,94 €

Ecoclone (ZTM)

Zamrznjeni reagenti, MTP

Anti - C 3,75 € Anti - c 1,93 € Anti - E 1,93 € Anti - e 7,30 €

Skupno (20 % izguba): 0.98 €

Zaradi naštetih prednosti mikrotitrske ploščice Biotest Erytype S Rh–Pheno single smo 22.12.2004 končali primerjalno ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone. Primerjalno smo nadaljevali ugotavljanje fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single in v epruveti z reagenti Ecoclone. Ko smo primerjali ugotavljanje antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single in v epruveti z reagenti Ecoclone, smo pri ugotavljanju v epruveti ugotovili 39 (0,29 %) nepravilno določenih antigenov. Pri ugotavljanju antigenov C, c, E in e v epruveti smo dobili 1 lažno negativen rezultat, ko prisoten antigen C ni reagiral z reagentom Ecoclone Anti-C, vendar je bilo zaradi vizualnega vrednotenja rezultatov in ročnega vpisovanja le-teh v informacijski sistem DATEC kar 38 nepravilno

36


vpisanih rezultatov. Z avtomatiziranem ugotavljanjem antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single se je zmanjšala možnost napake iz 0,29 % na 0,15 % saj se pri avtomatiziranem postopku izognemo številnim napakam pri vizualnem vrednotenju rezultatov in administrativnim napakam (Preglednica VIII). Preglednica VIII: Primerjava števila napak na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno single in v epruveti z reagenti Ecoclone

Število testiranih antigenov: 13388

Testiranje v epruveti z reagenti

Ecoclone

MTP Biotest Erytype S Rh-Pheno single

Število lažnih rezultatov 39 20

% lažnih rezultatov glede na skupno število testiranih antigenov 0,29 0,15

Pri ugotavljanju antigenov C, c, E in e v epruveti smo veliko časa potrebovali za označevanje epruvet, pipetiranje reagentov Ecoclone v označene epruvete, ročno pripravo eritrocitnih suspenzij in vizuelno vrednotenje rezultatov ( Preglednica IX).

37


Preglednica IX: Časovna primerjava ugotavljanja fenotipa Rh v epruveti in na mikrotitrski ploščici

Metoda ugotavljanja fenotipa Rh v epruveti z

reagenti Ecoclone

Metoda ugotavljanja fenotipa Rh na MTP Biotest Erytype S Rh–Pheno single

Predpriprava (reagentov, epruvet, MTP, pipet, nastavkov, stojal, taljenje bromelina)

7 minut 5 minut

Označevanje epruvet - MTP 33 minut 0,5 minute Pipetiranje reagentov 5 minut 0 Priprava eritrocitne suspenzije 13 minut Pipetiranje eritrocitne suspentije

8 minut 16 minut

Stresanje epruvet oz. MTP 0,5 minut 2 minuti Inkubacija na sobni temperaturi

10 minut 10 minut

Centrifugiranje 17 minut 2 minuti

Stresanje epruvet oz. MTP in vrednotenje rezultatov

8 minut (2 osebi) 4 minute

Potreben čas za izvedbo celotnega postopka ugotavljanja fenotipa Rh pri 50 vzorcih

109 minut 39 minut

Zaradi vseh naštetih prednosti smo se odločili, da so mikrotitrske ploščice Biotest primernejše za rutinsko uporabo.

4.2. Primerjava dveh načinov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e Kasneje se je pokazala potreba po izdaji krvi skladne v krvni skupini ABO RhD in tudi v antigenu K. Na Odseku za imunohematološko testiranje dajalcev krvi smo želeli pripraviti komponente krvi za izdajo Kell skladne krvi, zato smo poizkusili uvesti dve novi avtomatizirani metodi ugotavljanja antigena K.

38


Vzporedno smo ugotovili antigene K, C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone in na mikrotititrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single 1020 dajalcem. V primeru, da se naši rezultati ugotavljanja fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici niso ujemali z rezultati v epruveti ali z že vpisanim rezultatom v informacijskem sistemu DATEC, smo vzorec testirali na gelski kartici DiaMed RhD+Phenotype. Če smo dobili različne rezultate ugotavljanja antigena K na mikrotitrski ploščici kot na gelu ali je bil v informacijskem sistemu DATEC že vpisan drugačen rezultat antigena K, smo vzorec potrditveno testirali ročno na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K in z reagenti Ecoclone v epruveti. Pri ugotavljanju antigenov K, C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone ni bilo lažno negativnih rezultatov, vendar je bilo kar 6 (0,12 %) nepravilno vpisanih antigenov v informacijskem sistemu DATEC (Priloga 4). Pri 2 vzorcih je bil antigen K v informacijskem sistemu DATEC vpisan lažno negativno in pri 2 vzorcih pa lažno pozitivno. Prav tako je bil v informacijskem sistemu DATEC antigen C pri 2 vzorcih vpisan lažno pozitivno. Lažno pozitivni oz. negativni rezultati vpisani v informacijskem sistemu DATEC so najverjetneje posledica napake vizualnega vrednotenja rezultatov v epruveti ter administrativne napake pri vpisovanju le-teh v Celični panel informacijskega sistema DATEC. Pri vrednotenju rezultatov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K single so bili 3 rezultati lažno negativni (Priloga 5). Pri 2 vzorcih (0,20 %) reagent na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single ni reagiral s prisotnim antigenom E in pri 1 vzorcu (0,10 %) reagent na mikrotitrski ploščici Biotest ni reagiral s prisotnim antigenom C. Pri določevanju antigenov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K single je čitalec Tecan SLT Spectra prisotno aglutinacijo 1-krat (0,02%) podal lažno negativno. Aglutinacije pri ostalih vzorcih so bile v skupkih, tako da je čitalec Tecan SLT Spectra rezultate vedno pravilno ovrednotil (Slika 12).

Slika 12: Čitanje mikrotitrske ploščice Biotest Erytype Rh+K 16–single v čitalcu Tecan SLT Spectra s pomočjo programa Medusa Opazili smo, da ima ugotavljanje antigenov K, C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16–single tudi nekaj pomanjkljivosti. Pri ugotavljanju Fenotipa Rh smo dobili tudi lažno negativne rezultate. Proizvajalec Biotest za ugotavljanje antigena E na

39


mikrotitrski ploščici uporablja dva različna klona reagentov anti–E ločeno. Če bi želeli ugotoviti antigen E 100%, bi morali uporabljati mikrotitrske ploščice Biotest z dvema različnima klonoma reagentov, kar pa bi metodo podražilo in časovno podaljšalo. Dokler se antigeni C, c, E in e določajo le orientacijsko in so predhodne ugotavljanja samo v pomoč pri iskanju fenotipsko negativne krvi, smo se odločili, da bomo uporabljali mikrotitrsko ploščico Biotest Erytype Rh+K 16–single. Cena reagentov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16–single ni bistveno dražja od reagentov Ecoclone v epruveti, pač pa je cena opreme (laboratorijska robota, čitalci, centrifuge, stresalci), vzdrževanja in kalibracije opreme bistveno višja, kot pri klasičnem načinu v epruveti. Pri testiranju na mikrotitrski ploščici Biotest ne moremo izbirati različnih reagentov, ker so le ti že liofilizirani v vsaki mikroepruveti. Manjši delež vseh lažnih rezultatov (Preglednica X), večja sledljivost ter prihranek pri času pa so prednosti, zaradi katerih je avtomatizirana metodo ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K primerna za rutinsko uporabo. Preglednica X: Število lažnih rezultatov v epruveti in na mikrotitrski ploščici

Število testiranih antigenov

Število lažnih rezultatov v epruveti z reagenti

Ecoclone

Število lažnih rezultatov na MTP Biotest Erytype Rh +

K

5100 6 4

% lažnih rezultatov glede na skupno število testiranih

antigenov 0,12 0,08 Z uvedbo metode ugotavljanja fenotipa Rh in antigena K na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single bomo avtomatizirano pretestirali celotno bazo dajalcev na antigene C, c, E in e. S tem bomo prispevali k hitrejši odzivnosti pri iskanju antigenske krvi pri pacientih s številnimi protitelesi in naredili bomo en korak naprej k izdaji krvi skladne tudi v antigenih C, c, E in e.

4.3. Rezultati ugotavljanja antigena K na gelski kartici Druga metoda, katero smo želeli avtomatizirati, je bila ugotavljanje antigena K na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K. Na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K smo ugotovili antigen K 140 dajalcem (Priloga 6). Rezultate ugotavljanja antigena K na gelski karici DiaMed DiaClon Anti-K smo primerjali z določitvijo tega antigena na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K single. Pri ugotavljanju antigena K na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K nismo imeli težav, saj čitalec gelskih kartic ID Reader SA ni podal lažnih rezultatov. Čitalec ID Reader SA je samo pri 1 vzorcu (0,71 %) ovrednotil aglutinacije kot »?«. Rezultat smo popravili in shranili.

40


4.4. Prenos rezultatov iz čitalca mikrotitrskih ploščic in iz čitalca gelskih kartic v informacijski sistem Za ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e smo potrebovali naslednje izpise iz informacijskega sistema DATEC:

Izpis »106«: Številke krvi za testiranje antigena K na gelu oz. MTP Izpis »107«: Izpis Kell zadržane krvi v obdobju Izpis »108«: Izpis vseh dajalcev glede na testiranje v obdobju Izpis »109«: Izpis vseh testiranj (Kell + Fenotip Rh) za enega dajalca Izpis »110«: Izpis Kell pozitivnih dajalcev, ki še nimajo antigena Cellano

Preverjali smo, ali so na vseh zahtevanih izpisih ustrezne številke odvzema in ustrezni testi. Preverili smo identičnost vseh prenesenih podatkov iz čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in iz čitalca gelskih kartic ID Reader SA v informacijski sistem DATEC. Preverjali smo prenos rezultatov testiranj in vezavo teh rezultatov na matično številko in priimek dajalca krvi. Preverjali smo tudi prenos rezultatov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single in antigena K na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti-K preko vmesne podatkovne baze v informacijski sistem DATEC. Pri vseh 246 vzorcih je prenos rezultatov ugotavljanja na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K single iz čitalca Tecan SLT Spectra potekal v informacijski sistem DATEC pravilno, prav tako je pri vseh 140 vzorcih prenos rezultatov iz čitalca ID Reader SA v informacijski sistem DATEC potekal pravilno (Priloga 7). Vsi rezultati so se pravilno vezali na matično številko dajalca. Pri vpisovanju rezultatov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e v informacijski sistem DATEC nam je računalniški program pri neskladju rezultatov v vseh primerih pravilno izpisal številke krvi. Pri neskladju rezultatov antigena K nam je računalniški program številko krvi tudi zadržal. Po ročnem razširjenem testiranju smo zadržano kri lahko sprostili. Pri sproščanju zadržane krvi smo preizkusili tudi različne prioriteti oseb, katere imajo dostop v informacijski sistem DATEC. Prva prioriteta je samo vpogled rezultatov testiranja antigenov K, C, c, E in e v Celičnem panelu informacijskega sistema DATEC in vpisovanje rezultatov ostalih antigenov v Celični panel informacijskega sistema DATEC. Druga prioriteta je vpisovanje rezultatov ugotavljanja vseh antigenov (tudi antigenov K, C, c, E in e) ter sproščanje Kell zadržane krvi. Sistem arhiviranja rezultatov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e v informacijskem sistemu DATEC ima svojo elektronsko obliko arhiva. Nov način ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e na mikrotitrski ploščici in antigena K na gelski kartici ima v primerjavi s načinom ugotavljanja teh antigenov v epruveti določene prednosti. Interpretacija dobljenih rezultatov s čitalcem mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in s čitalcem ID Reader SA je enostavnejša in identična kot odčitek rezultata s prostim očesom, rezultate testiranja lahko shranimo. Nanašanje vzorcev na mikrotitrske ploščice in gelske kartice s pomočjo laboratorijskih robotov je standardizirano. Količine vzorcev so zelo majhne (8 μL). Označevanje mikrotitrskih ploščic in gelskih kartic je enostavnejše in hitrejše, oznake pa se ne morejo tako hitro izbrisati, kar se pri klasičnem načinu ugotavljanja v epruveti lahko hitro zgodi. Tveganje okužbe osebja s krvjo je manjše, saj pipetiranje vzorcev izvaja laboratorijski robot, stik z vzorcem v mikrotitrski ploščici oz. gelski kartici pa skorajda ni mogoč. Prednost avtomatizacije je tudi v pozitivni

41


identifikaciji vzorcev in v manjšem številu laboratorijskega osebja. Pri avtomatiziranem ugotavljanju antigenov ne potrebujemo epruvet, ročnih pipet, nastavkov za pipete. Večina teh prednosti se je izkazala tudi pri našem delu, še posebej pri enostavnem odčitavanju aglutinacije, nanašanje vzorcev ter prihranek časa. Pomembna prednost je visoka diagnostična vrednost ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e na mikrotitrski pločici Biotest Erytype Rh+K 16-single in antigena K na monoklonski gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K (visoka specifičnost, zanesljivost in občutljivost) v primerjavi s klasičnim načinom v epruveti. Zelo pomemben je tudi certifikat CE, katerega imajo reagenti na mikrotitrski ploščici Biotest in na gelski kartici DiaMed, medtem ko si reagenti Ecoclone tega certifikata še niso pridobili. Poleg tega, da so avtomatizirani postopki hitrejši, omogočijo avtomatski prenos rezultatov v informacijski sistem, za testiranje potrebujemo manjše količine vzorcev, omogočajo tudi testiranje velikega števila vzorcev. S tem se bo postopno pretestirala baza dajalcev krvi za razširitev indikacij tako za transfuzije Kell kot tudi Rh (DCcEe) skladne krvi. Pri urgentnih naročilih za senzibilizirane paciente, predvsem tiste z multipnimi aloprotitelesi, se bo hitreje našla antigensko skladna kri. Celotna cena postopka avtomatiziranega ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e (reagenti, vzdrževanje laboratorijskih robotov, čitalcev, stresalcev, centrifug za mikrotitrsko ploščico, centrifug za gelske kartice,…) je sicer višja od ročnega ugotavljanja teh antigenov v epruveti, vendar je postopek enostavnejši in zanesljiv, kar je za varno transfuzijo zelo pomembno, to pa je velika pridobitev za pacienta. Na osnovi rezultatov ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e z različnimi tehnikami in različnimi reagenti in naše obdelave zbranih podatkov ugotavljamo, da je zanesljivost avtomatiziranega ugotavljanja antigenov K, C, c, E in e v skladu z dobro proizvodnjo prakso. Z rezultati ugotavljanja smo potrdili, da je delovanje laboratorijskega sistema zanesljivo, v skladu z našimi zahtevami, zato lahko enote krvi avtomatizirano testirane na antigen K uporabimo za izdajo Kell skladne krvi. V primeru senzibiliziranih pacientov na antigen K obvezno potrditveno testiramo izdano kri na antigen K. Ker je ugotavljanje antigenov K, C, c, E in e na mikrotittrski ploščici in gelski kartici s pomočjo robotov Tecan RSP 8051–ID in Tecan Genesis RSP 200 delno avtomatizirano, priporočamo nabavo robotov, kateri izvajajo popolno avtomatizacijo. Pri popolni avtomatizaciji vzorec vstavimo v laboratorijski robot, le ta opravi vse postopke, vključno z pipetiranjem vzorcev, centrifugiranjem, stresanjem in čitanjem rezultatov, na koncu vse rezultate le potrdimo. Pri popolni avtomatizaciji se izognemo izbiranju vzorcev za posamezne teste, prestavljanju mikrotitrskih ploščic oz. gelskih kartic v inkubatorje, centrifuge, na stresalce in v čitalce, zmanjša pa se tudi nabor testov pri posameznem odvzemu. Robot za popolno avtomatizacijo shrani vse rezultate in vse kode reagentov, kateri so se uporabili pri testiranju.

42


5. SKLEP Pri primerjavi ugotavljanja prisotnosti antigenov K, C, c, E, in e z ročno tehniko in avtomatizirano metodo smo ugotovili, da je novi avtomatizirani način ugotavljanja antigenov K, C, c, E, in e na mikrotitrski ploščici primernejši kot način testiranja v epruveti. Z ročno tehniko smo pri ugotavljanju fenotipa Rh dobili 0,29 % nepravilnih rezultatov, medtem ko smo pri avtomatiziranem načinu ugotavljanja antigenov C, c, E, in e na prazni mikrotitrski ploščici dobili 1,57 % lažno negativnih rezultatov, pri ugotavljanju teh antigenov na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh-Pheno pa smo dobili le 0,15 % lažno negativnih rezultatov. Za potrebe izdaje Kell skladne krvi smo ugotovili, da sta metodi avtomatiziranega ugotavljanja antigena K na mikrotitrski ploščici in gelski kartici najprimernejši kombinaciji ugotavljanja z dvema različnima metodama. Pri ugotavljanju antigena K na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K in na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single smo dobili 100 % ujemanje v rezultatih. Prenosi rezultatov avtomatiziranega ugotavljanja antigenov K, C, c, E, in e iz čitalca mikrotitrskih ploščic in čitalca gelskih kartic v informacijski sistem DATEC so potekali pravilno. Vsi rezultati so se vezali na pravega dajalca krvi. Pri vseh neskladjih je informacijski program pravilno javil neskladnost pri posameznem antigenu. Novi izpisi v informacijskem sistemu DATEC so vsebovali vse zahtevane številke krvi.

43


6. LITERATURA

1. Svet Evrope : Priporočilo o pripravi, uporabi in zagotavljanju kakovosti komponent krvi, 10. izdaja, oktober 2004.

2. Lukić L:Transfuziologija (interna skripta ZTM Ljubljana), Ljubljana 1993 3. Mollison PL, Engelfriet CP, Conterars M,: Blood transusion in clinical medicine,

10th ed. Oxford: Blackwell Science Ltd., 1997 4. Colin Y, Baillyp, Cartron JP: Molecular genetic basis of Rh and Lw blood groups.

Vox Sanguinis 1994; 67 S3:67 – 69 5. Issit PD, Anstee DJ: Applied Blood Group Serology. Fourth ed. Durham:

Montgomery Scientific Publications, 1998 6. Daniels G: Human Blood Group. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science Ltd, 2002 7. Potočnik M, Rožman P: Transfuzijska medicina, Osnove komponentne terapije in

imunohematologije, 2. del – Imunohematologija, 2006. Ljubljana, Zavod RS za transfuzijsko medicino

8. Glonar L: Tečaj transfuzijske medicine, Rh sistem, Ljubljana, Zavod RS za transfuzijsko medicino, 2001.nepag.2001. Ljubljana, Zavod RS za transfuzijsko medicino.

9. Maček Kvanka M, Pipuš M, Bricl I: Prenatalne senzibilizacije in transfuzija skladne krvi, Zbornik predavanj, Terme Olimia, oktober 2006

10. Maček Kvanka M: Predlog indikacij za transfuzijo eritrocitov skladnih izven ABD na ZTM, Strokovni svet ZTM, februar 2005

11. Bizjak B: Ugotavljanje senzibilizacij pred transfuzijo Splošni Bolnišnici Maribor, Zbornik predavanj, Terme Olimia, oktober 2006

12. Kramar I, Mrkonjić V: Klinično pomembna protitelesa v 10. letih v Splošni bolnišnici Izola, Zbornik predavanj, Terme Olimia, oktober 2006

13. Guidelines for the Blood Transfuzion Services in the United Kingdom, 6th Edition, 2002

14. National Guidelines for the Processing of Blood and Blood Components and for the Use of Blood Products« given by the German Medical Association, latest Edition 2000.

15. Hughes-Jones NC, GardnerB. Red cell agglutination: the first description by Creite(1869) and further observations made by Landois(1875) and Landsteiner (1901). Br J Haematol 2002;119(4):889-893.

16. Kelton JG, HeddleNM, Blajchman MA: Blood Transfusion–A Conceptual Approach. Churchill Livingstone. New York 1984: 34 – 70

17. Potočnik M, Tečaj transfuzijske medicine. Ljubljana, Zavod RS za transfuzijsko medicino, 2001.nepag.2001. Ljubljana, Zavod RS za transfuzijsko medicino.

18. Shulman IA, Saxena S, Ramer L. Assessing blood administering practices.Arch Pathol Lab Med 1999; 123(7):595 – 598

44


7. PRILOGE Priloga 1: Rezultati ugotavljanja antigenov C, c, E in e v epruveti z reagenti Ecoclone, katere smo primerjali z rezultati testiranja na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single in z rezultati testiranja fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici z reagenti Ecoclone

Število lažno negativnih rezultatov

Napaka pri vrednotenju rezultatov ali administrativna napaka

DATUM Število vzorcev C c E e C c E e

28.9.2004 24 29.9.2004 48 1.10.2004 24 4.10.2004 104 8.10.2004 24

10.11.2004 48 11.10.2004 4 12.11.2004 48 15.11.2004 48 1 18.11.2004 96 2 4 19.11.2004 96 1 22.11.2004 48 25.11.2004 96 26.11.2004 96 30.11.2004 120 1 1.12.2004 48 2.12.2004 48 3.12.2004 48 6.12.2004 48 7.12.2004 57 8.12.2004 54 9.12.2004 54

10.12.2004 54 13.12.2004 24 14.12.2004 24 1 15.12.2004 24 18.3.2005 36 29.3.2005 94 2 31.3.2005 64 1 6.4.2005 72 2 1 8.4.2005 72

14.4.2005 96

45


20.4.2005 48 2 26.4.2005 48 4.5.2005 48 6.5.2005 48

11.5.2005 96 4 13.5.2005 48 17.5.2005 48 1 19.5.2005 48 19.5.2005 20 8.9.2005 48

14.9.2005 48 15.9.2005 48 21.9.2005 96 1 29.9.2005 96 2 30.9.2005 23 3.10.2005 47 1 1 6.10.2005 72 2 2 1 2

12.10.2005 96 1 21.10.2005 96 1 1 7.11.2005 48 9.11.2005 72 1

15.11.2005 44 21.11.2005 72 23.11.2005 47 29.11.2005 48 2.12.2005 68

Skupno št. vzorcev 3362 1 0 0 0 14 7 14 3 % 0,03 0 0 0 0,42 0,21 0,42 0,09

46


Priloga 2: Rezultati ugotavljanja antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype S Rh–Pheno single


Čitalec aglutinacijo ovrednoti lažno

negativno

Čitalec aglutinacije ne ovrednoti (»?«)


28.9.2004 24 29.9.2004 48 11 11 11 11 1.10.2004 24 2 4.10.2004 104 3 8.10.2004 24

10.11.2004 48 1 12.11.2004 48 1 15.11.2004 48 1 18.11.2004 96 4 5 19.11.2004 96 0 1 22.11.2004 48 7 25.11.2004 96 1 26.11.2004 96 30.11.2004 120 1.12.2004 48 2.12.2004 48 3.12.2004 48 1 6.12.2004 48 1 7.12.2004 57 8.12.2004 54 9.12.2004 54

10.12.2004 54 1 13.12.2004 24 14.12.2004 24 15.12.2004 24 3 18.3.2005 36 29.3.2005 94 1 31.3.2005 64 6.4.2005 72 8.4.2005 72 1

14.4.2005 96 20.4.2005 48 26.4.2005 48 4.5.2005 48 6.5.2005 48 1

11.5.2005 96

47


13.5.2005 48 17.5.2005 48 19.5.2005 48 25.5.2005 20 8.9.2005 48

14.9.2005 48 15.9.2005 48 21.9.2005 96 29.9.2005 96 1 1 30.1.1900 23 3.10.2005 47 6.10.2005 72

12.10.2005 96 21.10.2005 96 7.11.2005 48 9.11.2005 72

15.11.2005 44 21.11.2005 72 23.11.2005 47 1 1 29.11.2005 48 1 2.12.2005 68

Skupno št. vzorcev 3347 2 0 2 1 1 4 2 8 19 % 0,06 0 0,06 0,03 0,03 0,12 0,06 0,24 0,14 Opomba: Ker je bilo 29.09.2004 premalo fiziološke raztopine z Bromelinom, robot 11-krat ni pipetiral eritrocitne suspenzije, zato smo te vzorce izključili pri izračunih.

48


Priloga 3: Rezultati ugotavljanja antigenov C, c, E in e na mikrotitrski ploščici z reagenti Eccoclone



negativno

Čitalec aglutinacije ne ovrednoti ("?")


11.10.2004 4 1 0 10.11.2004 48 3 12.11.2004 48 1 16 15.11.2004 48 1 18.11.2004 96 2 19.11.2004 96 1 22.11.2004 48 6 25.11.2004 96 33 33 33 33 0 26.11.2004 96 7 3 30.11.2004 120 1 1 5 2 1.12.2004 48 0 2.12.2004 48 3 3.12.2004 48 0 6.12.2004 48 0 7.12.2004 57 0 8.12.2004 54 1 4 9.12.2004 54 1

10.12.2004 54 1 13.12.2004 24 0 14.12.2004 24 1 0 15.12.2004 24 0

Skupno št. vzorcev 1150 1 0 0 0 2 0 1 14 43 % 0,09 0 0 0 0,17 0 0,09 1,22 0,93 Opomba : Dne 25.11.2004 mikrotitrske ploščice niso bile dovolj oprane z Tweenom, posledično so se eritrociti prilepili na dnu mikroepruvete na mikrotitrski ploščici, zato smo pri izračunih izključili 33 vzorcev.

49


Priloga 4: Rezultati testiranja antigena K in fenotipa Rh v epruveti z reagenti Ecoclone, katere smo primerjali z rezultati ugotavljanja antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single.


Število lažno pozitivnih rezultatov

vpisanih v CP


vpisanih v CP Datum

Število vzorcev C c E e K C c E e K C c E e K

15.12.05 37 16.12.05 48 1 19.12.05 48 20.12.05 32 03.01.06 48 04.01.06 64 1 05.01.06 102 06.01.06 71 1 1 09.01.06 64 10.01.06 64 11.01.06 48 12.01.06 48 13.01.06 64 16.01.06 47 17.01.06 64 1 18.01.06 64 19.01.06 107 1

Skupno št. vzorcev 1020 0 0 0 0 0 2 0 0 0 2 0 0 0 0 2

% 0 0 0 0 0 0,2 0 0 0 0,2 0 0 0 0 0,2

50


Priloga 5: Rezultati testiranja antigena K in fenotipa Rh na mikrotitrski ploščici Biotest Erytype Rh+K 16-single



negativno Čitalec aglutinacije ne ovrednoti (»?«)

Datum Število vzorcev C c E e K C c E e K C c E e K

15.12.05 37 16.12.05 48 19.12.05 48 20.12.05 32 03.01.06 48 04.01.06 64 05.01.06 102 06.01.06 71 09.01.06 64 10.01.06 64 11.01.06 48 12.01.06 48 13.01.06 64 1 16.01.06 47 17.01.06 64 1 18.01.06 64 1 19.01.06 107 1

Skupno št. vzorcev 1020 1 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

% 0,1 0 0,2 0 0 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

51


52

Priloga 6: Rezultati testiranj antigena K na gelski kartici DiaMed DiaClon Anti–K

DATUM Število vzorcev



negativno Čitalec aglutinacije ne ovrednoti (»?«)

19.9.2006 34 0 0 1 21.9.2006 6 0 0 0 27.9.2006 12 0 0 0

16.10.2006 12 0 0 0 19.10.2006 9 0 0 0 20.10.2006 12 0 0 0 8.11.2006 14 0 0 0

29.11.2006 22 0 0 0 30.11.2006 19 0 0 0

Skupno št. vzorcev 140 0 0 1 % 0 0 0,71 Priloga 7: Prenos podatkov iz čitalca mikrotitrskih ploščic Tecan SLT Spectra in iz čitalca gelskih kartic ID Reader SA v informacijski sistem Datec

DATUM

Število vzorcev testiranih na gelski

kartici DiaMed DiaClon Anti-K

Število vzorcev testiranih na MTP Biotest Erytype Rh+K 16-single

Opombe pri prenos podatkov v informacijski sistem Datec

19.9.2006 34 42

V IS Datec so se prenesli tudi rezultati kontrolnih krvi iz MTP. Izpisa »106«, »108« OK, na izpisu »107« krvi, katere so bile zadržane pred dnevi.

21.9.2006 6 47 Izpisi in prenos OK. 27.9.2006 12 20 Izpisi in prenos OK.

16.10.2006 12 22 Izpisi in prenos OK. 19.10.2006 9 16 Izpisi in prenos OK. 20.10.2006 12 20 Izpisi in prenos OK. 8.11.2006 14 22 Izpisi in prenos OK.

29.11.2006 22 30 Izpisi in prenos OK. 30.11.2006 19 27 Izpisi in prenos OK.

Skupno št. vzorcev 140 246

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI - ffa.uni-lj.si · PDF fileInterpretacija gelske kartice ... E in e ter avtomatizirati prenos podatkov iz dveh laboratorijskih ... vezavo rezultata na matiþno