Uvod Do Prietokovej Cytometriex

VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE

I. Pre astnkov pecializanho tdia v pecializanom odbore: Laboratrne a diagnostick metdy v klinickej imunolgii a alergolgii

II. Pre astnkov pecializanho tdia v pecializanom odbore: Klinick imunolgia a alergolgia pred pecializanou skkou

RNDr. Mira Horvthov, PhD.stav klinickej imunolgie, alergolgie a orgnovch transplantci

Lekrska fakultaSlovensk zdravotncka univerzita v Bratislave

Bratislava 2012

VOD DO PRIETOVEJ CYTOMETRIE_____________________________________________________________________________

Prietokov cytometria (flow cytometry, FC) je metda umoujca tdium jednotlivch buniek, prpadne inch astc v suspenzii, prostrednctvom analzy ich fyziklnych a/alebo chemickch vlastnost.

Prietokov cytometria je bioanalytick metda spjajca v sebe princpy fluorescennej mikroskopie a hematologickho analyztora.

Vyuva fluorescenne znaen monoklonov protiltky k detekcii komplementrnych antignov na povrchu aj vo vntrianalyzovanch buniek.

Vzhadom k vysokej senzitivite, rchlosti, irokej palete analytickch monost a relatvne nzkej cene za vyetrenie sa stala zlatm tandardom vo viacerch odboroch biomedicnskych analz.


Historicky prv prietokov cytometer bol popsan v roku 1947 (Guckera spol.). Tento prstroj umooval potanie astc v aerosle.

Dleitou etapou vo vvoji FC bolo intenzvne tdium vyuitia fluorescennch farbv v ndorovej cytolgii v 50. rokoch 20. storoia. Fluorescenn farbiv boli pouvan najprv vo fluorescennej mikroskopii, neskr sa zaali uplatova aj v prietokovej cytometrii.

V mnohch oblastiach stanovenia presnej diagnzy bol fluorescenn mikroskop nahraden prietokovm cytometrom

http://www.nirrh.res.in/support/equip/flow_cytometer.htmhttp://www.cupath.com/


P

R

I

E

T

O

K

O

V

C

Y

T

OM

E

T

R

E

Schma systmu prietokovho cytometra

http://flow.csc.mrc.ac.uk/



Hlavn komponenty prietokovho cytometra

Systm fluidiky - transportuje analyzovan astice do prietokovej (meracej) komory

Optick systm zahruje excitan zdroje (lasery) a zbern optickdrhy (oovky, zrkadl a optick filtre), ktor zachycujfluorescenn a rozptlen iarenie a privdzaj ho na opticky aktvnu vrstvu optoelektronickch detektorov (fotonsobiov a fotodid)

Elektronika digitalizcia snmanho optickho signlu na signly elektronick, ktor graficky reprezentuj jednotliv bunky na monitore riadiaceho potaa

Interpretcia spracovanie dt uvateskm softvrom a tatistickanalza

1. Zdroj svetelnho la (laser) emituje svetlo uritch vlnovch dok.

2. Laminrny prd nosnej kvapaliny una bunkovsuspenziu prstrojom a bunky jedna za druhou postupuj prietokovou komrkou, v ktorej pretnaj sveteln l, exponovan zvzkom laserovch lov.

3. Detektor (fotonsobi) zachycuje optick signly emitovan pri prechode buniek laserovm lom.


http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/

sveteln l

detektor

nosn kvapalina

Hydrodynamick fokuscia

analyzovan astice prechdzajprietokovou komrkou jedna za druhou v zkom stredovom zvzku

http://flow.csc.mrc.ac.uk/


predn sveteln rozptyl (FCS, forward scatter) je mierou vekosti buniekhttp://flow.csc.mrc.ac.uk/


bon sveteln rozptyl(SSC, side scatter) je mierou granularity buniek

Imunofenotypizcia a monoklonov protiltky


Imunofenotypizcia je analza heterognnej bunkovej populcie s cieom charakterizova prtomnos a zastpenie rznych populcibuniek.

Prv pokusy charakterizova T- a B-lymfocyty pecifickmi antisraminamierenmi proti povrchovm znakom a pomocou tvorby roziet s ovmi erytrocytmi prebehli v 60. a 70. rokoch minulho storoia.

Prevratn objav nositeov Nobelovej ceny Khlera a Milsteina z roku 1975 znamenal zsadn obrat v experimentlnom pouit pecifickch imunoglobulnov, tzv. monoklonovch protiltok.

Fluorescencia


Fluorescencia je kvantovo mechanick jav, ktor spova v uvonenasti excitanej energie elektrnu vo forme fotnu.

Elektrny fluorochrmu s v prpade prietokovej cytometrie excitovanlaserovm iarenm pecifickej vlnovej dky, ktor zodpovedabsorpnmu maximu pouitho fluorochrmu. Tm djde k prechodu elektrnu na vyiu energetick hladinu.

as excitanej energie je spotrebovan na zmeny rotane vibranho stavu molekuly, a vina tejto energie je pri nvrate elektrnu na pvodn energetick hladinu vyiaren do okolia vo forme fotnov s niou energiou, teda vou vlnovou dkou, ne maj fotny excitujce. Rozdiel medzi vlnovou dkou excitujceho a emitovanho iarenia nazvame Stokesov posun.


Tabuka niektorch fluorochrmov pouvanch v prietokovej cytometrii

FITC; pH sensitive389519495Fluorescein

587520494FluorX

PerCP-Cy5.5 conjugate695490,675TruRed

Peridinin chlorphyll protein675490PerCP

PE-Texas Red613480;565Red 613

767480;565;743PE-Cy7 conjugates

aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red670480;565;650PE-Cy5 conjugates

240 k578480;565R-Phycoerythrin (PE)

NBD-X294539466NBD

528425Lucifer yellow

551403Pacific Orange

Maleimide406455403Pacific Blue

Hydrazide596423(375);401Cascade Blue

PharRed767650; 755APC-Cy7 conjugates

104k660650Allophycocyanin (APC)

Sulfonyl chloride625615589Texas Red

Reactive and conjugated probes

NotesMWEm (nm)Ex (nm)Probe

http://flowcyt.salk.edu/fluo.html

Druhy histogramov


jednoparametrov

dvojparametrov - bodov diagram (Dot Plot)

denzitn (Density Plot)

kontrov

Niektor aplikcie prietokovej cytometrie

objem a morfolgia buniek

povrchov markery buniek

intracelulrne antigny

analza DNA

apoptza a ivotnos buniek

sortovanie buniek

ADCC (Antibody Dependent Cytotoxicity Assay)


http://www.abcam.com/


krv v protizranlivom roztoku (napr. EDTA) inkubcia krvi s monoklonovou protiltkou znaenou

fluorochrmom

Metodika imunofenotypizcie leukocytov v udskej perifrnej krvi

lza ervench krviniek lyzanm roztokom

zastavenie reakcie fosftovm roztokom

meranie a analza vzorky prietokovm cytometrom

Zkladn panel na imunofenotypizciu lymfocytov

leukocyty: CD45+ (Leukocyte Common Antigen)

monocyty/makorofgy: CD14+

T-lymfocyty: CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+

B-lymfocyty: CD19+

NK bunky: CD3-CD(56+16)+


Imunofenotypizcia subpopulci T-lymfocytov

http://www.scq.ubc.ca/flow-cytometry-a-technology-to-count-and-sort-cells/


Dvojparametrov dot plot histogramy pri analze CD4 a CD8 T-lymfocytov


http://www.bio.umass.edu/micro/immunology/lymfocyty monocyty granulocyty

Documents

Uvod Do Prietokovej Cytometriex