Univerzita Palackého v Olomouci

Bakalářská práce

Olomouc 2012 Monika Gembalová

2

Univerzita Palackého v Olomouci

Přírodovědecká fakulta

Katedra botaniky

Molekulární identifikace

a charakterizace kolekce hub z čeledi

Morchellaceae a řádu Boletales

Bakalářská práce

Monika Gembalová

Studijní program: Chemie

Studijní obor: Chemie pro víceoborové studium – Biologie (CH – BI)

Forma studia: Prezenční

Olomouc 2012 Vedoucí práce: doc. RNDr. Vladan Ondřej, Ph.D.

3

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala sama pod vedením

doc. RNDr. Vladana Ondřeje, Ph.D. Veškeré literární zdroje a informace, které jsem

v práci použila, jsou uvedeny v seznamu použité literatury.

V Olomouci dne …………………… Podpis ……………………...

4

Děkuji panu doc. RNDr. Vladanovi Ondřejovi, Ph.D. za jeho odborné vedení a cenné

rady. Dále bych chtěla poděkovat panu Ing. Pavlovi Havránkovi a panu Josefovi

Šutarovi za poskytnutí materiálu. Děkuji také své rodině za podporu a zázemí.

5

SOUHRN

Čeleď Morchellaceae byla dosud charakterizována převážně na základě

morfologických znaků (velikost a tvar plodnic, výtrusy). Některé studie uvádějí,

že do této čeledi patří pouze tři až pět druhů, jiní se domnívají, že i 50 a více (Madhavi

2005). Genetickou příbuznost lze určit na základě sekvenčních dat ITS regionů.

Z vytvořených fylogramů bylo možné identifikovat fylogenetické vazby u vybraných

zástupců čeledi Morchellaceae.

Řád Boletales je jednou z hlavních skupin tvořících houby, které jsou zastoupeny

ve většině lesních ekosystémů po celém světě. Tato skupina obsahuje asi tisíc

popsaných druhů (Binder & Hibbett 2006). Vzhledem k rozdílným ekologickým

podmínkám je taxonomická identifikace složitá. Na základě této skutečnosti byly

použity genetické metody, aby objasnily příbuznost studovaných vzorků. Výsledky

získané ze sekvenčních dat poukazují na vyčlenění rodu Xerocomellus, který obsahuje

dvě geneticky rozdílné skupiny. V rámci rodu Xerocomellus se vyčlenil rod Chalciporus.

6

SUMMARY

Family Morchellaceae has been characterized mainly on the basis of the

morphological features (sporocarp size and form, spores). Some studies state, that

this family includes only 3 to 5 species, while others assume even more than 50

(Madhavi 2005). Genetic relatedness can be determined from the sequence data

of the ITS regions. The phylogenetic relationships of selected representatives of the

family Morchellaceae were identified from the resulting phylograms.

Order Boletales is one of the main groups of fungi, which are present in most

of the forest ecosystems all over the world. This group consists of about 1000

described species (Binder & Hibbet 2006). Taxonomic identification is difficult

because of different ecological circumstances. Based on this fact, genetic methods

were used to clarify the relatedness of the studied species. The results obtained

from the sequence data indicate the division of the genus Xerocomellus, which

contains two genetically different groups. Genus Chalciporus branched off

from within the genus Xerocomellus.

7

OBSAH

1 CÍLE PRÁCE 8

2 ÚVOD 9

3 TEORETICKÁ ČÁST 10

3.1. CHARAKTERISTIKA ŘÁDU PEZIZALES 10

3.1.1. Systém a charakteristika čeledi Morchellaceae 11

3.1.2. Charakteristika studovaných rodů 11

3.2. CHARAKTERISTIKA ŘÁDU BOLETALES 14

3.2.1. Hřiby a jejich morfologie 14

3.2.2. Klobouk 15

3.2.3. Hymenofor 16

3.2.4. Výtrusy 17

3.2.5. Třeň 17

3.2.6. Dužina 18

3.2.7. Vnější obal plodnice 18

3.2.8. Charakteristika studovaných rodů 19

3.3. MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÉ METODY 22

4 PRAKTICKÁ ČÁST 24

4.1. MATERIÁL 24

4.1.1. Biologický materiál 24

4.1.2. Chemikálie 29

4.1.3. Vybavení 29

4.2. METODY 29

4.2.1. Izolace DNA 29

4.2.2. PCR (polymerázová řetězová reakce) 30

4.2.3. Elektroforéza 31

4.2.4. Purifikace PCR produktů a sekvenování 31

5 VÝSLEDKY 33

6 DISKUZE 38

7 ZÁVĚR 39

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 40

8

1 CÍLE PRÁCE

Vypracování rešerše na téma molekulární identifikace a charakterizace kolekce

hub z čeledi Morchellaceae a řádu Boletales

Použití molekulárně-biologických metod (izolace DNA, PCR, elektroforéza,

sekvenování) ke zjišťování genetické variability

Práce se sekvenčními daty a sestavení fylogramů

9

2 ÚVOD

Rod Morchella, Verpa a Ptychoverpa patří do třídy Pezizomycetes, řádu Pezizales

a čeledi Morchellaceae (Kalina & Váňa 2005). Smrži představují jedny z nejvíce

ceněných jedlých hub, ale veškeré informace o toxicitě dosud nebyly jasně definovány.

Na základě fylogenetických vztahů by bylo možné např. rozlišit rod Morchella (smrž)

a Gyromitra (ucháč), jež patří mezi houby jedovaté (Ondřej et al. 2011). Smrži mají dvě

odlišné ekologické strategie. Jsou to saprotrofické houby rostoucí na narušené půdě

charakterizované vysokou dostupností živin a nízkým konkurenčním tlakem, anebo

mutualistické houby v stabilizovaných ekosystémech s vysokou konkurencí na živiny.

Tato ekologická plasticita je velmi neobvyklá (Buscot et al. 1996). Systém založený

na morfologických znacích zahrnuje 3-30 druhů rodu Morchella. Tato skutečnost odráží

obrovskou variabilitu plodnic způsobenou jejich stanovišti a specifickými abiotickými

a biotickými podmínkami. Na základě sekvenčních dat bylo možné oddělit skupinu

Adnatae (žlutí smrži) a Distantes (černí smrži). Později bylo potvrzeno, že čeleď

Morchellaceae, včetně rodu Morchella je monofyletického původu (Kellner et al. 2005).

Smrže je velmi obtížné taxonomicky charakterizovat a některé skupiny dosud nejsou

jasně popsány. Díky genetické studii je možné na základě získaných vzorků ověřit

taxonomickou identifikaci včetně fylogenetických vztahů a porovnat je s výsledky

z celého světa (Ondřej et al. 2011).

Řád Boletales patří do podtřídy Agaricomycetidae a zahrnuje čeledi Boletaceae

(s hymenoforem v podobě rourek), Gomphidiaceae a Paxillaceae (hymenofor tvořený

lupeny). Většina zástupců jsou mykorhizní houby s úzkou vazbou na jeden nebo

několik druhů dřevin (Kalina & Váňa 2005), ale mohou být i mykoparazité. Houby

uvedeného řádu se vyskytují na většině lesních území na celém světě. Dosud je

popsaných asi 1000 druhů. Vzhledem k rozmanitosti plodnice je charakterizace

dle morfologie složitá. Řád Boletales tvoří monofyletický taxon (Binder & Hibbett

2006), což je jediná přirozená skupina ve smyslu fylogenetiky (Kalina & Váňa 2005).

10

3 TEORETICKÁ ČÁST

3.1. Charakteristika řádu Pezizales

Řád Pezizales zahrnuje operkulátní diskomycety. Mycelium je podzemní, jedno-

i vícebuněčné. Někdy se tvoří sklerocia. U většiny druhů je známá pouze teleomorfa,

tj. pohlavně se rozmnožující fáze životního cyklu. Pohlavní rozmnožování je různé.

Nejčastěji se vyskytuje gametangiogamie, ale může dojít i k spermatizaci, somatogamii

a autogamii, která je typická pro rod Morchella (Kalina & Váňa 2005).

Vývoj plodnice je askohymeniální. Základ této plodnice je na místě, kde došlo

k pohlavnímu procesu. Její vývoj probíhá s vývojem askogenních hyf. Plodnice jsou

typu apothecia. Mají miskovitý, poduškovitý, kalichovitý a různě zprohýbaný tvar.

U některých zástupců mohou být stopkatá. Dosahují různé délky od 10 do 25 cm

výšky. Z ontogenetického hlediska se jedná o plodnice gymnokarpní (otevřená

plodnice s nezakrytým hymeniem), hemiangiokarpní (hymenium je nejprve uzavřené

a teprve během vývoje plodnice se obnažuje) nebo angiokarpní (uzavřená plodnice,

která se otevírá až v době zralosti spor). Povrch plodnice kryje jedno- až vícevrstevná

peridie. Výtrusorodá část, gleba, vzniká zprohýbáním apothecia na lišty (Kalina & Váňa

2005).

Vřecka jsou unitunikátní zpravidla elipsoidního až válcovitého tvaru. Mohou být

ale i kapkovitá až kulovitá. U většiny zástupců jsou operkulátního typu (otevírají se

víčkem). Tvar, velikost, struktura stěn i barva spor jsou v rámci řádu velmi variabilní

(Kalina & Váňa 2005). Vrchol vřecek se zbarvuje při zkoušce s jodem modře (Antonín

2006).

Většina druhů tohoto rozsáhlého řádu jsou půdní saprofytové s nápadně

zbarvenými plodnicemi (žlutě, oranžově, purpurově, fialově). Rostou na holé půdě,

mrtvém dřevě, rostlinných zbytcích, ale i na spáleništích či exkrementech (Kalina

& Váňa 2005).

3.1.1. Systém a charakteristika čeledi Morchellaceae

Oddělení: Vřeckovýtrusné houby, vřeckaté houby, askomycety – Ascomycota

Pododdělení: Pezizomycotina (syn. Ascomycotina)

Třída: Pezizomycetes

Řád: Pezizales

Čeleď: Morchellaceae (Kalina & Váňa 2005)

11

Čeleď Morchellaceae

Tato skupina je dosti nejednoznačná. Mezi charakteristické znaky používané

v klasifikaci patří např. zvrstvení stěny, popř. uspořádání hyf v apotheciu (Hansen

& Pfister 2006). K záměnám může dojít u dvou podobných rodů. Jedná se o kačenku

(Verpa) a ucháče (Gyromitra). Ptychoverpa bohemica je běžně lidmi konzumována

a prodávána také komerčně. Některé druhy těchto rodů mohou být potenciálně toxické,

zejména jsou-li nedostatečné tepelně upravené. Z těchto důvodů je lépe se jim

vyhnout. Rozdíly mezi chřapáčem (Helvella) a terčovnicí (Disciotis) se neuvádějí,

neboť je lze snadno rozpoznat dle vzhledu apothecia (Pilz et al. 2007).

Plodnice jsou rozděleny na klobouk a třeň. Plodná kloboukatá část je kuželovitá

až téměř kulovitá, často nepravidelná, jamkatá, na bělavém válcovitém třeni. Vnitřní

část klobouku je zcela nebo alespoň do poloviny přirostlá ke třeni. Rostou saprotrofně

na zemi v listnatých lesích a hájích (Antonín 2006).

Čeleď Morchellaceae zůstává nejednoznačná, a to i přesto, že již bylo několik studií

zveřejněno. Znalosti týkající se ekologie, biologie a rozmanitosti druhů zůstávají

omezené, kvůli jejich vysoké variabilitě. Liší se barvou, která se pohybuje od černé

až po nažloutlou, tvarem i velikostí žeber. Všechny tyto skutečnosti velmi komplikují

systematizaci dle morfologických znaků. Vyskytují se po celém světě na celé řadě

různých stanovišť. V Izraeli byla zkoumána unikátně dlouhá doba vývoje plodnic. Byl

objeven druh, který produkuje askokarpy po delší dobu. Pomocí molekulárních metod

bylo možné popsat výskyt jednotlivých druhů v letech 2001 až 2007

(Masaphy et al. 2009).

Právě z důvodu nejednoznačnosti systému proběhla genetická studie s cílem ověřit

taxonomickou identifikaci včetně fylogenetických vztahů v porovnání se záznamy

z celého světa (Ondřej et al. 2011).

3.1.2. Charakteristika studovaných rodů

Morchella esculenta (smrž obecný)

Jeden z nejhojnějších zástupců čeledi Morchellacea má klobouk vysoký 4 – 8 cm

a široký 3 – 6 cm. Tvar je zpravidla vejčitý, kulovitý nebo tupě kuželovitý. Spodním

okrajem přirůstá ke třeni. Povrch kryjí nepravidelně uspořádané hluboké jamky různých

tvarů ohraničené téměř kolmými přepážkami. Zbarvení se v průběhu růstu mění

od šedé až šedookrové po žlutookrovou až hnědou, na ostří přehrádek je

až načervenalá (Hagara 1993).

12

Třeň se v dolní části rozšiřuje (Hagara 1993), tudíž nabývá tvaru kyjovitého

(Antonín 2006), výjimečně je tvaru válcovitého. Povrch kryjí jemná zrníčka, popř. je

vrásčitý nebo nízce jamkatý. Zbarvení bývá zprvu bílé, později u báze načervenalé

(Hagara 1993).

Dužina je vodnatě voskovitá, křehká, v jamkaté části klobouku žlutookrová

až hnědavě okrová, v dutině třeně i klobouku bělavá, s nevýraznou vůní a chutí

(Hagara 1993).

Roste brzy na jaře (Váňa 1996) ve světlých hájích, křovinách, parcích a zahradách

(Antonín 2006), především na hlinitopísčitých půdách (Hagara & Váňa 2005). Místy je

hojný, jinde může chybět (Hagara 1993).

Jedlá a velmi chutná houba vhodná k jakékoli úpravě i na sušení. Staré plodnice

mohou obsahovat jedovaté látky uvolňované při rozkladu dužiny (Hagara 1993).

Smrže obecného lze zaměnit s jinými druhy smržů, ale i s kačenkou českou

(Ptychoverpa bohemica), která má podstatně menší a pouze na vrcholu třeně přirostlý

klobouk. Nebezpečí hrozí pouze u záměny s ucháčem obecným (Gyromitra esculenta),

který má charakteristicky mozkovitě zprohýbaný klobouk (Hagara 1993).

Morchella elata (smrž vysoký)

Má poněkud tmavší, hnědě, olivově hnědě až černě zbarvený klobouk s výrazným

ostrým žebrováním (Antonín 2006), tvaru kuželovitého, válcovitě kuželovitého nebo

štíhlého. Vrchol klobouku je většinou ostrý, vzácně tupý. Spodní okraj mírně přesahuje

třeň a odsedle k němu přirůstá (Hagara 1993). Žebra jsou přehrádkovaná na čtyři až

vícehranné jamky, uspořádané víceméně v pravidelných svislých řadách (Antonín

& Hagara 2005). Zbarvení se pohybuje v různých odstínech hnědé s šedým, černavým,

purpurovým nebo olivovým nádechem (Hagara 1993).

Třeň je tvaru válcovitého, často s rozšířenou horní nebo spodní částí, většinou

ploše brázditý, dutý, hustě vločkatý, v mládí bělavý, později zlatavý, okrový

až žlutohnědý (Hagara 1993).

Tenká křehká dužina je ve třeni tuhá, za syrova bez výrazné vůně a chuti.

Po usušení aromatická (Hagara 1993).

Roste ve stinných hájích, na rumištích nebo podél cest (Antonín 2006). Hojnější je

pouze v podhorských oblastech (Hagara 1993). Vyskytuje se od nížin po horský stupeň

na vápenatých, hlinitých i písčitých půdách (Hagara 1993). Bývá častým průvodcem

porostů devětsilu podél cest (Antonín & Hagara 2005). Morfologicky je podobný jiným

smržovitým houbám charakterizovanými ostrým vrcholem klobouku, např.: smržem

kuželovitým (Morchella conica) (Hagara 1993).

13

Mitrophora semilibera (smrž polovolný)

Klobouk je tvaru kuželovitého až zvoncovitého, který je hnědě až olivově hnědě

zbarvený (Antonín 2006). Na povrchu má ostrá žebra rozdělená v protáhlé jamky.

Klobouk je asi do poloviny vnitřní plochy připojený k bělavému, jemně zrnitému třeni

(Antonín & Hagara 2005).

Roste ojediněle ve světlých hájích, zahradách a sadech (Antonín 2006). Je chutný.

Jako jediný náš druh smržů nemá klobouk přirostlý celou vnitřní plochou k třeni.

Záměna je možná jen za kačenku českou, která má však klobouk připojený k třeni

pouze na jeho vrcholu. Je rovněž jedlá (Antonín & Hagara 2005).

Morchella crassipes (smrž tlustonohý)

Vytváří velké, až 300 mm vysoké plodnice. Klobouk je kulovitý až tupě kuželovitý,

na temeni tupý nebo zašpičatělý, se zvlněnými žebry s nepravidelnými okrouhlými

nebo vícehrannými jamkami, okrový, šedohnědý až hnědý (Antonín & Hagara 2005).

Třeň bývá zpravidla kyjovitý, na bázi výrazně zduřelý (Antonín 2006).

Roste vzácně v zastíněných místech v lesích a hájích (Antonín 2006). Vzhledem

k mohutnosti a velikosti plodnic a tvaru třeně je poměrně snadno určitelný. Lze ho

zaměnit pouze se smržem obecným, který má však vždy víceméně okrouhlý klobouk,

nikoli tupě kuželovitý. Další odlišností je i třeň, který nebývá výrazně žebernatý. Někteří

autoři pokládají smrže tlustonohého jen za variantu smrže obecného (Antonín

& Hagara 2005).

Ptychoverpa bohemica (kačenka česká)

Patří mezi nejoblíbenější jarní houby. Má vysoký zvoncovitý žlutohnědý až hnědý

klobouk, výrazně podélně žebernatý. Připojuje se pouze nahoře k víceméně

válcovitému, v mládí jemně vločkatému bělavému třeni (Antonín & Hagara 2005).

Dužina je tenká, voskovitá, křehká, s nevýraznou vůní a příjemnou chutí (Hagara

1993).

Roste místy hojně, většinou v listnatých hájích, zejména pod osikami, ale také

pod jeřáby, olšemi, trnkami aj. dřevinami. Na některých nalezištích se vyskytuje

masově (Antonín & Hagara 2005). Dává přednost zásaditým půdám s dostatkem živin.

Za příznivého počasí je možné ji na stejných místech sbírat každé jaro. Jedná se

o velmi chutnou houbu s podobným využitím jako smrž obecný. Konzumují se pouze

mladé plodnice, dospělé plodnice jsou ke konzumaci nevhodné (Hagara 1993).

14

Zaměnit se dá s kačenkou náprstkovitou, jež má hladký nebo pouze jemně zbrázděný

klobouk, a s některými druhy smržů, ale ty mají vnitřní stranu klobouku přirostlou k třeni

celou plochou nebo alespoň do její poloviny (Antonín & Hagara 2005).

Verpa conica (kačenka náprstkovitá)

Podobná kačence české, ale o něco menší. Klobouk je olivově hnědý až hnědý,

téměř hladký nebo jemně vrásčitý. Nikdy nejsou patrná výrazná žebra. Od kačenky

české se liší i mikroskopicky. Výtrusy má daleko menší, v každém vřecku po osmi

(Antonín & Hagara 2005).

Roste většinou v listnatých hájích hlavně pod osikami, ale i jinými dřevinami

(Hagara 1993). Vyskytuje se ojediněle, na rozdíl od kačenky české. Je rovněž velice

chutná (Antonín & Hagara 2005).

Verpa conica var. cerebriformis (kačenka náprstkovitá mozkovitá)

Od typické formy kačenky náprstkovité se liší hluboce žilnatým, mozkovitě

utvářeným kloboukem. Podobá se kačence české, která však nemá mozkovitě

zprohýbaná klobouk a má pouze dva až čtyři výtrusy v každém vřecku. Obě formy mají

ve vřeckách po osmi výtrusech (Antonín & Hagara 2005).

V České republice je velice vzácná (Antonín & Hagara 2005).

3.2. Charakteristika řádu Boletales

Základ řádu tvoří druhy s rouškatými plodnicemi nebo plodnicemi přechodnými

k břichatkovitým houbám. Klasickými čeleděmi jsou potom Boletaceae, Gomphidiaceae

a Paxillaceae. Plodnice je hemiangiokarpní nebo gymnokarpní pilothecium. Velum

partiale je přítomno u řady druhů. Hymenofor je lehce od klobouku oddělitelný (Kalina

& Váňa 2005).

3.2.1. Hřiby a jejich morfologie

Tělo hub je tvořeno myceliem (podhoubím), což je vegetativní část houby v podobě

vláken nebo povlaků, umístěná v substrátu. U většiny hub se nachází pod zemí, kde

roste v soužití s některými cévnatými rostlinami. Zpravidla to bývají dřeviny.

Pro hřibovité houby je charakteristická ektomykorhiza. Při ektomykorhize mycelium

15

obaluje kořínky symbiotické rostliny, ale neproniká dovnitř buněk hostitele. Z podhoubí

vyrůstají plodnice, na kterých vznikají rozmnožovací tělíska. Období vývoje plodnic se

nazývá období fruktifikace (Šutara et al. 2009).

Symbiotické vztahy mezi houbami a cévnatými rostlinami bývají dlouhodobé.

Pro některé hřiby je charakteristický pouze jeden druh nebo rod stromu, zatímco jiné

mohou tvořit mykorhizu jak s listnáči, tak s jehličnany. Úzká vazba je například

u klouzků (rod Suillus), kde jedna skupina tvoří mykorhizu výhradně s modříny a druhá

s borovicemi (Šutara et al. 2009). Klouzky charakterizuje slizká pokožka klobouku

a často i přítomný prsten (Kalina & Váňa 2005). Rovněž křemenáče a kozáky jsou

vázány na určité stromy. Křemenáč osikový (Leccinum rufum) je vázán pouze na osiku

(Populus tremula) (Šutara et al. 2009). Kozáky a křemenáče mají v dospělosti poměrně

tenký, šupinatý třeň (Kalina & Váňa 2005).

Zvláštní způsob obživy má hřib příživný (Pseudoboletus parasticus), který je sice

schopný tvořit ektomykorhizu, ale v určitém období, tj. v době kdy vytváří plodnice,

přechází na parazitický způsob života a roste jako mykoparazit na plodnicích pestřece

obecného (Scleroderma citrinum) (Šutara et al. 2009).

U hřibu dřevožijného (Buchwaldoboletus lignicola) a hřibu sírového

(Buchwaldoboletus sphaerocephalus) se vyskytuje saprotrofismus. Tyto houby se živí

rozkladem dřeva jehličnanů (Šutara et al. 2009).

3.2.2. Klobouk

Klobouk téměř všech hřibů je v raném stadiu polokulovitý, později klenutý až ploše

rozprostřený. U starých plodnic se mohou okraje klobouku ohýbat nahoru. Průběh

růstu u většiny hřibů je podobný. Někdy může být tvar klobouku charakteristickým

znakem určitého druhu (Šutara et al. 2009).

Zbarvení klobouku bývá dosti proměnlivé působením vnějších vlivů a některých

ekologických činitelů. Mění se také v závislosti na stáří plodnic. U některých druhů je

klobouk v raném mládí zbarvený tmavěji než dospělá plodnice, u jiných druhů tomu je

naopak. Dochází k postupnému vytváření pigmentu v pokožkových hyfách na klobouku

v průběhu růstu plodnic. Na tvorbu pigmentu má vliv hlavně světlo. Mladé plodnice

hřibu smrkového (Boletus edulis), které jsou ukryté pod jehličím nebo listím, mají

klobouk bílý. Jakmile vyrostou a začne na ně dopadat světlo, získávají typicky hnědou

barvu (Šutara et al. 2009).

Pokožka klobouku se jeví jako holá. Ve skutečnosti je však sametová nebo

plstnatá. Mikroskopická stavba pokožky bývá tvořena trichodermem. Trichoderm je typ

pokožky tvořený částečně propletenými hyfami, které nejsou stejně dlouhé. Lze ho

16

najít u druhů rodů Boletus, Gyroporus, Buchwaldoboletus, Xerocomus, Phylloporus,

Tylopilus, Pseudoboletus, Porphyrellus, Leccinum aj. U mladých plodnic jsou hyfy

vzpřímené, u starších trichodermové hyfy zkolabují a jeví se jako lysý. Hyfy se mohou

také shlukovat do skupinek a tvořit povrch šupinkatý (Šutara et al. 2009).

Palisádodermem je tvořena např. pokožka hřibu žlutomasého (Xerocomellus

chrysenteron). Jedná se o kompaktní vrstvu víceméně rovnoběžných hyf, uspořádané

v antiklinálním směru. V pozdějších stádiích se kompaktní vrstva rozpadá a postupně

se roztrhává na fragmenty. Makroskopicky se pak pokožka jeví jako políčkovitě

rozpraskaná (Šutara et al. 2009).

Povrch klobouků některých hub může být i slizký (Suillus) nebo lepkavý (u většiny

druhů rodu Boletus). Ixotrichodermem je tvořena pokožka hub s nejvíce slizkým

kloboukem. V ixotrichodermu jsou vláknité hyfy pokožky uzavřené v gelatinózní hmotě.

Vyskytuje se například u hřibu pružného (Aureoboletus gentilis) a u většiny klouzků

(Šutara et al. 2009).

Pro křemenáče (Leccinum) je charakteristická nepravidelně přívěsková blanka

přesahující cca 2-4(-6) mm přes okraj klobouku. Tento znak lze sledovat jen

u mladších plodnic. U starších plodnic postupně mizí (Šutara et al. 2009).

3.2.3. Hymenofor

Hymenofor je část plodnice nesoucí výtrusorodou vrstvu - hymenium (rouško).

Hymenium je vrstva buněk bazidií, bazidiol a cystid, které jsou palisádovitě

uspořádané. Bazidie mají důležitou funkci z hlediska reprodukce. Dochází u nich

k redukčnímu dělení po karyogamii a k tvorbě výtrusů, kterými se rozmnožují. Cystidy

jsou zvláštní buňky důležité zejména k určování některých skupin hub. Podle umístění

na hymenoforu se dělí na pleurocystidy (cystidy na stěnách rourek), cheilocystidy

(cystidy na ústí rourek), a na kaulocystidy (cystidy na povrchu třeně)

(Šutara et al. 2009).

Hymenofor většiny našich hub je tvořen rourkami. Důležitým znakem je připojení

rourek na třeň. Toto připojení se postupně vyvíjí, proto je nutné ho posuzovat

až na dospělých plodnicích. Připojení rourek může být sbíhavé, připojené, mírně

stlačené, mírně stlačené a malým zoubkem sbíhající a silně stlačené až téměř volné.

Hřib dřevožijný (Buchwaldoboletus lignicola) a hřib peprný (Chalciporus piperatus) mají

sbíhavé rourky. Rourky mírně stlačené a malým zoubkem sbíhající jsou

charakteristické pro hřib plstnatý (Xerocomus subtomentosus) a hřib žlutomasý

(Xerocomellus chrysenteron). Rod Boletus má rourky stlačené (Šutara et al. 2009).

Mezi další důležité určovací znaky patří velikost pórů. V mládí jsou póry skoro

17

všech hub malé, ale u některých mohou zůstat drobné i v dospělosti. U některých

skupin se postupně zvětšují. Pro rod Boletus jsou charakteristické drobné plodnice,

které nejsou větší než 1mm. Středně velké póry (1-3mm) můžeme nalézt u rodů

Xerocomus a Xerocomellu (Šutara et al. 2009).

3.2.4. Výtrusy

Výtrusy boletoidního tvaru, tj. elipsovitě vřetenovité, protáhlé až válcovitě

vřetenovité s mělkou prohlubní nad apikulem, mají například druhy Chalciporus,

Aureoboletus, Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus, Xerocomellus, Tylopilus,

Porphyrellus, Pseudoboletus a Leccinum. Povrch výtrusů u těchto rodů je většinou

hladký. Pouze hřib sametový (Xerocomellus pruinatus) má výtrusy jemně podélně

žíhané a hřib plstnatý (Xerocomus subtomentosus), pro který je charakteristický povrch

plodnic ozdobený jemnou ornamentikou nazývanou „baciloidní“ (Šutara et al. 2009).

Barva výtrusného prachu patří mezi další určovací znaky. Olivový nebo

hnědoolivový prach mají rody Aureoboletus, Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus,

Xerocomellus aj. Výtrusný prach bez olivového odstínu (například hnědorůžový, světle

hnědý, hnědočervený apod.) najdeme u rodů Tylopilus a Chalciporus . Můžeme tedy

odlišit rody s olivovým výtrusným prachem od rodů, které olivový odstín nemají (Šutara

et al. 2009).

3.2.5. Třeň

Mezi makroskopické znaky třeně patří zejména tvar, velikost, zbarvení a povrchová

ornamentika (Šutara et al. 2009).

Na povrchu se na třeni vyskytuje síťka, plstnaté šupinky či drobné zrníčka. Síťka

pokrývá celý třeň, ale může být i redukovaná, či ve vzácných případech zcela chybět

i u druhů, u nichž je jinak běžně vyvinuta (Šutara et al. 2009).

Typická ornamentika je charakteristická pro rod Leccinum (kozáky a křemenáče).

Povrch třeně je roztrhaný na šupinky. Tyto šupinku jsou buď už od mládí tmavé, nebo

tmavnou až v průběhu dalšího vývoje (pouze u několika málo výjimek). Podobnou

ornamentiku lze najít u hřibu plavého (Hemileccinum impolitum) a hřibu skvrnitého

(Hemileccinum depilatum). Rozdíl je pouze v tom, že šupinky jsou zbarveny světle

a během růstu netmavnou nebo tmavnou pouze nepatrně (Šutara et al. 2009).

Výtrusy se mohou vytvářet nejen v hymenoforu, ale i na povrchu třeně. Třeň je tedy

plodná a pokrytá kaulohymeniem. Což je v mládí souvislá vrstva palisádovitě

uspořádaných buněk (kaulobazidie, kaulocystidy, kaulobazidioly), která se později trhá

18

na malé fragmenty – ostrůvky kaulohymeniálních buněk. Fragmenty se makroskopicky

jeví jako drobná zrníčka. Mezi tramou třeně a kaulohymeniem je vyvinuta laterální

stratum třeně. Od tramy, která je tvořena hustě uspořádanými hyfami s podélnou osou

třeně, se liší divergentním a volnějším uspořádáním hyf. Laterální stratum třeně je

charakteristické např. pro rody Buchwaldoboletus, Boletus, Xerocomus, Leccinum

a další. Neplodný povrch třeně má jen velmi málo hřibů (např. Gyrodon lividus) (Šutara

et al. 2009).

3.2.6. Dužina

Dužina hřibů je v mládí tuhá a kompaktní. Postupem času měkne a roztéká se

na kašovitou hmotu. Tato změna je typická pro většinu hřibů. Charakterizovat ji

budeme pouze u druhů, které ji mají nějakým způsobem význačnou, jak tomu je

např. u šiškovce černého (Strobilomyces strobilaceus), který má dužinu mimořádně

suchou (Šutara et al. 2009).

Dužina ve třeni bývá zpravidla tužší než v klobouku. Liší se mikroskopickou

stavbou. Zatímco trama dužiny klobouku je tvořena hyfami, které jsou volně

uspořádané a vzájemně nepravidelně propletené všemi směry, trama dužiny třeně je

tvořena hustě namačkanými a pravidelně uspořádanými více méně rovnoběžném

s podélnou osou třeně (Šutara et al. 2009).

Dalším charakteristickým znakem je barva dužiny. Díky ní lze některé druhy

spolehlivě určit. Hřib Engelův (Xerocomellus Engelii) má červenooranžovou

až mrkvově červenou dužinu v bázi třeně. Mezi další hřiby, které lze určit dle dužiny

patří hřib koloděj (Boletus luridus) nebo hřib kovář (Boletus luridiformis). Dužina se

u některých skupin může po poranění zbarvovat, ale u některých je neměnná. Tento

proces zbarvování se někdy nazývá oxidace. Intenzivní modré zbarvení je u druhů

Luridi rodu Boletus. U některých druhů rodu Leccinum je dužina nejprve špinavě

růžová a postupně se zbarvuje do šeda, šedočerna až černa. U šiškovce černého

(Strobilomyces strobilaceus) probíhá postupný proces černání (Šutara et al. 2009).

3.2.7. Vnější obal plodnice

Vnější obal plodnice se nazývá velum. Většina našich hub však velum ani prsten

nemá. Některé houby jsou ale v mládí obaleny zvláštní vrstvou pletiva. Jedná se

o plachetku neboli univerzální velum. Toto velum je vyvinuto pouze u šiškovce černého

(Strobilomyces strobilaceus). Postupně se roztrhává a na klobouku zůstává v podobě

vlnatých šupin (Šutara et al. 2009).

19

U některých klouzků (Suillus) je vyvinuto blanité velum nazývané závoj neboli

velum partiale. Nachází se mezi okrajem klobouku a třeněm. V mládí zakrývá rourky.

Během dalšího vývoje se postupně roztrhává a jeho zbytky zůstávají na okraji

klobouku, až na konec zcela zmizí. Na povrchu třeně zbytky velum partiale zůstávají

a vytváří prsten (Šutara et al. 2009).

3.2.8. Charakteristika studovaných rodů

Morfologická evoluce a ekologie řádu Boletales zůstává dosud do značné míry

neobjasněna. Během vývoje pravděpodobně docházelo k rozsáhlým konvergencím.

Na základě analýz bylo potvrzeno, že řád Boletales vytváří monofyletický taxon.

V současné době zahrnuje šest skupin: Boletineae, Paxillineae, Sclerodermatineae,

Suillineae, Tapinellineae a Coniophorineae. Výsledky získané na základě sekvenčních

dat potvrdily skutečnost, že Boletales, Agaricales a Atheliales jsou geneticky příbuzné.

Zástupci čeledi Boletales dosáhli pozoruhodné odlišnosti, neboť se vyskytují

na různých ekosystémech po celém světě (Binder & Hibbett 2006).

20

Tab. 1: Morfologické znaky řádu Boletales (a)

Klobouk

[mm] Tvar Barva Rourky

Xerocomellus

chrysenteron 30 – 80 klenutý šedohnědá připojené

Xerocomellus

porosporus 30 - 65 klenutý šedohnědá připojené

Xerocomellus marekii 25 - 65 klenutý červená stlačené

Xerocomellus engelii 30 - 70 klenutý hnědooranžová připojené

Xerocomellus

ripariellus 30 - 65 klenutý krvavě červený připojené

Xerocomellus pruinatus 30 - 90 klenutý načervenale hnědý připojené

Xerocomellus rubellus 35 - 65 klenutý karmínově až tmavě červená připojené

Boletus edulis 60 - 200 klenutý sytě hnědá stlačené

Buchwaldoboletus

lignicola 30 - 90 klenutý hnědooranžová sbíhavé

Aureoboletus gentilis 20 - 50 rozložený okrově načervenalá

krátce

sbíhavé

Tylopilus felleus 40 - 130 klenutý světle hnědá stlačené

Xerocomus

subtomentosus 40 - 80 klenutý hnědý až žlutý připojené

Xerocomus ferrugineus 40 - 90 klenutý hnědoolivová stlačené

Porphyrellus

porphyrosporus 45 - 100 klenutý šedohnědá připojené

Strobilomyces

strobilaceus 50 - 120

klenutý s

šupinami

šedá, na vrcholcích

načernalá připojené

Leccinum aurantiacum 50 - 90 klenutý oranžově červená stlačené

Chalciporus piperatus 20 - 40 klenutý hnědorezavá, měděná připojené

Boletus moravicus 30 - 90 klenutý okrová, naoranžovělá stlačené

Boletus badius 30 - 150 rozložený kaštanově hnědá stlačené

21

Tab. 2: Morfologické znaky řádu Boletales (b)

Póry

Výtrusný

prach Třeň Dužina

Xerocomellus

chrysenteron hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá

Xerocomellus

porosporus hranaté olivově hnědý válcovitý

bělavě

nažloutlá

Xerocomellus marekii hranaté olivově hnědý zahnutý

bledě

žlutá

Xerocomellus engelii hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá

Xerocomellus

ripariellus hranaté olivově hnědý válcovitý žlutá

Xerocomellus

pruinatus hranaté olivově hnědý

u báze

rozšířený žlutá

Xerocomellus rubellus hranaté olivově hnědý

u báze

rozšířený

žlutá, na

řezu modrá

Boletus edulis drobné hnědoolivový

soudkově

nebo vejčitě

břichatý bílá

Buchwaldoboletus

lignicola mírně protáhlé

hnědě olivový

až olivový

u báze

zahnutý

bledě

krémová

Aureoboletus gentilis drobné hnědě olivový

na bázi

ztenčený bílá

Tylopilus felleus drobné světle hnědý kyjovitý bílá

Xerocomus

subtomentosus hranaté hnědě olivový válcovitý nažloutlá

Xerocomus

ferrugineus hranaté hnědě olivový válcovitý

světle

krémová

Porphyrellus

porphyrosporus drobné hnědý válcovitý bílá

Strobilomyces

strobilaceus drobné téměř černý kyjovitý

bělavá

až našedlá

Leccinum

aurantiacum okrouhlé hnědý

v horní části

zúžený

bílá, na

řezu růžová

Chalciporus piperatus středně velké

světle až

středně hnědý štíhlý

rezavě

krémová

Boletus moravicus

protáhle

hranaté světle hnědý vřetenovitý

bledě

krémová

Boletus badius středně velké olivový soudkovitý

bělavá

až našedlá

22

Řád Boletales zahrnuje převážně mykorhizní houby, které tvoří ektomykorhizu

nebo endomykorhizu, často s velmi úzkou vazbou na jeden nebo několik druhů dřevin.

Vyskytuje se zde ale i parazitismu na plodnicích čeledi Sclerodermataceae,

popř. dřevní saprotrofismus. Řada patří k výtečným jedlým houbám, některé druhy jsou

jedovaté. Celkově se zde řadí 90 rodů a přes 1000 druhů (Kalina & Váňa 2005).

3.3. Molekulárně-biologické metody

Polymerázová řetězová reakce

Polymerázová řetězová reakce probíhá v podmínkách in vitro, tedy bez použití

buněk. Pomocí této techniky může být rychle a selektivně namnožena konkrétní

nukleotidová sekvence obsažená v jakékoli DNA (Alberts et al. 1998). Metodu PCR

vyvinul Kary Mullis, který za tuto práci obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii

(Snustad & Simons 2009). PCR je založena na využití DNA-polymerázy pro opakované

kopírování templátové molekuly DNA. Syntéza DNA je řízena krátkými oligonukleotidy

(primery), které se párují s templátovou DNA na počátku a konci amplifikovaného

fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA. Pomocí

těchto primerů nasyntetizuje DNA-polymeráza několik miliard kopií požadované

sekvence (Alberts et al. 1998).

Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát opakují (Snustad & Simons

2009).

1. Oddělení obou řetězců krátkým zvýšením teploty – denaturace DNA

2. Ochlazení roztoku v přítomnosti velkého nadbytku obou primerů, které

nasedají na obě komplementární sekvence DNA

3. Z obou primerů jsou syntetizovány nové řetězce DNA v přítomnosti

DNA-polymerázy (Alberts et al. 1998)

Proces se mnohokrát opakuje, dokud není dosaženo požadovaného stupně

amplifikace (Snustad & Simons 2009). Ve většině případů se provádí 20 až 30 cyklů.

Jako výchozí materiál pro PCR stačí i jediná molekula DNA, nebo jedna molekula mezi

miliony jiných. Výběr molekuly k replikaci zajišťuje specifický primer

(Nečas et al. 2000).

23

Elektroforéza

Elektroforéza je metoda umožňující separaci jednotlivých fragmentů DNA

dle velikosti (Alberts et al. 1998). DNA je rozpuštěna v nanášecím pufru o hustotě vyšší

než má elektroforetický pufr, takže vzorky DNA klesají na dno, aniž by se

v elektroforetickém pufru rozptýlily. Nanášecí pufr obsahuje barvivo pro sledování

rychlosti migrace molekul gelem. Ethidium bromid se váže na DNA a fluoreskuje, když

je osvícen ultrafialovým světlem (Snustad & Simons 2009).

Sekvenování

Restrikční fragmenty genové DNA obsahující části genů nebo geny celé mohou být

namnoženy v měřitelné množství, např. jejich klonováním nebo polymerázovou

řetězovou reakcí. Tím se získá homogenní vzorek DNA, který se dá použít ke zjištění

přesného pořadí nukleotidů (Nečas et al. 2000). Pro určení přesné sekvence

nukleotidů v úseku DNA byly vynalezeny dvě metody. Metoda Maxamova-Gilbertova

využívá různých chemických reakcí ke štěpení řetězců DNA specificky v místě A, G, C

nebo C + T (Snustad & Simons 2009). Metoda Sangerova (enzymatická, dideoxy) je

založena na syntéze fragmentů DNA, komplementárních k sekvenované DNA.

Enzymatická metoda využívá enzym DNA-polymerázu z E. coli k vytvoření kopií

sekvenované jednovláknové DNA. Do reakční směsi, která obsahuje jednovláknovou

DNA, byla přidána směs všech čtyř deoxyribonukleotidů, DNA-polymeráza, primer

a malé množství dideoxyribonukleotidů. Syntéza komplementárního řetězce DNA je

ukončena zabudováním dideoxyribonukleotidu. Nový nukleotid už dále nemůže být

přidán (Nečas et al. 2000).

V současné době jsou všechny větší sekvenace DNA prováděny na automatických

sekvenačních přístrojích (sekvenátorech), které používají modifikovanou

dideoxy-terminátorovou metodu (Snustad & Simons 2009).

24

4 Praktická část

4.1. Materiál

4.1.1. Biologický materiál

Vzorky hub čeledi Morchellaceae pocházely ze sbírky Ing. P. Havránka

a doc. V. Ondřeje, vzorky řádu Boletales ze sbírky J. Šutary. Pro srovnání byly použity

sekvence z genové banky.

25

Tab. 3: Zástupci čeledi Morchellaceae – české a slovenské vzorky

Vzorky číslo položky lokalita

Ptychoverpa bohemica PIS00000 ČR/Český ráj

Ptychoverpa bohemica PTB00000 ČR/Olomouc

Ptychoverpa bohemica PB000001 ČR/Praha

Ptychoverpa bohemica PB000002 ČR/Olomouc

Verpa conica PTU00000 ČR/U Strejčkova lomu

Verpa conica PHA00000 SK/NP Šur

Morchella esculenta ME000001 ČR/Přerov

Morchella semilibera MS000001 ČR/Hradec Králové

Morchella semilibera MS000002 ČR/Most

Morchella semilibera MS000003 ČR/Dymokury

Morchella sp. ME000002 SK/Bratislava

Morchella sp. ME000003 ČR/Olomouc

Morchella sp. MC000001 ČR/Hostýnské vrchy

Morchella sp. MM000001 ČR/Olomouc

Morchella sp. MM000002 ČR/Hradec Králové

Morchella sp. MM000003 ČR/Olomouc

Morchella sp. MM000004 ČR/Sovka

Morchella sp. MM000005 ČR/Protivanov

Morchella sp. MM000006 ČR/Olomouc

Morchella sp. MM000007 ČR/Karlov

Morchella sp. MM000008 ČR/Olomouc

Morchella sp. MM000009 ČR/Olomouc

Morchella sp. MM000010 ČR/Praha

Morchella sp. MM000011 ČR/Hradec Králové

26

Tab. 4: Zástupci čeledi Morchellaceae – vzorky z genové banky

Vzorky číslo položky lokalita

Ptychoverpa bohemica AM269502 Německo

Ptychoverpa bohemica AJ698479 Německo

Ptychoverpa bohemica AJ698479 Německo

Verpa conica AJ544205 Německo

Verpa conica AJ544204 Německo

Morchella crassipes AJ539482 Německo

Morchella crassipes AJ539481 Německo

Morchella crassipes EF081001 Čína

Morchella crassipes FJ860052 Čína

Morchella esculenta U0051851 Německo

Morchella esculenta DQ257342 Čína

Morchella esculenta EU086776 Čína

Morchella esculenta AJ543737 Německo

Morchella vulgaris AF000971 Francie

Morchella spongiola AJ539478 Německo

Morchella spongiola AJ539474 Německo

Morchella angusticeps AF000970 Francie

Morchella angusticeps AJ698476 Německo

Morchella angusticeps DQ257335 Čína

Morchella conica DQ257343 Čína

Morchella conica EF080999 Čína

Morchella conica AJ544195 Německo

Morchella costata AJ698478 Mexiko

Morchella costata EF080998 Čína

Morchella elata AJ698477 Německo

Morchella elata EF017946 Čína

Morchella gigas AJ543742 Německo

27

Tab. 5: Zástupci řádu Boletales

Vzorky číslo

položky lokalita

Xerocomellus chrysenteron 5407 ČR/Jesenická pahorkatina

Xerocomellus porosporus 4131 ČR/České Středohoří

Xerocomellus marekii 5209 ČR/Severozápadní Čechy

Xerocomellus marekii 5329 ČR/Severozápadní Čechy

Xerocomellus marekii 5446 ČR/Posázaví

Xerocomellu ripariellus 5305 ČR/Lesní brána

Xerocomellus pruinatus 4438 ČR/Krušné hory

Xerocomellus egelii 5231 ČR/Severozápadní Čechy

Xerocomellus egelii 5445 ČR/Severozápadní Čechy

Xerocomellus armeniacus 4285 Bulharsko/oblast Černého moře

Xerocomellus armeniacus var. luteolus 5223 ČR/Jižní Morava

Xerocomellus armeniacus var. luteolus 5285 ČR/Hodonínsko

Xerocomellus rubellus 4467 ČR/Východní Čechy

Xerocomellus rubellus 4468 ČR/Kněževes

"Xerocomellus roztrhankyanus" 5216 ČR/Jižní Morava

„Xerocomellus roztrhankyanus" 5266 ČR/Hodonínsko

Boletus edulis 5451 ČR/Jižní Čechy

Buchwaldoboletus lignicola 5447 ČR/Severní Čechy

Aureoboletus gentilis 5426 ČR/Polabí

Tylopilus felleus 5449 ČR/Jesenická pahorkatina

Porphyrellus porphyrosporus 4028 ČR/Západní Čechy

Xerocomus subtomentosus 5452 ČR/Severozápadní Čechy

Xerocomus ferrugineus 5450 ČR/Jižní Čechy

Strobilomyces strobilaceus 5448 ČR/Jesenická pahorkatina

Leccinum aurantiacum 4371 ČR/úpatí Krušných hor

Chalciporus piperatus 5345 ČR/Krušné hory

Boletus moravicus 5260 ČR/Táborsko

Boletus badius 5389 ČR/Jesenická pahorkatina

28

Obr. 1: Ověření amplifikace PCR produktů čeledi Morchellaceae

Obr. 2: Ověření amplifikace PCR produktů řádu Boletales

29

4.1.2. Chemikálie

CTAB: 2 g cetyltrimethylamonium bromidu (CTAB); 1,21 g Tris-base; 0,74 g

Na2-EDTA; 8,18 g NaCl; 80 ml destilované vody.

5x TBE pufr: 54 g Tris-HCl; 27,5 g kyseliny borité; 20 ml 0,5M disodné soli

ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA); 1 litr destilované vody; pH 8; na agarózovou

elektroforézu ředěno destilovanou vodou na výslednou koncentraci 0,5x.

Ostatní chemikálie: chloroform, octan sodný, izopropanol, ethanol,

2-merkaptoethanol, izoamylalkohol, agaróza, ethidium bromide (Serva, Německo),

tekutý dusík, destilovaná voda.

Komerční kity: FastStart PCR Master (Roche, Německo).

4.1.3. Vybavení

Chlazená centrifuga 5804 R (Eppendorf), centrifuga 5415 D (Eppendorf), XP cycler

(Bioer), počítač s fotoaparátem (Codak 290), digestoř, elektroforetická aparatura,

mikrovlnná trouba, třepačka, mraznička, lednička, nanodrop, váhy, magnetické

míchadlo, pH metr, odměrný válec, termoblok, třecí miska, parafilm, centrifugační

zkumavky, mikrozkumavky, PCR mikrozkumavky, dávkovací mikropipety, sterilní

špičky, ochranné rukavice, skalpel, pinzeta.

4.2. Metody

4.2.1. Izolace DNA

Do třecí misky byl vložen vzorek o hmotnosti 200 mg a rozetřen pomocí tloučku

v tekutém dusíku. Třecí miska byla vypláchnuta 1 ml CTAB a 2 µm

2-metkaptoethanolu, který byl zahřátý na 65°C. Roztok z třecí misky byl napipetován

do 2 ml mikrozkumavky. Inkubace probíhala 1,5 h při 65°C na termobloku. Po inkubaci

bylo k roztoku přidáno 600 µl směsi chloroformu a izoamylalkoholu (poměr 24:1).

Po promíchání byl roztok centrifugován 15 min v chlazené centrifuze při 4°C a 11 000

otáčkách/min. Horní vrstva byla odebrána a k ní bylo znovu přidáno stejné množství

chloroformu a izoamylalkoholu. Tento proces se zopakoval s 60 µl 3 M octanu sodného

a 500 µl izopropanolu. Roztok byl pomalým přeléváním promícháván a poté inkubován

30

minimálně 30 min, popř. přes noc v mrazničce při -20°C. Roztok byl centrifugován

v chlazené centrifuze při teplotě 4°C a 11 000 otáčkách/min po dobu 30 min.

Po centrifugaci se slil supernatant a ke sraženině DNA se přidalo 200 µl 70% etanolu.

Opět byla provedena centrifugace při 4°C a 11 000 otáčkách/min. Po centrifugaci se

etanol slil a DNA byla rozpuštěna v 200 µl sterilní vody. Vzorky byly zamraženy

při -80°C. Koncentrace DNA byla stanovena na přístroji nanodrop.

4.2.2. PCR (polymerázová řetězová reakce)

K PCR reakci byly použity primery ITS1 5´- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´

a ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ (White et al. 1990).

Tab. 3: Složení PCR mixu

Reakční složky Objemy [µl]

FastStart PCR Master mix 10

primer ITS1 o koncentraci 0,16 µM 0,25

primer ITS4 o koncentraci 0,16 µM 0,25

destilovaná sterilní voda 9

DNA o koncentraci 100 ng/µl 0,5

celkový reakční objem 20

Tab. 4: Teplotní profil PCR reakce

1 cyklus počáteční denaturace 95°C

35 cyklů denaturace 95°C

hybridizace primerů 55°C

prodlužování primerů 72°C

1 cyklus konečné prodloužení primerů 72°C

31

4.2.3. Elektroforéza

Na váhách byl navážen 1 g agarózy a pomocí odměrného válce odměřeno 45 ml

destilované vody a 5 ml TBE pufru, čímž vznikl 2% roztok. Tato směs se zahřívala

v mikrovlnné troubě, dokud nevznikl homogenní roztok. Vzniklý roztok se nechal

několik minut odstát, aby došlo k mírnému ochlazení. Poté byly přidány 2 µl ethidium

bromidu. Po zamíchání se roztok nalil do předem připravené elektroforetické aparatury

a nechal se asi 20 min ztuhnout. Po vložení ztuhlého gelu do TBE pufru byly postupně

naneseny vzorky po 2 µl spolu s barvivem. Elektroforéza běžela po dobu 30 min

pod napětím 100 V. Po vyjmutí z elektroforetické vany se gel se vzorky vyfotografoval

pod UV světlem.

4.2.4. Purifikace PCR produktů a sekvence

K rychlému čištění PCR amplifikačních produktů byl použit GenElute™ PCR

Clean-Up Kit (Sigma, USA). Purifikace je dosažena v několika krocích. DNA se váže

na křemičité membráně na kolonce.

1. Do předem připravené kolonky se napipetovalo 0,5 ml přípravného roztoku

(Column Preparation Solution). Odstředění probíhalo při 12 000 otáčkách

po dobu 30 sekund až 1 minuty. Po centrifugaci byl eluát odstraněn.

Přípravný roztok maximalizuje navázání DNA na membránu, což zaručuje

větší konzistenci výnosu.

2. Do kolonky se přidalo 5 dílů roztoku pro navázání DNA (Binding Solution)

a 1 díl PCR reakční směsi. Napipetovalo se 500 µl Binging roztoku a 100 µl

PCR reakční směsi. Centrifugace probíhala při 12 000 otáčkách po dobu

1 minuty. Eluát byl odstraněn, ale zkumavky zůstaly zachovány.

3. Do kolonek se naneslo 0,5 ml promývacího roztoku (Wash Solution).

Odstředění probíhalo při maximální rychlosti 1 minutu. Po odstranění eluátu

zůstávají zkumavky opět zachovány.

4. Dále probíhala centrifugace 2 minuty bez jakéhokoli roztoku, aby došlo

k odstranění přebytečného etanolu. Všechen zbývající eluát včetně

zkumavek mohl být odstraněn.

5. Kolonky se přenesly do nových 2 ml zkumavek. Aplikovalo se 50 µl elučního

roztoku (Elution Solution) přibližně do centra kolonek.

32

6. V konečné fázi probíhala centrifugace maximální rychlostí 1 minutu. Eluát

obsahující PCR produkty byl připraven k použití, popř. ke skladování při

-20°C.

7. Koncentrace byla změřena v nanodropu.

Sekvenování bylo provedeno na Ústavu experimentální botaniky (ÚEB) AV ČR

v Olomouci.

33

5 VÝSLEDKY

K analýze bylo poskytnuto 32 vzorků hub. Srovnání a výsledky byly doplněny

informacemi z genové banky. Po provedení PCR metody byla změřena koncentrace

jednotlivých vzorků a provedena gelová elektroforéza.

Výsledky sekvenace získané na Ústavu experimentální botaniky (ÚEB) AV ČR

v Olomouci byly dále zpracovávány pomocí Bayesianské metody MCMC (Markov

Chain Monte Carlo). K tomuto účelu byl použit software Beast 1.4.8. Tato metoda

v současné době zaznamenává zvýšení popularity ve vědách jako prostředek

pravděpodobnostního závěru (Qian et al. 2003), díky němuž bylo možné sestavit dále

uvedené fylogramy.

34

Obr. 3: Fylogram zástupců čeledi Morchellaceae (a)

Z obr. 3 je patrné rozdělení vzorků na žluté smrže (Adnatae) a černé smrže

(Distantes). Mezi zástupce černých smržů patří Morchella conica, Morchella

angusticeps a Morchella elata. Morchella angusticeps je na rozdíl od Morchella conica

velmi variabilní. Výsledky ukazují na skutečnost, že černí smrži vytváří dvě geneticky

35

rozdílné skupiny, i přesto, že jejich geografické rozdíly nejsou příliš významné.

Morchella esculenta, Morchella crassipes a Morchella spongiola byla vyčleněna

v rámci skupiny žlutých smržů.

Vyskytují se na spáleništích či jinak narušených půdách, popř. kalamitně na

novostavbách.

Obr. 4: Fylogram zástupců čeledi Morchellaceae (b)

Na obr. 4 jsou zobrazeny výsledky analýzy spolu s daty z genové banky. Rovněž je

zde uvedeno místo izolace. Za významnou genetickou odlišnost je považováno více

než 95%, což je zvýrazněno.

Čeleď Morchellaceae se rozčlenila zprvu na dvě části:

Morchella

Verpa, Ptychoverpa

K prozkoumání a následné genetické analýze byly poskytnuty vzorky z Olomouce,

Českého ráje a Slovenska. Na základě sekvenčních dat byly u rodu Ptychoverpa

bohemica objeveny dvě geneticky rozdílné skupiny.

36

Obr. 5: Fylogram zástupců řádu Boletales

Na obr. 5 je patrné rozčlenění na 3 hlavní fylogenetické skupiny, které zahrnují tyto

zástupce:

I. Skupina

Xerocomellus porosporus, Xerocomellus marekii, Xerocomellus

chrysenteron, Xerocomellus pruinatus a Xerocomellus ripariellus

37

II. Skupina

Xerocomellus engelii, Xerocomellus rubellus, Xerocomellus armeniacus

Podskupina Chalciporus piperatus

III. Skupina

Aureoboletus gentilis, Boletus moravicus, Xerocomus subtomentosus,

Xerocomellus armeniacus var. luteolus, „Xerocomellus roztrhankyanus“

(vzorek neoficiálně pojmenovaný dle Šutary)

Výsledky ukazují, že bylo správné vyčlenění rodu Xerocomellus z rodu Xerocomus.

Rod Xerocomellus obsahuje dvě geneticky odlišné skupiny. Chalciporus je geneticky

bližší rodu Xerocomellus z druhé skupiny, než je tomu v případě skupiny první.

Chalciporus tedy spadá do skupiny v rámci rodu Xerocomellus, ale vytváří svoji vlastní

podskupinu.

Vzorek Boletus moravicus patří pravděpodobně do skupiny Xerocomellus.

V případě Xerocomus subtomentosus (DQ131632) došlo k špatnému určení.

PCR amplifikace se nezdařila u vzorů Xerocomellus rubellus, Buchwaldoboletus

lignicola a Aureoboletus gentilis z důvodu kontaminace DNA inhibitory pocházející ze

vzorů.

38

6 DISKUSE

V této bakalářské práci byla zkoumána genetická příbuznost čeledi Morchellaceae.

Jednotlivé druhy smržů jsou velmi polymorfní, což ztěžuje jejich taxonomické rozlišení

(Masaphy et al. 2010). Wipf et al. (1996,1999) se pokusil objasnit systematiku rodu

Morchella na základě sekvenčních dat pro ITS regiony jaderné ribozomální DNA

(Kellner et al. 2005).

Masaphy et al. (2010) a Hansen & Pfister (2006) uvádí rozdílnost mezi Verpa

conica a Ptychoverpa bohemica, což se s dosaženými výsledky shoduje. Masaphy

et al. (2010) rovněž uvádí příbuznost týkající se dvou rodů, a to Disciotis

a Ptychoverpa. Ptychoverpa bohemica je blízce příbuzná s Disciotis venosa (Masapy

et al. 2009, Masaphy et al. 2010). Hansen & Pfister (2006) naopak tuto skutečnost

popírá.

Na základě sekvenčních dat bylo možné smrže rozčlenit na Adnatae (žluté smrže)

a Distantes (černé smrže). O‘Donnell et al. (1997) potvrdil skutečnost, že čeleď

Morchellaceae vytváří monofyletický taxon (Kellner et al. 2005). Ze získaných dat došlo

k vyčlenění dvou skupin zahrnující Morchella angusticeps a Morchella conica patřící

mezi černé smrže. Pilz et al. (2007) k této skupině zařazuje ještě M. elata, která je ale

geneticky příbuzná s M. angusticeps, což se shoduje s předloženými výsledky.

Adnatae zahrnuje M. spongiola, M. crassipes, M. esculenta (Ondřej et al. 2011), což

potvrzuje obr. 3. Ke stejným závěrům dospěl i Kellner et al. (2005). Pilz et al. (2007)

k žlutým smržům řadí dále tyto zástupce: M. deliciosa, M. rufobrunnea, M.

guatemalensis, M. herediana a rovněž M. esculenta.

Binder & Hibbett (2006) dospěli k závěru, že řád Boletales tvoří monofyletický

taxon, čemuž odpovídají i předchozí studie (Binder a Bresinsky 2002a, Bruns et al.

1988, Grubisha et al. 2001, Jarosch 2001, Kretzer and Bruns 1999). I přesto, že se

zlepšilo celkové rozlišení hlavních skupin Boletales, stále není možné odpovědět

na všechny otázky týkající se sesterských vztahů (Binder & Hibbet 2006). Dentinger

et al. (2010) rozlišuje skupinu zahrnující rody Boletus, Tylopilus, Porphyrellus

a Xerocomus. Dentinger et al. (2010) uvádí bližší příbuznost rodů Boletus

a Porphyrellus. Šutara el al. (2009) vyčlenil rod Xerocomellus z rodu Xerocomus, což

genetická analýza prokázala. Rod Chalciporus je geneticky příbuzný s rodem

Xerocomellus, ale vytváří vlastní podskupinu.

39

7 ZÁVĚR

V této práci byly pomocí molekulárně-biologických metod charakterizovány

fylogenetická vztahy vybraných zástupců hub. Na základě sekvenčních dat ITS regionů

došlo k vyčlenění smržů na Adnatae (žluté smrže) a Distantes (černé smrže). Mezi

černé smrže patří Morchella conica, Morchella angusticeps a Morchella elata. U rodu

Ptychoverpa bohemica byly objeveny dvě geneticky rozdílné skupiny. Rod

Xerocomellus se vyčlenil z rodu Xerocomus. Součástí rodu Xerocomellus je rod

Chalciporus, který vytváří vlastní podskupinu.

40

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Alberts B., Johnson L. & Walter R. R. (1998): Základy buněčné biologie.

- Vydavatelství Espero Publishing, Ústí nad Labem.

Antonín V. & Hagara, L. (2005): Velký atlas hub. - Vydavatelství Ottovo, Praha.

Antonín V. (2006): Encyklopedie hub a lišejníků. - Vydavatelství Libri, Praha.

Binder M. & Hibbett D. S. (2006): Molecular systematics and biological diversification of

Boletales. - Mycologia, 98 (6): 971-981.

Buscot F., Wipf D., Di Battista C., Munch J., Botton B. & Martin F. (1996): DNA

polymorphism in morels: PCR/RFLP analysis of the ribosomal spacers and

microsatellite-primed PCR. - Mycol. Res. 100 (1): 63-71.

Hagara L. (1993): Atlas hub. - Vydavatelství Neografia, Martin.

Hansen K. & Pfister D. H. (2006): Systematics of the Pezizomycetes - the operculate

discomycetes. - Mycologia, 98 (6): 1029-1040.

Kalina T. & Váňa J. (2005): Sinice, řasy, houby, mechorosty a podobné organismy

v současné biologii. - Vydavatelství Karolinum, Praha.

Kellner H., Renker C. & Buscot F. (2005): Species diversity within the Morchella

esculenta group (Ascomycota: Morchellaceae) in Germany and France. -

Organism, Diversity & Evolution 5 101-107.

Masaphy S., Zabari L. & Goldber D. (2009): New long-season ekotype of Morchella

rufobrunnea from northern Israel. - Micologia Aplicada Inernational, 21 (2): 45-

55.

Masaphy S., Zabari L., Goldberg D. & Jander-Shagug G. (2010): The komplexity

of Morchella Systematics: A Case of the Yellow Morel from Israel. - FUNGI

Volume 3:2.

Nečas O., Svoboda A., Hejtmánek M., Janisch R., Červinka M., Lenhart K. & Kolář Z.

(2000): Obecná biologie pro lékařské fakulty. - Vydavatelství H&H, Jihlava.

Ondřej V., Havránek P., Kitner M. & Němcová P. (2011): Molecular identification and

charactization of the edible and medicinbal Morchellaceae germplasm collection

of „mulch morels“. - Int J Med Mushrooms, 13 (4): 369-375.

Pilz D., McLain R., Villrreal-Ruiz L., Berch S., Wurtz T. L., Parks C. G., McFarlane E.,

Baker B., Molina R. & Smith J. E. (2007): Ecology and Management of Morels

Harvested From the Forests of Western North America. - General Technical

report PNW-GRT-710.

Quian S. S., Stow C. A. & Borsuk M. E. (2003): On Monte Carlo methods for Bayesian

interference. - Ecological Modelling 159 269-277.

41

Snustad D. P. & Simmons M. J. (2009): Genetika. - Vydavatelství Masarykova

univerzita, Brno.

Šutara J., Mikšík M. & Janda V. (2009): Hřibovité houby. - Vydavatelství Academia,

Praha.

Váňa J. (1996): Systém a vývoj hub a houbových organismů. - Vydavatelství

Karolinum, Praha.