Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Izolovanje i identifikacija glavnih komponeti etarskog ulja biljne vrste

Anthriscus cerefolium L.

Master rad

Mentor

Prof. dr Goran Petrović

Student

Kristina Stoilkovski

Niš, 2017.

Прилог 4/1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Кристина Стоилковски

Ментор, МН: др Горан Петровић

Наслов рада, НР:

Изоловање и идентификација главних

компоненти етaрског уља биљне врсте Anthriscus

cerefolium L.

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Српски

Земља публиковања, ЗП: Србија

Уже географско подручје, УГП: Србија

Година, ГО: 2017

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33

Физички опис рада, ФО: 6 поглавља, 47 страна, 4 табелe, 32 графичкa приказа

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Органска хемија и биохемија

Предметна одредница/

Кључне речи, ПО:

изоловање, структурна анализа, ГЦ/МС, НМР

спектроскопија, Anthriscus cerefolium L.

УДК

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Експериментални део рада рађен је у лабораторијама

за органску хемију и биохемију ПМФ-а у Нишу у

оквиру пројекта ОИ 172047

Извод, ИЗ:

Из свежих надземних делова биљне врсте Anthriscus cerefolium L.

изоловано је етарско уље хидродестилацијом по Clevenger-у. Хемијски

састав уља одређен је ГЦ/МС техником и идентификоване су 22

компоненте што чини 99,8% укупног узорка. Најзаступљеније компоненте

су једињења фенилпропаноидног типа, естрагол (1-алил-4-метоксибензен)

и осморизол (1-алил-2,4-диметоксибензен), са укупним уделом од чак

98,1%. Пронађен је оптимални систем елуената којим се постиже

максимално раздвајање главних компоненти на силика гелу као

стационарној фази као и одговарајућа хроматографска техника. Извршено

је раздвајање естрагола и осморизола а квалитет раздвајања и чистоћа

компоненти проверена је ГЦ/МС техником. Структура изолованих

компоненти одређена је масеном спектрометријом ниске резолуције и 1Х и 13Ц једнодимензионом и дводимензионом НМР спектроскопијом.

Датум прихватања теме, ДП: 15.01.2017

Датум одбране, ДО:

Чланови

комисије,

КО:

Председник: др Олга Јовановић

Члан: др Снежана Јовановић

Члан, ментор: др Горан Петровић

Образац Q4.09.13 – Издање 1

Прилог 4/2

ПРИРОДНО – МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monographic

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master work

Author, AU: Kristina Stoilkovski

Mentor, MN: dr Goran Petrović

Title, TI: Isolation and identification of the main components of

the Anthriscus cerefolium L. essential oil

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33

Physical description, PD: 6 chapters, 47 pages, 4 tables, 32 graphic representations

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Organic chemistry and biochemistry

Subject/Key words, S/KW: isolation, structural analysis, GC/MS, NMR spectroscopy ,

Anthriscus cerefolium L.

UC

Holding data, HD: Library

Note, N:

The experimental part of this master work was performed in

the laboratories for organic chemistry and biochemistry of

Faculty of Sciences and Mathematics as a part of the grant

172047

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Abstract,

AB:

From the fresh aerial parts of the Anthriscus cerefolium L. essential oil wаs

isolated by Clevenger type hydrodistillation. Chemical composition of the oil

was analyzed by GC/MS technique. In the essential oil of fresh plant 22

components were found, what makes 99.8% of all. The major components are

phenylpropanoid compounds, estragole (1-allyl-4-methoxybenzene) and

osmorhizol (1-allyl-2,4-dimethoxybenzene) which makes 98.1% of the sample.

An optimal elution system has been found to achieve the maximum separation

of the main components on the silica gel as a stationary phase as well as the

appropriate chromatographic technique. Separation of estragol and osmorhizol

was performed and the quality of separation and component purity was checked

by GC/MS technique. The structures of the isolated components were

determined by low-resolution mass spectrometry and 1H and 13C single-

dimensional and two-dimensional NMR spectroscopy.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2017

Defended on, DE:

Defended

Board, DB:

President: dr Olga Jovanović

Member: dr Snežana Jovanović

Member, Mentor: dr Goran Petrović

Eksperimentalni deo ovog rada je uradjen u laboratorijama za organsku hemiju i

biohemiju PMF-a u Nišu i predstavlja deo istraživanja u okviru projekta 172047.

Najiskrenije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Goranu Petroviću na izboru teme,

stručnoj pomoći, izdvojenom vremenu i nizu korisnih saveta i sugestija tokom izrade

eksperimentalnog dela i pisanja master rada.

Posebno bih se zahvalila koleginici Sanji Mitić kao i doktorantkinji Jeleni

Stamenković koje su mi bile od velike pomoći tokom izrade ekspertimentalnog dela

rada.

Na kraju, neizmernu zahvalnost dugujem svojoj porodici na pruženoj ljubavi, podršci i

motivaciji tokom studiranja.

Sadržaj:

1. UVOD I CILJEVI RADA ...................................................................................................... 1

2. OPŠTI DEO ............................................................................................................................ 4

2.1. Etarska ulja ...................................................................................................................... 5

2.2. Sistematika biljaka ........................................................................................................... 6

2.3. Anthriscus cerefolium L ................................................................................................... 7

2.4. Metode za analizu etarskih ulja ....................................................................................... 8

2.5. Hromatografija ................................................................................................................. 9

2.6. Adsorpciona hromatografija .......................................................................................... 10

2.6.1. Hromatografija na tankom sloju (TLC) .................................................................. 10

2.6.2. Stvaranje hromatograma ......................................................................................... 11

2.6.3. Kvalitativna analiza ................................................................................................ 11

2.6.4. Kvantitativna analiza .............................................................................................. 12

2.6.5. Hromatografija u koloni .......................................................................................... 12

2.7. Gasna hromatografija (GH) ........................................................................................... 14

2.8. Gasna hromatografija/Masena spektrometrija (GC/MS) ............................................... 15

2.9. NMR spektroskopija ...................................................................................................... 16

2.9.1. Protonska NMR spktroskopija ................................................................................ 17

2.9.2. Hemijsko pomeranje ............................................................................................... 18

2.9.3. Spinsko kuplovanje ................................................................................................. 19

2.9.4 Hemijska pomeranja nekih funkcionalnih grupa .................................................... 19

2.9.5. Razlaganje signala .................................................................................................. 20

2.9.6. Rastvarač ................................................................................................................ 21

2.9.7. 13C NMR spektroskopija ......................................................................................... 21

3. EKSPERIMENTALNI DEO................................................................................................ 22

3.1. Analiza etarskog ulja ..................................................................................................... 23

3.2. Reagensi......................................................................................................................... 23

3.3. TLC hromatografija ....................................................................................................... 23

3.4. Hromatografija na koloni............................................................................................... 23

3.5. GC-MS hromatografska analiza .................................................................................... 23

3.6. NMR analiza .................................................................................................................. 24

4. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................................................................ 25

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja svežeg nadzemnog dela vrste A. cerefolium .................. 26

4.2. Izolovanje najzastupljenijih komponeti u etarskom ulju A. cerefolium primenom

hromatografskih metoda ....................................................................................................... 28

4.3. NMR analiza komponeti ................................................................................................ 35

4.3.1. NMR analiza Estragola ........................................................................................... 35

4.3.2. NMR analiza Osmorizola ....................................................................................... 39

5. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 44

6.LITERATURA ...................................................................................................................... 46

1. UVOD I CILJEVI RADA

2

Lekovite biljke su oduvek imale značajno mesto u medicinskoj praksi. Najranije

zabeleženi podaci mnogih naroda (npr. starih Egipćana, Sumeraca, Asiraca, Grka, Kineza i

Indijaca) govore o korišćenju biljaka u terapijske svrhe od strane čoveka. Ispitivanjem

hemijskih, bioloških i farmakoloških osobina prirodnih proizvoda korišćenih u tradicionalnoj

medicini širom sveta dobijeni su mnogi terapeutski agensi koji se danas koriste u modernoj,

konvencionalnoj medicini: morfin iz opijuma (Papaver somniferum) se koristi kao analgetik,

digitoksin i ostali glikozidi naprstka izolovanih iz Digitalis spp. koriste se za lečenje bolesti

srca, taksol iz pacifičke tise (Taxus brevifolia) za lečenje kancera, kinin izolovan iz kore

kininovog drveta (Cinchona spp.) za lečenje malarije, aspirin iz kore vrbe (Salix spp.) kao

analgetik, antipiretik i antiinflamatorik, kofein iz kafe (Coffea arabica) – stimulans [1].

Tretman biljnim ekstraktima, pa zatim jedinjenjima izolovanim iz prirodnih izvora, kao

i neorganskim jedinjenjima, je dugi niz godina predstavljao nezamenljivi i gotovo jedini

dostupni (poznati) vid lečenja. Transformacija prirodnih jedinjenja izolovanih iz biljaka u

sintetske derivate i sinteza analoga započinje početkom XIX veka sa razvojem farmaceutske

industrije i farmaceutske hemije. Sa napretkom sintetičke hemije, naročito sredinom XX veka,

sinteza i proizvodnja lekova uzima maha – sintetski analozi i potpuno “sintetički” molekuli u

sve većoj meri zamenjuju “prirodne” lekove. Farmaceutske kompanije usmeruju svoja

istraživanja i razvojne budžete ka dobijanju sintetičkih jedinjenja, dok razvoj kombinatorne

hemije i računskog pristupa u dizajniranju novih lekova (eng. computational drug design)

dodatno umanjuju interesovanje za prirodnim proizvodima kao potencijalnim izvorima novih

lekova [2].

Poslednjih godina XX veka je evidentan rast popularnosti herbalne i homeopatske

medicine u svetu, interesovanja za organskom (“zdravom”) hranom i prirodnom kozmetikom.

Razlog popularizacije “prirodnih” proizvoda je moguća nebezbednost i toksičnost

novosintetisanih jedinjenja po ljudsko zdravlje i životnu sredinu. Popularnost prirodnih

proizvoda se može pripisati i uviđanju da su fitohemikalije “bezbednije” po zdravlje zbog

viševekovnog korišćenja istih od strane čoveka, tj. ko-evolucije biljaka i ljudi. Danas je na

tržištu prisutan veliki broj proizvoda koji sadrže aktivne biljne sastojke – fitofarmaceutski

proizvodi ostvaruju oko 50% od ukupnog prometa na tržištu farmaceutskih proizvoda [2].

Biljka se može smatrati kompleksnom biosintetskom laboratorijom. Oružje

odbrambenog sistema biljaka od biljojeda, drugih predatora, mikroba i virusnih infekcija čine

brojna bioaktivna jedinjenja koje biljka sintetiše. Nakon više od 100 godina farmaceutskog

istraživanja, samo trećina danas poznatih bolesti se može efikasno lečiti danas dostupnim

lekovima. Činjenica, koja se ne sme ignorisati je da su brojna biološki aktivna jedinjenja koje

biljke poseduju odabrana, razvijena i usavršena evolucijom u toku mnogo dužeg perioda nego

što su to uradile ili to mogu uraditi farmaceutske kompanije [2].

Biljni ekstrakti se dobijaju tako što se usitnjeni delovi biljke, uglavnom suve, dovode u

kontakt sa rastvaračem za ekstrakciju u odgovarajućem uređaju, ekstraktoru. U sledećoj fazi

procesa nastaje međuproizvod (miscella, eluat) koji se odvaja od ostataka biljne droge. Ako se

u procesu ekstrakcije koriste tečni ekstragensi (etanol ili smeša etanola i vode, masna ulja i

sl.) nakon filtracije se dobija tečni ekstrakt. Kao rezultat procesa ekstrakcije može se dobiti i

suvi ekstrakt, ako se od faze miscelle nastavi proces uparavanja u vakuum uparivaču. U ovoj

fazi nastaje polučvrsti ekstrakt od koga se daljim procesom sušenja na odgovarajući način

dobija suvi ekstrakt.

3

U okviru familije Apiaceae, vršena su mnoga ispitivanja kako hemijskog sasatava, tako

i same biološke aktivnosti različitih ekstrakata. Utvrđeno je da se u ekstraktima velikog broja

vrsta roda Eryngium nalaze terpenoidi, triterpenoidni saponozidi, kumarini, poliacetileni i

steroidi. Zahvaljujući bogatom hemijskom sastavu, ovi ekstrakti su pokazali citotoksičnu,

antiinflamatornu, antibakterijsku, antifungalnu, antimalarijsku, antioksidativnu i

antihiperglikemijsku aktivnost [3].

Dok su brojne vrste familije Apiaceae fitohemijski i farmakološki okarakterisane, i

imaju primenu u oficijelnoj medicini, o mnogima nema podataka ili su oni veoma oskudni.

Među slabo ispitane spadaju i samonikle vrste iz tribusa Scandiceae: Anthriscus sylvestris L.

Hoffm., Anthriscus cerefolium L. Hoffm., Chaerophyllum bulbosum L., Chaerophyllum

hirsutum L., Chaerophyllum temulentum L. i Scandix pecten-veneris L. Sam tribus

Scandiceae sadrži 70-90 vrsta, od kojih više njih ima značaj (doduše, ograničen) u ishrani ili

tradicionalnoj medicini, dok za sada nemaju primenu u oficijelnoj medicini i ne pominju se u

farmakopejama.

U Evropi, biljna vrsta Anthriscus cerefolium L., kod nas poznata kao baštenska

krasuljica. Krbuljica je jednogodišnja biljka s tankim, vretenastim i belim korenom koja

potiče iz Azije i južne Evrope. Miris i ukus su topli, slični peršunu, a pomalo i anisu. Cveta od

maja do jula mada zavisi od staništa i vremenskih uslova. Kultivisana je rano, ali se pored

bašta u kojim se gaji vrlo često može naći i samonikla u prirodi. Bere se cela biljka u vreme

cvetanja, a ponekad i seme. Suši se u hladovini, a nakon sušenja biljku je potrebno iseći i

spremiti u dobro zatvorene staklene posude (nikako je ne treba čuvati u limenim posudama).

Često se upotrebljava u francuskoj kuhinji. Obavezan je sastojak mešavine začina fines

herbes. Naseckani listovi u izobilju se dodaju salatama, supama, povrću, piletini, ribi i jelima

s jajima. Stavlja se pri kraju kuvanja jer brzo gubi aromu. Krbuljicom se začinjava namaz od

maslaca i svežeg kravljeg sira. Koristi se i sušeno, usitnjeno lišće. Začinske osobine sušene

krebuljice su slabe [3].

Imajući u vidu napred iznešene činjenice, odlučili smo da iz etarskog ulja nadzemnih

delova biljke Anthriscus cerefolium L. primenom hromatografskih metoda izolujemo glavne

komponete i izvršimo njihovu potpunu identifikaciju primenom instrumentalnih metoda.

Navedena istraživanja su vršena primenom sledećih postupaka i metoda:

➢ Priprema eluenata različitog sastava i osobina, da bi se utvrdilo pomoću kog sistema

se postiže najbolje razdvajanje;

➢ Razdvajanje i izolovanje glavnih komponenti hromatografskim metodama na silika-

gelu kao stacionarnoj fazi i to: analitičkom TLC hromatografijom, hromatografijom na

koloni i preparativnom TLC hromatografijom;

➢ Snimanje izolovanih frakcija na GC-MS da bi se potvrdilo njihovo prisustvo, izvršila

primarna identifikacija i utvrdio kvalitet razdvajanja;

➢ Potpuna karakterizaciju izolovanih komponti korišćenjem jednodimenzione i

dvodimenzione NMR spektroskopije.

2. OPŠTI DEO

5

2.1. Etarska ulja

U Evropskoj Farmakopeji etarska ulja su definisana na sledeći način:

Etarsko ulje je mirisan proizvod, uglavnom kompleksne kompozicije, dobijen iz

botaničkog sirovog biljnog materijala parnom ili suvom destilacijom ili pogodnim

mehaničkim procesima bez zagrevanja. Etarska ulja su obično izdvojena iz vodenog sloja

fizičkim procesima koji ne utiču značajno na njihovu kompoziciju. Etarska ulja mogu biti

podvrgnuta dodatnoj obradi.

Etarska ulja totalno isparavaju bez ostavljanja ostataka; na sobnoj temperaturi su obično

tečna. Njihova relativna gustina je obično manja od 1; poseduju visok indeks prelamanja i

visoke optičke aktivnosti. Tokom dugoročnog skladištenja bez zaštite od svetlosti i kiseonika,

etarska ulja, oksiduju; boja, konzistencija i miris mogu da se promene.

Analogno njihovom raznovrsnom sastavu, opseg medicinske primene etarskih ulja je

veoma širok. Koriste se za spoljašnju upotrebu zbog njihovih spazmoličkih, antiinflamatornih,

umirujućih, antibakterijskih, antivirusnih i antimikrobnih karakteristika. Koriste se protiv

gripa, respiratornih oboljenja, poremećaja krvotoka, angina, razdražljivog debelog creva,

stomačnih tegoba itd. Za internu upotrebu obično se koriste u vidu kapsula, ali i kao tablete,

masti ili čista ulja.

Ona se ne koriste samo u medicinske svrhe, već i u industriji parfema, za aromaterapiju

ili u ezoterične svrhe.

Neželjeni efekti se pojavljuju obično tek nakon predoziranja od lekova koji sadrže

etarska ulja. Opisani neželjeni efekti su obično kontaktni dermatitis, fotosenzitezacija,

stomačne tegobe, proliv, paraliza i grčevi. Etarska ulja mogu imati hepatoksični nefrotoksin i

kancerogene efekte [4].

Etarska ulja se uglavnom sastoje od tepena, kao što su monotepeni i seskvitepeni i retko

ditepeni, koji su isparljivi. Takodje sadrže okside, epokside i perokside, kao i estre, laktone

aldehide, ketone i njihove derivate.

Prilikom izolovanja etarskog ulja najvažnije je obezbediti dobar prinos i kvalitet

proizvoda. Najvažnije je napraviti pravilan izbor postupka, odnosno tehnike izdvajanja

etarskog ulja. Koji će se postupak primeniti zavisi od: vrste biljke, sadržaja ulja u biljci, dela

biljke iz koga će se etarsko ulje ekstrahovati (koren, stablo, list, cvet, plod i sl.), prinosa i

kvaliteta etarskog ulja koji obezbeđuje primenjeni postupak. Za ispitivanje hemijskog sastava

najviše se koriste hromatografske metode, pre svega gasna hromatografija.

Etarska ulja se najčešće dobijaju destilacijom vodenom parom (hidrodestilacijom) i to u

aparaturi po Clevenger-u, običnom destilacijom, destilacijom pod sniženim pritiskom,

presovanjem, ceđenjem ili ekstrakcijom pomoću različitih organskih rastvarača [5].

6

2.2. Sistematika biljaka

Sistematika je biološka disciplina koja se bavi proučavanjem, razgraničavanjem,

upoređivanjem, hijerarhijom i filogenijom organskih vrsta.

Sistematika je oblast biologije u kojoj se definišu grupe organizama na osnovu njihovih

odlika, da bi se zatim utvrdile veze između tih grupa i preko tih veza grupe klasifikovale po

različitim principima.

Osobine po kojima se vrši grupisanje mogu biti bilo koja svojstva organizama:

fiziološke, morfološke, ekološke, biohemijske, genetičke, biogeografske (rasprostranjenost), i

druge odlike ponašanja. Različite grupe organizama nazivaju se taksoni. Taksoni koji imaju

zajednička svojstva grupišu se u taksone višeg nivoa. Stavljanje organizama u taksone koji se

nalaze na različitim hijerarhijskim nivoima naziva se klasifikacija, a nivo koji takson ima u

klasifikaciji naziva se sistematska ili taksonomska kategorija.

Osnovna taksonomska (sistematska) jedinica je vrsta (spacies). Vrsta predstavlja skup

svih biljaka, odnosno jedinki, koje se slažu u najvećem broju, naročito biljnih karakteristika,

koje zauzimaju određen prostor ili areal i koje mogu imati potomstvo. Vrste se međusobno

razlikuju po konstantnim naslednim karakteristikama.

Pored vrste, osnovne taksonomske jedinice, postoje niže (infraspecijske) i više

(supraspecijske) taksonomske jedinice. Kod varijabilnih vrsta razlikujemo sledeće

infraspecijske jedinice: podvrste, varijatete i forme.

Podvrsta (subspecias) obuhvata biljne odlike u okviru vrsta koje nisu oštro međusobno

razgraničene, pri čemu se često radi o geografskim ili ekološkim populacijama.

Varietet (varijetas) je još niža jedinica. Čije se jedinke međusobno razlikuju od drugih.

Kod kultivisanih biljaka, varijetetu odgovarajuća jedinica je sorta (cultivar), koja se odlikuje

specifičnim morfološkim, biološkim i proizvodnim osobinama.

U supraspecisjke jedinice spadaju: rod (genus), familija (familia), red (ordo), klasa

(classis), odeljak (phylum) i carstvo (regnum) [6].

Slika 1. Sistematika biljaka

7

2.3. Anthriscus cerefolium L.

Taksonomske kategorije

Taksoni

Carstvo (regnum) Plantae

Razdeo (phylum) Tracheophyta

Klasa (classis) Magnoliopsida

Red (ordo) Apiales

Familija (familia) Apiaceae

Rod (genus) Anthriscus

Vrsta (species) A. cerefolium

Podvrsta (subspecies) Trichospermus

Tabela 1. Filogenetsko stablo roda Anthriscus cerefolium L.

Krasuljica ili vrtna krasuljica, čerfol, krabulica, krabuljica, kračuljac, krbuljica

baštenska, krvelj, krinfolj, krošulica, krosuljica, krosulica, vonjuša, je biljka iz porodice

štitarki, klasični je začin francuske kuhinje, i vrlo liči peršunu, od kojeg se razlikuje po nešto

manjem i svetlijem lišću, a njen ukus je više slađi i skloniji komoraču.

Spada u jednogodišnje biljke s tankim, vretenastim i beličastim korenom. Stabljika je

okrugla 30 do 70 cm visoka, vrlo nežno uzdužno naborana, na člancima ima nežne pahuljaste

12 bele dlake, inače je gola.

Listovi su svetlozelene boje, dvostruko do četvorostruko perasti, s gornje strane goli, a

sa donje strane po nervaturi lista i lisnoj peteljci čekinjasto dlakavi. Donji listovi su s

peteljkom dok su gornji sedeći.

Cvet je štitastog oblika, gotovo sedeći, a cvetići u štitu su mali i beli. Čitava biljka ima

slatkasto-aromatičan miris, koji se kod sušenja gotovo posve izgubi. Ukus je vrlo sličan anisu.

Cveta od maja do kraja jula, što zavisi od staništa i vremenskih uslova.

Plod sazreva od avgusta do septembra. Krasuljica potiče iz zapadne Azije i južne

Evrope, a voli sunčana staništa.

To je biljka koja se odavno uzgaja, pa se iz vrtova i uzgoja često preseli i u slobodnu

prirodu. U stvari, danas je kod nas po pravilu nalazimo u prirodi, ali uvek blizu naselja.

Krasuljica se koristi u kulinarske svrhe, a u narodnoj medicini za upale, kao depurativ,

diuretik i hipotenziv. Ekstrakt krasuljice poseduje protivupalnu, antigljivičnu, spazmolitičku

aktivnost i negativni jonotropni efekat.

8

Na specifičan ukus najviše utiče etarsko ulje kojeg u svežoj biljci ima oko 0,03%, do

oko 0,9% u plodovima.

Ovo se ulje sastoji od oko 60% estragola i oko do 30% dimetoksialilbenzena a osim

ovih jedinjenja se u ulju nalaze i manje količine isoanetola, te kavibetola. Osim etarskog ulja

biljka sadrži i gorke supstance, glikozide, karotin, vitamin C i relativno dosta gvožđa i

magnezijuma [7].

Slika 2. Anthriscus cerefolium L.

2.4. Metode za analizu etarskih ulja

Različite metode se koriste za analizu etarskih ulja, od kojih je gasna hromatografija

obično korišcena zbog isparljivosti komponenti etarskih ulja. Ova vrsta analize daje

informacije o pojedinačnim komponentama etarskih ulja i njihovim relativnim količinama.

Hromatografija na tankom sloju jednostavana je i brza metoda i koristi se za preliminarna i

rutinska ispitivanja etarskih ulja i njihovih komponenti.

Gasna hromatografija je skupa i dugotrajana metoda; snimanje po uzorku traje 45-60

minuta i samo se jedan uzorak može analizirati za to vreme. Hromatografijom na tankom

sloju se može analizirati do 17 uzorka na jedinoj pločici; brza je, pouzdana, ekonomičana i

ima veoma fleksibilan način analize. Rezultati su brzi i jasno vidljivi. Sa uvođenjem

automatske opreme hromatogrami mogu biti dobro dokumentovani i metoda tankoslojne

hromatografije može ispuniti GMP smernice. Ipak gasna hromatografija je standardna metoda

za analizu etarskih ulja a tankoslojna hromatografija se može posmatrati kao komplementarna

metoda. Gasna analiza pruža detaljne informacije dok je tankoslojna hromatografija poželjana

za preliminarne analize mnogih uzoraka [4].

9

2.5. Hromatografija

Hromatografija (od grč. χρώμα: chroma boja i grč. γραφειν: grafein pisati) je naziv za

grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje komponenti smeša.

Pod hromatografijom se podrazumevaju različite metode koje se zasnivaju na različitoj

raspodeli komponenata uzorka između dve faze, od kojih je jedna mobilna a

druga stacionarna. Hromatografske metode uključuju kretanje smeše koja se ispituje i koja je

rastvorena u mobilnoj fazi i kreće se kroz stacionarnu fazu. Ovom tehnikom se delovi smeše

razdvajaju na komponente (kvalitativna analiza) i omogućava da se u kasnijoj fazi metode

komponenta kvantitativno izoluje i analizira.

Hromatografija može biti analitička i preparativna. Preparativne hromatografske metode

se bave razdvajanjem komponenti smeše radi dalje analize i smatraju se i metodom

prečišćavanja. Sa druge strane analitičke hromatografske metode, gde se radi sa relativno

malim količinama uzorka, određuju procentualni odnos komponenti neke smeše.

Drugim rečima, hromatografija je analitička metoda koja omogućava razdvajanje i

kvantitativno određivanje supstanci koje su po strukturi slične il imaju

slične hemijske osobine [8].

U zavisnosti od tipa raspodele hromatogarfija se deli na:

1. Tečno-tečna hromatografija

2. Tečno-čvrsta hromatografija

3. Hromatografija zasnovanu na razmeni jona

4. Gel hromatografija

1. Tečno-tečna hromatografija ili podeona hromatografija ima tečnu stacionarnu fazu koja je

različitog sastava od tečne mobilne faze i međusobno se ne mešaju. Razdvajanje molekula se

zasniva na raspodeli između dve tečne faze.

2. Čvrsto-tečna ili adsorpciona hromatografija ima čvrstu stacionarnu fazu koja se sastoji od

čestica velike površine i tečnu mobilnu fazu. Razdvajanje molekula je zasnovano na

različitom vezivanju za stacionarnu fazu.

3. Jonoizmenjivačka hromatografija (IEC) je hromatografska metoda koja kao stacionarnu

fazu koristi polimerne smole (najčešće polistirenske umrežane pomoću divinil-benzena), na

koju su kovalentnom vezom vezane jonske funkcionalne grupe. Te grupe su

neutralisane jonima suprotnog polariteta i mogu biti zamenjeni jonima koji su prisutni u

ispitivanom uzorku. U zavisnosti od afiniteta, joni će se zadržavati na stacionarnoj fazi u

različitom vremenskom periodu, što omogućava njihovo razdvajanje. Uopšteno rečeno,

jonoizmenjivač najlakše vezuje jone većeg naelektrisanja i manjeg radijusa. Kao mobilna faza

najčešće se koriste puferi.

4. Gel hromatografija ima kolonu pakovanu sa poroznim materijalom koji ima određenu

veličinu pora. Molekuli manje molekulske mase će prolaziti kroz kolonu dok će se veći

zadržavati.

10

2.6. Adsorpciona hromatografija

2.6.1. Hromatografija na tankom sloju (TLC)

Adsorpciona hromatografija na sloju (TLC adsorpciona hromatografija) se, kao što ime

kaže, odvija na tankom sloju adsorbensa nanešenom na čvrsti nosač (najčešće staklene ploče).

Komponete smeše se nakon razdvajanja indentifikuju u obliku mrlja izazvanih odgovarajućim

reagensom. Mobilnu fazu čine rastvarači i njihove zasićene pare koje se kapilarni silama

“penju” u zatvorenoj komori. Da bi se naglasile prednosti ove hromatografske metode

neophodno je upoređivanje sa adsorpcionom kolonskom hromatografijom, jer se isti fizički

sistem koristi u oba slučaja.

Kolonska hromatografija je vrlo spor proces koji zahteva relativno velike količine

adsorbensa i uzorka. Za razliku od toga TLC hromatografiji potrebne su male količine

adsorbensa i izuzetno male količine uzorka, a primenjena aparatura je vrlo jeftina. Nakon

razvijanja razdvojene mrlje (koje odgovaraju zonama u kolonskoj hromatografiji) su locirane

na ploči, tako da nije potrebno sakupljanje frakcija.

Za pratično izvođenje hromatografskog postupka potrebna je sledeća oprema:

hromatografske ploče, posude (komore) za razvijanje hromatograma, prsklice za izazivanje

hromatograma, pipete za nanošenje uzorka, UV-lampa.

Adsorbensi. Dve glavne osobine adsorbensa za razdvajanje su veličina čestice i njihova

homogenost, jer adhezija na nosaču puno zavisi od toga. Grubo prosejani materijal neće

nagraditi zadovoljavajući tanak sloj, pa je za dobro razdvajanje TLC hromatografijom

potreban fino prosejan materijal. Izbor adsorbensa zahteva poznavanje osobine supstance koja

se ispituje, tj. njenu hemijsku aktivnost prema adsorbensu, hidrofilnost ili hidrofobnost,

postojanost itd.

Adsorbens Klasa jedinjenja koja se razdvaja

Silika-gel

Amino kiseline, alkaloidi,šećeri, masne kiseline, lipidi,

ulja, neroganski anjoni ili katjoni, steroidi,trepenoidi

Aluminijum oksid Alkaloidi, fenoli, steroidi, vitamin, karoteni, amino

kiseline

Celit Steroidi, neorganski katjoni

Celulozni prah Amino kiseline, alkaloidi, nukleotidi

Jono-izmenjivačka celuloza Nukleotidi, halidni joni

Skrob Amino kiseline

Poliamidni prah Antocijanini,aromatične kisline, antioksidanti, flavonidi,

proteini

Sefadeks Amino kiseline, proteini

Tabela 2. Adsorbensi za TLC hromatografiju sa klasama jedinjenja koja se razdvajaju

11

Često se hromatografskom materijalu dodaju vezivna sredstva koja neće menjati

hromatografska svojstva sloja, koja su inertna kako prema rastvaračima u razvijaču, tako i

prema reagensima koji služe za izazivanje mrlja. Osim toga ne smeju zatvarati međuprostor

između zrna adsorbensa, jer bi time bila smanjena protočna moć sloja.

Pored vezivnog sredstva hromatografskom materijalu se dodaju razni indikatori radi

lakšeg uočavanja mrlja. Većinom su to čvrste materije koje fluoresciraju delovanjem UV-

zračenja. U Tabeli 2. prikazani su adsorbensi za TLC hromatografiju sa klasama jedinjenja

koja se razdvajaju [9].

2.6.2. Stvaranje hromatograma

a) Nanošenje uzorka. Za nanošenje uzorka na tankom sloju potrebno je mnogo pažnje.

Nanošenje mrlje vrši se pomoću mikropipete ili kapilare, nanešena zapremina uzorka treba da

bude 1-5 mm3, s tim da ukoliko je potrebna veća količina uzorka, nanošenje na istom mestu

treba izvršiti nekoliko puta. Najpovoljnije je uzeti rastvore u kojima se koncetracija pojedinih

sastojaka kreće između 0,002 mg/cm3 i 1 mg/cm3. Ako su koncetracije ispod navedene, mrlje

se teško uočavaju, dok koncetracije veće od 1 mg/cm3 uzrokuju jako širenje mrlje, a time i

prekrivanje susednih mrlja.

Uzorak koji se nanosi na tanak sloj mora biti potpuno rastvoren u odgovarajućem

rastvaraču. Uzorak se na startnoj liniji u većini slučajeva nanosi u obliku rastvora, u tačku ili u

liniju. Izraz “startna linija” se koristi jer je to pozicija od koje započinje razdvajanje

komponeti smeše. Inače, jedina prednost nanošenja u tačku je u tome što se na ploči iste širine

može naneti više uzoraka nego nanošenjem u obliku linije. Najveći nedostatak nanošenja u

tačku je prezasićenje sloja. Posledica se pokazuje u širenju mrlje i nastajanju “repova”. Pri

kraju gornje ivice ploče povuče se tzv. “ciljna linija” (krajnja tačka putovanja fronta

rastvarača) oštrim perorezom. Onog trenutka kada front rastvarača dostigne označenu ciljnu

liniju, razdvajanje je završeno.

b) Razvijanje hromatograma. Kada su uzorci naneti na hromatografske ploče, ploče

se stavljaju u hromatografske kade, u kojima se nalazi smeša rastvarača, visine od 0,5-1 cm.

Važno je napomenuti da smeša rastvarača treba da stoji u hromatografskoj kadi jedan dan pre

stavljanja hromatografskih ploča u nju, kako bi se iznad rastvarača stvorio dovoljan pritisak

pare, koje igraju ulogu mobilne faze. Poželjno je kao mobilnu fazu koristiti smešu rastvarača

niske polarnosti. Jedan od razloga za to je da se minimizira adorpcija bilo koje komponete

smeše rastvarača [9].

2.6.3. Kvalitativna analiza

Identifikacija zona kod TLC hromatograije vrši se pomoću Rf vrednosti. To je odnos

između puta koji je prešla neka komponeta smeše za vreme hromatografisanja i puta koji je

prešao razvijač. Rf vrednost komponeti smeše dobijene TLC hromatografijom u manjoj meri

su pouzdane u odnosu na one dobijene hromatografijom na papiru.

12

Rf vrednost zavisi od:

• Prirode adsorbensa

• Mobilne faze

• Aktivnosti adsorbensa

• Temeprature

• Ravnoteže

• Nanošenja mrlje

Najčešće upotrebljavani postupak za dobijanje pravih podataka je upoređivanje položaja

mrlje na hromatogramu analizirane smeše sa položajem mrlja niza poznatih čistih jedinjenja -

internih standarada [9].

2.6.4. Kvantitativna analiza

U TLC hromatografiji najčešće se zasniva na spektrofotometrijiskim merenjima, pošto

je količina supstance u smeši proporcialna sa onom na mrlji. Osim mogućnosti da se sastruže

sloj na onom delu hromatograma gde se nalazi ispitivani sastojak a zatim sastojak ekstrahuje

odgovarajućim rastvaračem i spektrofotometrira, može se spektrofotometrijsko merenje vršiti

i direktno na hromatogramu. U postupku ekstrahovanja i spektofotometrijskog merenja

najvažnija je operacija ekstrahovanja iz mrlje, dok se spektrofotometrijsko određivanje vrši na

uobičajan način. Kako je većina ispitivanih sastojaka neobojena, valja najpre pouzdano

označiti područije na hromatogramu gde se nalazi ispitivani sastojak. Prilikom označavanja

dela površine s koje treba sastrugati sloj potrebno je voditi računa o tome da površina bude

uvek jednaka. Kada je potrebno određivanje male mase sastojaka preporučuje se primena

slojeva debljine do 2 mm [9].

2.6.5. Hromatografija u koloni

Stvaranje hromatograma sastoji se u dodavanju rastvora smeše komponeti preko

adsorbensa u koloni pri čemu se stvaraju pokrivene zone pojednih komponeti na samom vrhu

kolone, koje nisu potpuno jasno razdvojene. Pod “zonama” u koloni se ovde podrazumevaju

“oblasti” adsorbensa sa dominatnim sadržajem date komponete smeše.

Nakon nanošenja uzorka, prelivanje kolone rastvaračem koji ne mora nužno biti

rastvarač u kome je rastvorena smeša, ili smešom rastvarača, pospešuje bolje razdavajanje

zona. Ovaj postupak se naziva razvijanje hromatograma.

Dektekcija zona vrši se najrazličitijim metodama. Obojene zone se jasno raspoznaju na

belo obojenom adsorbensu. Neobojene supstance se često pretvaraju u obojena jedinjenja

prelivanjem kolone odgovarajućim reagensom. Osim vizuelnog utvrđivanja položaja zona,

sve više se primenjuje fizičko-hemijske metode kao što su refraktometrija, UV spektroskopija,

13

polarometrija, radio hemijske metode i dr. U zavisnosti od toga da li je hromatografija

analitička ili preparativna, ispiranje zona znači dalje dodavanje rastvarača ili smeše

rastvarača, sve dok se zone pojednih komponeti u potpunosti ne razdvoje i omogući njihova

uspešna detekcija, ili, ukoliko je potrebno, i kvantitativno sakupljanje. Može se reći da je

ispiranje produženo razijanje hromatograma [9].

Izbor adsorbensa. Od adsorbensa se zahteva da poseduje određene osobine i to:

1. Mora biti nerastvoran u svakoj od upotrebljenih mobilnih faza;

2. Adsorbens mora da bude takav da reverzibilno adsorbuje datu supstancu, pri tom

ne izazivajući nikakve hemijske promene na njoj;

3. Adsorbens mora imati dovoljno razuđenu površinu (tj. dovoljno aktivnih centara)

za adsobciju svih komponeti smeše ali ne sme biti previše aktivan da spreči

kretanje zona pri procesu razijanja hromatograma.Veličina čestica treba da je takva

da eluent može kroz njega da prolazi umrenom brzinom.

Kolona za hromatografiju. Kolone su obično različitih dužina i prečnika, i na jednom

kraju se sužavaju i završavaju slavinom ili perforiranim čepom. Donji kraj cevi ovlaš se

zatvori vatom ili staklnom vunom. Priprema stuba za hromatografiju izvodi se tako što se sipa

eluent toliko da zauzme oko jedne trećine zapremine staklene cevi. Odmerena količina

adsorbensa pomeša se sa eluentom pa se dobijena smeša sipa u cev i ostavi da se slegne, sa ili

bez upotrebe pritiska ili vakuuma. Treba voditi računa da kolona ni u jednom trenutku ne

ostane “suva” [9].

Slika 3. Hromatografija na koloni

14

2.7. Gasna hromatografija (GH)

Gasna hromatografija (GC) ili Gasno-tečna hromatografija (GLC), je hromatografska

metoda razdvajanja i detekcije organskih jedinjenja. U gasnoj hromatografiji (GC) mobilna

faza je u gasovitom stanju, a stacionarna faza može biti tečna ili čvrsta. Mobilna faza (gas

nosač) nosi komponente smeše kroz kolonu. Uzorak se pre uvođenja u kolonu mora prevesti

u gasovito stanje.

Komponete gasnog hromatograma:

• Rezervoar sa gasom nosačem

• Regulator pritiska i protoka

• Injektor

• Kolona

• Detektor

Slika 4. Šema GC

Injektor, kolona i detektor se moraju nalaziti u termostatiranom delu. Kao gas nosač

najčešće se koriste helijum, vodonik ili azot. Moraju biti prečišćeni i ne smiju sadržati

hidrokarbonate, kiseonik ili vodenu paru. Uzorak se unosi pomoću mikrošprica ili pomoću

automatskog uređaja (autosampler). Injektor ima ulogu da ispari uzorak i pomeša ga sa

mobilnom fazom.

Postoje dva tipa kolona za GC: pakovane i kapilarne kolone. Pakovane kolone, koje se

danas manje koriste, su dužine 1 – 3 m, a unutrašnji prečnik je 3 – 6 mm i punjene su

15

silikatnim materijalom. Kapilarne kolone se prave od stopljenog silicijum-dioksida,

dobivenog spaljivanjem silicijum-tetrahlorida u atmosferi kiseonika.

Unutrašnji prečnik im je od 100 – 530 µm, a dužina 12 – 100 m. Fleksibilne su i

proizvode se kao kružni namotaji [10].

Postoji više vrsta detektora za GC. Neki su univerzalni, a neki su osjetljivi samo na

pojedine komponente. Tipovi detektora za GC su:

• TCD (Detektor termalne provodljivosti)

• FID (Plameno jonizacioni detektor)

• ECD (Detektor zahvata elektrona)

• NPD (Azot-fosforni detektor)

• PID (Foto-jonizacijski detektor)

U hemijskoj analizi gasni hromatograf je instrument koji se koristi za razdvajanje

komponenti iz smeše datog uzorka. Princip gasno hromatografske analize je u prolasku

uzorka (nošen gasom nosačem) kroz kolonu koja razdvaja uzorak na komponente u zavisnosti

od fizičkih i hemijskih osobina komponenti i njihovih mogućih uzajamnih odnosa sa

stacionarnom fazom, kolonskim punjenjem. Komponenata smeše se razdvajaju na osnovu

različitog vremena zadržavanja komponenti u koloni (svaka komponenta ima svoje retenciono

vreme) i njihovom detekcijom se vrši identifikacija pojedinih komponenti. Detektor je na

kraju kolone i on električnim putem registruje pojedine komponente uzorka. Kojom će

brzinom uzorak prolaziti kroz kolonu se određuje temperaturom kolone u peći i podešavanjem

brzine prolaska nosećeg gasa (flow rate) [10].

Prilikom gasno hromatografske analize preko injektora se u kolonu

mikro špricem ubacuje tačno poznata zapremina uzorka (zapremina je izražena u

mikrolitrima). Dalje ulogu nosioca preuzima gas nosač, koji uzorak pronosi kroz kolonu.

Protok gasa nosača je i dalje stabilan ali uzorak se razlaže na sastavne delove zbog različitih

adsorbcionih sposobnosti pojedinih komponenti uzorka. Povećavanjem dužine pređenog puta

pojedinih komponenti kroz kolonu, povećava se i distanca između njih, tako da u idealnom

slučaju, prilikom izlaska uzorka iz kolone i stizanja do detektora, sve komponente uzorka su

jasno razdvojene i svaka posebno nailazi na detektor. Pomoću detektora, i vremena izlaženja,

se identifikuje svaka pojedina komponenta i koncentracija svake u datom uzorku [11].

2.8. Gasna hromatografija/Masena spektrometrija (GC/MS)

GC/MS aparat se sastoji od dve glavne jedinice: gasnog hromatografa (GC) i

spektometra masa (MS). Razlike koje postoje između različitih molekula smeše po hemijskim

svojstvima omogućuju razdvajanje dok molekul putuje kroz kolonu. Različitim molekulima

treba različito vreme (retenciono vreme) za eluiranje iz gasnog hromatografa što masenom

16

spektrometru omogućuje da jonizuje i detektuje jonizovane molekule svaki posebno. Maseni

spektrometar raščlanjuje svaki pojedini molekul u jonizovane fragmente i potom ih detektuje

koristeći odnos mase i naelektrisanja.

Ovom metodom analiziraju se jedinjenja koja je moguće prevesti u gasovito stanje pri

temperaturama nižim od 400°C a da se pri tome ne raspadnu.

Prednosti GC/MS aparata u odnosu na druge tehnike identifikacije molekula u uzorku

su bogate biblioteke masenih spektara koje olakšavaju identifikaciju nepoznatog uzorka [12].

Slika 5. Šeme GC/MS

2.9. NMR spektroskopija

Spektroskopija je tehnika kojom se analiziraju molekuli, a zansiva se na apsorpciji

energije od strane molekula. U organskoj hemiji najčešće se koriste sledeće tehnike: (1)

nuklearna magnetana rezonacija (NMR); (2) infracrvena (IC); (3) ultraljubičasta (UV); i

masena spektroskopija (MS). NMR spektroskopija, omogućava ispitivanje strukture okoline

pojedinačnih jezgara posebno vodonika i ugljenika, i daje nam najdetaljnije informacije o

strukturi molekula.

Nuklearno-magnetno-rezonantna spektroskopija (NMR) je svestrana spektroskopska

disciplina koja može da registruje signale atoma iz različitih položaja u molekulu i pri tome da

svaki signal dovede u vezu sa nekom od poznatih spinskih interakcija, glavnim izvorima

17

podataka o molekulskoj strukturi i dinamici. NMR spektroskopija je danas, uz rendgeno-

strukturnu analizu (kristalografiju X-zraka), jedina metoda kojom može da se odredi struktura

biopolimera sa razlaganjem na atomskom nivou [13].

2.9.1. Protonska NMR spktroskopija

Jezgra izotopa koja imaju neparan broj protona i neutrona, ili oba, pokazuju mehanički

spinski fenomen koji je vezan za ugaoni moment jezgra (µ). Ovaj ugaoni moment karakteriše

nuklearni spinski kvantni broj (I) koji se može prikazati jednakošću:

n

gde je n=0, 1, 2, 3, ...

Ona jezgra kod kojih je I=0 nemaju spinski ugaoni moment i ne pokazuju magnetni

rezonancioni fenomen (jezgra 12C i 16O). Jezgra kod kojih je I=1/2 (na primer, 1H, 19F, 13C, 31P i 15N) i I=1 (2H i 14N) su spin aktivna jezgra i stupaju u rezonanciju sa RF zračenjem.

Kako je za atomsko jezgro vezano naelektrisanje okretanje jezgra stvara malu električnu

struju i ima ograničeno magnetno polje zajedno sa njim. Magnetni dipol jezgra (µ) zavisi od

vrste jezgra. Kada se jezgra, koja se haotično kreću zbog termalnih energija molekula, postave

u spoljašnje magnetno polje tada nuklearni ugaoni magnetni moment teži da ih upravi prema

primenjenom magnetnom polju. Za jezgra koja imaju I=1/2 postoje dve moguće orijentacije

jezgara: paralelno sa spoljašnjim poljem (niža energija) i suprotno sa spoljašnjim poljem (viša

energija). Kako je paralelna orijentacija sa nižom energijom, veći broj jezgara ima ovu

orijentaciju u odnosu na antiparalelnu koja ima više energetsko stanje.

Ukoliko se orijentisana jezgra izlože zračenju elektromegnetnih zraka odgovarajuće

frekvencije tada će jezgra sa nižom energijom apsorbovati kvant energije i preći na viši

energetski nivo. Kada se ova spinska promena odigra za jezgro se kaže da je u rezonanciji sa

primenjenim zračenjem i metoda koja detektuje ove promene naziva se nuklearna magnetna

rezonancija (NMR).

Slika 6. Jezgra izložena elektromagnetnom zračenju

18

Nuklearna magnetna rezonancija je apsorpcija radiofrekventnog zračenja od strane

jezgra u jakom magnetnom polju. Apsorpcija zračenja prouzrokuje da se spinovi jezgara

izjednače ili brzo predju na viši energetski nivo.

Nakon prestanka zračenja jezgra otpuštaju (reemituju) apsorbovanu energiju

radiofrekventnog zračenja i vraćaju se u stanje niže energije.

Količina elektromagnetnog zračenja potrebna za rezonanciju zavisi od snage spoljašnjeg

magnetnog polja (Ho) i od karakteristika jezgra koje se ispituje. Jezgro protona postavljeno u

polje od 14100 gausa postiže rezonanciju kada se ozrači elektromagnetnim zračenjem od 60

MHz (mikrotalasno zračenje). Viša magnetna polja, koja se postižu kod superprovodnih

magneta, zahtevaju veću energiju zračenja i dobija se odgovarajuća, viša rezolucija [13].

2.9.2. Hemijsko pomeranje

Pošto je magnetni dipol nekog jezgra (µ) konstantna vrednost može se pretpostaviti da

će ista jezgra u nekom molekulu imati isti spinski prelaz na tačnoj vrednosti primenjene

frekvencije u datom primenjenom magnetnom polju (Ho). Medjutim, kod organskih molekula

to nije slučaj. Razlog je što elektroni u molekulu imaju malo magnetno polje koje teži da se

suprotstavi primenjenom polju zakljanjajući jezgro od pune snage primenjenog polja. Veća

elektronska gustina će biti, prema tome, veća zaštita pa će jezgro koje je bogato elektronima u

svom okruženju da se vidi na većoj vrednosti primenjenog polja u odnosu na jezgro za

manjim elektronskim okruženjem.

Rezultat je pomeranje NMR signala nekog jezgra u odnosu na referentni signal i naziva

se hemijsko pomeranje. Protoni ili ugljenikovi atomi vezani za elektronegativne atome će biti

nezaštićeni i njihovi signali će imati veće hemijsko pomeranje (manja vrednost primenjenog

magnetnog polja). Položaj signala se izražava u jedinicama bez dimenzija (δ-jedinicama,

ppm) i položaj signala se definiše jednakošću:

gde je ν-νs razlika frekvencija posmatranog signala i standarda (Hz), a νo radna frekvencija

instrumenta (Hz).

U 1H NMR spektroskopiji protoni zasićenih ugljovodonika apsorbuju u oblasti δ≈0,5-

1,5 ppm, protoni na ugljenikovom atomu vezanom za karbonilnu grupu su pomereni na δ≈2,0

ppm, elektronegativni atomi (kiseonik ili halogeni) pomeraju α-protone na δ≈3-4 ppm,

alkenski protoni su pomereni u oblast oko δ≈5-6 ppm, aromatski protoni su na δ≈7-8 ppm,

aldehidni protoni na δ≈10 ppm i najzaštićeniji protoni su iz karbonskih kiselina sa

vrednostima za hemijsko pomeranje od δ≈12 ppm.

Intenzitet apsorpcije za datu klasu jezgara (sa navedenim hemijskim pomeranjem) je

proporcionalan broju protona koji daju signal. Meri se površina ispod posmatranog signala

(dobija se njegovom integracijom) koja je direktno proporcionalna broju istih protona

(hemijski i magnetno ekvivalentnih) u molekulu. Integracija se uobičajeno daje kao

jednostavan odnos celih brojeva, na primer, sirćetna kiselina, CH3COOH, daje dva signala u

19

protonskom NMR: jedan na δ≈2 ppm sa površinom jednakom 3 i drugi na δ≈12 ppm sa

površinom jednakom 1.

U primeru metilacetata, CH3COOCH3 , takodje se dobijaju se dva signala: prvi na δ≈2

ppm i površinom jednakom 1 i drugi na δ≈4 ppm i površinom 1 (relativni odnosi za oba

signala su isti, ali oni predstavljaju po tri vodonika) [13].

2.9.3. Spinsko kuplovanje

Pojava multipliciteta je fenomen poznat kao spinsko kuplovanje (ili spinsko sprezanje) i

nastaje zbog interakcije magnetnog polja protona sa vezujućim elektronima u molekulu. U

suštini svaki proton može imati jednu od dve moguće spinske orijentacije u primenjenom

spoljašnjem magnetnom polju Ho tako da magnetno polje susednih protona može da ima

jednu od dve moguće vrednosti. Rezultat je da će n protona razlagati susedne protone na n+1

signala. Intenziteti ovih signala su jednostavno rezultat moguće orijentacije spinova tako da

protoni CH2 grupe mogu imati sledeće spinske mogućnosti:

Slika 7. Moguće orjentacije spinova

Dva para u sredini su degenerativni tako da ćese proton u susedstvu

Dva para u sredini su degenerativni tako da će se proton u susedstvu CH2 grupe razložiti

u tri razdvojena signala u odnosu 1:2:1. Razdvojenost izmedju ovih signala se naziva

konstanta kuplovanja, J, koja se meri u Hz i uobičajena vrednost za J ne prelazi 20 Hz. Važno

je znati da će grupe protona koji se kupluju uvek pokazivati tačnu vrednost konstante

kuplovanja. U spektru dietiletra CH3 grupa je razložena od dva protona sa susedne CH2 grupe

u tri signala (triplet), a CH2 grupa je razložena od tri protona metil grupe na n+1=4 signala

(kvartet). Dve etil grupe u dietiletru pokazuju jednaku apsorbanciju jer molekul ima ravan

simetrije tako da su obe etil grupe hemijski i magnetno ekvivalentne [13].

2.9.4 Hemijska pomeranja nekih funkcionalnih grupa

1. Elektronegativne grupe smanjuju zaštitu i utiču na pomeranje NMR signala susednih

protona na niže polje (viša vrednost u ppm).

2. Protoni sa kiseonika ili azota imaju veoma različita hemijska pomeranja koja zavise od

koncentracije, rastvarača, temperature, itd.

3. π-sistem kod alkena, aromatičnih jedinjenja i karbonilnih jedinjenja snažno smanjuju

zaštitu vezanog protona i pomera signal na niže polje, a višu vrednost u ppm.

20

Slika 8. Hemijsko pomeranje nekih funkicionalnih gupa

Za odredjivanje hemijskog pomeranja (δ) veoma je važno poznavanje i upotreba tablica

sa hemijskom pomeranjem za grupe protona.

Osnovne oblasti hemijskog pomeranja za klase organskih jedinjenja date su u Tabeli 3:

Hemijsko pomeranje (ppm) Klasa jedinjenja Struktura jedinjenja

0-2 Alkanski protoni CR3CH

2-3 Alilni protoni X=CR-CHR2

2-4.5 Protoni pored heteroatoma X-CHR2

4.5-7 Vinilni protoni R2C=CHR

6.5-8 Aromatični protoni ArH

10 Aldehidni protoni RCHO

12 Protoni karboksilnih kiselina RCOOH

Tabela 3. Hemijska pomeranja funkcionalnih grupa

2.9.5. Razlaganje signala

Razlaganje signala u dublet, triplet, kvartet, itd. je u vezi sa spinspinskim kuplovanjem

izmedju jezgara sa spinskim kvantnim brojem različitim od nule (I≠0). Vodonik ima I=1/2,

deuterijum I=1, ugljenik (12C) I=0 i ugljenik (13C) I=1/2. Multiplicitet signala ne predstavlja

broj protona na ugljenikovom atomu. Broj protona se dobija integracijom signala.

Razlaganje signala se odigrava izmedju neekvivalentnih jezgara. Primer je da etan daje

singlet, a metil grupa etanola se razlaže sa susednom metilenskom grupom [13].

21

2.9.6. Rastvarač

Većina NMR spektara se snima tako što se jedinjenja rastvaraju u rastvaračima. Na taj

način se dobijaju signali i za rastvarače pa se moraju uzeti u obzir kada se čitaju spektri. Da bi

uklonili signale protona iz rastvarača u 1H NMR spektroskopiji se koriste deuterisani

rastvarači. Kako nije moguće dobiti 100% deuterisani rastvarač dobijaju se u spektrima

signali za zaostale protone. U deuterisanom hloroformu (CDCl3 ) nalazi se mali procenat

CHCl3 čiji se signal vidi na δ=7,26 ppm. U deuterisanom metanolu nalazi se udeo CHD2OD

pa se dobija pentet signal na δ=3,31 ppm (1:2:3:2:1). Ukoliko se zna da deuterijum ima

spinski kvantni broj I=1 tada će n deuterijumovih atoma razlagati signal protona na 2I+1.

Uobičajena je praksa da se dodaje u uzorak tetrametilsilan (Me4Si) ili drugo

odgovarajuće jedinjenje kao interni standard koje ima signal za proton na δ=0,0 ppm. Noviji

instrumenti imaju mogućnost da se signal za rastvarač zadrži na tačnoj vrednosti u ppm (lock

signal) pa dodatak internog standarda nije neophodan [13].

2.9.7. 13C NMR spektroskopija

1. Omogućava detekciju karbonilnog, alkinskog ili aromatskog ugljenikovog atoma

zahvaljujući njihovim različitim hemijskim pomeranjima u 13C NMR-spektru;

2. Signali ugljenikovih atoma slabiji su od signala protona (13C NMR-spektroskopija

zahteva duže vreme snimanja uzorka);

3. 12C ima paran broj neutrona i protona (nema magnetski spin i ne može dati NMR

signal);

4. 13C izotop ima neparan broj neutrona (ima magnetski spin!);

5. 13C NMR-spektroskopija je manje osjetljiva od 1H NMR-spektroskopije (samo je

1% ugljenikovih atoma u uzorku u stanju 13C izotopa; žiromagnetska mera za 13C

iznosi tek 1/4 žiromagnetske mere za proton);

6. Površina signala u 13C NMR spektru ne mora biti proporcionalna broju C atoma,

7. Signali C atoma iz metilnih i metinskih grupa jačeg su intenziteta nego signali

kvaternih C atoma.

3. EKSPERIMENTALNI DEO

23

3.1. Analiza etarskog ulja

Za analizu i razdvajanje komponenti koristili smo etarsko ulje nadzemnog dela biljke

Anthriscus cerefolium L. koje je dobijeno u aparaturi po Clevengeru. Ulje je izolovano iz

svežih i suvih nadzemnih delova biljke [14].

3.2. Reagensi

- Cikloheksan

- Etil-acetat

- Toluen

- Diizopropil etar

- Benzol

- Metanol

- Sirćetna kiselina

- Dioksan

Svi korišćeni reagensi i rastvarači bili su p.a. ili HPLC čistoće.

3.3. TLC hromatografija

TLC je vršena na aluminijumskim pločama sa slojem silika-gela 60 UV254

(MACHEREY-NAGEL). Kao eluenti su korišćene smeše cikloheksana i etilacetata različite

razmere. Mrlje na TLC-u su vizualizovane pomoću UV lampe (254 i 365 nm).

3.4. Hromatografija na koloni

Za preparativno razdvajanje pomoću gravitacione kolonske hromatografije korišćena je

kolona (dužina 50 cm, preĉnik 1,5 cm) napakovna silika-gelom 60 (veličina zrna 0,2-0,5 mm)

i smeša cikloheksana/etilacetata za eluiranje pod izokratskim uslovima.

3.5. GC-MS hromatografska analiza

GC-MS analiza etarskih ulja, hromatografskih frakcija i izolovanih jedinjenja izvršena

je na aparatu Agilent 6890N, opremljenim sa HP-5MS (5% fenilmetilsiloksan, 30 m × 0,25

mm, debljina filma 0,25 mm, Agilent Technologies, Santa Klara, SAD) kapilarnom kolonom,

koji je bio direktno kuplovan sa 5975B, masenim detektorom iste kompanije. Kao noseći gas,

korišćen je helijum, sa konstantnim protokom od 1 ml/min.

24

Temperaturni uslovi: radna temperatura injektora i detektora 250°C; linearni

temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 50 do 290 °C, sa brzinom rasta

temperature od 4°C/min.. Injektirano je 1 µl rastvora uzorka u heksanu (1 mg u 1 ml heksana)

(1:100, w/v), u split modu (40:1).

Jonizacija je vršena elektronima energije 70 eV, sa akvizicijom u m/z opsegu 35‒650 i

dužinom trajanja jednog skena od 0,32 s.

Procentualni sastav pojedinih sastojaka određen je na osnovu površina pikova, bez

korišćenja korekcionih faktora. Obrada TIC hromatograma (TIC = Total Ion Current) i

masenih spektara vršena je u programu Amdis ver. 2.70.

3.6. NMR analiza

1H NMR i 13C NMR su snimljeni na Bruker Avance III 400 MHz spektrometru (1H na

400 MHz, a 13C na 101 MHz), opremljenim sa 5 mm dvojnom 1H/13C radnom glavom (probe

head). Svi NMR spektri snimljeni su na 25°C u CDCl3 sa tetrametilsilanom kao internim

standardom. Hemijski pomeraji izraženi su u ppm (δ jedinice) u odnosu na tetrametilsilan (δH

= 0 ppm) u 1H NMR spektrima, a u 13C NMR i heteronuklearnim 2D spektrima u odnosu na 13CDCl3 (δc = 77,16 ppm). Skalarna kuplovanja izražena su u hercima. 1H NMR spektri su

snimljeni sa 16 ponavljanja, relaksacionim vremenom od 1 s, vremenom prikupljanja signala

od 4 s, 0,125 Hz digitalnom FID rezolucijom, 51 280 FID veličinom, sa spektralnom širinom

od 6410 Hz i rezolucijom tačaka od 0,0003 ppm. 13C su snimljeni uz Waltz 16 1H

širokopojasno dekuplovanje, 12000 ponavljanja, relaksacionim vremenom od 0,5 s,

vremenom akumulacije signala od 1 s, digitalnom FID rezolucijom od 0,5 Hz, 65536 FID

veličinom, spektralnom širinom od 31850 Hz i rezolucijom tačaka od 0,005 ppm. Za snimanje

2D spektara korišćene su standardne pulsne sekvence. 1H-1H gDQCOSY i NOESY spektri su

snimljeni sa spektralnim širinama od 5 kHz i u F2 i u F1 oblasti. Snimanje je vršeno sa 1024 x

512 tačaka sa 32 ponavljanja i vremenom relaksacije od 2 s. Vreme mešanja prilikom

snimanja NOESY spektara je bilo 1 s. Obrada podataka je vršena na matrici sa 1024 podataka.

Inverzno-detektovani 2D spektri heteronuklearne korelacije su mereni u 512 kompleksnih

tačaka u F2 i 256 uzastopnih tačaka u F1, pri čemu je prikupljeno 128 (gHMQC) ili 256 (1H-13C gHMBC) ponavljanja po tački sa relaksacionim vremenom od 1 s. Spektralna širina za F2

dimenziju je bila 5 kHz, a za F1 27 kHz. gHMQC eksperimenti su bili optimizovani za C-H

kuplovanje od 165 Hz. 1H-13C eksperimenti su bili optimizovani za kuplovanje od 10 Hz.

Furijeova transformacija je bila izvršena na matrici od 512 podataka. Za sve 2D spektre

korišćene su kvadratne sinusne funkcije pomerene za π/2 duž F1 i F2 ose.

4. REZULTATI I DISKUSIJA

26

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja svežeg nadzemnog dela vrste A.

cerefolium

Hemijski sastav ulja svežih nadzemnih delova A. cerefolium dat je u tabeli 4, a

hromatogram je prikazan na slici 8. U etarskom ulju svežih nadzemnih delova ispitivane vrste

identifikovano je 22 jedinjenja, što čini 99,8% dobijenog etarskog ulja [14].

Slika 9. Hromatogram etarskog ulja svežih nadzemnih delova A. cerefolium

Najzastupljenija komponenta etarskog ulja (svežih nadzemnih delova) ispitivane vrste je

Estragol (1-Allyl-4-methoxybenzen) sa udelom od 75,1%, što čini približno 3/4 etarskog ulja.

Ostale najzastupljenije komponente, ali u mnogo manjoj količini, su Osmorizol (1-Allyl-2,4-

dimethoxybenzen) sa udelom od 23,0%. Strukture ovih jedinjenja date su na slici 9 [14].

O

H

H

H

O

H

H

H

O

Estragol Osmorizol

Slika 10. Strukture najzastupljenijih komponeti u etarskom ulju A. cerefolium

27

Tabela 4. Sastav etarskog ulja svežih nadzemnih delova A. cerefolium [14]

28

4.2. Izolovanje najzastupljenijih komponeti u etarskom ulju A.

cerefolium primenom hromatografskih metoda

Pripremljeni su eluenti različtog sastava i osobina, da bi se utvrdilo pomoću kog sistema

se postiže najbolje razdvajanje. Za razdvajanje su korišćene hromatografske metode na silika-

gelu kao stacionarnoj fazi.

Ispitivani su sledeći sistemi eluenata:

Sistem eluenta 1:

Sistem eluenta 2:

Sistem eluenta 3 :

29

Sistem eluenta 4:

Uzorak nadzemnog dela ulja je rastvoren u toluenu (40 µl ulja u 1 ml rastvarača).

Rastvoreni uzorak nanešen je na pločicu od silika gela (dimenzija 2,5x7,5 cm) kapilarom i u

kadicu za razijanje sipano je 5 ml razvijača iz svih navedenih sistema. Na osnovu dobijenih

hromatograma posmatranjem pod UV lampom na 254 nm, utvrđeno je da se najbolje

razdvajanje prisutnih komponeti (Estragola i Osmorizola) postiže sistemom cikloheksan-

etilacetat sa odnosom 95:5 što je prikazano na slici 11. Razdvajanje se pomoću svih

navedenih sistema može videti na sledećim slikama hromatograma ozračenim UV svetlošću

na 254 nm:

Slika 11. Sistem razivijača cikloheksan-etilacetat 1) 95:5, 2) 90:10, 3) 85:15

30

Slika 12. Sistem razvijača toluene-etilacetat 1) 90:10, 2) 95:5, 3) 85:15

Slika 13. Sistem razijača bezol-metanol, benzol-metanol-sirćetna, benzol-dioksan-

sirčetna 1) 90:10, 2) 45:8:4, 3) 95:25:4

Izmerena Rf vrednost na pločici gde je primenjivan sistem 95:5 cikloheksan-etilacetat

je:

31

Nakon utvrđivanja da je najbolje razdvajanje pomoću sistema cikloheksan-etilacetat

95:5, vršeno je razvijanje na većoj ploči (dimenzija 2,5x20 cm) u većoj komori, sa visinom

razvijača 1 cm. Sa slike 14 se može videti da je razdvajanje uspešno izvršeno pomoću

primenjivanog sistema.

Slika 14. Hromatogram uzorka sa razvijačem cikloheksan-etil-acetat (95:5)

Zatim je razdvajanje vršeno pomoću hromatografije na koloni. Za pakovanje kolone

(dužine 40 cm i prečnika 2 cm), korišćen je silika gel (veličina zrna 0,2-0,5 mm, 19,48g) i

silika gel sa UV indikatorom (4g). Frakcionisanje je izvršeno u 10 frakcije u erlenmajerima i

zatim je vršeno nanošenje frakcija kapilarom na malim pločicama od silika gela. Na prvoj

pločici su nanete frakcije jedan i dva, treća frakcija je naneta na drugoj pločici posebno, i

četvrta i peta frakcije su nanete zajedno na trećoj pločici. Ni u jednoj od ovih frakcija nije

došlo do potpunog razdvanja obzirom da su u svakoj bile prisutne obe komponete (slike 15,

16, 17). Frakcije su uparene na vakuum uparivaču, prebačene u vijale i snimljene na GC-MS-

u. Spojene su frakcije od 1-4, 5-7, i 9-10. Snimanjem je potvrđeno da nije ostvareno

razdvajanje glavnih komponenti ni u nijednoj od frakcija. Na hromatogramima su prisutna

oba pika (Estragol i Osmorizol) u različitim udelima.

32

Slika 15. Hromatogram frakcija od 1-4

Slika 16. Hromatogram frakcija od 5-7

33

Slika 17. Hromatogram frakcija 9-10

Posle primene hromatografije na koloni vršena je preparativna TLC hromatografija na

ploči od silika gela debljine 2 mm radi prečišćavanja i postizanja boljeg razdvajanja. Prvom

preparativnom hromatografija nakon skidanja mrlja sa hromatograma, razdvajanje nije bilo

uspešno što smo utvrdili snimanjem na GC-MS-u što se može videti na osnovu slike 17.

Uočeno je prisustvo pikova obe glavne komponete (slika 17). Nakon toga izvršena je još

jedna preparativna hromatografija spajanjem frakcija 8,9,10 i donje mrlje iz prethodne

preparativne hromatografije. Razvijen je hromatogram i izvršeno je skidanje gornje veće

mrlje sa hromatograma, nakon rastvaranja u rastvaraču, ceđenja i uparavanja na vakuum

uparivaču, snimljen je uzorak na GC-MS-u. Na osnovu dobijenog hromatograma utvrđeno je

da je uspešno odvojena komponeta estragol što se može videti na slici 18 sa masom od 211,9

mg, hromatografske čistoće 99,6%.

Slika 18. Izolovni Estragol snimljen GC-MS-om

34

Osmorizol je izolovan iz etarskog ulja nadzemog dela biljke, primenom prepartivne

hromatografije na tankom sloju. Vršena je preparativna TLC rehromatografija da bi se dobio

potpuno čist osmorizol. Na osnovu slike 19 razvijenog preparativnog hromatograma može se

videti da su prisutne komponete dobro razdvojene. Masa dobijenog Osmorizola je 10,3 mg,

hromatografske čistoće 96.2%.

Slika 19. Izolovani Osmorizol preparativni hromatogram

Slika 20. Hromatogram čistog Osmorizola

35

4.3. NMR analiza komponeti

Kao metoda za karakterizaciju izolovanih komponeti korišćena je NMR spektroskopija.

Osmorizol i Estragol su rastvoreni u deutero hloroformu u NMR kivetama i izvršeno je

snimanje na NMR spektrometru. Spektri su obrađeni u programu MestReNova (verzija 6.0.2).

4.3.1. NMR analiza Estragola

O

H

H

H

1

2 3

4

5678

9

10

Slika 21. 1H NMR spektar Estragola

36

Slika 22. HSQC spektar Estargola

Slika 23. HMBC spektar Estragola

37

Iz spektra Estragola (slika 21) se može videti da se na 3,36 ppm nalazi dublet od dva

protona čije pomeranje odgovara CH2 grupi koja je direktno vezana za benzenovo jezgro. Ova

dva protona imaju J = 6,7 Hz, i kupluju se sa protonom na 5,98 ppm (proton iz CH grupe

dvostruke veze). Ovaj proton se kupluje i sa protonima sa hemijskim pomeranjem od 5,08

ppm (multiplet od protona iz CH2 grupe dvostruke veze) dajući signal koji se može definisati

kao dublet, dublet, triplet. Iz HSQC spektra je utvrđeno da je proton na 3,36 ppm vezan za

ugljenikov atom u položaju 7 sa hemijskim pomeranjem na 39,24 ppm, iz HMBC spektra

(slika 23) se može videti da se ovaj proton daljinski spreže sa ugljenikovim atomima sa

pomeranjem na 115,18 ppm, 129,82 ppm, 137,83 ppm. Sledeći signal se javlja kao singlet od

tri protona čije je pomeranje 3,83 ppm i potiče od tri protona CH3 grupe vezane za kiseonik.

Ovi protoni su vezani za ugljenikov atom sa hemijskim pomeranjem na 55,22 ppm i daljinski

se sprežu sa ugljenikom u položaju 4 sa hemijskim pomeranjem na 157,88 ppm. Protoni

benzenovog prstena se nalaze na pomeranjima 6,87 ppm i 7,13 ppm, obzirom da zbog

simetrične strukture molekula, postoje po dva identična protona benzenovog jezgra i oni se

međusobno kupluju i javljaju se kao dubleti od po dva protona. Protoni benzenovog jezgra u

položaju 3 i 5 su vezani za ugljenikove atome sa istim pomeranjem od 113,84 ppm zbog

simetrije jedinjenja i ovi protoni se daljinski sprežu sa ugljenicima koji imaju hemijsko

pomeranje na 113,83 ppm (međusobno), 131,97 ppm, 157,74 ppm. Protoni benzenovog jezgra

u položaju 2 i 6 vezani za ugljenikove atome sa istim pomeranjem od 130 ppm se daljinski

kupluju sa ugljenikovim atomima sa hemijskim pomeranjem na 129,46 ppm (međusobno

daljinsko sprezanje) i 38,85 ppm.

Slika 24. 13C spektar Estragola

38

Slika 25. DEPT-90 spektar Estragola

Slika 26. DEPT-135 spektar Estragola

39

Na osnovu analize 13C spektra (slika 24), može se zaključiti da signali sa najmanjim

intezitetima potiču od kvaternernih ugljenikovih atoma benzenovog jezgra, jedan se javlja na

157,97 ppm, i to je ugljenikov atom benzena vezan za metoksi grupu, a drugi na 132,11 ppm

vezan za CH2 grupu. Iz DEPT-90 (slika 25) se može videti da se metinske grupe javljaju na

137,9 ppm, 129,52 ppm, 113,83 ppm koji potiču od ugljenikovih atoma benzena i CH grupe

dvostruke veze. Sledeći spektar DEPT-135 (slika 26) njegovom analizom se mogu videti

položaji CH2 grupe jer imaju negativnu vrednost i one se nalaze na 115,44 ppm i 39,35 ppm ,

na većem pomeranju se nalazi CH2 grupa dvostruke veze, dok se na manjem pomeranju

javlja CH2 grupa vezana za benzenovo jezgro. Na 55,29 ppm se nalazi ugljenikov atom iz

metoksi grupe.

4.3.2. NMR analiza Osmorizola

12

O

H

H

H

O

1

2 3

4

5678

910

11

Slika 27. 1H NMR spektar Osmorizola

40

Slika 28. HSQC spektra Osmorizola

Slika 29. HMBC spektra Osmorizola

41

U 1H NMR spektru jedinjenja Osmorizola (slika 27), dublet na najmanjem hemijskom

pomeranju 3,33 ppm pripada protonima CH2 grupe direktno vezane za benzenovo jezgro,

konstanta kuplovanja je J = 6,5 Hz i ovi protoni se kupluju sa protonima CH i CH2 grupe

dvostruke veze. Iz HSQC spektra je utvrđeno da je hemijski pomeraj ugljenika za koji su

vezani protoni metilenske grupe dvogube veze, 33,46 ppm. Na osnovu slike HMBC spektra se

može videti da se ovi protoni daljinski sprežu sa ugljenikovim atomima sa pomeranjima na

114,89 ppm, 120,83 ppm, 129,89 ppm, 137,39 ppm i 158,14 ppm. Još jedan triplet od 3

protona se javlja na 3,83 ppm i on je pripisan metil grupama vezanim za kiseonik. Iz HSQC

spektra je utvrđeno da je metoksi grupa u položaju 2 vezana za ugljenikov atom (ugljenik na

10 C atomu) prstena sa pomeranjem na 55,28 ppm a druga u položaju 4 sa ugljenikom

(ugljenik na 12 C atomu) na 55,16 ppm. Metil grupa u položaju 2 se daljinski spreže sa

ugljenikovim atomom na 159,04 ppm. U obliku multipleta na 5,04 ppm javljaju se protoni

CH2 grupe dvostruke veze, i oni su vezani za ugljenikov atom sa pomeranjem na 114,94 ppm

što se može videti iz HSQC spektra. Protoni iz ove grupe se daljinski spreže sa ugljenikovim

atomom na 33,46 ppm. Na nešto većem pomeranju na 5,99 ppm se nalazi proton iz CH grupe

čiji je ugljenikov atom vezan za dvostruku vezu i ima pomeranje od 137,38 ppm. Protoni

benzenovog jezgra se međusobno kupluju i njihova pomeranja se nalaze na 6,46 ppm kao

multiplet i na 7,05 ppm kao dublet. Proton benzenovog jezgra u položaju 5 ima pomeranje na

6,45 ppm i javlja se u obliku multipleta a vezan je za ugljenikov atom na 103,85 ppm. Drugi

proton u položaju 3 takođe se javlja u obliku multipleta na 6,46 ppm i vezan je za ugljenikov

atom sa pomeranjem na 98,48 ppm. Proton benzenovog jezgra u položaju 6 koji se javlja u

obliku dubleta na 7,04 ppm vezan je za ugljenik čije je pomeranje na 129,3 ppm (slika).

Proton u položaju 5 se daljinski spreže sa ugljenikovim atomima sa pomeranjem na 98,33

ppm, 120,89 ppm, proton u položaju 3 se daljinski spreže sa ugljenikovim atomima sa

pomeranjem na 103,70 ppm, 159,16 ppm, dok se proton u položaju 6 daljinski spreže sa

ugljenikovim atomima sa pomeranjem na 33,53 ppm, 158,64 ppm (slika 28).

42

Slika 30. 13C spektar Osmorizola

Slika 31. DEPT-90 spektar Osmorizola

43

Slika 32. DEPT-135 spektar Osmorizola

Sa 13C spektra na slici 30 se može videti da pikovi sa najmanjim intezitetima potiču od

tri kvaternerna ugljenikova atoma benzenovog jezgra koji se javljaju na 159,39 ppm, 158,10

ppm i 120,98 ppm. Iz DEPT-90 (slika 31) se može videti da se CH grupe javljaju na 137,42

ppm, 129,97 ppm, 103,92 ppm i 98,53 ppm koji potiču od ugljenikovih atoma bezena i CH

grupe dvostruke veze koja se nalazi na 137,42 ppm. Na spektru DEPT-135 (slika 32)

analizom se mogu uočiti položaji CH2 grupa koje imaju negativnu vrednost i one se nalaze na

pomeranjima od 114,98 ppm i 33,58 ppm, na većem pomeranju se nalazi CH2 grupa iz

dvostruke veze, dok se na manjem pomeranju javlja metilenska grupa vezana za benzenovo

jezgro. Na 55,37 ppm se nalaze dva C atoma iz metil grupa vezanih za kiseonikov atom u

metoksi grupama.

5. ZAKLJUČAK

45

U ovom radu su iz etarskog ulja nadzemnih delova biljke Anthriscus cerefolium L.

primenom različitih hromatografskih metoda na silika gelu kao stacionarnoj fazi, izolovane

glavne komponte i izvršena je njihova potpuna identifikacija primenom masene

spektorskopije niske rezolucije (MS) i jednodimenzione i dvodimenzione nuklearne magnetne

rezonace (NMR).

Dobijeni su sledeći rezultati:

❖ Najzastupljenija komponente etarskog ulja dobijenog iz svežih nadzemnih delova

ispitivane vrste su fenilpropanoidna jedinjnja i to Estragol (1-Allyl-4-methoxybenzen) sa

udelom od 75,1% i Osmorizol (1-Allyl-2,4-dimethoxybenzen) sa udelom od 23,0%.

❖ Analitičkom TLC hromatografijom na pločicama od silika gela (dimenzija 2,5x7,5 cm)

ispitan je kvalitet razdvajanja glavninih komponeti primenom sistema eluenta različitih

sastava i polarnosti. Na osnovu dobijenih hromatograma posmatranjem pod UV lampom

na 254 nm, utvrđeno je da se najbolje razdvajanje prisutnih komponeti (Estragola i

Osmorizola) postiže sistemom cikloheksan-etilacetat sa odnosom 95:5, koji je dalje

primenjivan u preparativnoj hromatografiji.

❖ Preparativno razdvajanje je najpre pokušano hromatografijom na koloni. Frakcionisanje je

izvršeno u 10 frakcija a kvalitet razdvajanja je utvrđen nanošenjem frakcija kapilarom na

malim pločicama od silika gela. Ni u jednoj od ovih frakcija nije došlo do potpunog

razdvanja obzirom da su u svakoj bile prisutne obe komponete. Frakcije su uparene na

vakuum uparivaču, prebačene u vijale i snimljene na GC-MS-u. Spojene su frakcije od 1-

4, 5-7, i 9-10. Snimanjem je potvrđeno da nije ostvareno razdvajanje glavnih komponenti

ni u nijednoj od frakcija. Na hromatogramima su prisutna oba pika (Estragol i Osmorizol)

u različitim udelima.

❖ Preparativnom hromatografijom na tankom sloju nakon skidanja mrlja sa hromatograma i

uparavanja utvrđeno je snimanjem na GC-MS-u da razdvajanje nije bilo uspešno. Uočeno

je prisustvo pikova obe glavne komponete. Nakon toga izvršena je rehromatografija

preparativnom TLC metodom tako što je nanet uzorak dobijen spajanjem frakcija 8, 9, 10

i donje mrlje iz prethodne preparativne hromatografije. Razvijen je hromatogram i

izvršeno je skidanje gornje veće mrlje sa hromatograma koji je nakon rastvaranja u

rastvaraču, ceđenja i uparavanja na vakuum uparivaču, snimljen na GC-MS-u. Na osnovu

dobijenog hromatograma utvrđeno je da je uspešno odvojena komponeta Estragol sa

masom od 211,9 mg, hromatografske čistoće 99,6%.

❖ Osmorizol je izolovan iz etarskog ulja nadzemog dela biljke, primenom prepartivne

hromatografije na tankom sloju. Vršena je preparativna TLC rehromatografija kako bi se

izolovala što čistija komponeta. Masa dobijenog Osmorizola je 10,3 mg, hromatografske

čistoće 96.2%.

❖ Kao metoda za karakterizaciju izolovanih komponeti korišćena je NMR spektroskopija.

Osmorizol i Estragol su rastvoreni u deutero hloroformu u NMR kivetama i izvršeno je

snimanje na NMR spektrometru. Spektri su obrađeni u programu MestReNova (verzija

6.0.2). Analizom 1H i 13C spektara kao i 2D spektara potvrđena je struktura izolovanih

komponenti.

6.LITERATURA

47

[1] M.Heinrich, J.Barnes., S.Gibbons, Williamson, E. M. Fundamentals of

Pharmacognosy and Phytotherapy, Elsevier Science Ltd., Spain, 2004.

[2] I.Raskin., D.M. Ribnicky., S. Komarnytsk., N. Ilic, A. Poulev, N. Borisjuk., A.

Brinker, D.A. Moreno, C.Ripoll, N. Yakoby, J.M. O’Neal, T. Cornwell, I. Pastor., B.

Fridlender,. Plants and human health in the twenty-first century, Trends in Biotechnology,

2002, 20, 522-531.

[3] P. Wang, Z. Su, W. Yuan, G. Deng, S. Li, Phytochemical constituents and

pharmacological activities of Eryngium L. (Apiaceae). Pharmaceut. Crop., 2012, 3, 99-

120.

[4] Diploma thesis of Katherine Gessler, Development of an optimisted HPTLC method

for analysis of essential oils, Universität Basel , May 2005.

[5] N. Kovačević, Osnovi farmakognozije, Treće izdanje, Srpska školska knjiga, Beograd

2004.

[6] B. Tatić, V. Blečić, Sistematika i filogenija viših biljaka, ZZUNS, Beograd 1988.

[7] https://hr.wikipedia.org/wiki/Krasuljica

[8] Browning, David Robert, Chromatography, New York 1959.

[9] D. Marković, S. Cakić, G. Nikolić, Hromatografija: teorijske osnove sa praktikumom,

Beograd 1998.

[10] https://sh.wikipedia.org/wiki/Gasna_hromatografija

[11] R. Chizzola, Composition of the Essential Oils from Anthriscus cerefolium var.

trichocarpa and A. caucalis Growing Wild in the Urban Area of Vienna (Austria), Nat.

Prod. Comm., 6/8, 2011, 1147-1149.

[12] S. Miliosavljević, Strukturne instrumentalne metode, Hemijski fakultet, Univerzitet u

Beogradu 1997.

[13] http://elektron.tmf.bg.ac.rs/oraganskahemija/nmr

[14] M. Jančić, Master rad: Hemijska analiza isparljivih komponenti biljne vrste

Anthriscus cerefolium L., Niš 2016.