Embed Size (px)
Citation preview
i
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KURKUMIN DALAMSEDIAAN CAIR OBAT HERBAL TERSTANDAR (OHT) KIRANTI®
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Yunita Dwi Wulansari
NIM : 078114113
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2011
ii
iii
iv
Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow.The important thing is not to stop questioning.
(Albert Einstein)
As long as we do our bestThere's no need to regret anythingAs long as we keep strugglingIn the end...we are the winner no matter(Anonim)
Karya ini kupersembahkan untuk yang tersayang,Mama, Papa, Kakak, dan Adikku,Teman-teman, sertaAlmamaterku
v
vi
vii
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat,
kasih, penyertaan, dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri
pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Sediaan Cair Obat Herbal Terstandar
(OHT) Kiranti®. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).
Selama perkuliahan, penelitian dan penyusunan skripsi, penulis banyak
mendapat bantuan dari berbagai pihak baik berupa bimbingan, dukungan,
semangat, kritik maupun saran. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis
ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada
1. Ipang Djunarko, M.Si, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata Dharma.
2. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen pembimbing sekaligus dosen
pembimbing akademik, atas bimbingan, masukan, perhatian, semangat, dan
motivasi yang diberikan baik selama perkuliahan, penelitian maupun
penyusunan skripsi ini.
3. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, masukan,
kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis
4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan, masukan,
kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis.
5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah bersedia memberikan
senyawa standar yang berguna dalam penelitian.
viii
6. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. atas pengetahuan dan diskusi yang telah diberikan
kepada penulis.
7. Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, dan Mas Wagiran atas bantuannya selama
peneliti bekerja di laboratorium.
8. Segenap dosen dan karyawan atas segala ilmu dan pengalaman yang diberikan,
sehingga berguna dalam penyusunan skripsi ini.
9. Eliz dan Veny, sebagai rekan kerja penulis atas segala dukungan, kebersamaan,
bantuan, dan semangat yang diberikan baik selama penelitian maupun saat
penyusunan naskah skripsi.
10. Tere, Seno, Lilis, Upil, Lala, Pakdhe, K3n, Benny, dan Pace, sebagai
teman seperjuangan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumental atas
semangat dan kebersamaannya
11. Lia, atas dukungan, semangat, bantuan, nasehat, kebersamaan, dan
pengalaman berharga, baik selama perkuliahan, penelitian, maupun
penyusunan skripsi.
12. Dinar, Anin, Fifi, dan Dika, atas dukungan dan bantuan yang diberikan
kepada penulis.
13. Yudi, Yemi, Veny, Lilis, dan Devina sebagai teman yang sering satu
kelompok atas pengetahuan dan pengalaman yang diberikan.
14. Mas Bayu, atas ilmu dan pengalaman yang telah dibagikan sehingga
sangat membantu penulis dalam penyusunan skripsi.
15. Teman-teman kos Pelangi yang pernah menjadi teman seperjuangan di
Yogyakarta.
ix
16. Teman-teman BEMF 2009/2010 dan DPMF 2010/2011 atas kebersamaan
dan pengalamannya.
17. Teman-teman KKN kel 26 XL yang telah menjadi teman yang baik selama
1 bulan di Ngaran, Bantul.
18. Teman-teman FST 07 atas pengalaman, suka duka, kekompakan dan
kebersamaan yang pasti tak akan terlupakan.
19. Teman-teman angkatan 2007, atas pengalaman dan kebersamaannya
selama ini.
20. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis,
terimakasih atas bantuan yang diberikan selama ini sehingga penulis bisa
menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk membantu penulis dalam
perkembangan selanjutnya.
Penulis
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ……………………………………………………......
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ………………………........
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................
HALAMAN PERSEMBAHAN ....................................................................
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………….
PRAKATA......................................................................................................
DAFTAR ISI..................................................................................................
DAFTAR TABEL .........................................................................................
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................
INTISARI ......................................................................................................
ABSTRACT ....................................................................................................
BAB I PENGANTAR ...................................................................................
A. Latar Belakang .........................................................................................
1. Permasalahan.......................................................................................
2. Keaslian penelitian ............................................................................
3. Manfaat penelitian ............................................................................
B. Tujuan Penelitian .....................................................................................
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................
A. Kurkumin.................................................................................................
i
ii
iii
iv
v
vi
vii
x
xiv
xv
xvi
xvii
xviii
1
1
3
4
4
5
6
6
xi
B. Sediaan Cair Oral.....................................................................................
C. Obat Herbal Terstandar...........................................................................
D. Kiranti.....................................................................................................
E. Kromatografi Lapis Tipis.......................................................................
1. Tinjauan umum..................................................................................
2. Sistem KLT.......................................................................................
F. Densitometri...........................................................................................
G. Validasi Metode.....................................................................................
1. Tinjauan umum..................................................................................
2. Parameter validasi..............................................................................
H. Landasan Teori........................................................................................
I. Hipotesis..................................................................................................
BAB III METODE PENELITIAN ..............................................................
A. Jenis Rancangan Penelitian.....................................................................
B. Variabel Penelitian..................................................................................
C. Definisi Operasional...............................................................................
D. Bahan Penelitian.....................................................................................
E. Alat Penelitian........................................................................................
F. Tata Cara Penelitian...............................................................................
1. Pembuatan pelarut (metanol pH 4)....................................................
2. Pembuatan fase gerak .......................................................................
3. Pembuatan larutan baku kurkumin ...................................................
4. Penetapan panjang gelombang maksimum .......................................
9
10
11
11
11
15
17
19
19
21
24
25
26
26
26
27
27
27
28
28
28
28
28
xii
5. Pembuatan kurva baku dan pengamatan nilai Rf .............................
6. Penentuan recovery dan Coefficient of Variation .............................
7. Penentuan recovery dan Coefficient of Variation
dalam matriks sampel........................................................................
G. Analisis Hasil..........................................................................................
1. Selektivitas ........................................................................................
2. Linearitas...........................................................................................
3. Akurasi..............................................................................................
4. Presisi.................................................................................................
5. Range.................................................................................................
6. Akurasi pengukuran baku dalam matriks sampel .............................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................
A. Pembuatan metanol pH 4........................................................................
B. Pembuatan Fase gerak ...........................................................................
C. Pembuatan Larutan Baku ......................................................................
D. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum...........................................
E. Pengamatan Nilai Retardation Factor (Rf) dan
Pembuatan Kurva Baku Kurkumin........................................................
F. Validasi Metode Analisis.......................................................................
1. Selektivitas........................................................................................
2. Linearitas..........................................................................................
3. Akurasi............................................................................................
4. Presisi..............................................................................................
29
29
30
30
30
31
31
31
31
31
32
32
33
33
34
36
41
41
44
44
45
xiii
5. Range..............................................................................................
G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin pada Sampel...............
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...................................................
A. Kesimpulan............................................................................................
B. Saran......................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA.................................................................................
LAMPIRAN...............................................................................................
BIOGRAFI PENULIS...............................................................................
46
46
49
49
49
50
54
72
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I.
Tabel II.
Tabel III.
Tabel IV.
Tabel V.
Tabel VI.
Tabel VII.
Tabel VIII.
Tabel IX.
Parameter analisis validasi metode………………………….....
Kriteria rentang recovery yang dapat diterima………………...
Kriteria CV yang dapat diterima……………………………....
Data replikasi kurva baku kurkumin…………………………..
Data replikasi kurva baku kurkumin dengan penyesuaian nilai
AUC……………………………………………………………
Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi…..
Data % recovery……………………………………………….
Data Coefficient of Variation (CV)……………………………
Recovery dan CV baku kurkumin dalam matriks sampel……..
21
22
22
39
40
43
45
45
48
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1.
Gambar 2.
Gambar 3.
Gambar 4.
Gambar 5.
Gambar 6.
Gambar 7.
Gambar 8.
Gambar 9.
Gambar 10.
Gambar 11.
Gambar 12.
Gambar 13.
Gambar 14.
Gambar 15.
Gambar 16.
Gambar 17.
Gambar 18.
Struktur molekul kurkuminoid……………………………….
Tautomerisasi keto-enol kurkumin.............................................
Reaksi degradasi kurkumin…………………………………..
Produk fotodegradasi kurkumin...............................................
Logo Obat Herbal Terstandar………………………………...
Kiranti Sehat Datang Bulan…………………………………..
Gugus metilen aktif kurkumin………………………………..
Spektra baku kurkumin konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan
175 ppm…………………………………………………….....
Gugus kromofor dan auksokrom kurkumin..............................
Baku Kukumin 100 ppm...........................................................
Interaksi kurkumin dengan fase gerak………………………..
Interaksi hidrogen kurkumin dengan fase diam………….…...
Hubungan antara konsentrasi dengan AUC/100 (replikasi
III)…………………………………………………………….
Rf baku kurkumin konsentrasi 100 ppm………………………
Rf sampel replikasi I………………………………………….
Range konsentrasi kurkumin…………………………………..
Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin…….
Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin…..
6
7
8
9
10
11
32
35
35
36
37
37
41
43
44
46
47
47
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1.
Lampiran 2.
Lampiran 3.
Lampiran 4.
Lampiran 5.
Lampiran 6.
Lampiran 7.
Lampiran 8.
Lampiran 9.
Lampiran 10.
Lampiran 11.
Lampiran 12.
Lampiran 13.
Lampiran 14.
Pernyataan jaminan keaslian bahan kurkumin standar hasil
sintesis……………………………………………………..…
Data penimbangan bahan..…………………………………..
Kromatogram seri baku kurkumin replikasi III…………...…
Kromatogram validasi metode……………………………….
Contoh perhitungan kadar kurkumin………………………...
Persamaan kurva baku dan gambar kurva baku kurkumin…..
Nilai AUC dan contoh perhitungan recovery kurkumin……..
Contoh perhitungan CV kurkumin…………………………..
Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin…...
Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin…
Contoh perhitungan resolusi…………………………………
Nilai AUC sampel dan sampel yang diadisi baku kurkumin...
Contoh perhitungan recovery baku kurkumin dalam sampel..
Perhitungan CV kadar baku kurkumin dalam sampel……….
55
56
56
58
63
64
65
66
66
68
69
70
70
71
xvii
INTISARI
Kurkumin merupakan senyawa yang berasal dari bahan alamiah daritanaman obat golongan curcuma yang bermanfaat bagi kesehatan dan banyakdigunakan dalam berbagai sediaan obat tradisional. Salah satu sediaan obattradisional yang mengandung kurkumin adalah sediaan cair obat herbal terstandarmerk ‘Kiranti”. Penetapan kadar kurkumin dapat dilakukan dengan metode KLT-densitometri. Oleh karena itu perlu dilakukan validasi metode terlebih dahuluuntuk mengetahui metode yang digunakan dapat memberikan hasil yang dapatdipercaya.
Penelitian ini merupakan penelitian noneksperimental-deskriptif. Dalampenelitian ini kurkumin dan senyawa-senyawa lain dalam sampel dipisahkandengan metode KLT dengan fase diam silika gel G 60 dan fase gerak kloroform :asam asetat glasial (95:5), serta dengan jarak pengembangan sejauh 10 cm.Setelah pemisahan senyawa dengan metode KLT, kemudian dilakukan analisiskuantitatif dengan densitometer.
Parameter validasi yang diteliti adalah selektivitas, linearitas, akurasi,presisi, dan range. Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki selektivitasdan linearitas yang baik pada konsentrasi 50-175 ppm (r=0,9999), nilai recoverydan CV berturut-turut untuk konsentrasi kurkumin 50 ppm; 100 ppm; dan 175ppm 98,95-101,10% dan 1,7%; 98,61-101,79% dan 0,7%; 100,18-103,83% dan0,9%. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode KLT-densitometri ini memilikivaliditas yang baik untuk menetapkan kadar kurkumin dalam sampel.
Kata kunci : Kurkumin, KLT, densitometri, validasi metode, obat herbalterstandar
xviii
ABSTRACT
Curcumin is compound which comes from plant that are beneficial tohealth and is widely used in various traditional medicinal. One of traditionalmedicine which used curcumin is liquid stock of Scientific Based HerbalMedicine Kiranti®. The determination of curcumin can be done with TLC-densitometry method. For that reason, it is important to get validation method firstto know the appropriate method can be used to get trustable result.
This research is noneksperimental-descriptive research. In this research,curcumin and other compounds in the sample are separated using TLC methodwith the stationary phase silica gel G 60 and a mobile phase of chloroform: glacialacetic acid (95:5), along with range development for 10 cm. Then quantitativeanalysis with densitometer can be done.
Validation parameter which observed were specificity, linearity, accuracy,precision, and range. The result showed that this method has good specificity andlinearity in the concentration 50-175 ppm (r=0,9999), recovery and CV valueconsecutively for the curcumin concentration 50 ppm, 100 ppm, and 175 ppmwere 98,95-101,10% and 1,7%; 98,61-101,79% and 0,7%; 100,18-103,83% and0,9%. With this result, it can be concluded that this TLC-densitometry method hasgood validity for quantitative analysis of curcumin in the sample.
Keywords: Curcumin, TLC, densitometry, validity method, scientific based herbalmedicine
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Penggunaan bahan alam, baik sebagai obat maupun tujuan lain cenderung
meningkat, terlebih dengan adanya isu back to nature serta krisis berkepanjangan
yang mengakibatkan turunnya daya beli masyarakat. Penggunaan obat-obatan
tradisional dipercaya oleh masyarakat memiliki efek samping yang relatif kecil
bila dibandingkan obat sintesis (Sari, 2006). Walaupun demikian bukan berarti
tanaman obat atau obat tradisional tidak memiliki efek samping yang merugikan,
bila tidak disertai dengan ketepatan dosis (Katno dan Pramono,2010).
Kebijakan Badan Pengawasan Obat dan Makanan mengenai obat herbal
adalah meningkatkan penjaminan keamanan obat herbal dengan mendorong
perkembangan obat herbal sampai ke tingkat fitofarmaka atau setidaknya obat
herbal terstandar (OHT). Perkembangan ini bertujuan untuk menjamin keamanan
obat herbal sehingga obat herbal dapat dimasukkan dalam pengobatan formal.
OHT adalah obat herbal yang menggunakan bahan baku yang telah
terstandar dan khasiatnya telah dibuktikan dengan uji praklinis. Standarisasi bahan
baku diperlukan agar dapat diperoleh bahan baku yang seragam yang akhirnya
dapat menjamin efek farmakologi tanaman tersebut (Hanani, 2010).
Salah satu senyawa yang berasal dari tanaman dan banyak digunakan
sebagai bahan obat atau campuran obat tradisional adalah kurkumin. Kurkumin
banyak terdapat pada tanaman Curcuma xanthorriza (temulawak) dan Curcuma
1
2
domesticae Val. (kunyit). Dalam tanaman Curcuma domesticae, kurkumin
terdapat bersama dengan demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, yang
dikenal dengan nama kurkuminoid. Kurkumin memiliki stabilitas yang rendah,
dimana kurkumin bersifat fotosensitif dan mudah terdegradasi dalam larutan. Oleh
karena itu, perlu penjaminan mutu terhadap produk yang memiliki kandungan
kurkumin karena dikhawatirkan kurkumin dalam produk terdegradasi selama
proses distribusi dan penyimpanannya.
Salah satu obat tradisional yang mengandung kurkumin sebagai komposisi
terbesarnya adalah sediaan cair OHT Kiranti®. Produk ini cukup banyak
digunakan oleh masyarakat. Bahan baku yang digunakan dalam produk ini adalah
simplisia. Standarisasi simplisia yang dilakukan meliputi: penetapan kadar
minyak atsiri, penetapan kadar air, kadar abu larut air, kadar abu yang tidak larut
air, kadar abu larut asam, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, susut
pengeringan, dan bahan organik asing (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan
Makanan, 1995a). Standarisasi yang dilakukan belum mencakup analisis kadar zat
aktif pada produk jadi. Oleh karena itu, penetapan kadar zat aktif dalam OHT
Kiranti® perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah zat aktif yang nantinya
mempengaruhi khasiat dari OHT tersebut.
Dalam sediaan ini selain terdapat kurkuminoid juga terdapat senyawa lain,
seperti golongan minyak atsiri. Oleh karena itu digunakan metode Kromatografi
Lapis Tipis (KLT)-densitometri untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan
tersebut. Melalui metode KLT, kurkumin dapat dipisahkan dari senyawa
kurkuminoid lainnya serta senyawa lain yang terdapat dalam sampel, sehingga
3
selanjutnya dapat ditetapkan kadarnya dengan metode densitometri. KLT cocok
untuk analisis obat di laboratorium farmasi, karena metodenya sederhana, cepat
dalam pemisahan, sensitif, kecepatan pemisahan tinggi, dan memerlukan jumlah
cuplikan yang sangat sedikit (Khopkar, 1990).
Penelitian ini merupakan rangkaian dalam penelitian penetapan kadar
kurkumin dengan metode KLT-Densitometri yang meliputi optimasi, validasi
metode, dan aplikasinya pada sediaan OHT yang beredar di pasaran. Dalam hal
ini peneliti mengambil bagian pada tahap validasi metode KLT-Densitometri
untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT.
Metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan OHT ini menggunakan
sistem yang diperoleh dari hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian
penelitian ini. Suatu metode analisis harus divalidasi ketika suatu metode
menggunakan sistem baru yang belum divalidasi sebelumnya. Validasi ini
bertujuan untuk memberikan jaminan bahwa metode analisis dengan sistem yang
digunakan tersebut memenuhi parameter-parameter validasi yang meliputi
selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range sehingga dapat memberikan
hasil analisis yang valid atau dapat dipercaya. Oleh karena itu, validasi metode
merupakan tahapan yang penting untuk dilakukan sebelum metode ini
diaplikasikan untuk analisis kadar kurkumin dalam OHT Kiranti®.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang maka diperoleh permasalahan sebagai berikut:
apakah penetapan kadar kurkumin pada sediaan cair OHT Kiranti® dengan metode
4
KLT-Densitometri memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas,
linearitas, akurasi, presisi, dan range?
2. Keaslian penelitian
Sejauh sepengetahuan penulis, penelitian validasi metode penetapan kadar
kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti® dengan metode KLT-densitometri
belum pernah dilakukan sebelumnya. Penelitian mengenai penetapan kadar
kurkumin dengan metode KLT yang pernah dilakukan yaitu, penetapan kadar
baku kurkumin (E-Merck) dengan metode KLT-densitometri dengan fase diam
silika gel GF 254 dan fase gerak kloroform:etanol:air suling (25:0,96:0,04)
(Martono, 1996), penetapan kadar kurkuminoid secara simultan dalam sampel
Curcuma menggunakan metode high performance thin layer chromatography
(HPTLC) (Gupta, Gupta, and Kumar, 1999), standarisasi mutu dengan HPTLC
terhadap adanya kurkuminoid dalam Curcuma longa L. (Paramasivam, Aktar,
Poi, Banerjee, and Bandyopahyay, 2008).
Penelitian yang dilakukan penulis, menggunakan sistem KLT dengan fase
gerak kloroform : asam asetat glasial (95:5). Sejauh sepengetahuan penulis sistem
KLT yang digunakan tersebut belum pernah digunakan dalam penelitian
sebelumnya.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KLT-Densitometri pada penetapan
kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT.
5
b. Manfaat praktis. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range metode
penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti® secara KLT-
Densitometri.
B. Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa penetapan kadar
kurkumin dengan metode KLT-Densitometri memenuhi parameter-parameter
validasi yaitu selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range sehingga dapat
digunakan untuk penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT Kiranti®.
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kurkumin
Kurkumin merupakan senyawa yang banyak terdapat dalam tanaman kunyit
(Curcuma longa L.) dan temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) (Tonnesen, 1989;
Van der Goot, 1997). Di alam kurkumin umumnya ditemukan bersama
demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, yang dikenal dengan
kurkuminoid (Tonnesen dan Karlsen, 1985).
OO
OCH3 OCH3
OHHO
OO
OCH3
OHHO
OO
OHHO
Gambar 1. Struktur molekul kurkuminoid (Aggarwal, Bhatt, Ichikawa, Ahn, Sethi,Sandur, Natarajan, Seeram, dan Shishodia, 2006)
kurkumin
demetoksikurkumin
bis-demetoksikurkumin
6
7
Kurkumin (1,7 – bis(4’hidroksi-3 metoksifenil)-1,6 heptadien, 3, 5-dion
(Jaruga, 1998; Pan, 1999) memiliki berat molekul 368,126 g/mol (Tonnesen and
Karlsen, 1983). Kurkumin tergolong senyawa diarilheptanoid dengan rumus
molekul C21O6H2O (Tonnesen and Karlsen, 1985). Strukturnya yang rigid dan
planar (adanya sistem konjugasi) membuat afinitas kurkumin terhadap lipid
bilayer menjadi besar, dan juga bertanggung jawab terhadap warna kuning yang
ada (Nakayama, 1997). Panjang gelombang 425 nm diketahui sebagai panjang
gelombang serapan maksimum kurkumin dimana menghasilkan sensitivitas
pengukuran paling baik (Paramasivam et al., 2008).
Kurkuminoid mempunyai aktivitas antiinflamasi (Kohli, Ali, Ansari, and
Raheman, 2005). Kurkuminoid menghambat senyawa eicosanoid seperti
prostaglandin, tromboksan dan prostasiklin dengan cara menghambat aktivitas
enzim cyclooxygenase (COX). Kurkuminoid juga menghambat pembentukan
senyawa leukotrien dengan menghambat aktivitas enzim lipooxygenase (LOX)
(Kohli et al., 2005). Dari tiga senyawa kurkuminoid, kurkumin mempunyai
aktivitas antiinflamasi yang paling kuat dibandingkan senyawa turunannya
(Agnam, Samhoedi, Timmerman, Venie, Sugiyanto, and Goot, 1995).
Kurkumin memiliki 2 bentuk tautomer, yaitu bentuk enol dan keto
(gambar 2). Dalam larutan, kurkumin terutama berada dalam bentuk enol.
Gambar 2.Tautomerisasi keto-enol kurkumin (Stankovic, 2004).
Bentuk keto Bentuk enol
OCH3OCH3 H3COH3CO
8
Sifat kimia kurkuminoid yang menarik adalah sifat perubahan warna
akibat perubahan pH lingkungan. Dalam susana asam, kurkuminoid berwarna
kuning atau kuning jingga, sedangkan dalam suasana basa berwarna merah
(Tonnesen and Karlsen, 1985).
Stabilitas kurkumin sangat dipengaruhi oleh pH lingkungan. Dalam
larutan berair dengan pH basa, kurkumin mengalami reaksi degradasi pada gugus
metilen aktif pada senyawa tersebut. Degradasi ini terjadi bila kurkumin berada
dalam lingkungan pH 8,5 – 10,0 dalam waktu yang relatif lama, walaupun hal ini
tidak berarti bahwa dalam waktu yang relatif singkat tidak terjadi degradasi
kurkumin (Tonnesen and Karlsen, 1985). Kurkumin dapat mengalami degradasi
membentuk asam ferulat dan feruloilmetan. Feruloilmetan dapat terhidrolisis
menghasilkan vanillin dan aseton (Stankovic, 2004).
Gambar 3.Reaksi degradasi kurkumin (Stankovic, 2004).
feruloilmetan asam ferulat
vanilin aseton
9
Instabilitas kurkumin juga dipengaruhi oleh adanya cahaya yang
menyebabkan terjadinya degradasi fotokimia senyawa tersebut (Van der Goot,
1997; Supardjan, dan Meiyanto, 2002) dan oleh sinar ultraviolet (Bermawie,
Rahardjo, Wahyuno, and Ma’mun, 2005).
Gambar 4.Poduk fotodegradasi kurkumin (Tonnesen and Greenhill, 1992).
B. Sediaan Cair Oral
Sediaan cair oral dapat berupa larutan, emulsi, atau suspensi. Larutan
merupakan campuran homogen antara dua zat atau lebih. Emulsi adalah dua
cairan yang tidak saling campur, dimana salah satu cairan terdistribusi dalam
bentuk droplet di dalam cairan lainnya. Sedangkan suspensi merupakan sistem
dispersi dimana partikel padat terdispersi dalam suatu pembawa (medium
dispersi) (Aulton, 1988).
10
Sediaan cair oral obat tradisional memiliki beberapa persyaratan yang
harus dipenuhi antara lain: keseragaman volume, angka lempeng total tidak lebih
dari 10, angka kapang khamir tidak lebih dari 10, mikroba patogen negatif,
aflatoksin lebih lebih dari 30 bagian per juta (bpj), bahan tambahan, wadah dan
penyimpanan, penandaan (Kementerian Kesehatan RI, 1994).
C. Obat Herbal Terstandar (OHT)
Merupakan sediaan obat bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan
khasiatnya secara ilmiah dengan uji pra klinik dan bahan bakunya telah distandarisasi.
OHT harus memenuhi kriteria: aman, klaim khasiat dibuktikan praklinik,dan telah
dilakukan standarisasi bahan baku yang digunakan dalam produk jadi (Badan
Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004).
Gambar 5. Logo obat herbal terstandar(Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004)
Bahan baku yang digunakan dalam produk jadi dapat berupa simplisia.
Simplisia adalah bahan alamiah yang digunakan sebagai obat tradisional dan belum
mengalami pengolahan apapun juga, kecuali dinyatakan lain merupakan bahan yang
dikeringkan (Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005).
Standarisasi simplisia meliputi: penetapan kadar minyak atsiri, penetapan kadar abu,
penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam, penetapan kadar abu yang larut air,
penetapan kadar air, penetapan susut pengeringan, penetapan kadar sari yang larut
11
dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan bahan organik
asing, dan penetapan kadar tanin (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan
Makanan, 1995a).
D. Kiranti®
Kiranti Sehat Datang Bulan® merupakan OHT yang memiliki indikasi
untuk mengatasi rasa nyeri, perasaan letih, bau badan tak sedap saat haid,
keputihan dan membuat tubuh tetap fit sekaligus segar (Anonim, 2010).
Gambar 6. Kiranti Sehat Datang Bulan® (Anonim, 2010).
Komposisi Kiranti Sehat Datang Bulan® terdiri dari: Curcumae
domesticae Rhizoma (30 g), Tamarindi Pulpa (6 g), Kaempferiae Rhizoma (3 g),
Arengae pinnata Fructose (3 g), Zingiberis Rhizoma (0,8 g), Paullinia cupana
(0,23 g), Cinnamomi Cortex (0,1 g) dan air (hingga 150 mL) (Anonim, 2010).
E. Kromatografi Lapis Tipis
1. Tinjauan Umum
Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh
suatu proses migrasi diferensial dinamis oleh sistem yang terdiri dari 2 fase atau
12
lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu
dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya
perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau
kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-masing zat dapat diidentifikasi atau
ditetapkan dengan metode analitik (Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan,
1995b).
Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi di antara
dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase
gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya,
yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Umumya zat terlarut dibawa melalui media
pemisah oleh aliran pelarut berbentuk cairan atau gas yang disebut eluen. Fase diam
dapat bertindak sebagai adsorben, seperti halnya adsorben alumina yang diaktifkan,
silika gel, dan resin penukar ion, atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga
partisi antara fase diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan
dalam suatu penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam (Direktorat Jenderal
Pengawas Obat dan Makanan, 1995b).
Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi kertas
dengan berbagai macam variasinya pada umumnya merupakan kromatografi planar.
KLT dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. Pada KLT, fase
diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar
yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium, atau pelat plastik. Meskipun
demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari
kromatografi kolom (Rohman, 2009).
13
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanannya lebih mudah dan lebih
murah dibandingkan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang
digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat
melaksanakan setiap saat secara cepat (Rohman, 2009).
Pemilihan pelarut yang digunakan untuk senyawa yang akan dianalisis
dengan metode KLT, harus dapat melarutkan analit dengan sempurna, mudah
menguap, viskositas rendah, serta dapat membasahi lapisan penyerap (Sherma and
Fried, 1996).
Deteksi bercak pemisahan pada KLT dapat dilakukan dengan cara-cara
berikut:
a. menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan bereaksi
secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu
sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang bercak dipanaskan terlebih
dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan intensitas warna
bercak
b. mengamati lempeng di bawah lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254
atau 366 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak
yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi
c. menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu
dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai
bercak hitam kecoklatan
d. memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup
14
e. melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer (Gandjar
dan Rohman, 2007).
Pada kromatografi planar, senyawa yang berbeda dalam campuran
sampel menempuh jarak yang berbeda sesuai dengan seberapa kuat mereka
berinteraksi dengan fase diam dibandingkan dengan fase gerak. Semakin polar
solut maka semakin tertahan kuat ke dalam adsorben polar (silika gel). Solut-solut
non polar tidak mempunyai afinitas atau mempunyai sedikit afinitas terhadap
adsorben polar, sementara solut-solut yang terpolarisasi memiliki afinitas yang
kecil terhadap adsorben polar disebabkan adanya interaksi dipol atau interaksi-
interaksi yang diinduksi oleh dipol. Solut-solut polar, terutama yang mampu
membentuk ikatan hidrogen, akan terikat kuat pada adsorben karenanya butuh
fase gerak yang cukup polar untuk mengelusinya. Berikut adalah urutan polaritas
solut-solut organik: alkana < alkena < aromatis < eter < ester < keton dan aldehid
< tiol < amin dan amida < alkohol < fenol < asam-asam organik (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Retardation factor (Rf) merupakan parameter karakteristik KLT. Harga
Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan
jarak tepi muka pelarut dari titik awal (Roth, 1994). Angka Rf berjangka antara
0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua desimal (Stahl, 1985).
Rf =
(Dean, 1995)
Harga Rf untuk senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga
standar. Pengukuran yang sering dipakai lainnya menggunakan pengertian Rx atau
15
Rstd yang didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh
senyawa yang tidak diketahui dengan jarak yang digerakkan oleh senyawa standar
yang diketahui (Hardjono, 1983). Nilai Rx dapat dihitung:
Rx,a
(Dean, 1995).
Pengekoran noda kromatogram terjadi apabila proses pemisahan yang
terjadi tidak sempurna. Terlalu tingginya konsentrasi komponen yang ditentukan
juga merupakan salah satu penyebab terjadinya kromatogram yang berekor.
Penyebab pengekoran yang lain adalah ketidakjenuhan chamber. Ketidaktepatan
pemilihan fase gerak terhadap jenis fase diam dan macam sampel yang dianalisis
juga merupakan penyebab pengekoran kromatogram yang lainnya (Mulja dan
Suharman, 1995).
2. Sistem KLT
a. Fase diam. Fase diam yang sering digunakan dalam KLT adalah
bahan penjerap (adsorben). Silika gel merupakan penjerap yang paling banyak
digunakan dalam KLT. Pada umumnya ditambah dengan bahan pengikat untuk
memberikan kekuatan perlekatan pada pendukungnya. Bahan pengikat yang
sering digunakan adalah gipsum, dan silika gel yang diberikan tambahan senyawa,
ini dikenal dengan istilah ”silika gel G”. Kadang-kadang untuk mempermudah
identifikasi diatambah zat yang berfluoresensi sehingga dikenal dengan istilah
silika gel GF. Bahan penjerap lain yang digunakan adalah alumina, selulosa,
sefadex, poliamida, kieselguhr, dan amilum (Harborne, 1973).
16
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu
mendeaktifkan permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel.
Hal seperti ini dapat diatasi dengan memanaskan plat pada suhu 105ºC (Gandjar
dan Rohman, 2007).
b. Fase gerak. Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu
atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam yaitu lapisan
berpori karena ada gaya kapiler. Yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu
analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multikomponen, maka harus berupa
suatu campuran sederhana mungkin terdiri atas maksimum tiga komponen (Stahl,
1985).
Pemilihan sistem pelarut untuk mencapai sistem pemisahan yang
diperlukan mungkin melibatkan beberapa percobaan, tetapi pilihan pelarut cukup
terbatas dengan pertimbangan interferensi respon detektor atau kerusakan yang
mungkin terjadi dari fase diam (Dean, 1995).
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase
gerak:
1) fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif
2) daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan (Rohman, 2009).
17
F. Densitometri
Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang mendasarkan
pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan bercak pada
plat KLT. Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit
dengan kadar kecil, yang mana diperlukan pemisahan terlebih dahulu dengan
KLT (Rohman, 2009).
KLT-densitometri merupakan salah satu dari metode analisa kuantitatif.
Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan mengukur
kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada umumnya
pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan bercak
senyawa standar yang dielusi bersama-sama (Hardjono, 1985).
Metode densitometri mempunyai cara kerja yang sederhana dan cepat.
Pada metode densitometri diperlukan adsorbens dan fase gerak yang murni. Untuk
memperoleh hasil yang baik umumnya digunakan adsorbens siap pakai yang telah
mengalami pra pencucian (Gritter, 1991).
Alat densitometri mempunyai sumber sinar yang bergerak di atas bercak
pemisahan pada lempeng kromatografi yang akan ditetapkan kadar komponennya.
Lempeng digerakkan menyusuri berkas sinar yang berasal dari sumber sinar
tersebut. Bercak yang kecil dan intensif akan menghasilkan suatu puncak kurva
absorbsi yang sempit dan tajam, sebaliknya bercak yang lebar akan menghasilkan
puncak kurva absorbsi yang melebar dan tumpul (Sudjadi, 1988).
18
Teknik pengukuran dapat didasarkan atas pengukuran intensitas sinar
yang diserap (absorbansi), intensitas sinar yang dipantulkan (reflaktansi) atau
intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi) (Mintarsih, 1990).
Pada beberapa alat TLC scanner sudah dilengkapi alat pemroses data
atau mikro komputer, sehingga integrasi luas puncak atau tinggi puncak tersebut
dapat langsung direkam atau dicatat sebagai data sekaligus dengan
kromatogramnya dan dapat pula direkam dan dicatat langsung sebagai kadarnya,
melalui teknik pemrogaman tertentu. Penelusuran bercak dapat dilakukan secara
horizontal maupun vertikal (scanning horizontal atau scanning vertical).
Penelusuran bercak secara horisontal dapat dilakukan satu persatu, atau apabila
satu pelat bercak yang diperoleh segaris semua maka dapat dilakukan penelusuran
untuk semua bercak sekaligus. Sedangkan cara penelusuran vertikal, hanya dapat
dilakukan satu per satu. Pada penelusuran bercak horisontal dengan penelusuran
beberapa bercak sekaligus hanya dapat dilakukan apabila bercak-bercak tesrsebut
benar-benar berada dalam satu baris. Cara ini akan mengalami kesulitan jika
bercak yang sangat dekat dengan bercak yang akan ditetapkan, karena ada
kemungkinan bercak yang tidak diinginkan ikut tertetapkan (Mintarsih, 1990).
Penelusuran bercak akan mendapatkan hasil yang baik apabila dilakukan
pada panjang gelombang maksimum, karena perubahan konsentrasi pada bercak
sedikit saja sudah terdeteksi. Pengukuran dilakukan dengan menelusuri bercak
yang akan ditetapkan kadarnya pada kisaran panjang gelombang zat tersebut
(Mintarsih, 1990).
19
Pelat yang digunakan untuk KLT pada densitometri sebaiknya digunakan
pelat buatan pabrik, karena pada pelat buatan sendiri fase diamnya kurang rata,
sehingga akan mempengaruhi hasil penelusuran dengan densitometri, yaitu berupa
puncak yang lebar dan kasar. Puncak yang lebar disebabkan kurang kompaknya
fase diam, puncak yang kasar disebabkan permukaan pelat kurang rata (Mintarsih,
1990).
Ada dua cara penetapan dengan alat densitometer. Pertama, setiap kali
penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan dielusi
bersama dalam satu lempeng, kemudian Area Under Curve (AUC) sampel
dibandingkan dengan AUC zat baku. Yang kedua, dengan membuat kurva
hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku diperoleh dengan
membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermacam-macam konsentrasi
(minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh dicari AUC dengan
densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan : y = bx + a, dimana x adalah
banyaknya zat yang ditotolkan dan y adalah AUC (Supardjan, 1987).
G. Validasi Metode
1. Tinjauan Umum
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan
untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat akurat, spesifik, dan reprodusibel
pada kisaran analit yang akan dianalisis. Secara singkat validasi merupakan aksi
konfirmasi bahwa metode analisis yang akan digunakan sesuai dengan tujuan
yang diinginkan (Rohman, 2009).
20
Suatu metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa
parameter-parameter kinerjanya cukup mampu untuk mengatasi problem analisis,
karenanya suatu metode harus divalidasi, ketika:
a. metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu
b. metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan, atau
karena munculnya suatu problem yang mengarahkan bahwa metode tersebut
harus direvisi
c. penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah
seiring dengan berjalannya waktu
d. metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda, dikerjakan oleh analis
yang berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda
e. untuk mendemonstrasikan kesetaraan antar 2 metode, seperti antara metode
baru dan metode baku (Swartz dan Krull, 1997).
Tujuan utama validasi metode adalah untuk menghasilkan hasil analisis
yang paling baik. Untuk memperoleh hasil tersebut, semua variabel yang terkait
dengan metode analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan
sampel, tahap penyiapan sampel, jenis penyerap yang digunakan pada
kromatografi, fase gerak, dan sistem deteksinya. Banyaknya parameter yang harus
divalidasi tergantung pada tujuan analisis (Adamovics, 1997).
Menurut The United States Pharmacopeia 30th tahun 2007, metode
analisis dapat dibedakan menjadi 4 kategori, yaitu:
a. Kategori I. Mencakup prosedur analisis kuantitatif, untuk menetapkan kadar
komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi.
21
b. Kategori II. Mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif yang
digunakan untuk menganalisis impurities dalam sediaan farmasi.
c. Kategori III. Mencakup prosedur analisis yang digunakan untuk menentukan
karakteristik penampilan suatu sediaan farmasi, misalnya disolusi dan
pelepasan obat.
d. Kategori IV (tes identifikasi)
Tabel I. Parameter analisis validasi metode(United States Pharmacopeial Convention, 2007)
2. Parameter Validasi
a. Akurasi. Akurasi atau kecermatan metode analisis adalah kedekatan
hasil analisis yang diperoleh dengan menggunakan metode tersebut dengan nilai
yang sebenarnya. Penentuan kecermatan metode analisis biasanya dinyatakan
dengan persen perolehan kembali terhadap sampel yang kadarnya telah diketahui
dengan pasti (Mulja dan Suharman, 1995).
22
Tabel II. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima(United States Pharmacopeial Convention, 2007)
Analit pada matriks sampel (%) Rentang recovery yangdiperoleh(%)
100 98-102>10 98-102>1 97-103
>0,1 95-1050,01 90-107
0,001 90-1070,0001 (1 ppm) 80-110
0,00001 (100 ppb) 80-1100,000001 (10 ppb) 60-115
0,00000001 (1 ppb) 40-120
b. Presisi. Presisi suatu metode analisis merupakan sejumlah pencaran
hasil yang diperoleh dari analisis berulang kali pada suatu sampel homogen.
Presisi umumnya dinyatakan dalam coefficient of variation (CV) atau koefisien
variasi (KV) (Mulja dan Hanwar, 2003).
Tabel III. Kriteria CV yang dapat diterima(United States Pharmacopeial Convention, 2007)Kadar analit CV(%)
≥ 1 % 2,5> 0,1 5
1 ppm 161 ppb 32
c. Linearitas. Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk
memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi
analit pada kisaran yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran
seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan
konsentrasi (x) (Rohman, 2009). Persyaratan data linearitas yang bisa diterima
jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Yuwono and Indrayanto,
2005).
23
d. Batas Deteksi (Limit of Detection atau LOD). Batas deteksi
didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji
yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu.
Sebagai contoh, batas deteksi merupakan banyaknya sampel yang menunjukkan
respon (S) 3 kali terhadap derau (N) atau LOD = 3 S/N (Swartz and Krull, 1997).
e. Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification atau LOQ). Batas
kuantifikasi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang
dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan (Rohman, 2009). Batas kuantifikasi
didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi
operasional metode yang digunakan. Kadang-kadang rasio signal to noise 10:1
digunakan untuk menentukan LOQ (Rohman, 2009).
f. Selektivitas (Spesifisitas). Selektivitas atau spesifisitas merupakan
kemampuan suatu metode yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cernat
dan seksama dengan adanya kompoenen lain yang mungkin ada dalam matriks
sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
metode terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa
cemaran, produk degradasi, senyawa sejenis, dan senyawa asing lain, kemudian
dibandingkan dengan hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan yang
ditambahkan tersebut (Harmita, 2004).
24
Selektivitas pada metode kromatografi ditunjukkan melalui nilai resolusi
(Harmita, 2004). Dalam teknik pemisahan, daya pisah (resolusi) antara analit yang
dituju dengan pengganggu lainnya harus > 1,5 (Swartz and Krull, 1997).
g. Range (kisaran). Menurut ICH, kisaran suatu prosedur analisis adalah
interval antara konsentrasi (jumlah) analit pada level atas dan pada level bawah
dalam suatu sampel, yang mana dapat ditunjukkan bahwa prosedur analisis
mempunyai level akurasi, presisi, dan linearitas yang sesuai.
F. Landasan Teori
Kurkumin banyak terdapat dalam tanaman Curcuma longa dan Curcuma
xanthorrhiźa. Kurkumin di alam biasanya terdapat bersama bis-
demetoksikurkumin dan demetoksikurkumin, yang dikenal dengan nama
kurkuminoid. Kurkumin merupakan salah satu senyawa yang terkandung dalam
banyak obat tradisional. Salah satu kategori obat tradisional adalah obat herbal
terstandar, dimana obat tradisional ini telah melalui standarisasi bahan baku dan
uji praklinis.
Metode KLT dapat memisahkan beberapa campuran senyawa karena
adanya perbedaan interaksi antara senyawa-senyawa tersebut dengan fase diam
dan fase gerak yang digunakan. Bercak analit hasil pemisahan KLT dapat
dianalisis kuantitatif dengan metode densitometri.
Suatu metode dapat digunakan dalam penetapan kadar apabila metode
tersebut telah divalidasi. Parameter validasi meliputi selektivitas, akurasi, presisi,
25
linearitas, dan range. Metode dikatakan valid apabila memenuhi persyaratan
parameter validasi.
G. Hipotesis
Metode KLT-densitometri pada penetapan kadar kurkumin dalam sampel
OHT Kiranti® memenuhi parameter-parameter validasi, yaitu selektivitas,
linearitas, akurasi, presisi, dan range yang baik.
26
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan bersifat noneksperimental deskriptif karena
tidak terdapat manipulasi dan perlakuan terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas adalah sistem KLT yang telah dioptimasi, yaitu jenis dan
komposisi fase gerak.
2. Variabel tergantung adalah parameter validasi yaitu selektivitas, linearitas
akurasi, presisi, dan range.
3. Variabel pengacau terkendali adalah:
a. pelarut, untuk mengatasinya digunakan pelarut pro analisis yang memiliki
kemurnian tinggi.
b. pH pelarut, untuk mengatasinya dilakukan pengaturan pH pelarut, yaitu
pada pH 4.
c. cahaya, untuk mengatasinya pengerjaan dilakukan di ruangan dengan
intensitas cahaya yang terbatas serta dengan penggunaan alumunium foil.
26
27
C. Definisi Operasional
1. Sistem KLT yang digunakan dalam penelitian adalah fase diam berupa silika
gel G 60 dan fase gerak berupa campuran kloroform dan asam asetat glasial
(95:5).
2. Kadar kurkumin dinyatakan dalam satuan part per million (ppm).
3. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, linearitas, akurasi,
presisi, dan range.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kurkumin
(hasil sintesis Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. yang telah dikonformasi
strukturnya dengan metode spektroskopi H-NMR dan Mass Spectra, serta
memiliki titik lebur 181,2-182,40C), metanol p.a. EMSURE® ACS, ISO, Reag.
Ph. Eur (E. Merck), kloroform p.a. EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph. Eur (E.
Merck), asam asetat glasial EMPARTA® ACS (E. Merck), plat KLT silika gel G
60 (E. Merck), dan sediaan cair OHT Kiranti®.
E. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat
densitometer (Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602),
indikator pH, penyaring Millipore, mikropipet Scorex, neraca, neraca analitik
(Scaltec SBC 22 max 60/210 g; min 0,001 g; d=0,01/0,1mg; e=1mg),
ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 Ey), vaccum (Gaast model
28
DOA-P104-BN), dan alat-alat gelas yang umum digunakan dalam analisis
(Pyrex).
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan pelarut (metanol pH 4)
Dibuat campuran metanol dan asam asetat glasial dengan perbandingan
9:1.
2. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian menggunakan campuran
kloroform : asam asetat glasial (95:5). Fase gerak dibuat dalam labu ukur 100 mL
kemudian digojog.
3. Pembuatan larutan baku kurkumin
a. Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 ppm. Sejumlah lebih kurang
10,0 mg baku kurkumin ditimbang seksama kemudian dilarutkan dalam metanol
pH 4 hingga volume tepat 10,0 mL.
b. Pembuatan seri larutan baku. Sebanyak 0,250 mL; 0,375 mL; 0,500
mL; 0,625 mL; 0,750 mL; dan 0,875 mL larutan stok kurkumin diambil dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian diencerkan dengan metanol pH 4
hingga tanda, sehingga didapatkan konsentrasi 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125
ppm, 150 ppm, dan 175 ppm.
4. Penetapan panjang gelombang maksimum
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm masing-
masing ditotolkan dengan volume penotolan 3 µL pada plat KLT dengan fase
29
diam silika gel G 60 dan setelah kering dikembangkan dalam bejana kromatografi
yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai jarak rambat 10 cm, plat
dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat hasil pengembangan kemudian
secepatnya discanning panjang gelombang serapan maksimumnya dengan
densitometer.
5. Pembuatan kurva baku dan pengamatan nilai Retardation Factor (Rf)
kurkumin
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150
ppm, dan 175 ppm masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 3 µL
pada plat KLT dengan fase diam silika gel G 60 dan setelah kering dikembangkan
dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah
mencapai jarak rambat 10 cm, plat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Plat
hasil pengembangan kemudian secepatnya diukur AUC dan tinggi peaknya
dengan densitometer. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan pilih persamaan
kurva baku yang paling baik. Selain itu dilihat pula nilai Rf dari masing-masing
seri baku kurkumin.
6. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku
Seri larutan baku konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175 ppm diberi
perlakuan seperti pada poin F.5. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali. Selanjutnya
dihitung kadar terukur dengan menggunakan persamaan kurva baku yang telah
dibuat pada poin F.5. Berdasarkan data ini dapat ditentukan recovery dan CVnya.
30
7. Penentuan recovery dan Coefficient of Variations (CV) baku dalam
matriks sampel
a. Pembuatan larutan sampel (LS). Sejumlah lebih kurang 15,0 mL
sampel ditambah metanol pH 4 hingga volume 25,0 mL. Larutan sampel
kemudian didegasing selama 15 menit dan disaring dengan kertas saring. Larutan
hasil penyaringan ditambah metanol pH 4 hingga volume 25,0 mL.
b. Pembuatan larutan sampel dengan penambahan baku kurkumin (LSK).
Sejumlah 0,125 mL larutan sampel kurkumin dimasukkan dalam labu takar 5 mL,
kemudian ditambahkan 4,5 mL LS dan ditambahkan metanol pH 4 hingga tanda.
Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.
c. Pengembangan dan pengukuran. LS dan LSK diberi perlakuan seperti
pada poin F.5. Setelah itu dihitung kadar baku kurkumin dalam sampel
menggunakan persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin F.5. Kadar baku
kurkumin dalam sampel adalah selisih kadar LSK dengan kadar LS. Selanjutnya
dihitung recovery dan CVnya.
G. Analisis Hasil
1. Selektivitas
Selektivitas ditentukan dengan membandingkan nilai Rf baku dan Rf
sampel. Selain itu selektivitas juga ditunjukkan dengan nilai resolusi ≥ 1,5.
Resolusi dapat dihitung dengan cara berikut:
Resolusi (Rs)
31
2. Linearitas
Linearitas dilihat dari harga r (koefisien korelasi) hasil pengukuran seri
baku kurkumin. Suatu metode dapat dikatakan memiliki linearitas yang baik jika r
> 0,999.
3. Akurasi
Akurasi metode analisis dinyatakan dengan recovery yang dapat dihitung
dengan cara berikut:
4. Presisi
Presisi metode analisis dinyatakan dengan CV (koefisien variasi) yang
dapat dihitung dengan cara berikut:
5. Range
Range merupakan interval konsentrasi analit yang memenuhi persyaratan
linearitas, akurasi, dan presisi.
6. Akurasi pengukuran baku dalam matriks sampel
Nilai recovery baku kurkumin dalam matriks sampel dapat dihitung
dengan rumus berikut:
Recovery =
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Metanol pH 4
Kurkumin merupakan senyawa yang tidak stabil dalam pH basa, karena
dapat terdegradasi pada gugus metilen aktifnya, sehingga terbentuk asam ferulat
dan feruloilmetan. Apabila kurkumin terdegradasi, maka kadar yang diperoleh
akan berkurang sehingga tidak dapat merepresentasikan kadar kurkumin yang
sebenarnya.
Gambar 7. Gugus metilen aktif kurkumin= gugus metilen aktif
Oleh karena itu, untuk menjaga stabilitas kurkumin selama pengerjaan, maka
digunakan metanol pH 4 sebagai pelarut. pH pelarut yang digunakan ini,
diperoleh berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian penelitian
ini. Metanol sendiri memiliki pH 5, sehingga untuk menurunkan pHnya hingga 4,
dilakukan penambahan asam asetat glasial sebanyak 1 bagian pada setiap 9 bagian
metanol.
32
33
B. Pembuatan Fase Gerak
Pembuatan fase gerak pada penelitian ini menggunakan fase gerak yang
diperoleh dari hasil optimasi yang dilakukan pada rangkaian penelitian ini, yaitu
kloroform : asam asetat glasial (95:5). Pembuatan fase gerak dengan jenis dan
komposisi tersebut bertujuan agar didapatkan polaritas fase gerak yang sesuai
sehingga dapat memisahkan kurkumin dengan senyawa lain dalam sampel secara
optimal. Selain itu, pemilihan asam asetat glasial sebagai salah satu komposisi
fase gerak, juga bertujuan untuk memberikan suasana asam untuk menjaga
stabilitas kurkumin. Sistem kromatografi pada penelitian ini merupakan
kromatografi fase normal, karena fase gerak pada penelitian ini bersifat non polar,
sedangkan fase geraknya, yaitu silika gel bersifat polar.
C. Pembuatan Larutan Baku
Larutan baku kurkumin dibuat dengan melarutkan baku kurkumin
menggunakan pelarut metanol pH 4. Penelitian ini menggunakan 6 seri
konsentrasi baku kurkumin, yaitu 50 ppm, 75 ppm, 100 ppm, 125 ppm, 150 ppm,
dan 175 ppm. Pemilihan seri konsentrasi ini disesuaikan dengan melihat respon
detektor terhadap sinyal (peak) yang dihasilkan, apabila sinyal yang dihasilkan
pada konsentrasi tertentu terlalu kecil, maka sinyal tersebut dapat terganggu oleh
noise yang dihasilkan alat, maka pemilihan konsentrasi harus melihat rasio
konsentrasi analit terhadap sinyal (respon detektor). Selain itu pemilihan seri
konsentrasi ini juga bertujuan agar respon analit yang terdapat dalam sampel
dapat masuk ke dalam respon seri larutan baku. Dengan demikian persamaan
34
kurva baku yang diperoleh dapat digunakan untuk penetapan kadar analit dalam
sampel.
D. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Kurkumin
Penetapan panjang gelombang maksimum kurkumin dilakukan agar
didapatkan panjang gelombang dimana kurkumin memberikan respon yang
maksimum, sehingga sensitivitas pengukurannya tinggi, serta memberikan hasil
yang reprodusibel pada pengulangan pengukuran. Oleh karena itu, dengan
pengukuran pada panjang gelombang maksimum, diharapkan dapat
meminimalkan kesalahan pada pengukuran.
Penetapan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan
menggunakan 3 seri konsentrasi, yaitu konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, dan 175
ppm. Penggunaan 3 seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada
konsentrasi yang dianggap mewakili seluruh konsentrasi pada seri baku ini
dihasilkan spektrum serapan maksimum yang sama. Scanning panjang gelombang
maksimum kurkumin dilakukan pada panjang gelombang 400-500 nm, karena
panjang gelombang maksimum teoritis kurkumin adalah 425 nm. Dari hasil
scanning dengan densitometer, diperoleh panjang gelombang maksimum (λ maks)
ketiga seri konsentrasi pada 425 nm.
35
Gambar 8. Spektra baku kurkumin konsentrasi 50ppm, 100 ppm, dan 175 ppm (λ maks=425 nm)
Kurkumin memiliki gugus kromofor yang panjang serta auksokrom,
sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang visibel.
Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom pada kurkumin= kromofor= auksokrom
175 ppm
100 ppm
50 ppm
36
E. Pengamatan nilai Retardation Factor (Rf) dan Pembuatan Kurva Baku
Kurkumin
Pengamatan nilai Rf merupakan parameter analisis kualitatif yang
nantinya digunakan untuk mengetahui ada tidaknya analit dalam sampel.
Pengamatan nilai Rf menggunakan konsentrasi tengah seri larutan baku kurkumin,
yaitu 100 ppm. Dari hasil pengamatan, diperoleh nilai Rf baku kurkumin 0,52.
Gambar 10. Baku kurkumin 100 ppm (nilai Rf=0,52)
Nilai Rf kurkumin dari sistem KLT ini dipengaruhi oleh interaksi kurkumin
dengan fase gerak maupun fase diamnya. Interaksi kurkumin dengan fase diam
dan fase gerak dapat dilihat pada gambar 11 dan 12.
37
OCH3
HO
O O
OCH3
OH
C Cl
Cl
Cl
C Cl
Cl
Cl
C Cl
Cl
Cl
C Cl
Cl
Cl
C
Cl
Cl
Cl
C Cl
Cl
Cl
C
O
O
H
H
H
H
HH
H
C Cl
Cl
Cl
H
H3C
Gambar 11. Interaksi kurkumin dengan fase gerak
O Si O
O
Si
O
O Si
O
O Si
O
O Si
O
O
Si Si Si Si Si OO
O
OOOO
O OH OH OH
OCH3
O
OCH3
O
Si
O
O
Si
Si
O
OH
O
Si OH
HHHH
H H
OO
Gambar 12. Interaksi hidrogen kurkumin dengan fase diam
Interaksi hidrogen
Interaksi dipol-dipol
Interaksi dipol-dipol
Interaksi dipol-dipol
Interaksidipol-dipol
38
Pada gambar 11 dan 12 dapat dilihat bahwa interaksi kurkumin dengan
fase geraknya lebih dominan. Adanya interaksi hidrogen dan interaksi dipol-dipol
antara asam asetat glasial dengan kurkumin serta interaksi dipol-dipol kloroform
dengan kurkumin akan menyebabkan lepasnya interaksi hidrogen antara kurkumin
dengan permukaan silika gel. Hal ini akan menyebabkan kurkumin dapat terelusi
oleh fase gerak dan mencapai jarak rambat tertentu. Interaksi yang sesuai antara
kurkumin dengan fase diam dan fase gerak akan menghasilkan nilai Rf yang baik,
yaitu antara 0,2-0,8.
Selain dari analisis interaksi senyawa terhadap fase diam dan fase
geraknya. Nilai Rf suatu senyawa juga dapat dijelaskan dari polaritas senyawa
tersebut dan kesesuaiaannya terhadap polaritas dari fase gerak yang digunakan.
Fase gerak yang digunakan yaitu campuran antara kloroform dan asam asetat
glasial (95:5) dengan indeks polaritas campuran 4,205. Dari hasil percobaan
indeks polaritas ini memiliki kesesuaian polaritas dengan kurkumin, sehingga
kurkumin dapat terelusi oleh fase gerak dan mencapai jarak rambat tertentu.
Pembuatan kurva baku kurkumin dilakukan 3 replikasi. Hal ini bertujuan
untuk mendapatkan nilai koefisien korelasi yang paling baik. Koefisien korelasi
menunjukkan korelasi hubungan antara konsentrasi dengan respon pengukuran,
baik itu Area Under Curve (AUC) atau tinggi peak. Respon yang menunjukkan
nilai korelasi yang paling baik terhadap konsentrasi akan digunakan dalam
pembuatan persamaan kurva baku.
Hasil pengukuran respon dari tiap kadar baku kurkumin pada tiga
replikasi dapat dilihat pada tabel IV.
39
Tabel IV. Data replikasi kurva baku kurkuminBaku kurkumin
Replikasi I Replikasi II Replikasi IIISeribaku
(ppm)AUC
Tinggipeak
Seribaku
(ppm)AUC
Tinggipeak
Seribaku
(ppm)AUC
Tinggipeak
51,5 7009,9 183 49,5 6528,6 145,5 50 6600 149,677,25 9403,3 252,1 74,25 8785,8 211,9 75 8864,1 216,9103 11159,2 272,2 99 11108,2 253 100 11298,6 257,7128,75 13535,4 341,5 123,75 13577,8 330,9 125 13455,5 336,9154,5 15461,5 355,8 148,5 15698 358,6 150 15774,6 364,6180,25 18444 449,5 173,25 17818,8 449,5 175 18201,1 397,7
A 2509,4781
88,7867 A 2011,2267
57,0619
A 1965,0057
60,5876
B 86,2372 1,900 B 91,9564 2,0190 B 92,4502 2,0146r 0,9976 0,9821 r 0,9997 0,9890 r 0,9999 0,9886
Pada tabel IV dapat dilihat bahwa hubungan antara kadar dengan AUC
menunjukkan korelasi yang lebih baik dibandingkan hubungan antara kadar
dengan tinggi peak. Korelasi yang baik ini dilihat dari nilai r yang paling
mendekati 1. Oleh karena itu, respon pengukuran yang akan digunakan adalah
AUC.
Rata-rata sudut yang dibentuk dari hasil pembuatan kurva baku adalah
89,340C. Sudut ini hampir berdempet dengan sumbu y, sehingga dari segi
sensitivitas kurva baku ini kurang layak ditampilkan. Oleh karena itu, diperlukan
penyesuaian pada nilai AUC agar diperoleh sudut kemiringan yang mendekati
450. Faktor koreksi yang digunakan untuk penyesuaian nilai AUC adalah 100.
Nilai ini selanjutnya akan digunakan sebagai faktor koreksi AUC untuk setiap
perhitungan. Hasil penyesuaian nilai AUC ini dapat dilihat pada tabel V.
40
Tabel V. Data replikasi kurva baku kurkumin dengan penyesuaian nilai AUCBaku kurkumin
Replikasi I Replikasi II Replikasi IIISeri baku
(ppm)AUC/100
Seri baku(ppm)
AUC/100Seri baku
(ppm)AUC/100
51,5 70,099 49,5 65,286 50 6677,25 94,033 74,25 87,858 75 88,641103 111,592 99 111,082 100 112,986128,75 135,354 123,75 135,778 125 134,555154,5 154,615 148,5 156,98 150 157,746180,25 184,44 173,25 178,188 175 182,011
A 25,0948 A 20,1123 A 19,6500B 0,8624 B 0,9196 B 0,9245r 0,9976 r 0,9997 r 0,9999
Kurva baku yang digunakan adalah kurva baku yang memiliki linearitas
yang baik. Linearitas menyatakan adanya hubungan respon pengukuran yang
secara langsung proporsional terhadap konsentrasi (jumlah) analit. Suatu kurva
baku memiliki linearitas yang baik apabila memiliki nilai r > 0,999 (Yuwono and
Indrayanto, 2005). Pada tabel V di atas dapat dilihat bahwa kurva baku replikasi II
dan III telah memenuhi persyaratan linearitas yang baik, namun yang dipilih
untuk digunakan pada perhitungan kadar selanjutnya adalah kurva baku replikasi
III, karena memiliki nilai r yang lebih mendekati 1. Kurva hubungan konsentrasi
kurkumin dengan AUC dapat dilihat pada gambar 13. Dengan demikian
persamaan kurva baku yang digunakan adalah y = 0,9245x + 19,6500, dengan r =
0,9999.
41
Gambar 13. Hubungan antara konsentrasi kurkumin dengan AUC/100(replikasi III)
F. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode
analisis yang digunakan memenuhi persyaratan validitas sehingga memberikan
hasil analisis yang dapat dipercaya. Validasi dilakukan dengan 3 seri konsentrasi
sebanyak 5 replikasi. Konsentrasi yang digunakan merupakan konsentrasi rendah,
sedang, dan tinggi dari konsentrasi seri baku, yaitu 50 ppm, 100 ppm, dan 175
ppm. Pemilihan ketiga seri konsentrasi ini adalah untuk mewakili setiap
konsentrasi dari seri baku, yaitu 50 ppm sampai 175 ppm. Parameter yang
digunakan dalam penentuan validitas metode ini adalah selektivitas, linearitas,
akurasi, presisi, dan range.
1. Selektivitas
Selektivitas metode menggambarkan kemampuan suatu metode untuk
mengukur respon analit dalam sampel secara akurat diantara semua komponen
yang terdapat dalam matriks sampel. Metode yang memenuhi persyaratan
selektivitas, maka metode tersebut hanya mengukur kadar analit. Pengambilan
42
analit dari matriks sampel, dilakukan dengan mengekstraksi sampel dengan
metanol pH 4. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan ultrasonikator.
Gelombang ultrasonik yang dihasilkan akan memberikan energi atau getaran yang
akan mendorong kurkumin keluar dari serbuk simplisia yang tersuspensi dalam
sampel, kemudian adanya metanol akan dapat menarik dan melarutkan kurkumin.
Hal ini disebabkan karena kurkumin memiliki kelarutan yang baik dalam metanol.
Namun banyak senyawa-senyawa dalam sampel yang juga memiliki kelarutan
yang baik dalam metanol, sehingga dapat ikut terekstraksi bersama kurkumin,
seperti demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, serta minyak atsiri. Oleh
karena itu, selektivitas yang baik dari metode diperlukan untuk mengukur analit
secara akurat tanpa terganggu oleh senyawa-senyawa lain yang terdapat dalam
sampel.
Penentuan selektivitas dari metode KLT-Densitometri ini dapat dilihat
dengan membandingkan nilai Rf baku dan Rf analit dalam sampel. Nilai Rf
merupakan parameter analisis kualitatif suatu senyawa dalam campuran pada
metode KLT, sehingga dapat digunakan sebagai parameter selektivitas. Parameter
lain dari selektivitas adalah resolusi, dimana suatu metode dikatakan memiliki
selektivitas yang baik apabila memiliki nilai resolusi > 1,5 (Swartz and Krull,
1997). Perbandingan nilai Rf antara baku dan analit dalam sampel serta nilai
resolusi dapat dilihat pada tabel VI.
43
Tabel VI. Perbandingan nilai Rf baku dan sampel, serta nilai resolusi
Konsentrasi serilarutan baku
kurkumin (ppm)Rf baku
Replikasisampel
Rf sampel Resolusi
50 0,53 1 0,50 2,475 0,53 2 0,50 2,25100 0,52 3 0,50 2,4125 0,53 4 0,51 2,53150 0,53 5 0,54 2,57175 0,54
Rata-rata 0,53 0,51 2,43
Pada tabel VI dapat dilihat bahwa Rf baku dan analit dalam sampel
menunjukkan nilai yang identik, dimana nilai Rf rata-rata dari baku adalah 0,53
dan Rf rata-rata dari analit dalam sampel adalah 0,51. Dari gambar 14 dan 15
dapat dilihat nilai Rf yang identik antara baku dan sampel. Sedangkan untuk nilai
resolusi, pada gambar 15 dapat dilihat bahwa pada kromatogram sampel terdapat
3 peak dan nilai rata-rata resolusi antara peak nomor 3 dengan peak terdekat (peak
nomor 2) adalah 2,43. Berdasarkan nilai Rf dan resolusi yang diperoleh tersebut,
maka metode KLT-Densitometri ini dikatakan memenuhi parameter selektivitas
dalam menetapkan kadar kurkumin.
Gambar 14. Rf baku kurkumin konsentrasi 100 ppm = 0,52
44
Gambar 15. Rf sampel replikasi 1 = 0,50
2. Linearitas
Linearitas suatu metode ditunjukkan oleh nilai koefisien korelasi (r) dari
kurva baku, dimana nilai r ini menunjukkan korelasi hubungan antara konsentrasi
dengan respon pengukuran, dalam hal ini AUC. Suatu metode dikatakan memiliki
linearitas yang baik apabila nilai r > 0,999 (Yuwono and indrayanto, 2005).
Berdasarkan data yang diperoleh dari hasil pembuatan kurva baku
diperoleh nilai r untuk replikasi II = 0,9997 dan replikasi III = 0,9999. Nilai r
yang kurva baku repliasi II dan III tersebut memenuhi persyaratan, sehingga dapat
dikatakan metode KLT-densitometri ini memiliki linearitas yang baik dalam
menetapkan kadar kurkumin.
3. Akurasi
Akurasi metode dalam suatu penelitian dinyatakan dengan nilai recovery.
Recovery merupakan persen perolehan kembali kadar terukur terhadap kadar
sebenarnya. Suatu metode dikatakan memiliki akurasi yang baik apabila nilai %
recoverynya antara 98-102% (Harmita, 2004).
45
Tabel VII. Data % recovery
Recovery (%)Kadarkurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V50 ppm 101,10 100,11 99,00 100,75 98,95
100 ppm 101,64 100,77 101,79 100,10 98,61175 ppm 101,99 100,18 102,72 103,83 100,96
Berdasarkan hasil yang diperoleh, nilai recovery yang masuk pada
rentang 98-102% adalah konsentrasi level rendah hingga sedang. Pada level
konsentrasi tinggi (175 ppm), metode ini memiliki nilai recovery antara 100,18-
103,83%, nilai recovery yang diperoleh tidak memenuhi persyaratan akurasi yang
baik yaitu 98-102% (Harmita, 2004). Oleh karena itu, metode ini dikatakan
memiliki akurasi yang baik pada kadar 50 ppm dan 100 ppm, sehingga dapat
digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin pada level tersebut.
4. Presisi
Presisi merupakan parameter yang menggambarkan kedekatan hasil
pengukuran satu dengan lainnya dalam kondisi analisis yang sama. Presisi
dinyatakan dengan nilai Coefficient of Variation (CV) atau Relative Standar
Deviation (RSD). Kriteria presisi yang baik yaitu nilai CV ≤ 2% (Harmita, 2004).
Tabel VIII. Data Coefficient of Variation (CV)
Kadar kurkumin (ppm) SD CV (%)
50 ppm 50,2883 0,8552 1,7100 ppm 100,5458 0,7125 0,7175 ppm 179,4245 1,5902 0,9
Dari hasil perhitungan data yang diperoleh, nilai CV pada konsentrasi 50
ppm, 100 ppm, dan 175 ppm kurang dari 2 %. Oleh karena itu, metode penetapan
kadar kurkumin ini dikatakan memiliki presisi yang baik, sehingga penetapan
46
kadar kurkumin pada level konsentrasi tersebut menggunakan metode ini akan
memberikan kedekatan hasil pengukuran.
5. Range
Range merupakan interval antara konsentrasi analit pada level bawah dan
level atas dalam suatu sampel, yang masih memenuhi parameter linearitas,
akurasi, dan presisi.
Gambar 16. Range konsentrasi kurkumin
Pada gambar 16 dapat dilihat bahwa range konsentrasi metode ini adalah
50-100 ppm. Range ini menunjukkan area analisis yang memenuhi parameter
linearitas, akurasi, dan presisi.
G. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin dalam Sampel
Penentuan akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel dilakukan
dengan menambahkan baku kurkumin ke dalam matriks sampel. Namun sebelum
melihat akurasi dan presisi baku kurkumin dalam sampel, adisi baku kurkumin
pada sampel juga dilakukan untuk memastikan bahwa peak dengan nilai Rf yang
identik terhadap baku kurkumin memang merupakan peak senyawa kurkumin.
Linearitas dan presisi
akurasi
47
Hal ini dapat diketahui dengan melihat apakah terjadi penambahan luas area pada
peak yang dimaksud ketika dilakukan penambahan baku ke dalam sampel.
Apabila luas area pada peak tersebut bertambah ketika baku kurkumin
ditambahkan maka dapat dipastikan bahwa peak tersebut merupakan peak
kurkumin. Berikut adalah gambar peak dari sampel tanpa penambahan baku dan
sampel yang ditambah baku:
Gambar 17. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku kurkumin
Gambar 18. Kromatogram sampel dengan penambahan baku kurkumin
Berdasarkan hasil yang diperoleh, terjadi penambahan luas area pada
peak yang memiliki nilai Rf identik terhadap baku kurkumin. Dengan demikian
dapat disimpulkan bahwa peak tersebut merupakan kurkumin.
48
Setelah dapat dipastikan bahwa peak dengan nilai Rf yang identik
tersebut merupakan kurkumin, maka dilakukan penentuan akurasi dan presisi
baku kurkumin dalam sampel. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah metode
ini masih dapat mengukur respon baku kurkumin dalam matriks sampel secara
akurat dan seksama. Akurasi dan presisi baku yang ditambahkan dapat dilihat
pada tabel IX.
Tabel IX. Recovery dan CV baku kurkumin dalam matriks sampel
Replikasi Recovery (%) CV (%)
I 101,28
II 99,47
III 101,83
IV 96,99
V 103,55
2,5
Kadar baku yang ditambahkan pada sampel adalah 25 ppm, maka
menurut USP, nilai recovery yang dapat diterima yaitu 90-107% dan nilai
CV≤16%. Oleh karena itu, dari tabel IX dapat disimpulkan bahwa metode KLT-
Densitometri ini dapat mengukur analit dalam matriks sampel secara akurat dan
seksama.
49
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Metode KLT-densitometri dengan instrumen Camag TLC Scanner 3
CAT. No. 027.6485 SER. No.160602, fase diam silika gel G 60, fase gerak
kloroform:asam asetat glasial (95:5), volume penotolan 3,0 μL, dan jarak
pengembangan 10 cm memiliki selektivitas dan linearitas yang baik akurasi yang
baik pada konsentrasi 50-100 ppm, presisi yang baik pada konsentrasi 50-175
ppm, serta range antara 50-100 ppm. Berdasarkan hasil tersebut, maka metode
KLT-densitometri ini memiliki validitas yang baik untuk menetapkan kadar
kurkumin dalam sampel OHT Kiranti®.
B. Saran
Perlu dilakukan penetapan kadar kurkumin pada sampel OHT Kiranti®
menggunakan metode ini.
50
DAFTAR PUSTAKA
Adamovics, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals,2nd Edition,Marcel Dekker, New York.
Aggarwal, B., Bhatt, D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sandur, S.K.,Natarajan, C., Seeram, N., and, Shishodia, S., 2006, Curcumin-Biologicaland medicinal Properties, 299-300, http://www.indsaff.com/10%20Curcumin%20biological.pdf , diakses tanggal 25 Oktober 2010.
Agnam, N., Samhoedi, H., Timmerman, H., Venie, U. A., Sugiyanto, Goot, H.,1995, The Relationship Between Structure And Inhibition Of LipoxygenaseActivity of Curcumin Derivatives In International Symposium On CurcuminPharmacochemistry ISCP, Yogyakarta.
Anonim, 2010, Kiranti Sehat Datang Bulan, http://diarykiranti.com/kiranti-funfact-sdb/, diakses tanggal 25 Oktober 2010.
Aulton, 1988, Pharmaceutics: The Science of Dossage Form Design, edisi II,Churchill Livingstone, New York, pp. 310,335.
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2004, KeputusanKepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia No. HK00.05.4.2411 tentang Ketentuan Pokok Pengelompokkan dan PenandaanObat Bahan Alam indonesia, Badan Pengawas Obat dan MakananRepublik Indonesia, Jakarta.
Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2005, Pedoman CaraPembuatan Obat tradisional yang Baik, Badan Pengawas Obat danMakanan Republik Indonesia, Jakarta.
Bermawie, N., Rahardjo, M., Wahyuno, D., Ma’mun, 2005, Status Teknologi DanPanen Tanaman Kunyit Dan Temulawak Sebagai Penghasil Kurkumin, 85,96, Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik, Bogor.
Dean, J., 1995, Analytical Chemistry Handbook,Mc Graw-Hill Inc., USA,pp.4.98, 4.113.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995a, Materia MedikaIndonesia, edisi VI, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp.148-152.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995b, FarmakopeIndonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp.735-737.
51
Drakeiron, 2008, Info Pentagamavunon-0, http://drakeiron.wordpress.com,diakses tanggal 25 Oktober 2010.
Gritter, J.R., Bobbit, J.M., dan Scharting, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi,diterjemahkan oleh Kosasih Pamawinata, Edisi II, Penerbit ITB, Bandung.
Gandjar, G.I., dan Rohman, A, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp.362-363.
Gupta, A. P., Gupta, M. M., and Kumar, S., 1999, Simultaneous determination ofcurcuminoids in curcuma samples using high performance thin layerchromatography, http://203.190.147.121/bitstream/123456789/80/1/JJournal_Liquid_Chromatography_Related_Technologies_22_1561.pdf,diakses tanggal 15 Februari 2010.
Hanani, E., 2010, Standarisasi Simplisia dan Ekstrak Daun Handeuleum(Graptophyllum Pictum), Laporan Penelitian, Universitas Indonesia,Jakarta.
Harborne, 1973, Phtochemical methods, diterjemahkan oleh KosasihPadmawinata dan Iwang Soediro, Terbitan II, hal.10-11, Institut TeknologiBandung, Bandung.
Hardjono, 1983, Kromatografi, Laboratorium Analisa Kimia Fisika Pusat, UGM,Yogyakarta, pp.32-34.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan CaraPerhitungannya, Departemen Farmasi FMIPA UI, Depok, pp.5-25.
Katno, dan Pramono, 2010, Tingkat Manfaat dan Keamanan Tanaman Obat danObat Tradisional, Laporan Penelitian, Fakultas Farmasi UniversitasGadjah Mada, Yogyakarta.
Kementerian Kesehatan RI, 1994, Keputusan Menteri Kesehatan RINomor:661/MENKES/VII/1994, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Khopkar, 1990, Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh SaptoRaharjo, Universitas Indonesia Press, Jakarta.
Kohli, K., Ali, J., Ansari, M. J., and Raheman, Z., 2005, Curcumin : A NaturalAnti- inflammatory Agent, 141 -142, In Indian Journal of Pharmacology,Jamie Hamdard University, New Delhi.
Martono, S., 1996, Penentuan kadar kurkumin secara kromatografi lapis tipis-densitometri, Buletin ISFI Yogyakarta, 2 (4), 11-21.
52
Mintarsih, 1990, Penetapan Kadar Alkaloid Kininda dalam Akar, Batang, danDaun Chinchona Succirubra Pavon et Klotzsch dari Daerah KaliurangSecara Spektrodensitometri (TLC-Scanner),Skripsi, Universitas GadjahMada, Yogyakarta.
Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga UniversityPress, Surabaya, pp.102.
Mulja, H.M dan Hanwar, 2003, Pinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (GoodLaboratory Practice),Majalah Farmasi Airlangga, Vol.III, No.2, 71-76.
Nakayama, T., 1997, Affinities of Dietary Phenolic Antioxidants for LipidBilayers, in Shahidi, F., Ho, Chi-Tang. (Eds.), Phytochemicals andPhytopharmaceutical, 355-356, AOCS Press, USA.
Paramasivam, M., Aktar, W., Poi, R., Banerjee, H., Bandyopahyay, A., 2008,Occurrence of curcuminoids in Curcuma longa: A quality standardizationby HPTLC, http://www.banglajol.info/index.php/BJP/article/, diaksestanggal 15 Februari 2010
Rohman, 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,pp.45, 47, 53, 217.
Roth, H.J., 1994, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh Sarjono Kisman,Slamet Ibrahim, Cetakan 2, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.
Sari, L.O., 2006, Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan Manfaatdan Keamanannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol.III, No.1, 1-7.
Sherma, J., and, Fried B., 1996, Handbook of Thin Layer Chromatography, 2nd
Edition, Marcel Dekker, Inc., pp.20.
Stahl, 1985, Drugs Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkanoleh Kosasih Padmawinata, Institut Teknologi Bandung, Bandung.
Stankovic, I., 2004, Curcumin: Chemical and Technical Assestment,ftp://ftp.fao.org/es/esn/jecfa/cta/CTA_61_Curcumin.pdf, diakses tanggal 15Februari 2010.
Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, cetakan pertama, Penerbit Kanisius,Yogyakarta, pp.167-175.
Supardjan, A. M., Meiyanto, E., 2002, Efek Antiproliferatif Pentagamavunon – 0Terhadap Beberapa Sel Kanker, Laporan Penelitian, Lembaga PenelitianUniversitas Gajah Mada, Yogyakarta.
53
Swartz and Krull, 1997, Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals, 2nd
Edition, Marcel Dekker, USA.
Tonnesen, H. H., 1989, Studies On Curcumin And Curcuminoids, Catalytic EffectOf Demethoxy And Bis-demethoxycurcumin On The Peroxydation OfLinoleic Acid By 15- Lipoxygenase, Internal Journal Pharmacy, Vol. XV,51, 179-181
Tonnesen, H. H. and Greenhill, J. V., 1992, Studies on curcuminandcurcuminoids.. Curcumin as a reducing agent and as a radicalscavenger, Int. J. Pharm., XXII87
Tonnesen, H. H., and Karlsen, 1983, Curcuminoid and It’s Compounds, JournalChromatography, Vol. 4, 259 -376.
Tonnesen, H.H., and Karlsen, 1985, Studies On Curcumin and CurcuminoidsAlkaline Degradation of Curcuming Z.Lebens, Unters, Forsch, 180 : 132-134.
United States Pharmacopeial Convention, 2007, The United States Pharmacopeia,30thedition, United States Pharmacopeial Convenction Inc., New York.
Van der Goot, H., 2002, The Chemistry and Qualitative Structure – ActivityRelationships Of Curcumin In Recent Development In CurcuminPharmacochemistry, Procedings of The International Symposium onCurcumin Pharmacochemistry, 1995, Edited By Suwijyo Pramono, AdityaMedia, Yogyakarta.
Yuwono, M. and Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methodsof Analysis, Profile of Drug Substances, Excipients, and RelatedMethodology, Elseiver Inc., 32, 243-259.
54
LAMPIRAN
55
Lampiran 1. Pernyataan Jaminan Keaslian Bahan Kurkumin Standar Hasil
Sintesis
56
Lampiran 2. Data Penimbangan Bahan
1. Baku Kurkumin
Kurkumin (g) Replikasi I Replikasi II Replikasi IIIBerat kertas 13,966 15,001 14,785Berat kertas + zat 13,976 15,011 14,795Berat kertas + zat 13,9764 15,0112 14,7952Berat kertas + sisa 13,9661 15,0013 14,7852Berat zat 0,0103 0,0099 0,0100
2. Validasi Metode Kurkumin
ReplikasiKurkumin (g)
I II III IV VBerat kertas 14,675 14,253 13,728 14,852 15,227
Berat kertas +zat
14,685 14,263 13,738 14,862 15,237
Berat kertas +zat
14,6853 14,2633 13,7386 14,8622 15,2374
Berat kertas +sisa
14,6753 14,2531 13,7287 14,8523 15,2371
Berat zat 0,0100 0,0102 0,0099 0,0099 0,0103
3. Validasi Metode Kurkumin dalam Matriks Sampel
Kurkumin (g)Berat kertas 15,752Berat kertas + zat 15,762Berat kertas + zat 15,7623Berat kertas + sisa 15,7524Berat zat 0,0099
Lampiran 3. Kromatogram seri baku kurkumin replikasi III
1. Seri 1 (50 ppm)
57
2. Seri 2 (75 ppm)
3. Seri 3 (100 ppm)
4. Seri 4 (125 ppm)
58
5. Seri 5 (150 ppm)
6. Seri 6 (175 ppm)
Lampiran 4. Kromatogram validasi metode
1. Konsentrasi rendah (50 ppm)
Replikasi I
59
Replikasi II
Replikasi III
Replikasi IV
60
Replikasi V
2. Konsentrasi sedang (100 ppm)
Replikasi I
Replikasi II
61
Replikasi III
Replikasi IV
Replikasi V
62
3. Konsentrasi tinggi (175 ppm)
Replikasi I
Replikasi II
Replikasi III
63
Replikasi IV
Replikasi V
Lampiran 5. Contoh perhitungan kadar kurkumin
1. Skema pembuatan
Timbang lebih kurang seksama 10,0 mg kurkumin
↓
Larutkan dengan metanol pH 4 ad hingga 10,0 ml
↓
Pipet 0,25 ml; 0,375 ml; 0,5 ml; 0,625 ml; 0,75 ml; dan 0,875 ml
↓
Encerkan dengan metanol pH 4 ad hingga 5,0 ml
2. Perhitungan seri kadar kurkumin
Bobot kurkumin hasil penimbangan = 0,0103 g = 10,3 mg
Kadar stok kurkumin = 10,3 mg / 10 ml = 1030 mg / 1000 ml = 1030 ppm
64
Kadar seri larutan baku kurkumin :
C1.V1 = C2.V2
1030 ppm x 0,25 ml = C2 x 5 ml
C2 = 51,5 ppm
Baku kurkuminReplikasi I Replikasi II Replikasi III
Seribaku(ppm)
AUCTinggipeak
Seribaku(ppm)
AUCTinggipeak
Seribaku(ppm)
AUCTinggipeak
51,5 7009,9 183 49,5 6528,6 145,5 50 6600 149,677,25 9403,3 252,1 74,25 8785,8 211,9 75 8864,1 216,9103 11159,2 272,2 99 11108,2 253 100 11298,6 257,7
128,75 13535,4 341,5 123,75 13577,8 330,9 125 13455,5 336,9154,5 15461,5 355,8 148,5 15698 358,6 150 15774,6 364,6180,25 18444 449,5 173,25 17818,8 449,5 175 18201,1 397,7
A2509,47
8188,786
7A
2011,2267
57,0619
A1965,00
5760,587
6B 86,2372 1,900 B 91,9564 2,0190 B 92,4502 2,0146r 0,9976 0,9821 r 0,9997 0,9890 r 0,9999 0,9886
Dilakukan penyesuaian nilai AUC agar nilai tan α mendekati 1
Baku kurkuminReplikasi I Replikasi II Replikasi III
Seri baku(ppm)
AUC/100Seri baku
(ppm)AUC/100
Seri baku(ppm)
AUC/100
51,5 70,099 49,5 65,286 50 6677,25 94,033 74,25 87,858 75 88,641103 111,592 99 111,082 100 112,986128,75 135,354 123,75 135,778 125 134,555154,5 154,615 148,5 156,98 150 157,746180,25 184,44 173,25 178,188 175 182,011
A 25,0948 A 20,1123 A 19,6500B 0,8624 B 0,9196 B 0,9245r 0,9976 r 0,9997 r 0,9999
Lampiran 6. Persamaan kurva baku dan gambar kurva baku kurkumin
1. Persamaan kurva baku yang digunakan adalah replikasi 3, yaitu :
y=0,9245x+19,6500
65
2. Gambar kurva baku kurkumin
Lampiran 7. Nilai AUC dan contoh perhitungan recovery kurkumin
1. AUC kurkumin
AUC/100Kadarkurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V50 ppm 66,386 66,85 64,956 65,752 66,761100 ppm 112,693 118,79 112,817 112,087 113,547175 ppm 184,658 184,968 184,713 185,956 187,885
2. Contoh perhitungan recovery
Replikasi I
Perhitungan kadar teoritis
- Bobot kurkumin hasil penimbangan = 0,0100 g = 10 mg
- Kadar stok kurkumin = 10 mg/10 ml = 1000 mg/1000ml = 1000 ppm
C1.V1=C2.V2
Kadar rendah → 1000 ppm x 0,25 ml = C2 x 5 ml
C2 = 50 ppm
Kadar sedang → 1000 ppm x 0,5 ml = C2 x 5 ml
C2 = 100 ppm
Kadar tinggi → 1000 ppm x 0,875 ml = C2 x 5 ml
C2 = 175 ppm
Perhitungan kadar terukur
y = 0,9245x+19,6500
y = AUC / 100
66
Kadar rendah → 66,386 = 0,9245x + 19,6500
x = 50,5527 ppm
Kadar sedang → 112,693 = 0,9245x + 19,6500
x = 100,6414 ppm
Kadar tinggi → 184,658 = 0,9245x + 19,6500
x = 178,4835 ppm
Perhitungan recovery
Recovery
Kadar rendah → = 101,10%
Kadar sedang → = 101,64%
Kadar tinggi → = 101,99%
Recovery (%)Kadarkurkumin Replikasi I Replikasi II Replikasi III Replikasi IV Replikasi V50 ppm 101,10 100,11 99,00 100,75 98,95100 ppm 101,64 100,77 101,79 100,10 98,61175 ppm 101,99 100,18 102,72 103,83 100,96
Lampiran 8. Contoh perhitungan CV kurkumin
Kadar kurkumin (ppm) SD CV (%)50 ppm 50,2883 0,8552 1,7100 ppm 100,5458 0,7125 0,7175 ppm 179,4245 1,5902 0,9
Lampiran 9. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku
1. Replikasi I
67
2. Replikasi II
3. Replikasi III
4. Replikasi IV
68
5. Replikasi V
Lampiran 10. Kromatogram sampel dengan penambahan baku
1. Replikasi I
2. Replikasi II
69
3. Replikasi III
4. Replikasi IV
5. Replikasi V
70
Lampiran 11. Contoh perhitungan resolusi
Diketahui: Rf kurkumin = 0,50
Rf peak terdekat = 0,32
Perhitungan:
Resolusi (Rs)
=
= 2,4 (replikasi I)
Replikasi II→ 2,25
Replikasi III→ 2,4
Replikasi IV→ 2,53
Replikasi V→ 2,57
Lampiran 12. Nilai AUC sampel dan sampel yang diadisi baku kurkumin
AUC/100Replikasi
Sampel AdisiI 69,88 93,055II 68,795 91,556III 70,058 93,358IV 69,983 92,175V 68,567 92,261
Lampiran 13. Contoh perhitungan recoverybaku kurkumin dalam sampel
Perhitungan kadar teoritis
Bobot kurkumin = 0,0099 g = 9,9 mg
Kadar stok kurkumin = 9,9 mg/10 ml = 990 mg/1000 ml = 990 ppm
C1.V1 = C2.V2
990.0,125=C2.5
71
C2= 24,75 ppm
Replikasi I
Perhitungan kadar baku + sampel terukur
y = 0,9245x + 19,65
93,055 = 0,9245x +19,65
x = 79,3997 ppm
Perhitungan kadar sampel terukur
y = 0,9245x + 19,65
69,88 = 0,9245x +19,65
x = 54,3321 ppm
Perhitungan kadar baku terukur
Kadar terukur baku = kadar (baku + sampel) terukur - kadar sampel terukur
= 79,3997 – 54,3321
= 25,0676 ppm
Perhitungan recovery kadar baku terukur
Recovery =
=
= 102,34 %
Lampiran 14. Tabel perhitungan CV kadar baku kurkumin dalam sampel
Replikasi (ppm) (ppm) SD CV (%)I 25,0676II 24,6197III 25,2028IV 24,0043V 25,629
24,9047 0,6189 2,5
72
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul Validasi MetodeKromatografi Lapis Tipis (KLT)-Densitometri padaPenetapan Kadar Kurkumin dalam Sediaan Cair ObatHerbal Terstandar (OHT) Kiranti® ini bernama lengkapYunita Dwi Wulansari. Penulis dilahirkan di Surakartapada tanggal 10 Juni 1989 sebagai anak kedua dari tigabersaudara, dari pasangan Heru Handoyo dan Ika Yanti.Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di SDMarsudirini Surakarta pada tahun 2001, di SMP PangudiLuhur Bintang Laut Surakarta pada tahun 2004, dan diSMA Negeri 3 Surakarta pada tahun 2007. Penuliskemudian melanjutkan pendidikannya di FakultasFarmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada
tahun 2007. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi UniversitasSanata Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lainpanitia pelepasan wisudawan/wisudawati 2008 (konseptor), panitia inisiasiFakultas Farmasi TITRASI 2008 (pendamping kelompok), panitia inisiasiFakultas Farmasi TITRASI 2009 (Steering Comitte), Badan Eksekutif MahasiswaFakultas (BEMF) Farmasi 2009/2010 (divisi organisasi), dan Dewan PerwakilanMahasiswa Fakultas 2010/2011 (wakil ketua). Di bidang akademik, penulispernah menjadi asisten dosen praktikum Spektroskopi, asisten dosen praktikumKromatografi, dan asisten dosen praktikum Kimia analisis. Selain itu, pada tahun2009 penulis juga pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM), yangberjudul Sediaan Celup Kulit Ari Kacang Tanah sebagai Minuman Kesehatanbagi Penderita Demam Berdarah Dengue, dimana program ini diselenggarakanoleh DIKTI.
