Analiza proteina

Slijed analizeSolubilizacijaizolacijaseparacijadetekcijaMETODEOtapanje proteina detergentima:ionski ( sodium dodecyl sulphate, SDS)neionski (Nonidet P-40, Triton X-100)ImunoprecipitacijakromatografijaelektroforezaBojenje:-Coomassie blue-Silver staining-imunobloting(western blotting)-jodinacija-metaboliko radioaktivno obiljeiavanje-biotinilacija

Analiza proteina:

- solubizaciju (detergent)- izolaciju (kromatografija i imunoprecipitacija)- razdvajanje (separacija) elektroforezom- detekcija (coomassie blue, western blotting, metaboliko radioaktivno obiljeavanje, jodilacija, biotinilacija)

ULTRACENTRIFUGIRANJE SE TEMELJI NA RAZLIKAMA U RELATIVNOJ MOLEKULSKOJ MASI I OBLIKU MOLEKULA PROTEINA(LIPOPROTEINSKE FRAKCIJE)

FRAKCIONIRANJE TALOENJEM SOLIMA ILI OTAPALIMA TEMELJI SE NA RAZLIKAMA U TOPLJIVOSTI POJEDINIH VRSTA PROTEINA U PRISUSTVU IONA ILI DEHIDRIRAJUIH OTAPALA :NaSO4, NaSO2, MgSO2, (NH4)2SO4, ALKOHOL, ETER

KROMATOGRAFIJA SE TEMELJI NA RAZLIKAMA U VELIINI, OBLIKU, NABOJU I TOPLJIVOSTI

ELEKTROFOREZA PROTEINA TEMELJI SE NA RAZLIKAMA U ELEKTRINOM NABOJU POJEDINIH PROTEINSKIH FRAKCIJA

HISTOLOKE METODE

IMUNOKEMIJSKE METODE SE TEMELJE NA SVOJSTVU PROTEINA DA REAGIRAJU KAO ANTIGEN SA SVOJIM SPECIFINIM PROTUTJELOM

FRAKCIONIRANJE I DETEKCIJA PROTEINA

- Centrifugiranje

- Ultracentrifugiranje

Figure 5-23 Cell fractionation by differential centrifugation

Figure 5-24 Separation of organelles from rat liver by equlibrium density-gradient centrifugation

Solubilizacija proteinaDetergenti:

neionski (Nonidet P-40, Triton X-100) ionski (sodium dodecyl sulphate, SDS)zwitterionski (CHAPS,..)

KROMATOGRAFIJA

KROMATOGRAFIJA JE METODA KOJA SE TEMELJI NA RAZLIKAMA U VELIINI, OBLIKU, NABOJU I TOPLJIVOSTI ESTICA

Tvari koje se kromatografiraju rasporeuju se u dvije faze:mobilna plin, tekuinaStacionarna - imobilizira s ena nosau (papir)

RAZLIITA TOPIVOST TVARI UVJETOVATI E RAZLIITOM BRZINOM PUTOVANJA KROZ KOLONU

KROMATOGRAFIJA NA PAPIRUTANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJAKROMATOGRAFIJA NA KOLONAMA

Figure 3-43 Three commonly used liquid chromatographic techniques

FRAKCIONIRANJE I DETEKCIJA PROTEINA

-STRUKTURA PROTEINA UVJETUJE I NJIHOVA -FIZIKALNO-KEMIJSKA SVOJSTVA TJ. OVISNO O NAZONOSTI POJEDINIH AMINO KISELINA U PROTEINU

-TEMPERATURA 60-70C DENATURIRA PROTEINE

POMOU RAZNIH KEM-FIZIKALNIH METODA PROTEINI SE MOGU FRAKCIONIRATI:

- TALOENJEM SA SOLIMA ILI OTAPALIMA- ULTRACENTRIFUGIRANJEM- KROMATOGRAFIJOM- ELEKTROFOREZOM PROTEINA - IMUNOKEMIJSKIM METODAMA- HISTOLOKIM METODAMA

ELEKTROFOREZA

PUTOVANJE NABIJENIH ESTICA U ELEKTRINOM POLJU

PUTOVANJE MALIH NABIJENIH ESTICA IONTOFOREZA

PROTEINI SU AMFOTERNE MOLEKULE - POTREBAN STALAN Ph

NOSAI ZA ELEKTROFOREZU: PAPIR CELULOZA-ACETATCELLOGELAGAR GELAGAROZA GELKROBNI GELPOLIAKRIL AMID GEL

TO NAM SVE TREBA ZA ELEKTROFOREZU:

-PROTEIN-APARAT TJ. KOMORA ZA ELEKTROFOREZU-PUFER-ELEKTRODE-IZVOR ISTOSMJERNE STRUJE

Ovisno o pH sredine (PUFERA) razliiti proteini imaju razliiti broj + i naboja tj. Proteini se NALAZE izoelektrinoj tokiAmfoliti - niskomolekularne amfoterne molekule

Amfoterne molekule - proteini

SDS POLIAKRILAMID ELEKTROFOREZA

POLIAKRILAMID

SDS (SODIUM DODECIL SULFAT) OMOGUAVA ISTI NABOJ SVIM PROTEINIMA (POLIPEPTIDIMA)

REZULTAT OVAKVE ELEKTROFOREZE JESU PROTEINSKE PRUGE (OBOJANE) KOJE SE JAVE NA KRAJU PAGE-a COMMASIE BLUE BOJANJEM

2 TIPA SDS-PAGE: - NE REDUCIRAJUIM UVJETIMA - REDUCIRAJUIM UVJETIMA

Figure 3-13 In vitro denaturation of proteins- Dithiothreitol -DTT- 2-MERKAPTOETANOL -ME

POSEBNE ELEKTROFORETSKE TEHNIKE:

ZONSKA ELEKTROFOREZAIMUNOELEKTROFOREZAROKET-IMUNOELEKTROFOREZAELEKTROFOREZA NA POLIAKRILAMIDNOM GELU(PAGE)DVODIMENZIONALNA ELEKTROFOREZA

DVODIMENZIONALNA ELEKTROFOREZAModifikaciju elektroforeze koje se odvija u dvije faze:

faza:protein se razdvoji u jednom smjeru

faza: potom se razdvojeni proteini izloe elektrinoj struji okomit na prethodni tjek (druga dimenzija)

lmunoprecipitacija se sastoji od nekoliko faza:

- liziranje stanica pomou detergenata ( ako je protein vezan za membranu )- vezanje specifinog antigena i protutijela - precipitacija kompleksa antigen-antitijelo- ispiranje precipitata- disocijacija antigena iz imunog kompleksa.

(Most common screening techniques are ELISA and RIA)Low concentration(1-20 ug/ml)High concentration(1-10 mg/ml)

Cloning hybridomas from fusionPlate at limiting dilution (

Cloning hybridomas from fusionPlate at limiting dilution (

IMUNOPRECIPITACIJA I AUTORADIOGRAFIJA

PRECIPITACIJA (TALOENJE) JE STVARANJE NE TOPLJIVIH KOMPLEKSA ANTIGENA I PROTUTJELA

AUTORADIOGRAFIJA JE METODA DETEKCIJE PROTEINA (MOLEKULA)NA OSNOVU EMISIJE RADIOAKTIVNIH ZRAKA KOJE ODAILJU POJEDINE RADIOAKTIVNO OBILJEENE AMINO KISELINE U PROTEINU

WESTERN BLOT

1980.GOD.TRANSFER ELEKTROFOREZOM RAZDVOJENIH PROTEINA NA NITROCELULOZNU MEMBRANUZNAAJ U PROUAVANJU PROTEINA VRSTO VEZANIH NA MEMRANI

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

FACS cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorting)

488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector

Argon laserHe-Ne LaserLasers

He-Cd LaserArgon LaserHe-Ne Laser1998 photo J.Paul Robinson

SMALL BEADLARGE BEADFrequency HistogramSMALL BEADLARGE BEADSample inSheathSheath inLaser beamStream Charge+4KV-4KVWasteSORT RIGHTSORT LEFTSORT DECISIONSPiezoelectriccrystal oscillatorLast attacheddropletLEFTRIGHTSensorsSensorSignals are collected from several sensors placed forward or at 90 to the laser beam. It is possible to sort individual particles. The flow cell is resonated at a frequency of approximately 32KHZ by the piezoelectric crystal mounted on the flow cell. This causes the flowing stream to break up into individual droplets. Gating characteristics can be determined from histograms (shown right) and these can be used to define the sort criteria. These decisions are all controlled by the computer system and can be made at rates of several thousand per second.

Figure 1 The central component of a flow cytometer is the flow cell. A cutdown of a typical flow cell indicates the salient features. Sample is introduced via the sample insertion rod. Sheath fluid (usually water or saline) is ntroduced to surround the insertion rod causing hydrodynamic focussing of flowing cells which are contained within a core fluid. The laser intersects the fluid either outside the flowcell (in air) or in a slightly extruded portion of the flow cell tip (in quartz).

MULT1

Fluorescentni mikroskopKoristi ultraljubiaste svjetlosne zrake kojima pobuuje fluprescenciju iz preparata

Fluorescentni mikroskop

Konfokalni fluorescentni mikroskop

Konfokalni scanning fluorescentni mikroskop

**