Volumen 1 Revista Biotecnología

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

Loja - Ecuador2012

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

Volumen: 1, Nro. 1: 2012

ISSN 1390-7573

Volumen: 1, Nro. 1

Año: 2012

ISSN: 1390-7573

IEPI: CUE-000967

COMITE EDITORIAL:

Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph. D.DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN - UNLIng. Iván Granda Mora, Mg. Sc.,DOCENTE INVESTIGADOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

COMITÉ DE REVISIÓN:

Aminael Sánchez Rodríguez, Ph.D.,Roldán Torres Gutiérrez, Ph.D.Klever Iván Granda Mora, Mg. Sc.

EDITOR:

Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D.DIRECCION: Ciudad Universitaria “Guillermo Falconí Espinosa”, Sector “La Argelia”EMAIL: [email protected]

César Sandoya V.RESPONSABLE DE COMUNICACIÓN INSTITUCIONAL

Byron Gutiérrez Q.DISEÑO Y DIAGRAMACIÓN - UNL

Loja – Ecuador

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍAUNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA

EDITORIAL

El Centro de Biotecnología (CB) de la Univer-sidad Nacional de Loja, se creó como una en-tidad responsable de la investigación científica aplicada, innovación biotecnológica y docencia, con el objetivo de impulsar la Biotecnología en beneficio de la colectividad, con especial én-fasis en lo productivo y social, por lo tanto el CB considera las necesidades de los sectores agrícola, ambiental, pecuario, de salud públi-ca, y apoyo a la investigación para la vida, el desarrollo y la legislación, siendo esta unidad académica un referente para la región sur y el Ecuador, que ofertará alternativas tecnológicas, y se proyecta a desarrollar estudios de Posgra-do y de Maestría en Ciencias Biotecnológicas en coordinación con las Áreas Académicas de la Universidad Nacional de Loja y otras entida-des públicas y privadas nacionales y externas. El Centro de Biotecnología cuenta con instala-ciones y equipamiento para realizar estudios, exploración y manipulación de genes de anima-les, plantas, y microorganismos de interés eco-nómico y ecológico, así como para desarrollar biotecnologías competitivas, con enfoque multi e interdisciplinario

La presente publicación abarca artículos de revisión sobre las temáticas biotecnológicas referentes a los proyectos de investigación propuestos a desarrollar en el Centro de Bio-tecnología, en los que se proporciona en forma resumida y analítica el Estado del Arte con la información actualizada generada por centros e investigadores del mundo científico. En la se-gunda sección se proporciona un resumen de los proyectos de generación biotecnológica que han sido formulados y elaborados por el per-sonal de investigadores del Centro de Biotec-nología y se han sometido al análisis de pares externos y a captación de financiamiento para su ejecución. Finalmente se describe las acti-vidades vinculadas con la gestión del centro y cumplidas durante el año 2011.

AUTORIDADES UNIVERSITARIAS:

Dr. Gustavo Villacís Rivas, Mg.Sc.,RECTOR

Dr. Ernesto González Pesantes, Mg.Sc.,VICERRECTOR

Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D. DIRECTOR DE INVESTIGACIÓN - UNL

COMITÉ DIRECTIVO DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA:

Dra. Graciela Yépez de Ruíz,DIRECTORA DEL ÁREA JURÍDICA, SOCIAL Y ADMINISTRATIVA (E)

Dr. Edgar Benítez González, Mg.Sc.,DIRECTOR DEL ÁREA AGROPECUARIA Y DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

Dr. César León Aguirre,DIRECTOR DEL ÁREA DE LA EDUCACIÓN, EL ARTE Y LA COMUNICACIÓN (E)

Dr. Jorge Reyes Jaramillo,DIRECTOR DEL ÁREA DE LA SALUD HUMANA (E)

Ing. José Ochoa Alfaro,DIRECTOR DEL ÁREA DE LA ENERGÍA, LAS INDUSTRIAS Y LOS RECURSOS NATURALES RENOVABLES

Dr. Tito Muñoz Guarnizo, Mg. Sc.,DIRECTOR DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

CONTENIDOS

I. ARTÍCULOS DE REVISIÓN

RECURSOS GENÉTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIÓN Autor: Ing. Aníbal Homero Ruiz Sánchez.

BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y BIOINFORMÁTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS Autores: Ing. Marlon Pineda Escobar, Dr. Ph.D. Aminael Sánchez Rodríguez

MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS Y SU CONTRIBUCIÓN A LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NI-TRÓGENO

Autores: Ing. Klever Iván Granda Mora, M.Sc., Biólogo. Santiago Erazo Sotomayor.

USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNA-TIVA ECOLÓGICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES EN CULTIVOS

Autor: Ing. Ángel Rolando Robles Carrión, M.Sc.

MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON Autora: Ing. María Natalia Morales Palacio Mg.Sc.

NANOESTRUCTURAS POLIMÉRICAS PARA LA DETECCIÓN DE ADN Autor: Ing. Iván Burneo Saavedra Mg. Sc.

II. RESUMEN DE PROYECTOS:

“ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCE-LLEA HELBORNII VAR. PEN-TAGONA)”

Autor: Ing. Marlon Pineda Escobar

“PRODUCCIÓN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMINOSAS: ME-DIANTE LA UTILIZACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS”

Autor: Ing. Kléver Iván Granda Mora, M.Sc

“MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON” Autor: Ing. María Natalia Morales Palacio, Mg.Sc

“AMPLIACIÓN Y ESPECIALIZACIÓN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTEC-NOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA, PRIORIZANDO LEGUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR”

Autor: Ing. Aníbal Homero Ruiz Sánchez.

“DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS “LABEL-FREE” MEDIANTE EL USO DE MA-TERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIÓN TEMPRANA Y RÁPIDA DE CÁNCER”.

Autor: Ing. Iván Burneo Saavedra Mg. Sc.

PRODUCCIÓN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATO-RIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA.

Autora: Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga

III. INFORMATIVO

INFORMATIVO DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA - 2011

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Centro de biotecnología: E-mail: [email protected] 5

I. Artículos de revisión

CENTRO BIOTECNOLOGÍA

Centro de biotecnología: Dir.: “La Argelia” - PBX: 072547252; Loja, Ecuador6

RECURSOS GENÉTICOS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACIÓN

Aníbal Homero Ruiz Sánchez1.

1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: [email protected] _____________________________________________________________________________

RESUMEN

La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una característica fá-cilmente observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genéticos cuya definición, según la FAO (1989), es “el material hereditario con valor económico, científico o social”. Con la desaparición de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas; debida a procesos como la deforestación masiva, degradación y contaminación de los hábitats naturales que, en definitiva, no son sino resultados de la explotación abusiva de los recursos del planeta, es lo que hoy conocemos como erosión genética. Los Recursos Genéticos en la actuali-dad se han instaurado como una nueva rama de la Biotecnología que se independiza de la Gené-tica y la Biología Molecular, sus principales objetivos son velar por la conservación y la utilización sostenible de los recursos genéticos para la alimentación y la agricultura, y por la distribución justa y equitativa de los beneficios derivados.

Palabras clave: Recurso genético; Erosión Genética; Conservación In situ – Ex situ_____________________________________________________________________________



ABSTRACT

The diversity among species and within species, biodiversity, is a feature easily observable. Part of this diversity is what we recognize as the definition of genetic resources, FAO (1989), is “the heredi-tary material of economic value, scientific or social.” With the disappearance of species and wild forms of cultivated plants, due processes such as massive deforestation, de-gradation and pollution of natural habitats, in short, are but results of the abuse of the planet’s resources, is what is now known as genetic erosion. genetic resources have now been introduced as a new branch of biotech-nology that is independent of Genetics and Molecular Biology, its main objectives are to ensure the conservation and sustainable use of genetic resources for food and agriculture, and the fair and equi-table the benefits.

Key words: Genetic Resources, Genetic Erosion, Conservation In situ - Ex situ_____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

El Ecuador se localiza en el extremo occidental de América del Sur, entre 1° 30’ N y 5° S de latitud y 75° W y 81° W de longitud, siendo un país pequeño en superficie (275 830 km2), pero poseedor de una configuración climatológica, fisiográfica y orográfica destacable, lo cual le permite disponer de una gama de recursos con singular potencial productivo. (1). La biodiver-sidad que podríamos llamar domesticada, bá-sicamente la agrícola, y más específicamente el pool de recursos genéticos de uso en la ali-mentación y la agricultura, es la gran despen-sa que garantiza a la humanidad los alimen-tos, los vestidos y, en una parte importante, las medicinas. La preservación de esta riqueza es esencial en el desarrollo de la agricultura sostenible y la se-guridad alimentaria. (2)

La diversidad genética es muy importante para la ali-mentación humana. (2). Los bancos de germoplasma como mecanismos de con-servación, son depósitos de recursos fitogenéticos que proporcionan la materia pri-ma para el mejoramiento de los cultivos. Es-tos recursos cumplen una función vital en el desarrollo sostenible de la agricultura en tanto ayudan a aumentar la producción de alimen-tos y a combatir el hambre y la pobreza. (3)

Las semillas que se almacenan en los bancos

de germoplasma son un recurso vital e irreem-plazable, una herencia que se debe conservar para proveer opciones a la agricultura en el futu-ro, en un mundo que afronta el cambio climático y otros desafíos. La conservación sostenible de los recursos genéticos depende del trabajo efi-caz del personal de los bancos de germoplas-ma, cuyo papel es crítico para garantizar que el germoplasma se conserve de manera efectiva y eficiente. (3).

Generalidades de los Recursos Genéticos.

Desde la aparición de la vida en la Tierra hace unos 3.000 millones de años, el proceso evo-lutivo ha originado una enorme diversidad de especies e individuos que mediante los proce-

sos de selección permanente se han adaptado a las dife-rentes condiciones del globo. Esta variabilidad genética acumulada resulta esencial para el equilibrio del sistema y constituye lo que se deno-mina germoplasma del pla-neta.Dentro de este conjunto, los “recursos filogenéticos” com-prenden la diversidad gené-

tica correspondiente al mundo vegetal que se considera poseedora de un valor para el pre-sente o el futuro. Bajo esta definición se inclu-yen normalmente las categorías siguientes: variedades de especies cultivadas, tanto tradi-cionales como comerciales; especies silvestres o asilvestradas afines a las cultivadas o con un

La diversidad genética es muy importante para la alimenta-ción humana. Los recursos fito-genéticos cumplen una función vital en el desarrollo sostenible de la agricultura en tanto ayu-dan a aumentar la producción de alimentos y a combatir el hambre y la pobreza.



valor actual o potencial, y materiales obtenidos en trabajos de mejora genética (Esquinas- Al-cázar 1993). (6)

Los recursos fitogenéticos son el conjunto de combinaciones de genes resultante de la evo-lución de las especies, constituyen la base de la seguridad alimentaria mundial tienen po-tencial de uso agrícola actual o futuro (4). El estudio y conservación de los recursos fitoge-néticos es una disciplina emergente en la que obviamente la Genética es la clave en la que se apoyan otros componentes del arco de las ciencias puras y aplicadas que estudian a los seres vivos y su utilización por el hombre. (5)

La diversidad entre especies y dentro de cada especie, biodiversidad, es una característica fácilmente observable. Una parte de esta biodiversidad es lo que reconocemos como recursos genéticos cuya definición, según la FAO (1989), es “el material hereditario con valor económico, científico o social contenido en las especies”; definición que incluye una enorme cantidad de especies si se acepta que su valor sea al menos potencial. Sin em-bargo, frecuentemente el término de recursos fitogenéticos se entiende por los mejoradores de forma más limitada, incluyendo los pocos cientos de especies cultivadas, pratenses y forestales con utilidad directa y/o cuya di-versidad genética puede usarse en mejora y domesticación. Otro de los hechos fácilmente observables en la naturaleza es la adaptación de los seres vivos a su medio natural, lo que implica adaptación a condiciones del medio físico (climático y edáfico) y del medio biológi-co: mecanismos de defensa contra predado-res y patógenos. (5).

Erosión Genética

La pérdida de diversidad se acentuó entre los años 1940-50 cuando el desarrollo de la mejora genética dio lugar a la introducción de variedades comerciales, uniformes y mucho más adaptadas a las técnicas modernas de cultivo y a los nuevos sistemas de comerciali-zación, siendo incuestionable el beneficio ob-tenido de ello por una población mundial cre-ciente y subalimentada. Sin embargo, como

contrapartida, las variedades modernas, con una base genética muy reducida, han ido des-plazando a innumerables variedades tradicio-nales, heterogéneas y menos productivas, pero altamente adaptadas a su ambiente lo-cal y poseedoras de una gran diversidad ge-nética. La consecuencia paradójica es que la aplicación masiva de los logros de la mejora vegetal ha puesto en marcha un proceso que destruye los materiales esenciales de abas-tecimiento de los propios fitomejoradores. (6)

El problema de la erosión genética de las varie-dades locales se ve agravado, además, por la desaparición de especies y formas silvestres de las plantas cultivadas debida a procesos como la deforestación masiva o la degradación y con-taminación de los habitats naturales que, en de-finitiva, no son sino resultados de la explotación abusiva de los recursos del planeta. La pérdida de variabilidad genética supone una limitación de la capacidad de responder a nuevas necesi-dades y un incremento de la vulnerabilidad de nuestros cultivos frente a cambios ambientales o aparición de nuevas plagas o enfermedades. (6). El reconocimiento de la erosión genética como un problema grave tiene lugar en los años 50, cuando el desarrollo agrícola empieza a alcan-zar a las regiones del planeta con mayor diversi-dad genética, siendo en este momento cuando se empiezan a poner en marcha medidas glo-bales para preservar los recursos fitogenéticos.

En el ámbito internacional, la reunión Técnica organizada por FAO en 1961 “Plant Explora-tion and Introduction” puede considerarse el punto de partida en el desarrollo del proceso coordinado de conservación de recursos filo-genéticos. Sucesivas actividades y reuniones promovidas por este organismo establecieron las directrices para solucionar los problemas técnicos relacionados con la recolección, conservación, evaluación, etc. del germoplas-ma y sus resultados se han plasmado en dos libros de obligada referencia: “Genetic Re-sources in Plant: Their Exploration and Con-servation” (Frankel y Bennett, 1970) y “Crop Genetic Resources for Today and Tomorrow” (Frankel y Hawkes, 1975). En 1983, se es-tableció el “Sistema Mundial de la FAO para la Conservación y Uso Sostenible de los Re-



cursos Fitogenéticos para la Alimentación y la Agricultura” cuyos objetivos son asegurar la conservación y promover la disponibilidad y utilización sostenible de los recursos genéti-cos, para las generaciones presentes y futu-ras (FAO, 1996).(6)

Razones para colectar germoplasma

• Rescatar una especie en peligro de ex-tinción o de erosión genética.

• Usar el germoplasma inmediatamente.• Completar colecciones ex situ.• Profundizar en los conocimientos sobre

la especie.• Aprovechar una oportunidad para colectar.• La colecta forma parte de una estrategia

de conservación. (11)

Evaluación y Caracterización

Son actividades complementarias que con-sisten en describir los atributos cualitativos y cuantitativos de las accesiones de una mis-ma especie para diferenciarlas, determinar su utilidad, estructura, variabilidad genética y relaciones entre ellas, y localizar genes que estimulen su uso en la producción o en el mejoramiento de cultivos. Ambas requieren exactitud, cuidado y constancia, e incluyen un componente importante de registro de datos. Estas dos actividades son muy parecidas y su principal diferencia radica en que:

1. En la caracterización se persiguen propó-sitos múltiples, describiendo los fitorecursos en la forma más amplia posible, para los más diversos caracteres de dichos materiales.

2. En la evaluación tiene propósitos defini-dos, o sea, evalúa caracteres o cualidades con determinados objetivos. Es importante para identificar rasgos potencialmente valio-sos de las muestras, así como las variedades locales que podrían utilizar directamente los agricultores. (7).

Conservación El aspecto de cómo conservar es uno de los más desarrollados. Este aspecto implica los

métodos de conservación en sí y los previos de recolección. Los estudios realizados sobre las técnicas de muestreo, recolección y con-servación son numerosísimos. En el aspecto concreto de la conservación, esta puede rea-lizarse in situ o ex situ. El primer tipo es usado fundamentalmente con especies silvestres, forestales o no, y en muy baja proporción con especies cultivadas. (5)

Las plantas se conservan dependiendo de su necesidad y/o utilidad actuales y futuras. Los re-cursos fitogenéticos se pueden conservar en su hábitat natural (in situ), en condiciones diferen-tes a las de su hábitat natural (ex situ), o combi-nando los métodos in situ y ex situ, es decir, de manera complementaria. La selección de uno o varios métodos depende de las necesidades, las posibilidades y la especie objetivo. (4) La conservación de los recursos filogenéticos es una labor continua, de largo plazo, que implica inversiones importantes en tiempo, personal, instalaciones y operación, justificables en fun-ción de las necesidades no del deseo o conve-niencia de conservar un material. Las razones para conservar y las especies objetivo se deben definir con base en criterios lógicos, científicos y económicos como la necesidad, el factibilidad de conservarlas (Maxted et al. 1997). (4).

Requerimientos de la conservación

Como cualquier proceso estratégico, la con-servación de los recursos fitogenéticos impli-ca planificar y tomar decisiones con base en información previa. La conservación requiere establecer prioridades en cuanto a: a) el tipo de material que se va a conservar (especies en peligro o de interés para la alimentación y la agricultura), b) las actividades que se van a realizar con él posteriormente, y c) los recursos disponibles para realizar esas acti-vidades. Las prioridades pueden variar pero hay que tener presente que la conservación y el uso del germoplasma son los objetivos más importantes. La conservación debe dis-minuir al máximo posible los efectos del nue-vo ambiente en las especies objetivo. Quie-nes conservan germoplasma deben conocer la taxonomía de las especies y las técnicas para representar su variabilidad genética y



conservar estable el genotipo original. Tam-bién se debe obtener información como datos de pasaporte, caracterización y evaluación (Cuevas 1988). (4). Las instalaciones en donde se va a conservar el material deben garantizar el aislamiento tan-to de factores ambientales como contra plagas y enfermedades. Las instalaciones pueden va-riar en diseño y dimensiones dependiendo del número y el tamaño de las muestras que van a conservar pero deben contar con un suministro constante de energía eléctrica y equipos que permitan acondicionar, conservar y regenerar los materiales. Deben ser seguras para que protejan el material de incendios, inundacio-nes, robo, saqueo y disturbios de orden públi-co. El manejo de las colecciones de recursos fitogenéticos debe estar a cargo de personal calificado, en lo posible de diversas disciplinas (fisiólogos, botánicos, mejoradores y agróno-mos), que conozca los aspectos técnicos y los procedimientos de seguridad inherentes a sus labores. Conviene que la colección dependa de un grupo de personas laboralmente esta-bles —no exclusivamente del curador— que puedan darle continuidad al trabajo de con-servación, sin presiones políticas o de orden público. La sola creación de un banco de ger-moplasma no garantiza la conservación de los recursos genéticos de interés para un país. La conservación requiere apoyo institucional, es decir, proveer de manera sostenida los re-cursos económicos, humanos y técnicos nece-sarios para mantener las colecciones y realizar las actividades de conservación. (4)

Conservación ex situ de los recursos fito-genéticos

Es la conservación de genes o genotipos de plantas fuera de su ambiente de ocurrencia na-tural, para uso actual o futuro (Hoyt 1988 citado por Engle 1992). La conservación ex situ perte-nece al importante conjunto de actividades que componen el manejo de los recursos fitogenéti-cos. Se considera complementaria de la in situ por cuanto no es posible conservar ex situ to-das las especies. La conservación ex situ abar-ca un amplio espectro taxonómico. Sirve para proteger desde especies silvestres y formas re-gresivas hasta especies cultivadas. Aplicada a

especies domesticadas, la conservación ex situ busca conservar fuera de su centro de origen o diversidad tanto las especies como la variabili-dad producida durante el proceso evolutivo de domesticación. Este tipo de conservación se ha utilizado ampliamente durante las últimas déca-das (Hidalgo 1991). (4)

Conservación in situ de los recursos filo-genéticos

La conservación in situ, también llamada con-servación dinámica, se realiza en las áreas en las que ocurre naturalmente la diversidad bio-lógica. Para los recursos Fitogenéticos silves-tres, esta conservación se realiza en los sitios en que las poblaciones de las especies de in-terés evolucionaron y se diversificaron. En el caso de los recursos fitogenéticos cultivados, la conservación in situ se realiza en los predios o fincas de los agricultores que poseen varie-dades locales o criollas y en los huertos fami-liares. Esta estrategia de conservación adquie-re una importancia creciente ante escenarios globales que afectan a nuestro planeta, tales como la pérdida de biodiversidad, el cambio climático y los procesos de desertificación. En las próximas décadas, una población mundial creciente requerirá cada vez más de la diversi-dad genética para lograr nuevas adaptaciones a estreses ambientales, resistencia a nuevas plagas y/o enfermedades, productos nutraceú-ticos y otra gran diversidad de productos, far-maceúticos y cosméticos, entre otros.

La principal diferencia entre ambos tipos de conservación, es que en la conservación in situ no se aísla a los recursos fitogenéticos de su entorno biofísico, socio-económico y cultural. Continúan ocurriendo los procesos evolutivos y co-evolutivos, así como los procesos de se-lección y diversificación en los agrosistemas. La generación de variantes genéticas adap-tadas de forma continuada es sustancial para el mantenimiento de la vida y las especies en el planeta, especialmente importante ante las perspectivas de cambio climático. La seguridad alimentaria de los pueblos, el mantenimiento de los servicios ecosistémicos, la recreación, el turismo y el futuro del mejoramiento genético dependen directamente de la conservación di-námica de la biodiversidad. (8)



Documentación e información de recursos genéticos Se denomina documentación a la organización de la información, siendo un componente bá-sico y fundamental para tomar decisiones res-pecto al manejo y uso de los recursos genéti-cos. El término documentación incluye todos los procesos necesarios para recopilar, orga-nizar, analizar y distribuir la información sobre los recursos fitogenéticos. Contiene para una especie o grupo de especies datos sobre es-tatus taxonómico, estado de conservación y datos de caracterización, entre otros.

La actividad de documentación de recursos genéticos debe prever incluir todas las for-mas en que las especies se encuentren y no quedar restringida al manejo de una estruc-tura tradicional de banco de germoplasma, asociado generalmente a semillas. Incluyen las colecciones ‘a campo’, colecciones in situ, cultivos de tejidos, colecciones de ADN, y de herbarios asociados a materiales con-servados. La documentación incluye tam-bién la información sobre variedades criollas de especies introducidas, muchas de ellas conservadas en fincas de agricultores; la de parientes silvestres afines a las cultiva-das y la de especies silvestres reconocidas como potenciales recursos genéticos. A este cúmulo de información también deben inte-grarse los datos de evaluación agronómica realizada por mejoradores, fitopatólogos, la información generada por químicos, citoge-netistas, etc., así como la contenida en las publicaciones existentes.

La documentación comprende la obtención, almacenamiento, procesamiento, análisis y difusión de los datos e informaciones, tanto por métodos manuales como computarizados relacionados con las actividades de: 1) am-pliación de la variabilidad genética disponible (por medio de colectas, mejoramiento gené-tico, métodos biotecnológicos); 2) conserva-ción in situ (en áreas protegidas y en predios rurales o fincas); 3) conocimiento asociado al uso de esos recursos genéticos; 4) conserva-ción ex situ (banco de mediano y largo plazo,

in vitro, colecciones de campo, colecciones de ADN, etc.); 5) estado de las colecciones (inventario, viabilidad, % de germinación, po-der germinativo, número de semillas, peso de muestra, etc.), así como actividades de rege-neración y/o multiplicación llevadas a cabo; 6) caracterización (morfológica, química, mole-cular, otras.); 7) evaluación agronómica (ca-racteres cuantitativos).

Un sistema de documentación correctamente diseñado debe permitir el acceso de links in-ternos y externos, y facilitar el almacenamien-to y recuperación de objetos digitales, tales como imágenes, hojas de cálculo, pdf, etc.). Una característica valiosa de un sistema de documentación es la capacidad de importar y exportar datos mediante planillas electróni-cas para actualización y consulta. Esto agiliza enormemente la carga de las bases de datos e incentiva el uso del sistema. Un sistema de documentación no es un sistema para el aná-lisis de materiales de ensayos en la etapa de mejoramiento, sino que es para el registro de datos que aporten al conocimiento del germo-plasma y promover su uso. La rápida evolución y diseminación de las Tecnologías de la Información y Comunicacio-nes (TIC) proveen en la actualidad excelentes mecanismos confiables y probados que son usados para los sistemas de información. Las aplicaciones web son herramientas de soft-ware que facilitan el acceso a la información para fines de mantenimiento y consultas de las bases de datos independientemente de la ubicación geográfica del usuario. Más recien-temente, la difusión del uso de dispositivos móviles agrega más oportunidades al acceso remoto de la información. (8)

Bancos internacionales y nacionales de genes

Once centros GCIAI administran colecciones de germoplasma en nombre de la comuni-dad mundial. Bioversity International, CIAT , CIMMYT, CIP, ICA RDA, Centro Mundial de Agrosilvicultura (anteriormente ICRAF), ICRI-SAT , Instituto Internacional de Agricultura Tropical, Instituto Internacional de Investi-gaciones Agropecuarias, INIBAP , IRRI y el



Centro Africano del Arroz (antes WARDA). El total de las colecciones de CIMMYT, ICA RDA, ICRISAT e IRRI comprenden más de 100 000 muestras cada una. En conjunto, los centros mantienen un total aproximado de 741 319 muestras de 3 446 variedades de 612 géneros distintos. Además, muchas otras instituciones internacionales y regiona-les conservan colecciones importantes, por ejemplo.

• El AVRDC conserva alrededor de 56 500 muestras de germoplas-ma de hortalizas.

• El Centro Nórdico de Recursos Genéti-cos (NordGen) conserva cerca de 28 000 ejemplares de 129 géneros de especies cultivadas.

• El Centro Agronómico Tropical de Inves-tigación y Enseñanza (CATIE) tiene un total de más de 11 000 muestras de hor-talizas, frutas, café y cacao.

• El Centro de Recursos Fitogenéticos (SPGRC) de la Comunidad para el Desa-rrollo del África Austral (SADC) conser-va más de 10 500 ejemplares de varios cultivos importantes para la agricultura africana.

• La West Indies Central Sugarcane Bree-ding Station (WICSBS) de Barbados con-serva alrededor de 3 500 muestras.

• El banco de genes International Cocoa Genebank de Trinidad y Tobago (ICGT), en la Universidad de las Indias Occiden-tales, conserva aproximadamente 2 300 ejemplares.

• El Centro para los Cultivos y los Árboles del Pacífico (CePaCT) de la Secretaría de la Comunidad del Pacífico mantiene colecciones de aproximadamente 1 500 muestras de distintos cultivos, incluyen-do colocasias, ñames y boniatos.

Un acontecimiento muy significativo desde la publicación del Primer Informe ha sido la creación del SGSV. Si bien no se trata de un banco de genes en sentido estricto, el SGSV ofrece instalaciones seguras para el almace-namiento de muestras de seguridad de los ejemplares que hay en bancos de genes de todo el mundo. En todo el planeta, gobier-

nos, universidades, jardines botánicos, ONG, compañías, agricultores y demás interesados de los sectores público y privado conservan recursos en bancos de genes a nivel local y nacional. Albergan una amplia gama de dis-tintos tipos de colecciones: colecciones na-cionales conservadas a largo plazo, coleccio-nes de trabajo mantenidas a mediano o corto

plazo, colecciones de ma-terial genético y otras. Los cuatro bancos nacionales de genes más importantes son los que se encuentran en el Institute of Crop Germ-plasm Resources, la Aca-

demia China de Agronomía (ICGR-CAA S) de China, el National Center for Genetic Re-sources Preservation de Estados Unidos de America, el National Bureau of Plant Genetic Resources (NBPGR) de India y el N. I. Vavi-lov All-Russian Scientific Research Institute of Plant Industry (VIR). También, existen bancos nacionales de genes que hospedan más de 100 000 muestras en Alemania, Brasil, Cana-dá, Japón y la República de Corea.

El NPGS del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos trabaja con un sistema de conservación de germoplasma que establece una red entre 31 bancos de genes dentro del país y conserva más del siete por ciento de las tenencias de germoplasma, lo que representa más del 50 por ciento de los géneros conserva-dos en los bancos de genes a nivel mundial. El banco de genes de semillas Millennium Seed Bank es el más grande del mundo dedicado a la conservación de especies silvestres. Está dirigido por el Jardín Botánico Real de Kew, que también cuenta con colecciones vivas de envergadura, así como también un herbario y colecciones carpológicas.(10)

La comisión de recursos genéticos para la alimentación y la agricultura

Consciente de la importancia de la biodiver-sidad en la alimentación y la agricultura para la seguridad alimentaria mundial, la Organi-zación de las Naciones Unidas para la Agri-cultura y la Alimentación (FAO) creó en 1983 la Comisión de Recursos Genéticos para la

Los centros de genes mantienen un total aproximado de 741.319 muestras de 3.446 variedades de 612 géneros distintos.



Alimentación y la Agricultura, de carácter in-tergubernamental. El mandato original de la Comisión – trata la cuestión de los recursos Fitogenéticos en la Alimentación y la Agricul-tura – se amplió en 1995, para incluir todos los componentes de la biodiversidad relativa a la alimentación y la agricultura.

Con más de 170 miembros, la Comisión constituye un foro intergubernamental para alcanzar un consenso mundial sobre polí-ticas pertinentes para la biodiversidad en la alimentación y la agricultura. Sus objetivos principales son velar por la conservación y la utilización sostenible de los recursos genéti-cos para la alimentación y la agricultura, y por la distribución justa y equitativa de los benefi-cios derivados de su uso, para las generacio-nes presentes y futuras.

La tarea de la comisión se centra en el desa-rrollo y la supervisión de la aplicación de políti-cas y nuevas iniciativas complementarias que no estén destinadas únicamente a fomentar la sensibilización acerca de estas cuestio-nes, sino que miren hacia el futuro para saber cómo solucionar los problemas. Además, se encarga de orientar la preparación periódica de evaluaciones mundiales acerca del esta-do y las tendencias de la diversidad genética, las amenazas para la diversidad genética y las medidas que están siendo tomadas para la conservación y utilización sostenible. La comisión también negocia planes de acción, códigos de conducta y otros instrumentos de interés para la conservación y utilización sos-tenible de recursos genéticos relativos a la alimentación y la agricultura.

CONCLUSIONES

Los recursos genéticos en la actualidad son prioridad de todos los países y en especial de América Latina y el Caribe, donde se locali-za la mayor biodiversidad de especies vege-tales en el mundo. Es tal la importancia de los recursos genéticos; que hoy en día vemos como se ha instaurado como una nueva rama de la Biotecnología que se independiza de la Genética y la Biología Molecular.

Somos conscientes que los recursos genéticos son la base de la subsistencia del ser humano. Ya sea directamente, por su consumo como ve-getales para la alimentación del hombre, como por ser la base de la alimentación animal, que suministra las proteínas tan necesarias para la vida, los recursos genéticos están en el centro de la seguridad alimentaria mundial.

REFERENCIAS

1. Leipzig, 1996. Biodiversidad en Ecua-dor. Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias. Quito-Ecuador. 137p.

2. Tapia, C; Zambrano, E; Monteros, A. 2008. Estado de los recursos Fitoge-néticos para la Agricultura y la Alimen-tación en Ecuador. INIAP. Quito – Ecua-dor. 101p.

3. Kameswara, N; Hanson, J; et.al. 2007. Manual para el Manejo de Semillas en Bancos de Germoplasma. Bioversity In-ternational. Roma - Italia. 167p.

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BIOLOGÍA DE SISTEMAS Y BIOINFORMÁTICA: ESTUDIO DE INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS

Marlon Pineda Escobar1, Aminael Sánchez Rodríguez2

1. Centro. Biotecnología, Universidad Nacional de Loja (UNL), La Argelia, Loja, Ecuador. E-mail: [email protected], 2. Department of Microbial and Molecular Systems, K.U. Leuven, Kasteel-park Arenberg 20, B-3001 Leuven, Belgium. E-mail: [email protected]____________________________________________________________________________

RESUMEN

Con la finalización del genoma humano y el crecimiento en número de diversos genomas se-cuenciados, una nueva era de la investigación sobre evolución molecular está tomando forma. La gran cantidad de avances tecnológicos en el área biológica, están llevando a la unificación de campos científicos como la biología molecular, bioquímica, física, matemáticas y ciencias de la computación, lo que ahora se conoce como biología de sistemas. En este artículo hacemos un énfasis en los flujos de trabajo en bioinformática que permiten la adopción de enfoques compa-rativos que van más allá del estudio de organismos modelos de forma aislada para dar forma a una nueva dimensión de estudios: los sistemas biológicos.

Palabras clave: Biología de Sistemas; Bioinformática, Interacciones moleculares____________________________________________________________________________



ABSTRACT

With the completion of the human genome and the growth in number of sequenced genomes, a new age of evolutionary research is taking shape. Many technological advances in biology are leading to the unification of diverse scientific fields such as molecular biology, biochemistry, phy-sics, mathematics and computer science, now known as systems biology. In this paper we focus on bioinformatics workflows that allow to go beyond the study of model organisms in isolation to shape a new dimension of study: the biological system.

Key words: Systems biology; Bioinformatics; Molecular interactions____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

La maduración de la Biología Molecular, de nuestros tiempos ha cambiado de forma sig-nificativa, la forma en que miramos a la célula: ello permite un acercamiento holístico y no de-terminístico. Las nuevas tecnologías que han dado lugar al acceso a grandes volúmenes de datos, el mayor poder computacional y el di-seño de nuevos algoritmos, han cambiado la actitud de muchos científicos sobre cómo so-lucionar algunos de sus problemas (1). Sólo en la última década hemos tenido acceso a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala, el análisis compa-rativo de organismos (ej. comparaciones de familias de genes) (1), y ha propiciado el na-cimiento de una nueva disciplina denominada Biología de Sistemas (2). El acceso a esta in-mensa cantidad de datos significa proporcio-nar una visión profunda en el árbol de la vida a casi todos los niveles de divergencia entre especies. Por ello no es sorprendente que la comprensión de relaciones filogenéticas sea un objetivo de investigación común entre los biólogos evolucionistas, y en los científicos interesados en la organización y función del genoma (1). A partir de esta concepción se han realizado muchos estudios referentes a las interacciones biológicas, tratando de ex-plicar el surgimiento de caracteres fenotípicos complejos de manera integrada (2).

Una de las dificultades más importantes que afrontamos proviene, de la enorme cantidad de datos que disponemos: la secuencia de más de un millón y medio de proteínas, la de más de mil genomas, la estructura tridimen-sional de más de 20 mil proteínas; también

disponemos de muchos datos que indican qué proteínas interaccionan entre sí; y todo el conocimiento científico acumulado a lo largo de las últimas décadas se encuentra disperso en más de 12 millones de artículos. El reto es ser capaces de relacionar todos estos datos, extraer conocimiento de ellos, comprender la biología de los organismos (3) y empezar a tener un impacto importante en nuestra com-prensión de la evolución molecular (1).

Los animales, hongos y plantas son los más representados en términos de iniciativa ge-nómica, porque han iniciado el interés de las diversas comunidades científicas, incluyendo los parasitólogos, fitopatólogos, los oceanó-grafos, y biólogos en general. A medida que se realizan más estudios genómicos, se va proporcionando información sobre la función de los sistemas biológicos, a través del bioa-nálisis mediante el empleo de nuevos méto-dos de alto rendimiento como la bioinformáti-ca que permite analizar información biológica a través de modelos computacionales. (1).

Cuando se secuencia un genoma vemos poco más que una larga serie de caracteres en un alfabeto de cuatro letras (los nucleóti-dos: A, C, T y G). Para lograr extraer patrones significativos de dicha información, la bioin-formática tiene un papel protagonista por dos razones principales: por una parte, la enorme cantidad de datos disponibles sólo puede ser analizada utilizando ordenadores; por otra, los datos son complejos, entre la maraña que entretejen hay información que sólo puede salir a la luz utilizando sofisticados algoritmos computacionales, que permiten comprender la información que encierran estos libros de



instrucciones encontrando los genes y su función. Esta herramienta de bioanálisis ha aporta-do algunas soluciones que son alternativas de gran valor al lento y costoso trabajo ex-perimental (3). Desde los primeros estudios en esta temática y hasta el presente, la se-cuenciación del genoma humano ha dado un empujón importante a esta disciplina (3).

La importancia del análisis comparativo es evidente en la proporción cada vez mayor de nuevos proyectos en ge-nomas procarióticos que se han elegido por su relación filogenética con organismos modelo como Escherichia coli y Bacillus subtilis y sus correspondientes taxones relacionados. Esta misma tendencia está ocurriendo en los eucariotas. Algunos ejemplos destacados son los múltiples pro-yectos de genómica en Saccharomyces, en Ascomycetes, en Plasmodium y otras iniciati-vas de genoma en nematodos y Drosophila, y el gran número de los proyectos de genómica de primates y mamíferos. (1).

El objetivo de esta reseña es realizar una re-copilación y análisis de la información relacio-nada con la Biología de Sistemas, que a tra-vés de la Bioinformática permita en conjunto, analizar y entender dos de las preguntas fun-damentales: la función de los sistemas bioló-gicos en las interacciones y el conocimiento de la evolución de la diversidad de la vida.

Parte Especial:

En los últimos años, se han producido gran-des avances en diferentes técnicas de biolo-gía molecular, que han generado un aumen-to exponencial en la cantidad de información proveniente de genes, proteínas, dinámica celular y respuestas de los organismos fren-te a mutaciones y el medio que los rodea. El principal objetivo de las ciencias biológicas es comprender la organización y dinámica de los componentes que forman los sistemas vivos, es decir, investigar las relaciones espaciales

y temporales entre moléculas, células, teji-dos, órganos y organismos que dan lugar a causa y efecto en sistemas vivos.

Frente a la aproximación tradicional de la bio-logía al estudio de genes, proteínas y célu-las como entidades individuales, la Biología de Sistemas busca la comprensión global de

las interacciones que se pro-ducen a todos los niveles en los seres vivos. Permitien-do mirar a la célula con un acercamiento holístico y no determinístico.

La Biología de Sistemas es un campo emergente de las ciencias de la vida con un carácter multidisciplinario.

En esta nueva disciplina convergen expertos procedentes de áreas como la genómica, pro-teómica, metabolómica, bioquímica y biología molecular, bioinformática, biofísica, fisiología y modelación computacional. Fruto de esta colaboración entre grupos podrán establecer-se estándares en bases de datos, software y algoritmos. La Biología de Sistemas revolu-cionará la medicina del futuro. Actualmente, la medicina está enfocada al tratamiento de síntomas mientras que en un futuro será más predictiva, previsiva y personalizada. Esto ocurrirá gracias al apoyo que tendrá de disci-plinas como la Biología de Sistemas que per-mitirá la caracterización y el establecimiento de diferencias entre estados patológicos y normales mediante el diseño de modelos pre-dictivos de estados patológicos. A partir de esta concepción se han realizados muchos estudios referentes a las interacciones bioló-gicas, tratando de explicar el surgimiento de caracteres fenotípicos complejos de manera integrada.

Para llegar a materializar estos objetivos, es crítico desarrollar herramientas de software más potentes y modelos matemáticos más robustos que permitan realizar modelos cuan-titativos y cualitativos capaces de reproducir detalladamente los fenómenos biológicos. Paralelamente también es necesario desa-

Los animales, hongos y plantas son los más representados en términos de iniciativa genómi-ca, porque han iniciado el inte-rés de las diversas comunidades científicas, incluyendo los para-sitólogos, fitopatólogos, los ocea-nógrafos y biólogos en general.



rrollar nuevas tecnologías y metodologías (y abaratar las ya existentes) para miniaturizar, estandarizar y automatizar la obtención de datos experimentales. (2).

ASPECTOS GENERALES DE LA BIOLO-GÍA DE SISTEMAS:

La Bioinformática tradicionalmente se ha cen-trado en el estudio de las proteínas y los ge-nes de forma aislada. Por ejemplo, para pre-decir la función o la estructura tridimensional de una proteína nueva, se buscan proteínas parecidas cuya función o estructura ya se co-nozcan. Existen multitud de métodos compu-tacionales en torno a esta perspectiva, y han sido, y sigue siendo, de gran ayuda. Desde hace algunos años, sin embargo, el panora-ma se ha ampliado: nuevas técnicas experi-mentales nos permiten conocer las redes de interacción entre proteínas de una célula, o cómo se expresan en determinada situación miles de genes. Este emergente punto de vis-ta, más amplio, necesita de nuevos métodos para que seamos capaces de comprender los datos.

Una de las dificultades más importantes que afrontamos en Biología proviene, paradójica-mente, de la enorme cantidad de datos que disponemos. El reto es ser capaces de rela-cionar todos estos datos, extraer conocimien-to de ellos, y comprender la biología de los organismos. (3). La gran mayoría de los feno-tipos cuantificables en las especies presen-tan un gran nivel de variabilidad a nivel pobla-cional (variación genética natural). Mientras que la presencia de esta diversidad es am-pliamente reconocida, mucho menos se sabe acerca de las consecuencias de la variación genética natural o las fuerzas detrás de su mantenimiento o generación, que son funda-mentales para la evolución y la ecología. La utilidad de la biología de sistemas ha ido más allá de la capacidad para describir fenotipos individuales sino para empezar describiendo la forma de las interacciones (4). La biología de sistemas también ha comenzado a tener un gran avance para ayudar a entender mejor y así describir la biología de las plantas (5).

Este incluye el desarrollo de enfoques cla-ve para combinar datos de metabolómica y transcripción en la identificación de nuevos genes de regulación enzimática (6;7). Nume-rosos métodos de biología de sistemas ahora se aplican al estudio de la variación genética natural, incluyendo la transcriptómica (8;9), metabolómica (10;11), la proteómica (12), compilación de grandes conjuntos de datos fisiológicos (8), la red de herramientas de análisis (13;14), y toda la secuenciación del genoma (15;16).

Cada uno de estos enfoques tiene una mira-da fuerte y ayuda en la identificación rápida de genes subyacentes, fenotipos que van desde la floración a los mecanismos de resistencia biótica. Sin embargo, su uso potencial es la comprensión de las bases genéticas de deter-minados fenotipos biológicos que han sido re-visados ampliamente en los últimos años. (17).

Sólo en la última década hemos tenido acce-so a la casi completa diversidad de genomas, que permiten a gran escala el análisis com-parativo de organismos. Nuevos genomas, secuencias y métodos de análisis están ayu-dando a mejorar nuestra comprensión de la filogenia, y al mismo tiempo mejorarlas.

Actualmente, sin embargo, el nivel de la se-cuenciación del genoma de las diferentes ramas del árbol de la vida está lejos de ser equivalentes. Proyectos de genoma procarió-tico son abundantes, principalmente debido al pequeño tamaño del genoma, con 200 geno-mas ya publicados y 500 por lo menos actual-mente en curso (www.genomesonline.org).

En contraste, 300 genomas de eucariotas están terminados o en curso (www.genome-sonline.org). Sin embargo, estos datos están empezando a tener un impacto importante en nuestra comprensión de la evolución eucarió-tica. Los animales, hongos y plantas son los más representados en términos de iniciativa genómica. A medida que se realizan más pro-yectos genómicos, postgenómicos, la biología también va proporcionando información sobre la función de los sistemas biológicos (1).



La inmensa cantidad de datos obtenidos a tra-vés de los proyectos de secuenciación del ge-noma no proporcionan suficiente información acerca de funcionamiento de un organismo a nivel molecular. Por esta razón, en los últimos años se ha producido un incremento en los esfuerzos por entender la función y objetivos de las diversas moléculas existentes en la célula (ADN, ARN, proteínas, y metabolitos). Para lograrlo es preciso definir la estructura tridimensional de estas macromoléculas, su localización subcelular, interacciones macro-moleculares, y niveles de expresión.

Un nuevo tipo de terminología que emplea el sufijo “oma” se ha extendido en la comunidad científica en los últimos años, en referencia a los distintos tipos de subpoblaciones de ma-cromoléculas en la célula. Por extensión, a la disciplina o área de investigación que se encarga del estudio de cada una de estas subpoblaciones, se le añade el sufijo “ómica”.

El número de publicaciones es un buen indi-cador de la situación de la investigación en Biología de Sistemas. Al realizar una búsque-da utilizando como palabra clave “Biología de Sistemas” (Systems Biology) en la base de datos de publicaciones científicas Pubmed, se observan un total de 46448 artículos cien-tíficos publicados entre enero del año 1999 y octubre del 2011. Si se compara este núme-ro de artículos con los 71.707 artículos que emplean los términos Genómica o Genómica Funcional (Genomics) que se han publicado en el mismo período de tiempo, podemos ha-cernos una idea del estado inicial en que se encuentra la investigación en Biología de Sis-temas (2).

BIOINFORMÁTICA

ANÁLISIS DE DATOS GENÓMICOS

Con múltiples secuencias del genoma a dis-posición del público, ahora estamos en la era de la post-genómica. La llamada siguiente generación (NextGen) de técnicas rápidas y baratas de secuenciación es lo que permite abordar una amplia gama de aplicaciones de análisis genético que incluye: la genómica

comparativa, de alto rendimiento de detección de polimorfismo, el análisis de la regulación transcripcional, desentrañar los genes mu-tantes en las enfermedades, y muchos otros estudios, sólo limitada por la imaginación de los investigadores. La genómica comparativa es un paso fundamental en muchos estudios de análisis de secuencias y la anotación de genomas completos a través de la identifica-ción de regiones codificantes y regulación. Es además uno de los principales retos en la investigación actual en biología molecular (18) presentando una evaluación estadísti-ca de las características discriminatorias de proteínas codificantes y no codificantes entre especies. Distintos grupos de investigación han desa-rrollado un procedimiento automatizado que permite de forma masiva realizar búsquedas similares de agrupación de genes, cálculo de varias alineaciones, y la reconstrucción de ár-boles filogenéticos dando lugar a la produc-ción de tres bases de datos: HOVERGEN, HOGENOM y HOMOLENS. (19; 20).

ANÁLISIS DE DATOS DE TRANSCRIPTÓ-MICA:

La evaluación de los datos de transcriptómica requiere el uso de enfoques que aprovechen la dinámica de activación de funciones de los genes. Un nuevo enfoque complejo en la evaluación de los datos de expresión es pre-sentado por (21). En este trabajo los autores presentan tres nuevos métodos capaces de capturar los diferentes aspectos de la relación entre los genes, las funciones y co-expresión que son biológicamente significativos. Otro aspecto interesante del análisis a gran escala de datos de transcriptoma es tratado por (22) con EasyCluster, una herramienta de agrupa-ción capaz de generar nuevos genes.

ANÁLISIS DE DATOS DE PROTEÓMICA

Son dos elementos clave de ómicas, el análi-sis automático de datos y la visualización de datos (23) la una presenta una herramienta nueva llamada agrupación GIBA y demuestra



cómo la combinación de los métodos existen-tes, en este caso las herramientas de clus-tering para analizar las interacciones entre proteínas, puede aumentar la calidad de los resultados. (24) describe una herramienta de visualización para comparar dos proteínas LC-MS conjuntos de datos a un nivel muy de-tallado, mientras que (25) presentan un nue-vo enfoque computacional para visualizar y comparar quimiogenómica proteínas.

INTEGRACIÓN DE DATOS BIOLÓGICOS

La integración de los resultados de la predic-ción automática y visualización para el análi-sis genómico de datos del genoma es un gran problema de la era post-genómica. (26) describen su trabajo en la anotación y visualización de secuen-cias retrovirales endóge-nas usando el Sistema de Anotación distribuido (DAS) y eBioX. (27) aplicar la ex-periencia en la interacción persona-ordenador para crear componentes de software reutilizables que analicen a gran escala un conjunto de bases de datos (20).

La Bioinformática es el área de la Biología donde intentamos aplicar los métodos com-putacionales para analizar esta información. Desde los primeros estudios en esta temática y hasta el presente, la secuenciación del ge-noma humano ha dado un empujón importan-te a esta disciplina, debido a que se han des-crito millones de diferencias en la secuencia entre distintas personas.

La Bioinformática tradicionalmente se ha cen-trado en el estudio de las proteínas y los ge-nes de forma aislada. Desde hace algunos años, el panorama se ha ampliado: nuevas técnicas experimentales nos permiten cono-cer las redes de interacción entre proteínas de una célula, o cómo se expresan en deter-minada situación miles de genes. Este inci-piente punto de vista, más amplio, necesita de nuevos métodos para que seamos capa-ces de comprender los datos. (3)

INTERACCIONES FITOPATOLÓGICAS

En la tríada clásica de la epidemiología, la expresión clínica de la enfermedad infec-ciosa se entiende como un producto de una relación compleja de un agente infeccioso, la respuesta inmune del huésped y factores ambientales. (28). En síntesis moderna, los genes eran las características de adaptación de las especies, no un nivel de evolución, con una historia profunda o con procesos de ra-mificación potencialmente diferentes de las especies. Esta visión estaba relacionada con el supuesto de que la historia de las espe-cies estaba dominada por el ajuste fino de la

evolución de los sub-orga-nismos rasgos específicos a fines funcionales. (29).

Los estudios genéticos no sólo nos ayudan a enten-der mecanismos básicos en biología, sino también nos brindan información sobre

la relación entre el genotipo – contenido ge-nético de un individuo en forma de ADN – y el fenotipo – la expresión del genotipo en un determinado contexto ambiental. Entender di-chas relaciones entre el genotipo y el fenoti-po nos brinda el potencial de mejorar nuestra habilidad para prevenir, diagnosticar y tratar enfermedades.

En tiempos recientes, la biología molecular celular ha transitado del estudio de compo-nentes moleculares individuales al estudio del conjunto de dichos componentes y sus inte-racciones (30). Esta aproximación de biología de sistemas busca, en la medida de lo posi-ble, una descripción integral y cuantitativa de las células y de los organismos, para lo cual ha sido necesario el desarrollo de nuevos mé-todos tanto teóricos como experimentales. Las interacciones genéticas son particular-mente atractivas para el análisis de los siste-mas biológicos, por su naturaleza trascienden en la interacción física y reflejan relaciones funcionales entre diferentes componentes genéticos. Gracias a las interacciones gené-ticas conocemos en la actualidad un número

El poder del análisis genético consiste en que, mediante el es-tudio de relaciones genotipofe-notipo, podemos acercarnos a los detalles de los sistemas bio-lógicos.



importante de vías metabólicas, de transduc-ción de señales y de procesos de desarrollo.

El poder del análisis genético consiste en que, mediante el estudio de relaciones genotipo-fenotipo, podemos acercarnos a los detalles de los sistemas biológicos. De hecho, mucho de nuestro conocimiento sobre procesos bio-lógicos clásicos se recopiló incluso antes de que se describiera el dogma central de la bio-logía molecular. Las últimas décadas han vis-to un progreso sin precedente en el desarrollo de la biología molecular. Los avances tecno-lógicos y de diseño de protocolos han permiti-do a los científicos automatizar muchos de los experimentos que tradicionalmente se hacían a mano y a pequeña escala. La combinación de dichas tecnologías con los catálogos ge-néticos completos que representan las se-cuencias genómicas han resultado en experi-mentos de alto rendimiento que examinan las propiedades bioquímicas y genéticas de un gran número de genes en paralelo. De esta forma, podemos interrogar a los sistemas bio-lógicos de manera sistemática.

Dado el atractivo particular del estudio de las interacciones genéticas de los genes entre sí y de éstos con las condiciones externas, no es de extrañar que éstas también hayan sido sujeto de análisis funcional sistemático. Dichos estudios se enfocaron originalmente en organismos modelo como la levadura Sa-ccharomyces cerevisiae (31; 32; 33; 34; 35; 36) y el nemátodo de vida libre Caenorhab-diti selegans (37; 38), dada la facilidad con que estos organismos pueden ser manipu-lados genéticamente. Entre tanto, podemos aprender principios básicos sobre un número importante de procesos biológicos mediante el estudio de interacciones genéticas en or-ganismos más simples, donde muchas de las herramientas pertinentes ya están a la mano. Con esta idea en mente, muchos grupos de investigación han desarrollado protocolos para crear combinaciones genéticas de dife-rente naturaleza (inactivación completa, inac-tivación parcial, sobreexpresión, etc.) en pa-rejas de genes.

Esto nos permite construir el mapa de inte-

racciones para 2n pares de genes para un número n razonable de genes. Es importan-te destacar que el muestreo en estos casos aumenta de manera exponencial: un estudio de todas las interacciones de cien parejas de genes implica el análisis de 10.000 muestras experimentales, mientras que para el estudio de mil parejas de genes requeriría 1’000.000 de muestras. Los primeros estudios sistemá-ticos se concentraron en la identificación de parejas de mutaciones co-letales (39; 33; 35; 36). La tecnología más reciente ha permitido hasta cierto punto el análisis cuantitativo de interacciones genéticas mediante el estudio de fenotipos tales como la velocidad de cre-cimiento (32; 34). Algunas variantes de estos ensayos han examinado las interacciones de las perturbaciones genéticas con las condi-ciones externas tales como respuesta a es-trés o a la presencia de drogas (31; 40). (41).

CONCLUSIONES

De este estudio se resalta la importancia que tiene el conocimiento profundo de la Biología de Sistemas. Este conocimiento es vital des-de el punto de vista biológico, debido a que permite una adecuada y mejor comprensión de la organización y dinámica de los com-ponentes que forman los sistemas vivos, es decir, investigar las relaciones espaciales y temporales entre moléculas, células, tejidos, órganos. Y la integración de los resultados de la predicción automática y visualización para el análisis genómico de datos del genoma en estudio.

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MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS Y SU CONTRIBUCIÓN A LA FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO

Klever Iván Granda Mora1, Santiago Erazo Sotomayor1

1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: [email protected]____________________________________________________________________________

RESUMEN

El énfasis de la comunidad internacional en el desarrollo ambiental sostenible, parece centrar su atención en el papel potencial de la fijación biológica del nitrógeno (FBN), al suministrar nitrógeno para la agricultura con el fin de contrarrestar el indiscriminado empleo de fertilizantes nitrogena-dos. En la presente revisión exploramos los microorganismos beneficiosos fijadores de nitrógeno (N) asociados a las plantas, que pueden tener una gran influencia en el crecimiento y desarrollo de las mismas, al contribuir al balance del ciclo del nitrógeno (N), aumentando la absorción de los nutrientes y promoviendo su crecimiento, en esta revisión hacemos énfasis en la interacción Rhizobium-leguminosa su asociación y simbiosis con leguminosas de importancia agronómica y su aporte en el incremento de la sostenibilidad de los agro-ecosistemas y los rendimientos agrí-colas.

Palabras Claves: Fijación biológica del N, microorganismos, asociación, nutrientes, Rhizobium____________________________________________________________________________



ABSTRACT

The emphasis of the international community on sustainable environmental development seems to focus on the potential role of biological nitrogen fixation (BNF), to provide nitrogen for agricultu-re in order to counteract the indiscriminate use of nitrogenous fertilizers. In this review we explore the beneficial nitrogen-fixing microorganisms (N) associated ciated with plants, which can have a major influence on the growth and development of my-more, by contributing to the balance of the nitrogen cycle (N), increasing the absorption of nutrients and growth promoting, in this re-view we emphasize the Rhizobium-legume interaction and partnership symbiosis with legumes of agronomic importance and its contribution in increasing the sustainability of agro-ecosystems and agricultural yields.

Keywords: biological N fixation, microorganisms, association, nutrients, Rhizobium___________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

El suministro de nitrógeno (N) al suelo no es suficiente para compensar su creciente de-manda por las plantas y organismos vivos que habitan en este planeta, haciéndose ne-cesaria la aplicación de algún fertilizante ni-trogenado (Beever et al., 2007). Sin embargo, esta estrategia puede producir una creciente contaminación ambiental donde se ven afec-tados todos los factores actuantes, ya sean bióticos como abióticos (Urzua et al., 2001). El N es el principal factor nutricional que limita el crecimiento de plantas en los agroecosis-temas mundiales (Graham, 1988). Este ele-mento es un componente esencial en sustan-cias básicas para la vida, tales como ácidos nucleicos y la conformación de proteínas (Ha-rrison, 2003), por lo que el cultivo de plantas con capacidad para incorporar este elemento tanto a su metabolismo como para el ade-cuado comportamiento del ciclo del N en la biosfera es de vital importancia. Las plantas pertenecientes a la familia leguminosa (Fa-baceae) son unas de las máximas responsa-bles del equilibrio del N en los ecosistemas (Broughton et al., 2003). Estas son capaces de realizar el proceso de fijación biológica del N (FBN) mediante la estrecha relación con bacterias del suelo comúnmente conocidas como rizobios (Weir, 2006). En la presente revisión se abordan los princi-pales problemas causados por la aplicación indiscriminada de N sintético a los suelos, así como el aporte de los microorganismos dia-

zotróficos al ciclo de este vital elemento para el desarrollo y crecimiento de las plantas y a la FBN.

Impacto del nitrógeno (N) en los ecosiste-mas.

A partir de la década del 40, millones de tone-ladas de N sintético eran suministradas a las producciones agrícolas anualmente con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales. La alta demanda de alimentos fue un factor determinante de tal incremento en la produc-ción y aplicación de fertilizantes nitrogenados. La “revolución verde” se convirtió en el pun-to sublime de la difusión de los mencionados fertilizantes, trayendo consigo el gasto incal-culable de fuentes de energía natural para su producción y los nefastos problemas que han ocasionado en la ecología y el equilibrio bioló-gico (Biological Nitrogen Fixation, 2001). Des-de 1972, con la fundación de la IFOAM (In-ternacional Federation of Organic Agriculture Movements), se estableció que la agricultura orgánica debía aumentar la fertilidad de los suelos, su actividad microbiana e incremen-tar el reciclaje de los nutrientes. En la década de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto común de investigación teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la aplicación irracional de los fertilizantes químicos (IFOAM, 2001), lo cual se ha mantenido hasta la actual década. La aplicación de fertilizantes que contienen



N para las cosechas es esencial para equi-librar las entradas y salidas de nutrientes y por tanto para mantener o mejorar la fertilidad del suelo, para incrementar la productividad agrícola y a su vez, para evitar que los eco-sistemas naturales y los hábitats vírgenes se conviertan en tierras de cultivo (Beever et al., 2007). Sin embargo, esto ha traído como consecuencia el gran uso de fertilizantes ni-trogenados para reponer el N del suelo y para obtener los rendimientos deseados, una práctica que conlleva a altos costos y que produ-ce efectos severos al me-dio ambiente (Gustafson y Kreys, 2006). Los grandes incrementos de las produc-ciones de cereales en los países desarrollados entre 1959 y 1990 están directa-mente relacionados con el aumento de la aplicación de fertilizantes nitrogenados. Unido a los altos niveles de aplicación de estos fertilizantes se encuentra la emisión de óxido nitroso (N2O) a la atmós-fera, el deterioro de recursos no renovables, un desequilibrio en el ciclo global del N y la lixiviación del nitrato a las aguas subterráneas (Torres-Gutiérrez, 2008). El uso de N sintético en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5 a 80 millones de toneladas, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, in-crementándose sus costos de producción a más de 20 billones de USD anualmente (Bio-logical Nitrogen Fixation, 2001). En este pe-riodo, el ciclo global del N se ha visto afectado por el incremento irracional de la fijación de N mediante procesos industriales, es decir, me-diante la aplicación de fertilizantes nitrogena-dos; pero su impacto ambiental aún está por calcularse (Montañés et al., 2004).

Implicaciones de la liberación de N reacti-vo en los ecosistemas

La falta de N reactivo en los agro-ecosistemas lleva al descenso de la fertilidad de los sue-los, bajos rendimientos y escaso contenido

proteínico en las cosechas, reducción de la materia orgánica de los suelos, erosión y en casos extremos, la desertificación (Barbier y Bergeron, 2001). No obstante, existen nefas-tos problemas que pueden originarse con el exceso o la aplicación irracional de productos químicos nitrogenados. El exceso de NO3- en

los suelos comúnmente sue-le lixiviarse a los suministros de agua subterránea y agua potable, contaminando las fuentes fluviales. Aunque el llamado síndrome de niños cianóticos (enfermedad co-múnmente conocida como “niños azules”, causante de la metahemoglobinaemia), la misma que ha sido atri-buido recientemente a la contaminación bacteriana y no al exceso de NO3- en las aguas como originalmen-te se suponía (L’hirondel y L’hirondel, 2002).

Es ampliamente conocido que el exceso de NO3- en vegetales y ali-mentos causado por la irrigación con aguas contaminadas con NO3- está estrechamente relacionado con la aparición de cánceres in-testinales y gástricos (Leifert y Dorado, 2000). (Beever et al., 2007) han reportado que los nitratos en aguas superficiales aumentan la carga de N lo cual puede jugar un rol fun-damental en la eutrofización. Este proceso contribuye a la degradación de los recursos ecológicos creando grandes concentraciones de algas y organismos en las aguas superfi-ciales y su contaminación. En la atmósfera el oxido de N (NO2) de manera particular puede exacerbar varias enfermedades en los seres humanos, tales como asma y enfermedades cardiovasculares. En este medio, el incre-mento de las concentraciones de (N2O) con-tribuye sustancialmente al calentamiento glo-bal y consecuentemente a la salud humana (Graham y Vance, 2003).

Todos los ecosistemas emiten N2O y más de 50% de las emisiones globales son considera-dos como “naturales” (tierras bajo vegetación

La aplicación de fertilizantes que contienen N (un elemen-to necesario en la composición de proteínas, ácidos, nucleicos y otros componentes celulares) para las cosechas es esencial para equilibrar las entradas y salidas de nutrientes y por tanto para mantener o mejorar la fer-tilidad del suelo, para aumentar la productividad agrícola y a su vez, para evitar que los ecosiste-mas naturales y los hábitats vír-genes se conviertan en tierras de cultivo.



natural, océanos, etc.). La agricultura justifica el 86% de las emisiones globales antropogé-nicas de N2O (USEPA, 2006). De las emisio-nes N2O agrícolas, 44% está relacionado a la administración y la aplicación de abono ani-mal; y 14% es asociado directamente con el uso de fertilizantes minerales (Mosier et al., 2004). Sin embargo, está claro que aumen-tando la aplicación de fertilizantes nitrogena-dos aumentará las emisiones de este potente gas invernadero por los procesos naturales de desnitrificación (Merino et al., 2001).Las proyecciones recientes indican que la demanda global de fertilizantes nitrogenados en el 2050 podrían estar entre 107 y 171 t de N (Beever et al., 2007). De acuerdo con los cuatro escenarios reportados por la Eva-luación del Ecosistema del Milenio (2005) así como otros investigadores, corroboran que el consumo global del fertilizante nitrogenado en el 2050 se prevé que esté entre 110 y 140 t de N (Heffer y Prud’homme, 2006). Estos in-crementos sin precedentes en la producción agrícola para satisfacer los niveles de insu-mos calóricos y proteicos para el abasteci-miento a la gran población mundial, propicia la búsqueda de nuevos métodos de producción agronómicamente y ecológicamente susten-tables. (Biological Nitrogen Fixation, 2001).

La fijación biológica del nitrógeno (FBN)

El N es un elemento necesario en la compo-sición de proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes celulares, siendo así una mo-lécula esencial para el crecimiento de todos los organismos. En la atmósfera el N ocupa aproximadamente el 80%, existiendo en la forma N≡N; sin embargo, el N2, debido al tri-ple enlace entre los dos átomos de nitrógeno, que hace a la molécula casi inerte, no puede ser aprovechado por la mayoría de las formas vivientes, sino sólo por un pequeño grupo de microorganismos altamente especializados, que incluyen algas, bacterias y actinomicetos. Para ser utilizado en el crecimiento, este ele-mento debe ser primero reducido y luego “fija-do” (combinado) en la forma de iones amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). El proceso a través del cual los microorganismos reducen el nitró-geno hasta una forma utilizable es conocido

como Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN), este proceso puede ser llevado a cabo por los microorganismos de vida libre o en simbiosis con plantas. La FBN es una fuente eficiente de N, las entradas anuales de N en la tie-rra a partir de la FBN como se plantea por (Weir, 2006) oscilan entre 139 y 175 millones de toneladas de N, de este total cerca del 30 % (45 millones de toneladas de N) se lleva a cabo mediante interacciones asociativas planta-bacteria y con el pasto permanente, mientras mediante asociaciones simbióticas (Rhizobium-leguminosas), en terrenos ara-bles representa entre un 25 y un 30 % (entre 35 y 45 millones de toneladas de N). Aunque la exactitud de estas cifras puede ser cuestio-nada (Beever et al., 2007).

Los organismos que pueden fijar N, es decir, convertir el gas N2 estable en la atmosfera en una forma útil biológicamente, pertenecen to-dos ellos a un grupo biológico conocido como procariotas. Todos los organismos que redu-cen el N2 a NH4+ lo hacen con la ayuda de una enzima compleja, la nitrogenasa (Zahran, 1999). Un amplio espectro de microorganis-mos podría tener la capacidad de fijar N, sin embargo; solamente una proporción pequeña de las especies conocidas pueden hacerlo. Cerca de 87 especies en 2 géneros de ar-chaea, 38 géneros de bacterias y 20 géne-ros de cianobacterias han sido identificados como diazótrofos u organismos que pueden fijar el N2 atmosférico (Zahran y Afkar, 1995). La FBN resulta ser, entonces, una tecnología limpia de producción y una forma concreta de proteger el medio ambiente.

Interacciones asociativas diazotróficas. Contribución de las plantas no legumino-sas a la FBN.

El primer diazótrofo de vida libre fue reportado por Beijerinck en 1925 con el nombre de Spi-rillum lipoferum. Sin embargo, fue solamen-te cerca de medio siglo más tarde, después del descubrimiento de la asociación Azoto-bacter paspali-Paspalum notatum altamente específica y del descubrimiento de Spirillum lipoferum (ahora denominada Azospirillum) (Döbereiner et al., 1972), que los científicos



aumentaron su interés por las bacterias diazo-tróficas asociadas con plantas gramináceas. Debido al avance de los métodos de identi-ficación de microorganismos y a la biología molecular se ha reportado que varios géneros de bacterias son capaces de incluirse dentro de la denominacion de diazótrofos asociados íntimamente (endófitos) con las plantas, in-cluyendo entre otros generos; Acetobacter, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter (Gluco-nacetobacter), Beijerinckia, Burkholderia, En-terobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Paeni-bacillus y Pseudomonas (Dobbelaere, 2002).

Los esfuerzos para determinar las proporcio-nes de fijación del N en asociaciones natura-les con las plantas han producido una amplia gama de resultados. En los últimos 30 años muchos estudios de inoculaciones, unido a las mediciones de reducción de acetileno (ARA), el equilibrio del N y los experimentos de dilución del isótopo 15N, han sido realiza-dos con bacterias asociadas a las raíces para determinar si las bacterias proporcionan can-tidades significativas de N a las plantas culti-vadas (James, 2000). La contribución de las interacciones asociativas para la FBN global es una evidencia de la importancia económi-ca del cultivo de las plantas no leguminosas a nivel mundial; sin embargo, las respuestas de las cosechas variadas debido a limitaciones bióticas y abióticas (Roesch et al., 2006).

El arroz (Oryza sativa), el trigo (Triticum aesti-vum) y el maíz (Zea mays) son las tres fuentes principales de alimentación de la población mundial. En una cosecha el arroz consume alrededor de 16 o 17 kg de N para producir 1 t (Sahrawat, 2000). Una cosecha de trigo ne-cesita entre 26 y 28 kg de N para producir 1 t de grano (Angus, 2001). El maíz requiere de 9 a 11 kg de N para producir 1 t de biomasa (Anuar et al., 1995). La mayoría de los suelos carecen de suficiente N y las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados son esenciales para la obtención de buenos rendimientos de tales cereales. Generalmente la urea es la fuente más conveniente de N pero menos del 50% del producto aplicado es usada por las plan-tas (Halvorson et al., 2002). Esta baja eficien-cia tiene su causa fundamentalmente en la

volatilización del NH4+, la desnitrificación y las perdidas por escapes hacia la atmósfera (Bijay-Singh et al., 1995). Un determinado número de estudios realiza-dos en el cultivo del arroz sugieren que del 20 al 25 % de las necesidades totales de N pueden derivarse de la fijación asociativa. (James, 2000). Sherestha et al. (1996) rea-lizaron dos experimentos comparando hasta setenta variedades de arroz en cada uno. En un experimento se estimó que la cantidad de N derivado de la atmósfera oscilaba entre un 0 y un 20.2 %. En un segundo experimento se encontró que se fijo un equivalente de 16 a 70 % de N por hectárea. Rhizobium legu-minosarum bv. Trifolii comúnmente observa-do en la simbiosis con la planta leguminosa puede colonizar raíces del arroz de manera endofítica, reemplazando entre un 25 y un 33 % de la cantidad de fertilizante nitrogenado recomendado para el arroz en condiciones de campo (Yanni et al., 1997). Los experimentos de campo demostraron que la inoculación de esta bacteria aumentó el rendimiento medio del arroz en 3.8 t.ha-1 (Yanni et al., 2001).

La inoculación con Azospirillum brasilense puede incrementar el rendimiento del grano de trigo hasta un 30 % en condiciones de campo (Okon y Labandera-Gonzalez, 1994), pero solamente con proporciones de aplica-ción más bajas de fertilizante nitrogenado (50–60 kg N ha-1). Con aplicaciones más elevadas (110–170 kg N ha-1), los efectos de la inoculación de Azospirillum no fueron esta-dísticamente significativos (Dobbelaere et al., 2001). En el maíz García de Salamone et al. (1996) sugirieron que algunos cultivares fijan hasta un 60 % de N después de la inoculación con cepas apropiadas de Azospirillum. Recien-temente (Roesch et al., 2006) estudiaron la dinámica de las bacterias asociativas en dos genotipos de maíz y la influencia del suminis-tro de N los cuales reportaron que la dinámica y la distribución de las bacterias asociativas de los géneros Azospirillum, Burkholderia y Acetobacter fueron afectados por el estado ontogénico de la planta de maíz y la pobla-



ción bacteria fue afectada por la fertilización con N durante las primeras etapas del creci-miento de la planta.

En la Universidad de Wisconsin: Estados Uni-dos Riggs et al., (2001) mostraron mediante pruebas de invernadero; usando suelos no esterilizados que los rendimientos del grano de maíz aumentaron entre 36 y 48 % al inocu-lar las semillas con B. cepacia AMMDR1. En las pruebas de campo esta bacteria fue capaz de incrementar el rendimiento del maíz entre 5.9 y 6.3 %.

De igual forma Rhizobium etli bv. phaseoli y Ensifer sp. (anteriormente Sinorhizobium sp., puede colonizar las raíces del maíz e incre-mentar el peso seco de la planta (Gutiérrez-Zamora y Martínez-Romero, 2001), y a la vez incrementar los rendimientos del maíz en 34 y 11 % en condiciones de invernadero y de campo, respectivamente. Estos resultados enfatizan la importancia de evaluar combina-ciones de diferentes cepas de Rhizobium con genotipos de maíz.

Simbiosis de las bacterias que fijan N con las plantas.

Las interacciones simbióticas de las bacterias con varios grupos de plantas son las mejo-res estudiadas para el suministro biológico de N. En estas interacciones se encuentra una multiplicidad de bacterias con diferentes an-tecedentes fisiológicos, incluyendo las prote-obacterias Gram negativas como Rhizobium sp. y Burkholderia sp., Gram-positivas Fran-kia sp. (Benson y Silvester, 1993) y las cia-nobacterias filamentosas o unicelulares (Rai et al., 2000). Las características fisiológicas y morfológicas de estas simbiosis van desde comunidades extracelulares hasta interfaces altamente adaptadas dentro de órganos o compartimentos especiales. La simbiosis mu-tualista entre varias proteobacterias no foto-sintéticas del orden Rhizobiales con plantas de las ordenes Fabales, Curcurbitales y Ro-sales son las interacciones entre bacterias y plantas más ampliamente estudiadas (Kneip et al., 2007). En esta revisión nos centramos en la interrelación entre Rhizobium y plantas

leguminosas por su contribución sustancial al ciclo del N y a la FBN.

La simbiosis Rhizobium-Leguminosa

Un análisis de la historia de la FBN muestra que el interés generalmente se ha enfocado en el sistema simbiótico de las plantas legu-minosas con las bacterias conocidas genéri-camente como especie rizobia, debido a que estas asociaciones han tenido el mayor im-pacto cuantitativo en el ciclo del N. Entre las leguminosas existe un gran potencial para la contribución del N fijado a los ecosistemas (Tate, 1995). Hay aproximadamente 650 gé-neros y alrededor de 20 000 especies de le-guminosas (Sprent, 1985), y solamente cerca del 20% (Sprent y Sprent, 1990) han sido es-tudiadas para la nodulación y han mostrado tener la capacidad de fijar N2 atmosférico.

La FBN, en particular mediante la simbiosis Rhizobium-Leguminosa tiene un papel cru-cial en el aumento de la sostenibilidad de los rendimientos con mínimas entradas externas no renovables (Vance, 2001). La simbiosis entre las plantas de la familia Leguminosae y los procarióticas se caracteriza típicamente por la formación de nódulos en la raíz y parte del tallo que son inducidos y posteriormente invadidos por micro simbiontes específicos (Weidner et al., 2003). Weir (2006) reporta que entre ellas se encuentran el muy cono-cido grupo alfa-proteo bacterial de Rhizobia-ceae que contiene los géneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer, Mesorhizobium y Rhizobium; junto con otros grupos tales como Methylobacterium (Sy et al., 2001), Ochrobac-trum, Phyllobacterium (Valverde et al., 2005) y Shinela (Lin et al., 2008) y miembros de las Beta proteo bacterias Burkholderia (Moulin et al., 2001) y Cupriavidus (Chen et al., 2001).

El apoyo de la microscopia para examinar la simbiosis nodular ha ganado nueva importan-cia a la luz de estos descubrimientos y varios estudios han unido el enfoque visual con la caracterización molecular de los simbiontes (Elliott et al., 2007). La taxonomía rizobial ac-tual tiene 5 géneros y 79 especies, la mayoría de los cuales fueron descritos en la última dé-



cada usando técnicas de biología molecular (Weir et al., 2006).

Aplicación y contribución práctica de Inte-racción Rhizobium-Leguminosa.

Los efectos cuantitativos de las interaccio-nes Rhizobium-leguminosa pueden medirse en términos de cómo las bacterias respon-den al genotipo del hospedero. Varios inves-tigadores han estudiado cómo la capacidad de las cepas para competir por la ocupación del nódulo es afectada por el genotipo del hospedero. La incapacidad de las ce-pas introducidas que fijan el N para competir con las cepas propias del suelo por la ocupación del nódulo es una limitante importante en el desarrollo de los inoculan-tes de Rhizobium (Snoeck et al., 2003). Cregan et al., (1989) encontraron efectos significativos en los genotipos de soya (Glycine max) sobre la competitividad de cepas de Bradyrhizobium japonicum estrechamente relacionadas. Un ejemplo de ello lo constituye la limitación de la nodulación del genotipo de soya PI417566 cepa USDA 129 resultando en una baja ocu-pación nodular mientras que al inocular este mismo genotipo con las cepas USDA 123 o con USDA 127 se obtuvieron buenos resul-tados en la nodulación total. Sin embargo en otro cultivar de soya, la cepa USDA 129 ocu-po más del 87 % de los nódulos (Josephon et al., 1991) coinocularon dos cepas, KIM5 y Viking-1, en 12 cultivares de frejol común, mi-dieron la ocupación porcentual del nódulo de cada cepa para cada cultivar y encontraron una significativa interacción cultivar por cepa. De acuerdo con los primeros estudios repor-tados por Amarger (1986), la fijación del N de-pende de la interacción rizobia con el cultivar. Esto enfatiza la importancia de examinar la interacción entre la diversidad de cepas nati-vas de rizobia con un cultivar nuevo, además de la influencia del genotipo de la planta en la nodulación y la efectividad en una especie determinada. (Mhamdi et al., 2002) describie-ron la variabilidad de las cepas de rizobia con

la capacidad de nodular el frejol común en di-ferentes ambientes en Túnez, reportando que las cepas varían entre las regiones y los culti-vares, con R. leguminosarum. Recientemen-te (Tajini et al., 2008) demostraron la efecti-va combinación Rhizobium etli y (R. tropici CIAT899) en los genotipos del frejol común. Fue evidente que las cepas nativas de rizo-bia eran más eficientes que la cepa CIAT899. Todos estos resultados indican una estrecha interacción entre el genotipo del hospedero y rizobia. Se supone que esta interacción es el

resultado de la coevolución entre las cepas de Rhizo-bium y los genotipos del hos-pedero (Aguilar et al., 2004).

En estudios en condiciones controladas, Granda Mora et al. (2010) reportan la variabi-lidad genotípica de diferen-tes aislados de Rhizobium provenientes de nódulos de

frejol común en la zona central de Cuba. Los resultados demostraron que todas las cepas fueron capaces de establecer adecuadas re-laciones simbióticas con el macro simbionte, observándose que muchas de estas cepas superaron los parámetros de nodulación (nu-mero de nódulos totales y peso fresco y seco de los nódulos) en comparación con la cepa tipo de R. etli CNPAF512.

La aplicación de combinaciones de diazótro-fos ha sido uno de los apartados de interés para científicos en todo el mundo, lo cual po-tencia el efecto de los diazótrofos simbióticos. Las asociaciones bacteriales diazotróficas contribuyen de manera sustancial a la FBN en cosechas de no leguminosas importantes. En las leguminosas la combinación de PGPR con diazótrofos simbióticos ejerce un mar-cado efecto en los parámetros fisiológicos y fenotípicos. (Rodelas et al., 1999) reportaron para el frejol blanco que las respuestas a la inoculación de Azotobacter y Azospirillum en combinación con Rhizobium conducía a cam-bios en el contenido total y/o la distribución de macro y micro nutrientes (K, P, Ca, Mg, Fe, B, Mn, Zn y Cu) cuando se comparaba con plantas inoculadas solamente con Rhi-

Las interacciones simbióticas de las bacterias con varios grupos de plantas son las mejores estu-diadas por el suministro biológi-co de N. (un elemento necesario en la composición de proteínas, ácidos, nucleicos y otros compo-nentes celulares).



zobium. Torres-Gutiérrez (2004, 2008) repor-ta el beneficio de la co-inoculacion de cepas de Azotobacter y Azospirillum conjuntamente con cepas tipo de Rhizobium etli y R. tropici. La combinación de los diazótrofos logró es-timular la nodulación, componentes del ren-dimiento y el rendimiento agrícola de geno-tipos de frejol común en comparación con la inoculación en solitario de Rhizobium y con la fertilización mineral, reduciendo las tasas de aplicación de fertilizante e incrementando las producciones.

Existen evidencias de algunos modos de acción para la estimulación de PGPR en la simbiosis Rhizobium-leguminosa, pero el modo más comúnmente implicado es la estimulación de crecimiento mediante la liberación de la fitohormona inducida (áci-do indol-3-acetico) (Vessey y Buss, 2002). De esta forma la estimulación de nodula-ción es más comúnmente un efecto indi-recto; las PGPR estimulan el crecimiento de la raíz lo cual proporciona más sitios para la infección y la nodulación. Burdman et al. (2000) relacionaron la estimulación mediada de Azospirillum brasilense en la nodulación del frejol común con una pro-ducción incrementada de flavonoides por el hospedero de la leguminosa. Estos fla-vonoides son las señales químicas inicia-les segregadas por el hospedero de la le-gumbre para inducir genes Nod en rizobia y por tanto iniciar la simbiosis Rhizobium-leguminosa (Schultze y Kondorosi, 1998). Se reportan otras evidencias por Thilak et al. (2006) mostrando que PGPR unido al eficiente Rhizobium puede también afectar positivamente en el crecimiento y la fijación del N en arveja. Recientemente Figueredo et al., (2007) reportaron la nodulación me-jorada y la fijación del N en el frejol común con la co-inoculación de Rhizobium y va-rias cepas de Paenibacilus. En este estu-dio la co-inoculación con Rhizobium tropici (CIAT899) y Paenibacillus polymyxa (DSM 36) tuvieron concentraciones más altas de legemoglobina, actividad de nitrogenasa y eficiencia de la fijación de N2 y por tanto se formaron asociaciones de mayor eficiencia simbiótica.

CONCLUSIONES

Los procesos naturales de FBN juegan un im-portante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio am-biental. El incremento de su aplicación puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguien-te efecto benéfico al ciclo del N, el calenta-miento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Estimular la aplicación de microorganismos diazotróficos, ya sean de vida libre como simbióticos, trae-rá consigo el incremento de las producciones agrícolas sin la utilización de elementos no renovables, disminución de los costos de pro-ducción y la reducción de las emisiones de gases con efecto invernadero. REFERENCIAS

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USO DE MICROORGANISMOS ANTAGONISTAS Y SUSTANCIAS NATURALES COMO UNA ALTERNATIVA ECOLÓGICA EN EL CONTROL DE ENFERMEDADES

EN CULTIVOS

Ángel Rolando Robles Carrión1

1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: [email protected] ____________________________________________________________________________

RESUMEN

En este trabajo se presenta una revisión bibliográfica sobre las principales aplicaciones de micro-organismos antagonistas y sustancias naturales en el control de enfermedades en los cultivos, con el objetivo de tener una visión más técnica y científica del estado actual de uso de estos biofungicidas en este campo. En primer lugar se revisa el concepto de control biológico y los diversos mecanismos de acción (Antagonismo, Antibiosis, Competencia, Fungistasis, Resisten-cia sistémica adquirida, y Micoparasitismo) con que actúan frente a las diversas enfermedades en plantas. En segundo término se presentan los microorganismos antagonistas y sustancias naturales más importantes en el control de enfermedades en plantas, algunos de los cuales han sido probados como biofungicidas satisfactoriamente. La revisión realizada permite vislumbrar un gran potencial de aplicación de estos bioproductos en el área agrícola.

Palabras claves: microorganismos antagonistas, sustancias naturales, mecanismos de acción, enfermedades de plantas. ____________________________________________________________________________



ABSTRACT

This paper presents a literature review on the main applications of antagonistic microorganisms and natural substances to control crop diseases, with the goal of giving a technical and scientific overview of the current state of the use of these bio-fungicides in the field. First we review the concepts of biological control and of the various mechanisms of action (antagonism, antibiosis, competition, fungistasis, systemic acquired resistance and mycoparasitism) against the various diseases in plants. Secondly, we introduce antagonistic microorganisms and natural substances that are important in the control of plant diseases, some of which have been successfully tested as biofungicides. This review offers a glimpse of the great potential of these bioproducts in agri-culture.

Key words: antagonistic microorganisms, natural substances, mechanisms of action, plant disea-ses. ____________________________________________________________________________

INTRODUCCIÓN

En los últimos años el control biológico de plagas y enfermedades en la agricultura ha adquirido gran importancia frente a los pro-blemas fitosanitarios ocurridos por el uso indiscriminado de plaguicidas químicos en la agricultura, lo cual ha traído como conse-cuencia severos problemas de contaminación al medio ambiente y ha generado la resisten-cia de plagas y enfermedades, así como la presencia de nuevas especies de microorga-nismos fitopatógenos con un grado de afecta-ción más virulento (Bravo et al. , 2006).

La mayoría de los microorganismos fitopató-genos tienen antagonistas biológicos que se pueden emplear como estrategia de lucha en un programa de control biológico. En los últi-mos años el empleo de bacterias y hongos an-tagonistas de enfermedades agrícolas ha co-brado una singular importancia, debido a que no solo actúan contra un grupo determinado de microorganismos fitopatógenos (como lo hacen los plaguicidas químicos), sino que se están utilizando para un grupo muy amplio de microorganismos fitopatógenos (Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006).

Aunque el control biológico no pretende re-emplazar completamente los sistemas de control químico, puede ser utilizado junto con otras técnicas como parte de un sistema inte-grado de control y ha de ser puesto en prác-tica integrándolo con los métodos y con las

estrategias de producción existentes actual-mente. El control biológico depende de un funcionamiento efectivo del microorganismo antagonista apropiado para cada ecosistema particular planta-patógeno (Pérez, 2004).

Concepto de Control Biológico

Pérez (2004), define el control biológico como la utilización de microorganismos naturales o modificados, para reducir los efectos de orga-nismos indeseables, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de los microorganismos beneficiosos para las plantas. Microorganismos antagonistas como agentes de biocontrol en enfermedades de las plantas.

Varios tipos de microorganismos (hongos, bacterias y virus) se han descrito como agen-tes de control biológico de enfermedades en cultivos. Prácticamente todas las plagas y en-fermedades son afectadas en alguna medi-da por organismos antagonistas. En muchos casos estos entes biológicos representan el factor más importante en la regulación de las poblaciones de microorganismos fitopatóge-nos en la naturaleza (Pérez, 2004; Ezziyyani et al., 2006; Mondino y Vero, 2006).

Mecanismos de acción

En la naturaleza existe una continua inte-racción entre los microorganismos fitopató-



genos y sus antagonistas, de forma tal que ellos ayudan a la regulación natural de las enfermedades. En condiciones naturales los microorganismos están en una proporción di-námica en la superficie de las plantas. No es fácil establecer con precisión los mecanismos que actúan en las interacciones entre los mi-croorganismos antagonistas y los microorga-nismos fitopatógenos sobre la planta.

En general los antagonistas tienen varios mo-dos de acción y la combinación de estos es importante para poder elegir un antagonista ideal. Si estos poseen diver-sos modos de acción, se re-ducen los riesgos de que los microorganismos fitopatóge-nos adquieran resistencia, lo cual se logra mediante el uso de combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción. Así, se han descrito varios mecanismos mediante los cuales los anta-gonistas ejercen su acción para controlar el desarrollo de microorganismos fitopatógenos (Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006; Ezziyyani et al., 2006).

Antagonismo

Es una interacción entre microorganismos donde uno interfiere con el otro, es decir cau-sa la pérdida o la actividad de uno de ellos. Esta es la base sobre la que se sustenta el verdadero control biológico de microorga-nismos fitopatógenos en las plantas (Pérez, 2004).

Antibiosis

Michel-Aceves (2001) y Pérez (2004) definen a la antibiosis como un proceso de interacción entre organismos en el cual uno o más meta-bolitos son excretados (enzimas hidrolíticas, metabolitos secundarios volátiles y pequeñas moléculas tóxicas) por un organismo y tienen efecto dañino sobre uno o más organismos, normalmente actúan en bajas concentracio-nes. Además, los antibióticos y otros produc-tos tóxicos que son volátiles (como el cianuro de hidrógeno), son capaces de afectar el cre-

cimiento de las células de los microorganis-mos fitopatógenos.

Competencia

La competencia surge cuando al menos dos organismos requieren para su funcionamien-to del mismo alimento. El consumo de uno reduce la cantidad disponible del otro; al final se impone uno de ellos. La competencia por nutrientes y espacio dentro de su nicho eco-lógico se realiza en la superficie de la hoja, es el principal mecanismo involucrado en el

control de bacterias fitopató-genas; en el caso de hongos es variable. La competencia es un modo de acción indi-recto (Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006).

Fungistasis

Es la imposición por parte del controlador biológico de dormancia especialmente de es-poras fungales por medio de la limitación de nutrientes. La más común de esta, es la re-lacionada con la disponibilidad de elementos nutritivos, el más estudiado hasta el momento el carbono (Pérez, 2004).

Resistencia sistémica adquirida

Consiste en una o varias moléculas excreta-das por los microorganismos controladores biologicos con la capacidad de inducir au-todefensas en las plantas frente a la acción del cualquier microorganismo fitopatógeno. Existen dos tipos de resistencia: la constitu-tiva, propia de la planta y que se expresa en cualquier momento, y la inducida, expresada solo ante determinados estímulos. Las inte-racciones planta-patógeno son de dos tipos: compatible, cuando ocurre la enfermedad, e incompatible, cuando la planta resiste.

De ahí se sustenta la teoría del gen para el gen, la cual dice que la resistencia de las plantas a las enfermedades frecuentemente resulta de la interacción específica de genes de resistencia (R) de las plantas con los co-

Varios tipos de microorganis-mos (hongos, bacterias y virus) se han descrito como agentes de control biológico de enfermeda-des en cultivos.



rrespondientes genes de avirulencia (Avr) de los patógenos.

Algunos de los procesos bioquímicos y fisio-lógicos asociados con la resistencia gen por gen son la generación de especies reactivas de oxígeno, la producción de oxido nítrico, la producción de compuestos antimicrobianos, la peroxidación de lípidos, el flujo de iones, y la inducción de genes de defensa, entre otros. (Pérez, 2004; Mondino y Vero, 2006).

Micoparasitismo

Es la acción antagónica entre dos hongos, el uno (hiperparásito) parasita al otro (micopará-sito) a través de una síntesis de exoenzimas hidrolíticas para facilitar la degradación de la pared celular del hospedante. Un antagonis-ta puede utilizar a un hongo como fuente de alimento. Basado en el micoparasitismo se dividen en dos grupos: biotrópicos, tienen un rango restringido de hospedantes, y necro-trópicos, matan a la célula antes o después de la invasión, excretan sustancias tóxicas y utilizan sus nutrientes (Michel-Aceves, 2001; Pérez, 2004).

Microorganismos antagonistas como con-troladores biológicos de enfermedades

Trichoderma sp.

Varias investigaciones han demostrado que el control biológico a través del uso de hongos benéficos como Trichoderma es una alterna-tiva potencial respecto al uso de fungicidas o fumigantes en la agricultura (Paredes-Esca-lante et al., 2009).

Agrios (2005), afirma que el género Tricho-derma comprende un conjunto de especies sin fase sexual evidente (anamorfo). Pertene-ce a la Subdivisión Deuteromycotina; Clase Hyphomycetes; Orden Hyphales (Moniliales) y Familia Moniliaceae. Hasta el momento no se conoce que dicho hongo sea patógeno de ninguna planta, exceptuando a T. viride. Sin embargo es capaz de controlar e hiperparasi-tar muchos hongos, nematodos y otros fitopa-tógenos, que atacan y destruyen los cultivos

(Cueva, 2007). Actualmente se conoce las siguientes especies del género Trichoderma: T. aggressivum, T. álbum, T. arundinaceum, T. asperellum, T. atroviride, T. aureoviride, T. bre-vicompactum, T. citrinoviride, T. citrinoviridex, T. crassum, T. erinaceum, T. fasciculatum, T. fertile, T. gamsii, T. ghanense, T. hamatum, T. harzianum, T. koningii, T. koningiopsis, T. lon-gibrachiatum, T. lignorum, T. minutisporum, T. oblongisporum, T. ovalisporum, T. pleurotico-la, T. polysporum, T. pseudokoningii, T. pub-escens, T. reesei, T. saturnisporum, T. spirale, T. strictipile, T. strigosum, T. stromaticum, T. tomentosum, T. virens, T. viride, T. virides-cens. (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007; Co-bos, 2010; Samuels et al., 2010).

El género Trichoderma es un grupo de hon-gos aislados del suelo que se reproducen asexualmente. Además, es un hongo fila-mentoso anamórfico, heterótrofo, aerobio fa-cultativo, con una pared celular compuesta de quitina, de rápido crecimiento. De conidióforo hialino muy ramificado no verticilado, fiálides individuales o en grupos, conidios hialinos de una célula, ovoides, nacidos en pequeños racimos terminales. Muchas cepas crecen eficientemente en medios sólidos o líquidos y en un amplio rango de temperaturas, ade-más son relativamente tolerantes a humeda-des bajas y tienden a crecer en suelos ácidos (Michel-Aceves, 2001; Cruz, 2007).

Los mecanismos de acción antagonista con que actúa frente a los hongos fitopatógenos son: competencia por espacio y nutrientes, micoparasitismo, antibiosis, la secreción de enzimas y la producción de compuestos inhi-bidores (Infante et al., 2009). Ezziyyani et al. (2004) manifiestan que T. harzianum controla a Phytophthora capsici, agente causal de la podredumbre de pimien-to, aumentando los niveles de enzimas hidro-líticas β-1,3-glucanasa (lisis enzimática), ejer-ciendo una mayor competencia por espacio y nutrientes e interacciona directamente con el microorganismo fitopatógeno (micoparasitis-mo), todo lo cual juega un rol importante en la reducción y destrucción del microorganis-mo fitopatógeno. Además, los géneros de T.



harzianum y longibrachiatum han demostra-do efectividad al reducir in vitro hasta un 65 % las enfermedades causadas por Alternaria solani Sorauer y Phytophthora infestans Mont de Bary en tomate. También se ha demostra-do que las especies del género Trichoderma controlan una amplia gama de hongos pa-togenos y dentro de ellos se encuentran los hongos fitopatógenos, tales como: Fusarium oxysporum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia so-lani, Fusarium sp, Paracercospora fijiensis, Rhyzopus stolonifer, Mucor spp., Penicillium digitatum, Aspergillus niger y Pythium sp., Al-ternaria sp., entre otros (Michel-Aceves et al., 2008; Cholango, 2009; Guédez et al., 2009; Guilcapi, 2009; Infante et al., 2009).

Bacterias como controladores biológicos de enfermedades

Las bacterias forman parte de la gran cantidad de microorganismos biológicos que existen como agentes de control de enfermedades fúngicas y bacterianas, tanto en la parte aé-rea como en la raíz de las plantas hospede-ras, y están presentes en la rizosfera, además favorecen el crecimiento y desarrollo de las plantas (Mondino y Vero, 2006). A este grupo de bacterias antagonistas de enfermedades se les deno-mina PGPB (Plant Growth Promoting Bacteria), es de-cir aquellas asociadas a las plantas que promueven el crecimiento de ellas. Dentro de los mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal podemos encontrar: mecanismos directos, son aquellos en donde los microorganismos actúan sobre la planta, dentro de ellos podemos encontrar a los promotores del crecimiento vegetal (auxi-nas, giberelinas y citoquininas), y mecanismos indirectos, aquellos en donde el microorganis-mo es capaz de inhibir diferentes microorga-nismo fitopatógenos (hongos y bacterias) que interfieren con el desarrollo de la planta y son neutralizados por diversos mecanismos como: competencia por espacio o nutrientes, produc-ción de metabolitos y antibióticos, secreción

de diversas enzimas hidrolíticas que degradan la pared celular de los microorganismo fitopa-tógenos, producción de sideróforos (los produ-cidos por estas bacterias tienen mayor afini-dad por compuestos de hierro) y el incremento de la capacidad de respuesta sistémica de la planta frente a los microorganismo fitopatóge-nos. Dentro de este grupo se puede mencio-nar a las Pseudomonas (aeruginosa, fluores-cens, putida), Bacillus y Burkholderia, que son las más usadas en el control de enfermedades en plantas (Mondino y Vero, 2006; Gato, 2006; Rodríguez et al., 2009).

Bacterias del género Pseudomonas

Las rizobacterias del género Pseudomonas han sido estudiadas como importantes agen-tes de biocontrol por su capacidad de inhibir el crecimiento de ciertos microorganismos fitopatógenos, como bacterias, hongos, ne-matodos y virus, los cuales pueden llegar a reducir considerablemente la producción de cultivos. Estos organismos ejercen ciertos mecanismos de acción antagonista que invo-

lucran la producción de com-puestos bacterianos como: sideróforos, ácido cianhídri-co y antibiótico. Además, se ha comprobado que indu-cen un sistema de resisten-cia en las plantas que hace que puedan tolerar el ataque de diversos microorganis-mo fitopatógenos del suelo (Chaves, 2007). P. fluores-cens es un cocobacilo Gram negativo que se encuentra

como saprófito en el suelo y es ampliamen-te conocido por ser una PGPR. Abunda en la superficie de las raíces, y es versátil en su metabolismo, además puede utilizar varios sustratos producidos por ellas mismas, y no establecen una relación simbiótica con la planta. Entre sus mecanismos de acción se encuentran el aumento de la toma de agua y nutrientes por la planta, la solubilización de fosfatos, la producción de reguladores del crecimiento vegetal y el control biológico de microorganismo fitopatógenos, la producción

Las bacterias forman parte de la gran cantidad de microorganis-mos biológicos que existen como agentes de control de enferme-dades fúngicas y bacterianas, tanto en la parte aérea como en la raíz de las plantas hospederas, y están presentes en la rizosfera, además favorecen el crecimiento y desarrollo de las plantas.



de sideróforos, la antibiosis y la inducción de resistencia a la planta, mediante la produc-ción de ácido salicílico, el cual actúa como una molécula de señalización que activa la “resistencia sistémica inducida” (RSI) (Gato, 2006; Rodríguez et al., 2009).

La especie P. aeruginosa fue aislada por pri-mera vez de muestras ambientales. Debido a que las colonias son pigmentadas, tiene el color característico de azul-verdoso hidroso-luble debido a la producción de pigmentos. Además, es un bacilo Gram negativo aerobio, muy versátil metabólicamente, pudiendo uti-lizar más de 80 compuestos orgánicos como fuentes de carbono y energía. Es oxidasa po-sitiva y puede crecer a temperaturas superio-res a 42 °C. Dicha bacteria produce toxinas como la piocianina, puede colonizar una am-plia variedad de cultivos y ser antagonista de diversas enfermedades fúngicas (Gato, 2006; Ruiz, 2007).

Bacterias del género Bacillus

El género Bacillus se caracteriza por ser bac-terias Gram positivas, no patogénicas, con propiedades antagonistas, son de forma ba-cilar, aerobias estrictas o anaerobias faculta-tivas, en condiciones estresantes forman una endospora que es termorresistente a los fac-tores físicos (desecación, radiación, ácidos y desinfectantes químicos), es decir tiene la capacidad de formar esporas que sobreviven y permanecen metabólicamente activas bajo condiciones adversas. (Lisboa, 2003; Cha-ves, 2007; Rodríguez y Martín, 2009).Muchas especies producen enzimas hidro-fílicas extracelulares que descomponen los polisacáridos, ácidos nucleicos y lípidos, per-mitiendo que el organismo emplee estos pro-ductos como fuentes de carbono y donadores de electrones. También producen antibióticos (bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidi-na y circulina), lipopéptidos que actúan como biosurfactantes y solubilizadores de fosfatos, son buenas secretoras de proteínas y meta-bolitos, fáciles de cultivar y altamente eficien-tes para el control de plagas y enfermedades. Los mecanismos de acción de Bacillus como antagonista de enfermedades fúngicas y bac-

terianas son: competencia por espacio y nu-trientes, antibiosis, inducción de resistencia, y promotores del crecimiento de las plantas (Chaves, 2007; Rodríguez y Martín, 2009). Bacterias del género Burkholderia

El género Burkholderia está compuesto por: bacilos rectos; Gram negativos; oxidasa y ca-talasa positivos; con una proporción de G+C que oscila entre el 59 y el 69,5 %. Son bacte-rias móviles con un flagelo polar único o bien con un penacho de flagelos polares según las especies. También son mesófilos y no espo-rulados. Su metabolismo es aerobio y muy versátil. Como sustancia de reserva utilizan el polihidroxibutirato (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009).

Burkholderia cepacia fue descubierta por Walter Burkholder en 1949 en las catáfilas de cebolla y en su epidermis radicular. La iden-tificación y clasificación de la B. cepacia es extremadamente complicada; se conoce aho-ra como un “complejo Burkholderia cepacia” y está compuesto por al menos 9 especies distintas que constituyen los denominados “genomovars” o genotipos: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. vietnamien-ses, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina y B. pyrrocinia; con la excepción de B. mallei y B. pseudomallei, las que son patógenas de animales y humanos. El género Burkholderia ecológicamente es saprófito, es decir que in-terviene en el reciclaje de materia orgánica, además es uno de los géneros bacterianos utilizados para biorremediación de herbicidas y plaguicidas recalcitrantes, como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos y para promover el crecimiento de las plantas (Stoyanova et al., 2007; Parra, 2009).

Parra et al., (2009) y Trujillo et al., (2007) quienes exponen la actividad antifúngica de B. cepacia aislada del maíz amarillo, lograron inhibir la esporulación de los hongos como F. solani, F. moniliforme, F. oxysporum, Aspergi-llus niger, Penicillium expansum, A. alternata y Curvularia sp., además indican que esta bac-teria produce sustancias químicas quinolisidí-nicas de naturaleza antibiótica, y antibióticos



como: A. cepacidina, B. xilocandina y pirrol-nitrina, capaces de inhibir el desarrollo de di-versos hongos fitopatógenos. En Venezuela se ha utilizado la bacteria B. cepacia en con-trol de enfermedades en especies forestales como la mancha azul en Pinus caribae cau-sada por Lasiodiplodia theobromae; también muchas especies del complejo B. cepacia se han utilizado en biorremediación ambiental por su capacidad de degradar plaguicidas recalcitrantes. (Alemán et al., 2003, Benítez y McSpadden, 2008). Un aspecto importante a señalar sobre esta bacteria es: la capaci-dad de inhibir a hongos entomopatógenos y a antagonistas como Beauveria bassiana y Trichoderma harzianum, por lo que se debe tener cuidado si se usa en combinación para un programa de Manejo Integrado de Plagas. (Santos et al., 2004; Parra, 2009).Sustancias naturales: Quitosana

La Quitosana es un producto obtenido de la desacetilación alcalina de la quitina, que es el principal componente del exoesqueleto de crustáceos como el camarón y el cangrejo. Las propiedades antimicrobianas de la Qui-tosana eran conocidas por el hombre desde la antigüedad, por lo cual la usaban como ci-catrizante de heridas. El uso en la agricultura comenzó su auge en la década de los setenta, aunque actualmente se siguen descubriendo otros usos de este compuesto (Lárez, 2008; Porras et al., 2009).

Son muchos los resultados exitosos de la uti-lización de Quitosana, así podemos mencio-nar los experimentos de Sánchez-Domínguez et al., (2007) quienes estudiaron el efecto in vitro de Quitosana en el desarrollo y morfo-logía de Alternaria alternata en tomate, y ob-tuvieron reducción del grado de inhibición y crecimiento de este hongo en un 50,6 %. La Quitosana en los últimos años se ha demos-trado tener un efecto negativo contra diversos hongos fitopatógenos. Esto dependerá del grado de polimerización, de acetilación, na-turaleza del hospedante, composición de los nutrientes, condiciones del medio ambiente y período de incubación; además, mientras menor sea el grado de polimerización de la Quitosana menor será el número de especies

de hongos que controle (Porras et al., 2009).

Lárez (2008) y Fernández (2010) reportan que la Quitosana tiene diversas propiedades como: actividad antibacteriana (controla un gran número de bacterias Gram negativas mediante la interacción electrostática con di-ferente grado de acetilación), actividad anti-fúngica (controla las enfermedades como: Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioi-des, Fusarium solani, Phytophthora capsici, Pythium debaryanum y Sclerotium rolfsii) y actividad antiviral (una solución acuosa 0,1 % de Quitosana controla completamente la in-fección en hojas de frijoles producida por el virus del mosaico de la alfalfa (AMV), el virus de la necrosis del tabaco (TMV), virus del no crecimiento del maní, virus del mosaico del pepino y el virus X de la papa.

Asimismo se ha demostrado la inhibición del viroide que afecta a las solanáceas, denomi-nado potato spindle tuber viroid. Además de ser antagonista de diversos microorganismo fitopatógenos en plantas, se ha señalado que Quitosana estimula el crecimiento de la plan-ta e induce a la resistencia frente al ataque de microorganismo fitopatógenos (Lárez, 2008; Rodríguez-Pedroso et al., 2006).

CONCLUSIONES

La presencia de residuos tóxicos en los ali-mentos debido a la utilización de productos químicos en la agricultura, hace que los mi-croorganismos antagonistas como: Tricho-derma sp., Pseudomonas aeruginosa, P. fluo-rescens, Bacillus y Burkholderia. A pesar que el uso de los biocontroladores es promisorio, es necesario estudiar en detalle los patosis-temas desde el punto de vista molecular para hacer una mejor proyección del controlador que seria efectivo en cada caso.

Por ello el Centro de Biotecnología de la Uni-versidad Nacional de Loja, está desarrollando el proyecto titulado “ESTUDIO DE LAS IN-TERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DE-SARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO



(Vasconcellea helbornii var. pentagona)”, con el objetivo de estudiar este patosistema entre microorganismos desde el punto de vis-ta molecular, para ello se utilizará técnicas de Secuencia Genómica de Nueva Generación, para mayor información referirse a la sección de resumen proyectos de investigación en la pagina 76.

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MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓNLYCOPERSICON

María Natalia Morales Palacio1

1. Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja, Ciudad Universitaria Guillermo Falconí Espinosa “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S” E-mail: [email protected]____________________________________________________________________________

RESUMEN

La hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico es el tomate riñón (Solanum lycopersicum). Esta situación ha despertado desde hace mas de una década, enorme interés en científicos de todo el planeta. La genética molecular ha tenido un impacto significativo en la estimación de su diversidad genética, en la determinación de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la sección Lycopersicon, así como en la generación de marcadores moleculares que han asistido a los genetistas, en la mejora genética de los cultivos comerciales. Ha sido generada para su estudio, abundante información para muchos de los marcadores de ADNc mapeados, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consen-sus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multilocus para determinar los efectos de la subdivisión de especies estrechamente emparentadas, se han diseñado primers específicos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genómico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad científica cuenta con basta información sobre el genoma, así como con el grado de filiación de las diferentes especies silvestres relacionadas genéticamente pertenecientes a la sección Lycopersicon.



Palabras clave: Tomate, Solanum, Lycopersicon, Filogenie, Genética, Marcador, Especie, Silves-tre____________________________________________________________________________

ABSTRACT

Tomato (Solanum lycopersicum) is the most important vegetable around the world and it has a very high economic value. This situation has caused too much interest for investigation in scientist around the entire. Molecular genetics has had a significant impact for the estimation of genetic diversity, in the phylogeny studies from wild species of Lycopersicon section, and from generation of molecular markers which have been used by geneticist in order to be attended from the genetic improvement of the tomatoes cultivars. Has been generated for tomato studies, a long informa-tion for many of the mapped cDNA markers, which have been joined into the General Index in To-mato Institute for Genomic Research, has made the mapping of cDNA markers, multilocus tests in order to determine the effects of the subdivision of closely related species, has been designed specific primers based on published data about cDNA or genomic DNA sequences, the amplified products were sequenced and generated new sequences, and joined in the Gene Bank Databa-se. In this moment, the entire scientific community has enough information about the genome, as well as the level of relationships between genetically related wild species belonging to the section Lycopersicon.

Key words: Tomato, Solanum, Lycopersicon, Phylogeny, Genetics, Marker, Wild____________________________________________________________________________

PROBLEMÁTICA

El tomate riñón (Solanum lycopersicum), es la hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico, por lo que su cultivo, producción y comercio, se han in-crementado en los últimos años; por ello, el principal objetivo de los mejoradores ha sido el de obtener variedades híbridas mejoradas que presenten resistencia a factores bióticos y abióticos, mayor productividad y mejor cali-dad del fruto.

En el Ecuador, el tomate se cultiva en dos re-giones. En el litoral se cultiva principalmente el tomate industrial, registrándose en el 2008 un total de 1023 ha cultivadas y una produc-ción de 15323 Tm; mientras que en los valles cálidos de la región interandina se cultiva ma-yoritariamente tomate de mesa, con 1586 ha cultivadas y una producción de 35151 Tm en ese mismo año. El total de tomate producido a nivel nacional en el 2008 fue 2610 Ha cul-tivadas, con una producción de 50551 Tm [1].

En el extremo Sur oriental de la región Inte-

randina (provincia de Loja), su cultivo cons-tituye una importante forma de ingresos para pequeños y medianos productores, sin em-bargo a nivel regional su producción es muy deficiente y se ha ido decrementando paulati-namente, de manera que en el año 2004 aquí se producía el 34,8% de tomate de la región y en el año 2008 solamente el 4,7%. [1]

La baja productividad de éste agroecosiste-ma, se debe principalmente a que con el inicio de la explotación petrolera en el Amazonas, el Ecuador experimentó un auge económico que aceleró la modernización de su agricul-tura en la zona costera del Pacífico, basada en el alto uso de insumos. [2] La agricultura tradicional de la serranía, también fue influen-ciada por esta tendencia de modernización, donde los pequeños agricultores de la Sierra producen productos para el autoconsumo y el mercado local, con el empleo exagerado de agroquímicos, particularmente, con hortalizas económicamente rentables como el tomate; por lo que , el fácil acceso a los plaguicidas, la poca capacitación sobre su uso seguro y el uso de variedades mejoradas para las con-diciones de los países donde se producen,



ha provocado la difusión del uso incorrecto de estos productos en Ecuador, además del efecto negativo en la calidad de los frutos, la salud de los consumidores y productores el medio ambiente y los sistemas agrícolas.

INTRODUCCIÓN

El Ecuador es mundialmente conocido por su flora y fauna únicas y posee una enorme variabilidad genética en varias especies de interés económico y social para el país. Nu-merosas especies silvestres de la sección Lycopersicon en las cuales reside toda la variabilidad genética disponible y que están emparentadas a las varieda-des cultivadas de tomate, se encuentran abundantemen-te distribuidas en las estri-baciones de los Andes del Ecuador: (Solanum pimpi-nellifolium, S. habrochaites, S. lycopersicum var. cera-siforme, S. cheesmanii, S. chmielewskii, S. chilense, S. neorickii, S. peruvianum, S. pennellii). [3]

El enorme interés económico mundial sobre estas especies ha ocasionado que se hayan potencialmente utilizado para el mejoramien-to genético de las variedades cultivadas, por poseer características interesantes para el mejoramiento tales como tolerancia a la hu-medad, resistencia a hongos e insectos, po-dredumbre de las raíces, mejora del color de los frutos, tolerancia a la sal, alto contenido de azúcar, tolerancia al frío y heladas, resis-tencia a la sequía; alto contenido de licopeno, etc. [3] Sin lugar a dudas, en las últimas décadas la genética molecular ha tenido un impacto sig-nificativo en la estimación de la diversidad ge-nética de las especies, en la determinación de la filiación genética, en la búsqueda de genes responsables de caracteres agronómicos de interés; así como, en la generación de marca-dores moleculares que han permitido asistir a los genetistas, en la mejora genética de los cultivos comerciales. El tomate riñón, siendo

una hortaliza de consumo masivo, posible de cultivar prácticamente en todos los países del mundo y casi en todas las latitudes, justifica el hecho de que haya despertado profundo inte-rés en científicos de todo el mundo, quienes han generado información en el campo mole-cular sobre las especies silvestres, las cuales constituyen el pool de genes para el mejora-miento de los cultivares comerciales.

Así por ejemplo, un estudio publicado en 1996, mediante el empleo de cerca de 2000 secuencias de especies de solanáceas re-gistradas en el EMBL y la base de datos del Banco de Genes, se encontraron 220 regio-

nes microsatélite “STRs” (Short Tándem Repeats) en la familia Solanaceae y 80 regiones microsatélite en el género Lycopersicon. Las repeticiones dinucleotídicas fueron encontradas en re-giones no codificantes del ADN, mientras que las repe-ticiones trinucleotídicas fue-ron predominantemente en-contradas en los exones del ADN. De las 80 regiones mi-

crosatélite del género Lycopersicon, escogie-ron 44 loci, identificando 36 pares de primers que mostraron fragmentos legibles o grupos de fragmentos en cultivares de L. esculentum y otras especies de Lycopersicon. Encontra-ron 29 bandas polimórficas para 4 especies de Lycopersicon y 10 pares de primer resul-taron polimórficos en 7 cultivares de tomate.

El porcentaje de loci polimórficos entre culti-vares varió desde el 6% en los loci más pe-queños, hasta 60% en los grupos con número de repeticiones mayores, sin embargo entre especies, encontraron hasta un 83% de po-limorfismo. En el trabajo se reportan entre 2 y 4 formas alélicas diferentes, aunque en unos pocos casos encontraron más de 8 for-mas alélicas distintas; por lo que, mediante el estudio se presentan loci microsatélites útiles para distinguir entre cultivares de tomate que se encuentren genéticamente estrechamente relacionados unos con otros. [4]

Un estudio publicado en 1996, mediante el empleo de cerca de 2000 secuencias de especies de solanáceas registradas en el EMBL, y la base de datos del Banco de Genes, se encontraron 220 regiones microsatélite en la familia Solanaceae y 80 regio-nes microsatélite en el género Lycopersicon.



En un estudio posterior, publicado en el 2005, otros autores publican los resultados de un estudio multilocus con el cual evalúan los pa-trones de polimorfismo de nucleótidos dentro y entre tres especies autoincompatibles de tomates silvestres (Clado Lycopersicon) es-trechamente relacionadas. Basados en los datos de secuencias de ADN para 13 loci nu-cleares, encontraron que la especiación ocu-rrió bajo un flujo de genes residuales, lo que implica a la selección natural, como una de las fuerzas de la evolución de conducir a la diversificación de los linajes de tomate. [5]

Las relaciones genéticas existentes entre las diferentes especies silvestres relacionadas con el tomate cultivado habían sido hasta el momento estudiadas por diversas técnicas como los RFLPs (restriction fragment length polymorphisms), ADN mitocondrial, ADN nu-clear y cloroplástico; regiones microsatélites, isoenzimas, ITS (secuencias de genes de transcritos espaciadores internos) o de ADN ribosómico nuclear, SNPs (single copy nu-clear polymorphism), GBSSI (granule-bound Starch Synthase gene), datos morfológicos, etc. En el 2005, se publican los resultados de un estudio en el que se emplean marcadores de tipo AFLPs, pero que además compara los resultados obtenidos, con aquellos generados previamente por diferentes técnicas. El estu-dio considera 10 especies de tomate silvestre, incluyendo el recientemente descrito en ese entonces S. galapagense, con una concen-tración en la mayoría de especies variables y distribuidas de S. peruvianum. Los datos generados mediante AFLPs, resultan larga-mente concordantes con aquellos generados con el GBSSI y los datos morfológicos; y, en general apoyan los resultados publicados por C.M. Rick; sin embargo, demuestran la distin-ta naturaleza de las poblaciones del norte y el sur del Perú (S. peruvianum) o sugieren que la taxonomía necesita una revisión. Solanum ochranthum es mantenido como hermano de las especies silvestres de tomate y S. habro-chaites y S. pennellii se ubican en el clado del tomate. [6]

Posterior al trabajo antes descrito y durante el mismo año, se reportan dos nuevas especies de tomate silvestre (Solanum arcanum y S. huaylasense) segregadas de Solanum peru-vianum. Estas dos especies se ubican en el clado con otros dos segregantes de S. peru-vianum (S. peruvianum sensu stricto y S. cor-neliomulleri) y junto a la morfológicamente si-milar (S. chilense). En la publicación además presentan una lista de todas las 13 especies de tomate silvestre reconocidas y sus equiva-lentes nombres en la sección Lycopersicon. [7]

En el 2007 se publican los resultados de la se-cuenciación de ocho loci nucleares no ligados en 4 poblaciones de dos especies relaciona-das (Solanum peruvianum y S. Chilense), con un total evaluado de 40 a 46 alelos por locus y por especie. Tanto el polimorfismo como la di-versidad nucleotídica para cada locus y cada población fueron cuantificadas, reportándose que la mayoría de los loci y de las poblacio-nes muestran polimorfismo. El mayor nivel de polimorfismo lo encontraron en las poblacio-nes de S peruvianum del norte peruano, res-pecto de las poblaciones del sur. En cuanto a Solanum chilense, tres poblaciones muestran comparables niveles de diversidad, mientras que otras 2 muestran una diversidad tan alta como las que encontraron en S. peruvianum. En el trabajo reportan que ambas especies mostraron gran variación de nucleótidos y proponen que la estructura de la población es una de las más importantes fuerzas de la evolución dentro y entre poblaciones en estos tomates silvestres. [8]

En el 2008, se publica un estudio sobre ge-nética de poblaciones en dos especies de tomate silvestre estrechamente relacionadas (S. peruvianum y S. chilense) pertenecientes a la sección Lycopersicon, colectadas en el centro y el sur del Perú; para ello realizan una secuenciación multilocus que les permite ge-nerar patrones de polimorfismo y divergencia en estas especies de tomate silvestres muy relacionadas. En el estudio focalizan múltiples poblaciones de las dos especies, escogiendo un subset de loci previamente analizados en trabajos iniciales (Roselius et al 2005; Stadler



et al 2005; Tanksley et al 1992). Los resulta-dos que obtienen sugieren que la especiación ocurrió bajo flujo genético residual, lo cual im-plica que la selección natural es una de las fuerzas evolutivas que maneja la divergencia de estas dos especies de tomate (tiempo de divergencia igual o menor a 0,55 millones de años). [9] Tal inferencia es fuertemente con-sistente con lo reportado por investigadores en trabajos previos, como los anteriormente citados.

La población ecuatoriana de especies silves-tres del grupo Lycopersicon había estado es-casamente representada en estudios previos, hasta que un grupo de investigadores publi-can en el 2008 los resultados de un estudio de estructura poblacional en una especie silvestre propia de las áreas costeras del Perú y Ecuador; y, que ha sido fuente para la generación de muchas va-riedades comerciales (So-lanum pimpinellifolium). Su variación fue detectada en 10 regiones microsatélites y analizaron 248 plantas representativas del área entera de distribución, con énfasis en la población ecuatoriana. En el estudio se reportan gran-des diferencias genéticas en las dos pobla-ciones; así, las poblaciones peruanas no pre-sentan estructura genética, mientras que las ecuatorianas se encuentran geográficamente parchadas. Los autores señalan que una po-sible causa de esta diferencia podría ser la naturaleza no uniforme del clima ecuatoriano, ya que encontraron una importante correla-ción entre la estructura genética y el clima. Por otro lado, las poblaciones ecuatorianas y del sur peruano presentan baja diversidad genética y alta heterocigosidad, posiblemente debido a la alta autogamia, pequeño tamaño de las poblaciones y formación de cuellos de botella. El extremo de casi ninguna diversidad genética lo presentan las poblaciones de las Islas Galápagos, a causa posiblemente de una reciente colonización desde regiones del Guayas y Los Ríos continental, donde encon-traron plantas genéticamente idénticas. [10]

Durante el siguiente año, se publica un es-tudio el cual señala que en general, tanto la clasificación como la filogenia de las especies que pertenecen a la sección Lycopersicon es compleja debido a la ausencia de un consen-sus que sea ampliamente aceptado; además, señala que estas especies divergieron re-cientemente y que aún están estrechamente relacionadas al punto en que en algunos ca-sos son incluso capaces de hibridarse inte-respecíficamente, lo cual disminuye aun más el poder diferenciar la variación intra e inte-respecífica. El estudio permitió dar solución a los problemas antes mencionados, mediante el empleo de muchas accesiones que cubrie-

ron el rango natural de cada especie que emplearon. En el estudio utilizan para la clasificación y relación filo-genética la técnica de los AFLPs en dos secuencias de genes nucleares; en adi-ción para evitar los sesgos debido al método molecular empleado (AFLP), caracteri-

zan el material con dos secuencias de genes nucleares. Los datos obtenidos sugieren una clasificación similar a aquellos previamente propuestos por otros autores, así como al-gunos cambios significativos. En el estudio se reconocen y distinguen doce especies; además, proponen que la especie S. corne-liomulleri es distinguible de S. peruvianum. En adición, los arboles obtenidos con ambas técnicas (secuencias y AFLPs) sugieren que S. arcanum podría representar un complejo de poblaciones compuesta de dos especies crípticas. Con la búsqueda de las relaciones filogenéticas entre especies, encuentran al-gunos grupos claros: Grupo Lycopersicon (S. pimpinellifolium; S. Lycopersicum; S. chees-maniae; S. galapagense) Grupo Arcanum: (S. chmielewskii; S. neorickii; S. Arcanum; S. huaylasense) Grupo Eriopersicon: (S. peru-vianum; S. chilense; S. penellii; S. habrochai-tes); y, no incluido en ningún grupo, pero es-trechamente relacionado S. lycopersicoides. [11]

Las poblaciones ecuatorianas y del sur peruano presentan baja diversidad genética y alta hete-rocigosidad, posiblemente debi-do a la alta autogamia, pequeño tamaño de las poblaciones y for-mación de cuellos de botella.



CONCLUSIONES

El tomate riñón es la principal hortaliza que se cultiva y se consume alrededor del planeta entero y su cultivo y producción denota gran importancia económica para sus productores. Las especies silvestres emparentadas al to-mate cultivado, son portadoras de un sinnú-mero de genes de interés agronómico, por lo que estas han constituido por décadas, la fuente de genes para el mejoramiento gené-tico de las variedades comerciales que han sido lanzadas al mercado, de manera que al momento existe una enorme cantidad de fenotipos que se comercializan (frutos rojos, amarillos, grandes, pequeños, acorazonados, ovalados, alargados, etc.), así como frutos con gran cantidad de sólidos solubles, me-jorados para la industria (salsas, jugos, etc.), plantas con ciclos de cultivo más cortos, con tipo de crecimiento determinado, resistentes a factores bióticos (hongos, insectos, bacte-rias) como a factores abióticos (sequías, hela-das, salinidad del suelo, etc.). Tal situación ha sido posible por supuesto al enorme interés que ha despertado su investigación en cien-tíficos de todo el mundo, quienes han gene-rado numerosos estudios sobre las especies de la sección Lycopersicon, de manera que al momento se cuenta con enorme cantidad de información, ya sea publicada en artículos científicos, así como información ingresada en las bases de datos del Banco de genes y que están disponibles para la comunidad en general; así mismo su estudio ha permitido establecer en forma clara la relación filogené-tica que existe entre estas especies estrecha-mente emparentadas..

REFERENCIAS

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10. Zuriaga E, Blanca JM, Cordero L, Sifres A, Blas-Cerdán WG, Morales R, Nuez F (2008) Genetic and bioclimatic variation in Solanum pimpinellifolium. Genet Resours Crop Evol. Doi: 10.1007/s10722-008-9340-z.

11. Zuriaga E, Blanca JM, Nuez F (2009) Classification and phylogenetic relations-hip in Solanum section Lycopersicon ba-sed on AFLP and two gene sequences. Genet Resours Crop Evol 56:663-678



NANOESTRUCTURAS POLIMÉRICAS PARA LA DETECCIÓN DE ADN

Iván Burneo Saavedra1,

Programa de Máster en Nanociencia y NanotecnologíaCentro de BiotecnologíaUniversidad Nacional de Loja

Supervisores: Olivier Henry1*, Ciara K. O’Sullivan1*, ‡1Nanobiotechnology and Bioanalysis Group, Department of Chemical Engineering, Universitat Rovira I Virgili, Avinguda Paısos Catalans, 26, 43007, Tarragona, Spain, ‡ Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats, Passeig Lluıs Companys 23, 08010 Barce-lona, Spaine-mail: [email protected], [email protected]____________________________________________________________________________

RESUMEN

El desarrollo de nuevos métodos de detección sigue siendo un tema de investigación muy activo en el campo de los biosensores ópticos o electroquímicos. La perspectiva de un análisis rápido requie-re el procesamiento y manejo de las muestras en pocos pasos; esto unido a una detección rápida permitiría diagnósticos más económicos y la obtención de resultados más rápidamente. El uso de filmes nanoestructurados en biodetección es una herramienta versátil para desarrollar y satisfacer los requerimientos de tamaño de muchas tecnologías lab-on-a-chip. Para lograr este objetivo, se preparó films de block-copolímeros que contienen espacios cilíndricos sobre sustratos de oro, producidos por



revestimiento por centrifugado, mediante eliminación de la fase de poli(metil-metacrilato) (PMMA) de la capa de poli(estireno-b-metilmetacrilato) (PS-b-PMMA), usando el método de degradación UV y grabado químico con ácido acético. Las condiciones de la operación de revestimiento por centrifuga-ción fueron optimizadas para preparar filmes de 10-20 nm de espesor, medido por reflectometría de Rayos X. La morfología de las películas fue caracterizada mediante microscopia de fuerza atómica (AFM) y las técnicas electroquímicas tales como voltametría cíclica y espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) se usaron para evaluar el comportamiento electroquímico de los electrodos na-noestructurados resultantes para la fabricación de sensores electroquímicos de ADN.

Palabras clave: Diblock copolímeros, nanoporos, bisoensores electroquímicos de ADN.____________________________________________________________________________

ABSTRACT

The development of new detection methods remains a very active research topic in the field of optical and electrochemical biosensors. The prospect of a rapid analysis requires processing and handling of samples in a few steps, and this coupled with rapid screening diagnoses would enable a more economic and obtain results faster. The use of nanostructured films in biosensing is a ver-satile tool to develop and meet the re-quirements size of many lab-on-a-chips. To achieve this goal, we prepared films of block-copolymers containing cylindrical spaces gold substrates produced by spin coating, by eliminating the phase of poly (methyl methacrylate) (PMMA) layer of poly (styrene-b-methyl methacrylate) (PS-b-PMMA), using the method of UV degradation and etching with acetic acid. The conditions of the coating operation by centrifugation were optimized to prepare films of 10-20 nm thickness, measured by X-ray reflectometry The morphology of the films was characterized by atomic force microscopy (AFM) and electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used to evaluate the electrochemical behavior of nanostructured electrodes resulting in the manufacture of electrochemical sensors DNA.

Key words: Diblock copolymers, nanopores, DNA electrochemical bisoensozres.____________________________________________________________________________

1. INTRODUCCIÓN

La consecución de patrones nanoscópicos funcionales regulares y el control de estruc-turas superficiales a la escala nanométrica son esenciales para el desarrollo de super-ficies con propiedades nuevas y útiles[1, 2]. Los filmes porosos han sido usados para la fabricación de materiales nanoestructurados que tienen aplicaciones potenciales en ca-tálisis y nanolitografía, en electrónica, óptica y magnetismo, así como en biosensores [1, 3-5]. Los materiales nanoestructurados cons-tituyen nuevas plataformas para la detección biomolecular que pueden proporcionar una mayor sensibilidad y susceptibilidad a la mi-niaturización [4, 5]. Los nuevos métodos de modelado basados en “top-down”, incluyen varios enfoques litográficos que emplean UV, rayos X, interferencia, zone plane array, scan-

ning óptico de campo cercano, haz de iones focalizados, haz de electrones, dip-pen y na-no-impresión [6] para obtener nanoestructu-ras altamente ordenadas. Sin embargo, estas tecnologías siguen siendo caras y con limita-ciones intrínsecas. Como alternativa, la auto-organización de ma-cromoléculas es una técnica emergente, pro-misoria y flexible [2], que se caracteriza por la formación espontánea de dominios de escala nanométrica que exhiben un alto grado de or-denamiento [7]. En este sentido, los block copo-límeros (BCPs) son materiales ideales debido a la conectividad de las dos cadenas química-mente distintas en morfologías ordenadas con una escala de tamaño limitado por la dimensio-nes moleculares de las cadenas del polímero. Además, el tamaño y forma de los nanodomi-nios pueden ser convenientemente controlados simplemente cambiando sus pesos molecula-



res y su composición [6, 8]. Los filmes delga-dos nanoporosos de BCPs son el centro de una intense investigación debido a su alto impacto para fabricar matrices de alta densidad para el almacenamiento de datos, la electrónica, la se-paración molecular, la química combinatoria, o la detección de ADN [5, 9-11].Los blocopolímeros pueden ser considerados como dos o más fragmentos químicamente ho-mogéneos de polímeros, es decir, cadenas de homopolímeros, unidas por enlaces covalentes para formar macromoléculas más complejas tales como los copolímeros lineales, di-, tri, o multibloque, y arquitecturas no lineales como multibrazo, starblock o graft copolímeros [12].

Esquema 1. Representación de varias clases de BCPs y los nanodominios formados. Adaptado de Lazarri et al. [12].

Los enfoques para controlar la orientación de los microdominios de blocopolímeros incluyen el uso de vapores de solventes, campos eléctri-cos, sustratos químicamente modelados, grafo epitaxia, cristalización epitaxial, control de inte-racciones interfacial, gradientes térmicos y zone casting [13]. Una vez fundida, se producirá la separación de fases entre los distintos bloques lo que se traduce en la formación de dominios laminares o cilíndricos como se representa en el Esquema 1. El espesor del film, el tiempo y la temperatura de annealing pueden ayudar a controla la uniformidad y la orientación del las películas auto-organizadas, mientras que el peso molecular del polímero y la variación de la longitud del bloque controlan el tamaño y la separación de los diferentes dominios. [7,14]. Para la fabricación de nanoestructuras, se re-mueve, posteriormente, uno de los bloques usando plasma o grabado químico [15]. Los fil-

mes ultra delgados (<100 nm de espesor) de nanoelectrodos se prepararon por spin-coating de una capa de poliestireno-b-polimetil metacri-lato (PS-b-PMMA) sobre sustratos de oro. Bajo condiciones óptimas, los bloques se auto-orga-nizan para formar dominios cilíndricos perpen-diculares a la superficie. Los bloques de PMMA pueden ser grabados por simple exposición a luz ultravioleta y ácido acético para exponer la superficie de oro.

La razón principal para el uso de nanoelectro-dos es el beneficio obtenido por la transferen-cia de masa mejorada debido al dominio de la difusión radial, disminución de las corrientes de carga y reducción de los efectos deletéreos de-bidos a la resistencia de la solución [16]. Como el electrodo disminuye en tamaño, la difusión radial se vuelve predominante y dando como resultado un transporte de masa más rápido y mejor sensibilidad, tiempos de respuesta más rápidos, y respuestas independientes de con-vección en comparación con los electrodos de tamaño macro. [14, 16,17].

El uso de filmes porosos nanoestrucurados en biodetección aparece como una herramienta versátil para desarrollar y satisfacer los reque-rimientos de tamaño de muchas tecnologías lab-on-a-chip [6]. Los sensores de ADN basa-dos en nanomateriales pueden detector la pre-sencia de genes o la mutación de genes aso-ciados a enfermedades humanas hereditarias y pueden usarse directamente para el monito-reo directo de los eventos de hibridación [18]. Muchas técnicas que incluyen la fluorescencia, espectrometría de masa, electroquímica, es-pectroscopia de resonancia de plasmones de superficie y microbalanza de cristal de cuarzo, se han desarrollado para la detección de ADN [19]. Sin embargo, las técnicas electroquímicas ofrecen grandes ventajas debido a su simpli-cidad, rapidez, bajo costo y alta sensibilidad. Muchas metodología se han propuesto para el monitoreo electroquímico de la hibridización del ADN [19, 20] de acuerdo a como se haga la medición eléctrica, por ejemplo, voltametría, amperometría/culombimetría, o espectrosco-pia de impedancia [21, 22].



La espectroscopia de impedancia (EIS) se usa ampliamente en el campo de la investigación biomédica [23]. El potencial de la EIS se basa en que la impedancia del sistema puede ser escaneado en un amplio rango de frecuencias para determinar las propiedades electrónicas de las varias interfaces que lo componen, por lo general se describe como un circuito equiva-lente de las resistencias, los condensadores e inductores en paralelo o en serie. Los modelos de los circuitos equivalentes son útiles para la interpretación del espectro de impedancia, y como tal la EIS es una técnica valiosa para la in-vestigación de la cinética y la morfología de los electrodos, de polímeros, de semiconductores, de sensores bioquímicos, de tejidos animales y vegetales [24]. El principal motivo para el estu-dio de sensores de impedancia es su capacidad para realizar detecciones label-free [21, 23, 25].

Esta técnica junto con indicadores electroac-tivos como el ferrocianuro de potasio, ha sido usada frecuentemente para caracterizar cade-nas simples o dobles de ADN [24], para el se-guimiento de la hibridización del ADN [26, 27] y para la detección de polimorfirmos de un solo nucleótido [28] usando electrodos modificados.

En este trabajo, presentamos los resultados tras el estudio de superficies de electrodos de oro modificados con nanoestructuras que de superficies de nanogaps poliméricos ultra-delgados preparados mediante auto-organi-zación de blocopolímeros de PS-b-PMMA de longitud de bloque variable para la fabricación de matrices de nanoelectrodos.

Esquema 2. Schematic of (a) surface nanostructure (top view), (b) effect of hybridisation and de-hybridisa-tion event on the blocking of the pore structure and (c)read out of resulting surface impedance variation due

to hybridisation and blocking of the pore structure.

Estos electrodos se usaron posteriormente para preparar sensores electroquímicos de ADN, inmovilizando cortas secuencias de ADN tiolado dentro de los poros poliméricos y monitoreando el evento de hibridización con una cadena de ADN complementario utilizan-do espectroscopia de impedancia electroquí-mica. La combinación de EIS y las matrices de nanoelectrodos podría ofrecer un método electrónico de detección simple basado en el aumento de la resistencia interfacial de la transferencia de electrones, asociada con el bloqueo de los poros seguido por la forma-ción de un aducto de ADN, como se muestra en el Esquema 2.

La voltametría cíclica junto con la EIS se usó para monitorear la calidad del graba químico de los dominios de PMMA tanto como la de-tección de los eventos de hibridización des-pués de la funcionalización de los electrodos con cadenas cortas de ADN, de 20 bases de longitud. La secuencia Exon 16, presente en el gen BRCA1 del cáncer de mama se usó como sistema modelo de ADN. Para carac-terizar la morfología y el espesor de los films nanoporosos se usó Microscopia de Fuerza Atómica (AFM) and y reflectometría de ra-yos-X. El presente trabajo demuestra que las estructuras de nanoporos permiten al sustra-to de oro subyacente mantener la actividad electroquímica y ser usadas en la detección de ADN.

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Materiales.

Ferrocianuro de potasio (III), tetrahidrofura-no, tolueno y tampón fosfato salino pH 7.4 con Tween 20 (PBS-T) fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (España), Sodio hexacianofe-rrato (II) decahidratado, cloruro de potasio, ácido sulfúrico, cloroformo y acetona fueron adquiridos de Scharlau Chemie (Barcelona, España), ácido acético glacial fue adquiri-do de Panreac (Barcelona, España). Se usó agua ultrapura (18 MΩ cm) obtenida con un



sistema Milli-Q RG (Barcelona, España). Los oligonucleótidos fueron comprados a Euro-gentec (Eurogentec, España) y a Biomers.net GmbH (Ulm, Alemania). Las secuencias de oligonucleótidos empleadas en este trabajo se enumeran a continuación:

DNA-SH target (Exon 16): 5’-SH-AG-GGT-CAT-CAG-AGA-AGA-GG-3’ Sonda complementaria (Exon 16 A): 5’-CCT-CTT-CTC-TGA-TGA-CCC-T-3’

Los blocopolímeros (BCP) poli(estireno-block-metil metacrilato) (PS-b-PMMA) fueron compra-dos a Polymers Source Inc. (Montreal,Canada) y usados como fueron recibidos. Los sistema de blocopolíme-ros usados en este trabajos fueron PS(24 KDa)-b-PM-MA(11.5 KDa) with Mw/Mn= 1.06, PS(39.8 KDa)-b-PM-MA(17 KDa) with Mw/Mn= 1.06, PS(68 KDa)-b-PMMA(33.5 KDa) with Mw/Mn= 1.08, y PS(140 KDa)-b-PMMA(60 KDa) with Mw/Mn= 1.08.La obleas de silicio de 4” de diámetro y 525 μm de espesor, recubiertas con 10 nm de titanio y 100 nm de oro fueron adquiridos a Platypus Technologies (Madison, USA), fueron usados como sustrato a menos que se indique lo con-trario. Se obtuvo chips de 2 x 2 cm2 usando un lápiz de diamante a partir de las obleas de silicio (RS electronics, Michigan,USA), luego lavadas en agua milipore, acetona y secadas bajo flu-jo de nitrógeno, y finalmente limpiadas usando ozono con el sistema PSD-UVT ozone (Novas-can Technologies, USA) durante 10 minutos.

2.2. Métodos

2.2.1. Fabricación de filmes poliméricos delgados. Los blocopolímeros PS-b-PMMA fueron disueltos en THF o tolueno para for-mar soluciones stock de 1 % w/v. Los films delgados fueron preparados por revestimien-to por centrifugación en chips de silicio-oro 2 x 2 cm2 centrifugados a velocidades de 4000 rpm y cocidos a 170ºC por 72 horas para ob-tener dominios cilíndricos. Los dominios de

PMMA se degradaron usando una lámpara UV (350 W) durante 10 min, que consiste en el entrecruzamiento de la matriz de PS y la degradación de los dominios cilíndricos de PMMA. Posteriormente, la degradación do-minios de PMMA se elimina por lavado con ácido acético glacial durante 5 min.

2.2.2. Caracterización

Medición del espesor de los films. El es-pesor de las películas de PS-b-PMMA se de-terminó utilizando reflectometría de rayos-X

(XRR) antes de la radiación UV, las mediciones se reali-zaron con un difractómetro de rayos-x D-500 (Siemens, Alemania)

Morfología de las pelícu-las poliméricas. Se usó Microscopía de Fuerza Ató-mica (AFM) para caracteri-zar la morfología de los films

preparados. Se usó un 5400 Scanning Probe Microscope (SPM)/Atomic Force Microsco-pe para obtener imagines de microscopía de fuerza atómica en modo tapping (Agilent Te-chnologies, USA). Cantiléveres de silicio con constantes elásticas de resorte entre 5 y 40 N.m-1 y frecuencias de resonancia de 150 y 300 Hz se usaron para obtener las imágenes. El radio típico de los tips fue inferior de 10 nm. El análisis de las imágenes de AFM fue realizado usando el software WSxM (Nanotec Electrónica, España).

Voltametría cíclica y Espectroscopía de Im-pedancia. Los ensayos de voltametría cíclica (CV) y Espectroscopía de Impedancia (EIS) se realizaron usando un potenciostato/galvanos-tato Autolab PGSTAT controlado con los soft-wares General Purpose Electrochemical Sys-tem (GPES) y Frequency Response Analyser (FRA) (Eco Chemie B.V., Holanda). Las me-diciones se llevaron a cabo en una sola celda electroquímica en un arreglo de tres electrodos que consiste en filmes copoliméricas/DNA como electrodos de trabajo, un alambre de Ag/AgCl como electrodo de referencia y un alambre de Pt como electrodo de conteo. Los electrodos de

Muchas técnicas que incluyen la fluorescencia, espectrome-tría de masa, electroquímica, espectroscopia de resonancia d plasmones de superficie y micro-balanza de cristal de cuarzo, se han desarrollado para la detec-ción de ADN.



trabajo fueron chips cuadrados (2 cm × 2 cm) de silicio-oro. El diámetro de los electrodos de trabajo se definió por un agujero circular perfo-rado en una máscara de plástico adhesivo de 6 mm de diámetro. El electrolito usado fue 10 mM Fe (CN)63-/10mM Fe(CN)64- en solución acuo-sa 0,1 M de KCl. Todos los potenciales se regis-traron con respecto al electrodo de referencia.

2.2.3. Ensayos analíticos

Inmovilización del AND. La inmovilización de las cadenas sencillas de ADN tiolado (HS-ssDNA) en la matriz de nanoelectrodos se lo-gró mediante absorción química [29]. En resu-men, 50 µL de una solución 1μM de la sonda tiolada, recién preparada en 1 µM KH2PO4 se depositó sobre la superficie del electrodo y se inmovilizó durante toda la noche en una cámara húmeda para evitar la evaporación. Luego los electrodos fueron lavados en una solución de PBS-Tween durante 5 min para eliminar las sondas no adsorbidas.

Hibridización. La hibridación se llevó a cabo a través de la adición de 50 µL (100 nM) de la sonda complementaria. El la secuencia de ADN blanco, Exon 16, se añadió a la super-ficie del electrodo de trabajo, seguido por un periodo de incubación de al menos una hora en una cámara húmeda, el electrodo fue la-vado con PBS Tween por 5 minutos para re-mover cualquier secuencia no hibridada. La regeneración de los electrodos se logró por lavados con una solución acuosa de 20 mM Nao durante 5 min, seguido por enjuague con PBS 600 por 10 min, y finalmente con agua Milli-Q. Los procesos de hibridización fueron realizados dos veces. Los niveles de inmovi-lización, hibridización, y deshibridización fue-ron medidos usando voltametría cíclica y EIS.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Morfología de los films delgados di-block-copoliméricos por Microscopía de Fuerza Atómica.

Se realizaron una serie de experimentos en los cuales se varió sistemáticamente los pa-rámetros de procesamiento (temperatura de

annealing y tiempo de grabado) con el fin de optimizar el proceso de auto-organización. Para caracterizar la morfología de los films resultantes, se analizó la distribución de pe-rímetros de poros observados por de AFM, como una medida indirecta de la distribución del tamaño del poro.

Efecto del espesor del film

Todas las películas de block-copolímero en los sustratos de oro se prepararon por re-cubrimiento por rotación a diferentes veloci-dades de giro. Utilizando Reflectometría de Rayos-X (XRR), se estimó el espesor de las películas fabricadas a velocidades de 2000, 3000 y 4000 rpm se estimó su espesor en 49, 36 y 16 nm, respectivamente.

Figura 1. Espectros de reflectometría de rayos X (XRR) utilizados en la determinación del espesor de películas delgadas de blocopolímeros recubiertos por centrifugación a 4000 rpm.

En la determinación del espesor (Figura 1), el ángulo de incidencia del haz de rayos X utilizado es mayor que el ángulo crítico θC. La medida resultante consiste en un patrón de interferencia entre el haz incidente y el haz reflejado, que consta de un patrón pe-riódico de fase lo que puede estar relacio-nado con el espesor total de la capa de en cuestión. El espesor se determinó usando la ecuación 1.

E. 1



donde d es el espesor de la película del-gada, λ es la longitud de onda del rayo-x, y θm+1 - θm es la diferencia entre el ángulo de incidencia de dos máximos y mínimos cercanos [30].

El auto-ensamblaje de las plantillas ordena-das depende en gran medida del espesor pe-lículas de polímeros, como se muestra en la Figura 2. Está bien establecido que la morfo-logía de las películas de blocopolímeros de-pende en gran medida el grosor de la super-ficie debido a las interacciones tienen lugar dentro de las películas [15].

Figura 2. Análisis del efecto del espesor de PS-b-PMMA en el procesamiento de películas delgadas. Imágenes de altura y fase, y distribución del perímetro de los poros de la PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% (w / v) en THF, a-c) girar a 2000 rpm,. d-f) 3000 rpm, y g i) 4.000 rpm.

La película más gruesa, de 49 nm centrifu-gada a 2000 rpm demostró una distribución ordenada y homogénea del tamaño de poro (Fig. 2a-c). Las películas más delgadas de 36 nm y 16 mostraron grandes distribucio-nes de tamaño de los poros con muy poco orden (Fig. 2d-i). Todas las películas se prepararon a una temperatura fija (165 º C) durante 48 horas, que fue suficiente para asegurar la formación de una estructura equilibrada y mostraron una morfología que consta de poros redondeados y una orien-tación perpendicular. Las figuras 2c, 2f y 2i,

muestran la distribución del perímetro de los poros. Se puede observar que el valor medio de los poros fue de aproximadamen-te 20 nm, suponiendo poros circulares, y la distancia entre poros más cercanos fue de 34 nm. Sin embargo, frente a la fabricación de películas delgadas como plataformas para el desarrollo de sensores de ADN, se prefirió las superficies ordenadas entre 10 y 20 nm de espesor a fin de evitar la limita-ción de la difusión del ADN presente en la muestra a través de los huecos en el ADN inmovilizado. Por tanto, se seleccionó una velocidad de revestimiento por centrifugado de 4000 rpm para el trabajo futuro.

Efecto de la naturaleza del sustrato

Las interacciones interfaciales entre los blo-ques de polímero determinan tanto el sustrato y las interfaces de superficie y, en consecuen-cia, la orientación de los microdominios den-tro de la película [31].

Figura 3. Análisis del efecto de la interacción de la superficie de silicio nativo y obleas de silicio con re-cubrimiento de oro, en películas delgadas de PS-b-PMMA. Imágenes de altura y fase, y de distribución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-PM-MA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 2000 rpm, 10 min exposición UV y 2 min ataque químico con ácido acético glacial. a-b) imágenes de topografía y fase en la obleas recubiertas de oro, d-e) imágenes de topografía y fase en obleas de Si nativo, y c-f) distribución de perímetros de poro sobre el oro y Si, respectivamente.

Como tal, ya que la mayoría de los infor-mes de películas delgadas de copolímeros en bloque patrón se han desarrollan en sus-tratos de silicio, se investigó también la in-fluencia de los sustratos, es decir, en obleas



de silicio con recubrimiento de de oro y obleas de silicio nativo, sobre la morfología y orientación de las estructuras porosas. Las imágenes AFM de la figura 3 presentan la morfología de las películas sobre los dos sustratos. Las películas de las soluciones de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17) fueron re-vestidas por centrifugado a 2.000 rpm, y co-cidas a 165 º C durante 48 h. Se puede ob-servar que, esencialmente, la morfología en ambos sustratos es la misma, debido a las similares interacciones polímero-sustrato.Sin embargo, se puede observar patrones ligeramente más ordenados en las pelícu-las centrifugadas sobre sustratos de Si nati-vo. La relación del área- perímetro y la dis-tancia de primer vecino, que representan el diámetro de poro y el espaciamiento de los poros [7], fueron de 34,5 nm y 3,6 nm para películas sobre sustratos de silicio y 38 nm y 5,4 nm para las películas en Au. Estos re-sultados sugieren una mejor distribución de los poros, una mejora en el espaciamiento y poros más grandes.

Efecto de las condiciones de post proce-samiento

Figura 4. Análisis del efecto del tiempo de grabado usando ácido acético glacial, en películas delgadas de

PS-b-PMMA. Las imágenes de altura y fase, y distri-bución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugado a 4000 rpm. a-b) 3 minutos de tiempo de grabado, c-d) 5 minutos, y e-f) distribución de perímetros de poros de 3 min y 5 min, respectivamente.

Se investigó también la evolución de la morfo-logía de los poros como una función del tiem-po de grabado. La figura 4 muestra las imá-genes de AFM de las películas después de 3 y 5 minutos de grabado usando ácido acético glacial seguido por cocido térmico a 165 º C durante 48 horas.

Para todos los tiempos de grabado utilizados, las superficies observadas fueron consisten-tes con una orientación perpendicular cilíndri-ca. La morfología resultante no mostró dife-rencias entre 3 y 5 minutos, y, en general la distribución de los poros son iguales con un valor medio del perímetro de los poros de 50 nm, aproximadamente 16 nm de tamaño de poro. Además, se observó que los tiempos de grabado más cortos de 2 minutos no son su-ficientes para completar la eliminación de los microdominios de PMMA.

El efecto del campo externo también fue uti-lizado en un intento de alinear microdomi-nios de los blocopolímeros siguiendo varios informes de Thurn-Albrecht et al. [8, 32], que afirman que un campo eléctrico podría orientar películas de hasta 1μm de espesor.

El cocido del diblock-copolímero se llevó a cabo durante 14 horas a 165 º C, por enci-ma de la temperatura de transición vítrea de los dos componentes (105 º C para el PS y 115 º C durante PMMA) bajo la aplicación de un campo eléctrico [32].

El tiempo de recocido se extendió a 48 ho-ras sin detectar cambios en la morfología y la orientación como se puede observar en la Figura 5, que presenta las imágenes topográficas y de fase posteriores a la ex-posición ultravioleta y la eliminación de los dominios de PMMA degradado por lavado con ácido acético.



Figura 5. Imágenes de AFM de la orientación de pe-lículas delgadas aplicando un campo eléctrico. PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en tolueno, centri-fugadas a 2000 rpm. a) Topografía y b) imágenes de fase.

Efecto del Tiempo de annealing en atmós-fera de solvente.

En el proceso de solvent-annealing, la mo-vilidad de las cadenas de copolímeros se ve reforzada por la presencia del disolvente y la reorganización del copolímero, condu-ciendo a la recuperación de estructuras or-denadas cilíndricas [33].

Tras la exposición a vapor saturado de clo-roformo en una cámara sellada a tempera-tura ambiente durante diferentes períodos de tiempo, las muestras de películas delga-das de recubiertos con PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) fueron llevadas a atmósfera ambiente y secadas rápidamente.

El efecto del tiempo de recocido disolvente se presenta en la Figura 6. Después de 24 h (Figura 6), la película muestra una estructu-ra muy desordenada con señales de sepa-ración de las microfase.

La exposición prolongada al vapor saturado de cloroformo (48 h, en la figura 6b) condu-ce a una estructura ordenada porosa con una relación área-perímetro de aproxima-damente 6 nm y la distancia de primer veci-no de 35 nm.

La ampliación de la duración del disolvente tratamiento de vapor (> 72 horas, la figura 6c, d), dio lugar a franjas y morfología lami-nar, de acuerdo con Xuan et al, 2004 [10].

Figura 6. Análisis del efecto del tiempo de solvent an-nealing utilizando cloroformo. Altura y distribución del perímetro de los poros de PS (39.8kDa)-b-de PMMA (17kDa) 1% en THF centrifugadas a 2000 rpm. a) 24 h, b) 48, c) 72, d) 92 h y e) distribución del perímetro sobre sustratos de oro.

Caracterización electroquímica de los fil-mes delgados de matrices de nanoelectro-dos por Voltametría Cíclica

En la caracterización de la profundidad de los poros por AFM, las incertidumbres en las me-diciones son demasiado grandes para la con-clusión definitiva de que los poros de penetrar la película por completo. Los métodos electro-químicos constituyen una forma sencilla para la caracterización de electrodos nanoporosos. Los informes anteriores han demostrado que los nanoelectrodos presentan una dependen-cia scan-rate [14], como se ve en la Figura 7., los voltamogramas cíclicos fueron tomados a velocidades de barrido diferentes (Figura 7), y las intensidades de los picos se representa en función de la raíz cuadrada de la velocidad de barrido (Figura 7b). Una relación lineal en-tre la corriente y la raíz cuadrada de las tasas de exploración muestran que el proceso elec-troquímico está limitado sólo por la difusión habitual de las especies electroactivas en la proximidad del electrodo [1]. Sin embargo, a velocidades de barrido bajas, los voltamogra-mas de la sonda de ferricianuro de potasio redox presenta un pico de forma sigmoidea, característica de un perfil de difusión radial de la sonda redox para los dominios nano-poros, mientras que las tasas de exploración se in-



crementan, los voltamogramas se vuelven más sinusoidales, característica de la difusión esencialmente no lineal. Estas observaciones indican que la nanoelectrodos se comportan casi de forma independiente el uno del otro, aunque a velocidades de barrido mayor sus perfiles de difusión se superponen [14].

Figura 7. Voltamogramas cíclicos a velocidades de barrido (10, 50, 100, 150, 200, 300, 400 y 500 mV / s) de Fe (CN) 63 - / Fe (CN) 64 - en sustratos de oro des-pués de cubrir con película delgada de PS (39.8kDa)-b-PMMA(17kDa). Recuadro: Relación lineal entre la intensidad de pico y la raíz cuadrada de la velocidad de exploración.

Un análisis cuantitativo de los datos de la ci-nética facilitó la estimación de la superficie real del oro subyacente utilizando la ecuación de Randles-Sevcik [34]:

donde: ip es la corriente máxima (A), A es el área de los electrodos (cm2), D es el co-eficiente de difusión (cm2 s-1), C es la con-centración (mol cm-3) y v es la velocidad de barrido (V s-1). El coeficiente de difusión del ferricianuro potásico se determinó primero utilizando un electrodo de área conocida, A. Los voltamogramas fueron adquiridos a ve-locidades de barrido diferentes (10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400 y 500 mV/s), y la ip resultante se graficó contra v1/2. El coeficiente de difusión se calculó a partir de la pendiente de la recta resultante como

Los datos de la figura 7 se extrajeron para es-timar la superficie real en un 2.16 x 10-7 cm2, es decir, aproximadamente tres órdenes de magnitud menor que la geometría real del electrodo.

Prueba de concepto del sensor electroquí-mico de ADN por voltametría cíclica y espec-troscopía de impedancia electroquímica.

Las películas nanoporosas de blocopolímeros sobre sustratos de oro, y la electroactividad de las sales de ferri/ferrocianuro de potasio (Fe(CN)6

3-/Fe(CN)64-) se probaron utilizando

voltametría cíclica después de la inmoviliza-ción de las sondas de ADN tiolado, la hibri-dación con la secuencia complementaria y la regeneración de los electrodos, es decir, dehibridación (Esquema 2). Un ejemplo típi-co se presenta en la Figura 8. La intensidad de la señal es proporcional a la concentración de las moléculas que sufren oxidación/reduc-ción, y la diferencia entre el potencial máximo está relacionado con la cinética del proceso electroquímico [1].

Figura 8. Voltamogramas cíclicos a una velocidad de barrido de 100 mV/s de la Fe (CN)6

3 - / Fe (CN)64 - en sustratos de oro después del recubrimiento con PS (39.8kDa)-b-PMMA (17kD). a) Película delgada, b) después de la inmovilización, c) después de la hibri-dación, d) regeneración (dehibridización) y e) segunda hibridación.

Tras la inmovilización, la corriente máxima medida aumentó considerablemente de 1,15 nA para la matriz de electrodos desnudos hasta 4,22 nA. Tras la hibridación, la corriente aumentó, además, a 5,38 nA y disminuyó a 5,26 nA después de la hibridación. Este com-portamiento es muy diferente de los senso-



res de ADN electroquímico preparados sobre electrodos de oro puro, donde por lo general, el ADN monocapa forma corrientes de pico que disminuyen debido a la obstrucción par-cial de los sitios de los electrodos activos. Sin embargo, en la hibridación, la corriente puede aumentar [36] o disminuir [37] dependiendo de la configuración de los electrodos y mono-capas inmovilizadas. En todos los casos, tras la re-generación, la señal del sensor se volvió a la registrada antes de la hibridación. A raíz de los resultados reportados por los grupos de investigación de Gooding et al. y Barton et al., se puede sugerir que a la inmovilización y la hibridación o la transducción de carga a través del ADN ocurrido o que de iones de puertas abiertas [37, 38]. Las gráficas de EIS después de cada derivatización etapas brin-dan una visión más clara de los resultados obtenidos [21]. Como se indica en los diagra-mas de Nyquist en la Figura 9, la impedancia total del sistema en gran medida el aumento de 3.200Ω a más de 12.000Ω en la inmovili-zación siguiente.

Figura 9. a) Resultados de impedancia electroquími-ca sobre sustratos de oro después del recubrimiento con película delgada PS(39.8kDa)-b-PMMA(17kDa). b) Después de la inmovilización, c) después de la hibri-dación, d) regeneración (dehibridización) y e) segunda hibridación.

Sin embargo, en la hibridación la resisten-cia a la transferencia de carga disminuye a aproximadamente 20.000Ω. Después de la hibridación, la resistencia a la transferencia de carga casi volvió a su valor inicial, aunque se observa la contribución de un componente capacitivo. A partir de estos resultados existe cierta preocupación de que el ADN inmovili-

zado podría haber removido de la superficie. Sin embargo, después de una segunda hi-bridación, la impedancia aumentó hasta un valor similar a la medida después de la pri-mera hibridación, es decir, un aumento de la impedancia de aproximadamente 6 veces, lo que confirma la presencia de sondas de ADN inmovilizado y la funcionalidad del sensor. La inmovilización del ADN y los eventos hibri-dación aumentan la carga global negativa de la superficie del electrodo debido a las cargas negativas presentes en el esqueleto de fosfa-to del ADN, y limitan aún más la difusión del ferricianuro con carga negativa a la superficie del electrodo, lo que resulta en un aumento de la impedancia. La impedancia inicialmente alta después de la inmovilización por tanto, podría atribuirse a la interacción no específica del ADN tiolada con los patrones de poliesti-reno, la mayoría de los cuales se lavó des-pués de la hibridación y la regeneración con hidróxido de sodio [21].

La inmovilización de la sonda de ADN tiolada en la superficie de oro con una densidad ópti-ma, el radio y el espaciamiento óptimo para la hibridación eventual son técnicas claves para mejorar la eficiencia de detección de ADN. Todos estos parámetros se puede mejorar mediante el desarrollo de una plataforma po-rosos bien ordenada que permita una inmovi-lización tiolada ADN fácil y bien orientada.

5. CONCLUSIONES

En conclusión, hemos analizado la calidad de auto-ensamblado de las películas delgadas de blocopolímero, se caracterizó la uniformi-dad y el grado de orden mediante microsco-pía de fuerza atómica, y se extrajo informa-ción sobre la distribución de los poros y el parámetro de distancia poro a poro (distancia al primer vecino) . Hemos demostrado mane-ras convenientes de ordenar películas de blo-copolímeros, cambiando las condiciones de elaboración y el uso de diferentes enfoques, tales como thermal annealing, campos eléc-tricos y solvent annealing. Otros enfoques de proceso también fueron considerados, tales



como recubrimiento por inmersión, pero el mejor resultado se logra mediante spin-coa-ting.Los experimentos se realizaron usando dos solventes diferentes, tolueno y tetrahidrofura-no, y se encontró un incremento ligero en el ordenamiento usando el primer solvente, de-bido a una mayor reactividad del solvente en la formación de los puentes de hidrógeno. Las mejores ordenadas basadas en pelícu-las delgadas de blocopolímeros se lograron usando solvent y thermal annealing, mien-tras que el espesor de las películas pudo ser controlado variando la velocidad de centrifu-gación. Mostramos que usando solvent an-nealing se puede conseguir microdominios cilíndricos porosos, ordenados y orientados en las películas, y que su morfología se man-tiene estable después del annealing. Además, la caracterización de las superficies por espectroscopía de impedancia y volta-metría cíclica mostraron que, el ADN tiolado puede ser inmovilizado en oro desnudo den-tro de los poros y el sensor de ADN resultante puede usarse para detectar la unión del ADN complementario mediante la medición de los cambios en la impedancia. Estos resultados prometedores de la funcionalización inicial, indican el potencial de las matrices de nano-electrodos porosos para la detección de ADN. Sin embargo, se requieren trabajos adiciona-les para controlar el tamaño de los poros y su distribución como requisitos cruciales para estudiar de forma fiable y mejorar el rendi-miento del sensor, en parámetros como se-lectividad, sensibilidad, límite de detección y la reproducibilidad.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue llevado a cabo con la ayuda financiera del Séptimo Programa Marco de la Comisión Europea (FP7/2007-2013) bajo el acuerdo FP7-IEF-221198.Por otra parte, agradezco a la Secretaría Na-cional de Educación Superior, Ciencia Tecno-logía e Innovación (SENESCYT), por la beca otorgada para realizar los estudios de Máster en Nanociencia y Nanotecnología en la Uni-versidad Rovira y Virgili, Tarragona, España.

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II. Resumen de proyectos



“ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PATÓGENO-PATÓGENO, QUE SE ESTABLECEN DURANTE EL DESARROLLO DE LA ENFERMEDAD DE LA MARCHITEZ VASCULAR EN EL BABACO (VASCONCELLEA HELBORNII VAR. PENTAGONA)”

Resumen

La investigación propone estudiar las bases genéticas de la interacción patógeno – patógeno entre Fusarium oxysporum spp. y Phytophthora sp., en la enfermedad del marchitamiento vascular en el Babaco, estas interacciones será el objetivo general de este proyecto. Para caracterizar la interacción patógeno - patógeno durante la infección del material vegetal, haremos uso de técnicas de secuenciación de nueva generación; ambas cepas coloniza-doras del Babaco serán secuenciadas. Subsecuentemente se llevará a cabo un análisis comparativo de las secuencias obtenidas respecto a genomas de especies relacionadas con Phytophthora sp y Fusarium oxysporum spp., lo que revelará determinantes genéticos únicos de las cepas secuenciadas. Estos factores genéticos distintivos son candidatos a participar en interacciones específicas del tipo patógeno - patógeno. Adicionalmente se estudiará el transcriptoma de ambas especies de forma aislada o en comunidad. Tal estudio de expre-sión génica mostrará genes que son activados o reprimidos durante la interacción patógeno - patógeno. Toda esta información en su conjunto facilitará determinar cuáles son las carac-terísticas genéticas que un agente usado en el biocontrol de la enfermedad de la marchitez radicular en Babaco debe tener para que sea efectivo y por tanto propiciará su identificación de forma racio-nal.

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“PRODUCCIÓN DE UN BIOINOCULANTE EFICIENTE PARA EL CULTIVO DE LEGUMI-NOSAS: MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE CEPAS NATIVAS DE

MICROORGANISMOS DIAZOTRÓFICOS”

Resumen

El presente trabajo se llevara a cabo con el objetivo de caracterizar e identificar genéticamente bacterias diazotróficas las mismas que serán aisladas de 8 zonas de muestreos en la provin-cia de Loja, así como determinar el efecto de estos aislados sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno en leguminosas de importancia agronómica, El análisis morfológico se basara en determinar las diferencias de las colonias obtenidas del aislamiento, donde se evaluara la tinción al Gram, tipo de crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. La identificación genética de los aislados resultantes de la caracterización morfológica se realizara mediante la secuenciación total de los genes de la región 16S ARNr en estrecha colaboración con las Universidades de Gent y Lovaina de Bélgica. El análisis fenotípico de los aislados se llevará a cabo en condiciones controladas y de campo, evaluándose los parámetros de nodulación, morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno en leguminosas como frejol, soya, maní, arveja y haba. Los resultados obtenidos de estas evaluaciones y determinados los mejores aislados cepas-genotipos, de estos se obtendrán bioinoculantes comerciales eficientes para el cultivo de leguminosas, para el efecto se seguirán protocolos establecidos según están-dares internacionales de fabricación.



MARCADORES MOLECULARES GENERADOS PARA SOLANUM SECCIÓN LYCOPERSICON

Resumen

La hortaliza más difundida en todo el mundo y la de mayor valor económico es el tomate riñón (So-lanum lycopersicum). Esta situación ha despertado desde hace mas de una década, enorme interés en científicos de todo el planeta. La genética molecular ha tenido un impacto significativo en la estimación de su diversidad genética, en la determinación de la filogenie existente entre las diferentes especies silvestres de la sección Lycopersicon, así como en la generación de marcadores moleculares que han asistido a los genetistas, en la mejora genética de los cultivos comerciales. Ha sido generada para su estudio, abundante información para muchos de los marcadores de ADNc mapeados, los cuales han sido integrados dentro de un extenso consen-sus en el Tomatoe Gene Index en el Insitute for Genomic Research, se ha realizado el mapeo de marcadores de ADNc, pruebas multilocus para determinar los efectos de la subdivisión de especies estrechamente emparentadas, se han diseñado primers específicos basados en datos publicados sobre ADNc o secuencias de ADN genómico, los productos amplificados han sido secuenciados y las nuevas secuencias generadas depositadas en la base de datos del Gene Bank, de manera que al momento la comunidad científica cuenta con basta información sobre el genoma, así como con el grado de filiación de las diferentes especies silvestres relacionadas genéticamente pertenecientes a la sección Lycopersicon.

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“AMPLIACIÓN Y ESPECIALIZACIÓN DEL BANCO DE GERMOPLASMA DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE LOJA,

PRIORIZANDO LE-GUMINOSAS DE LA ZONA 7 DEL ECUADOR”.

Resumen

El presente proyecto está relacionado a la ampliación del banco de germoplasma actual del Cen-tro de Biotecnología, priorizando leguminosas de la zona 7 del ecuador. El proyecto básicamente consiste en el rescate de accesiones de leguminosas del banco actual, con el fin de conformar un banco especializado de leguminosas que almacene colecciones de semillas, como; las que se puedan rescatar y otras que se colectaran. Para el cumplimiento de lo expuesto nos hemos planteados los siguientes objetivos. Garantizar la sobrevivencia del Recurso Genético de Le-guminosas de la Zona 7 del Ecuador, con miras a desarrollar investigación en la Universidad Nacional de Loja; Establecer un Banco de Germoplasma de Leguminosas para la Universidad Nacional de Loja; Conservar el Recurso Fitogenético de la Zona 7 del Ecuador; Evaluar el ger-moplasma e instaurar una base de datos digital. Las actividades a desarrollarse en el trascurso del proyecto están relacionadas con; pruebas de viabilidad del material germoplasmico actual, implementación de protocolos para el tratamiento adecuado de las semillas, adquisición de equi-pos, instrumental y recipientes para una adecuada conservación, evaluación agro morfológica del material obtenido a través de la siembra e instauración de una base de datos digital – soft-ware que almacene toda información obtenida. El proyecto como tal tiene una duración de 36 meses y el monto requerido es de 126672.10 Dólares America-nos.



“DESARROLLO DE BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS “LABEL-FREE” MEDIANTE EL USO DE MATERIALES NANOESTRUCTURADOS PARA LA DETECCIÓN

TEMPRANA Y RÁPIDA DE CÁNCER”

Resumen

El proyecto de investigación propuesto tiene como objetivo el estudio y desarrollo de nuevas superficies nanoestructuradas para la fabricación de biosensores electroquímicos de ADN. Bio-sensores de ADN utilizan ampliamente las herramientas de diagnóstico en el campo de la genó-mica y perfiles de expresión, a menudo organizados en el formato de microarrays para permitir el análisis en paralelo. La capacidad para detectar una sola muestra de una multitud de parámetros genéticos al mismo tiempo ha permitido a los investigadores lograr avances considerables en la comprensión de enfermedades como las enfermedades mentales, enfermedades del corazón, enfermedades infecciosas y el cáncer con el objetivo de adaptar el tratamiento necesario de forma adecuada. Para la consecución de este objetivo es clave el estudio de la química de la superficie nanoestructurada necesaria para la realización exitosa de este dispositivo, con el fin de lograr el aumento de la sensibilidad y límites de detección más bajos de los bio-sensores. Este proyecto contribuirá al desarrollo de microarrays electroquímicos de ADN. El proyecto es multi-disciplinario y aborda los campos del auto-ensamblaje molecular y el reconocimiento molecular en superficies, la biología molecular, el diseño de instrumentos y técnicas de microfabricación. La metodología de la investigación se centrará en la preparación de las superficies de los electrodos nanoestructurados. Se investigarán metodologías para la fabricación de monocapas de superfi-cies nanoporosas, buscando optimizar el tamaño y el grosor de los poros de las superficies poli-méricas. Las superficies preparadas serán funcionalizada con sondas de ADN cancerígeno y se monitoreará los eventos de inmovilización e hibridación con el ADN complementario. Por último, a fin de evaluar los dispositivos preparados se usarán técnicas como la microscopía de fuerza atómica, la voltametría y espectroscopia de impedancia electroquímica rutinariamente para con-firmar la funcionalización eficiente y el funcionamiento del disposi-tivo.

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PRODUCCIÓN DE BACTERINAS INACTIVADAS PARA PREVENIR LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS DE ORIGEN BACTERIANO EN COBAYOS (Cavia

porcellus) DE LA PROVINCIA DE LOJA.

RESUMEN

Actualmente uno de los mecanismos de prevención que se está empleando es el uso de bacte-rinas (producto biológico que se obtiene a partir de exudados o productos del animal enfermo, el cual es procesado, para posteriormente inocularlo y estimular al sistema inmunológico, provo-cando una respuesta específica), con la finalidad de generar inmunología (anticuerpos) frente a los agentes patógenos, y con ello evitar el uso de productos antimicrobianos, que se expresaría en el abaratamiento de los costos de pro-ducción y por último y no por ello menos importante, como una medida de prevención del posible impacto que dichos medicamentos pueden producir en el medio ambiente. Cabe destacar que en el mercado nacional no se encuentran bacterinas para esta especie, ni para prevenir, en particular, los problemas respiratorios, principal causa de la alta morbi-mortalidad de los cobayos, razones por las cuales el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja, se ve en la necesidad de implementar un laboratorio para producir bacterinas y ofertar a los productores para la prevención de problemas de salud de sus anima-les, que les causa serios daños económicos.

III. Informativo



ACTIVIDADES Y EVENTOS REALIZADOS EN EL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA

• Seminario interno de análisis de los proyectos en formulación, con miras a recoger los crite-rios del grupo de investigadores del centro de biotecnología.

• Presentación de los proyectos para análisis, ante los profesores y estudiantes del Área Agro-pecuaria y de Recursos Naturales Renovables, 18 de mayo de 2011 en el Aula Magna de la Carrera de Medio Ambiente.

• Socialización de los proyectos con investigadores del Centro Biotecnología en el aula de pro-yecciones, 05 de octubre de 2011.

• Gestión ante la Cooperación Belga en el marco del programa VLIR- UOS para aprobación del proyecto “Estudio de las interacciones patógeno-patógeno, que se establecen durante el de-sarrollo de la enfermedad de la marchitez vascular en el babaco (vasconcellea helbor-nii var. pentagona)”, con asistencia directa del Dr. Aminael Sánchez Rodríguez, Ph. D. a ejecutarse en coordinación con el Centro de Genética de Plantas y Microorganismos de la Universidad Católica de Lovaina y el Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja. El pro-yecto se encuentra aprobado.

• Creación de una base de datos del banco de germoplasma, que recopila información de las accesiones; año de ingreso, código de banco, número de estante, número de frasco, nombre común, nombre científico, país, provincia, cantón y localidad.

•

• Readecuación de los espacios logísticos del Banco de Germoplasma como: cambio de cu-bierta, puntos de luz, toma de agua, reservorios, implementación de un sistema de riego por



nebulización para el invernadero del Centro de Biotecnología y la compra de 2 bombas de mochila para fumigación.

• Reparación e instalación de dos cámaras frigoríficas para conservación de material fitogené-tico.

• Desarrollo de la tesis titulada “Repotenciación de cámaras frigoríficas para el centro de Bio-tecnología de la Universidad Nacional de Loja”.



• Creación del laboratorio de Microbiología y Bioinoculantes, adquisición de equipos, materia-les y reactivos.

• Realización del curso: “Biología Molecular para la Identificación de Microorganismos y Aná-lisis Computacional de Información Genética” los días 20-29 de julio de 2011, dictado por los profesores: Dr. Aminael Sánchez, Ph.D., y, Dr. Roldan Torres, Ph.D., de Bélgica y Cuba respectivamente.

• Apoyo en la formulación de tesis de pregrado y dirección de proyectos de investigación de tesis, por el personal del centro de biotecnología:

Tutoria de Ing. Natalia Morales Mg. Sc. a:

- “Caracterización morfológica y molecular de 100 accesiones de ají (Capsicum baccatum) del banco de germoplasma del Centro de Biotecnología de la Universidad Nacional de Loja”.

- “Caracterización molecular de la resistencia del tomate a Fusarium oxysporum”



Tutoría de Dr. Rómulo Chávez Valdivieso Ph. D. a:

- “Identificación de las patologías de los órganos genitales de las vacas faenadas en el camal frigorífico de Loja, CAFRILOSA”

- “Estudio de la eficacia de protocolos en la sincronización del celo de cabras del bosque seco tropical de la provincia de Loja, a base de la combinación de progestágenos con estradiol y en asociación con gonadotropina corionica”

Tutoría de Ing. Iván Granda Mg. Sc., a:

- Identificación y caracterización de cepas nativas de Rhizobium: sobre genotipos de frejol co-mún (Phaseolus vulgaris), en diferentes condiciones agroecológicas de la provincia de Loja.

• Formulación de la propuesta y preparación de la documentación soporte para el desarrollo de la “Maestría en Ciencias en Biotecnología Genómica”, que se pretende ejecutar con el apoyo del Instituto Nacional Politécnico de México, - IPN, Centro de Biotecnología Genómica de Reynosa, México.

• Elaboración de la Programación Institucional, a nivel de proyecto: POA 2012; PAC 2012.

• Defensa y sustentación de los proyectos ante la Comisión de Investigación de la Universidad Nacional de Loja, lográndose su aprobación e inclusión en el Presupuesto General de Investi-gación de la Universidad Nacional de Loja.

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CURSOS Y EVENTOS EN LOS QUE HA PARTICIPADO EL PERSONAL DEL CENTRO

• Curso Teórico-Práctico “Fundamentos de la PCR en Tiempo Real y Aplicaciones en Biología Molecular”. 06-07 de abril del 2011. Pontificia Universidad Católica del Ecuador. Quito.

• Seminario – Taller “Lectura, Escritura y Comunicación de la Ciencia”. 30 de mayo al 03 de junio de 2011. UNL. Loja.

• Taller “Diseño y Elaboración de Proyectos de Investigación Científica”. 11-15 de julio del 2011. UNL. Loja.

• Curso Teórico-Práctico “Uso y Aplicaciones de Marcadores Moleculares en Biotecnología



Agrícola”, 14 al 18 de noviembre de 2011. INIAP. Estación Experimental Pichilingue, Quevedo.

• “VIII Simposio Internacional de Recursos Genéticos de América Latina y el Caribe”. 21 al 23 de noviembre de 2011. Quito.

• Taller “Bioseguridad y Desechos Infecciosos”. 25-26 de noviembre del 2011. MSP. Loja.

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APOYO A LA FORMACIÓN EN CALIDAD DE DOCENTES:

• Ing. María Natalia Morales Palacio, Mg.Sc., en las Carreras de: Ingeniera Agronómica; y, Ma-nejo y Conservación del Medio Ambiente.

• Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D., en la Carrera de Medicina Veteriana y Zootecnia.



GRUPO DE INVESTIGADORES DEL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA 2011 - 2012

Dr. Rómulo Chávez Valdivieso, Ph.D.E-mail: [email protected]

Ing. María Natalia Morales Palacio Mg.Sc.E-Mail: [email protected]

Ing. Iván Patricio Burneo Saavedra Mg.Sc.E-mail: [email protected]

Ing. Kléver Iván Granda Mora Mg. Sc.E-mail: [email protected]

Ing. Ángel Rolando Robles Carriòn Mg. ScE-mail: aroblescarriò[email protected]

Ing. Aníbal Homero Ruiz SánchezE-mail: [email protected]

Ing. Marlon Oswaldo Pineda EscobarE-mail: [email protected]

Blgo. Omar Santiago Erazo SotomayorE-mail: [email protected]

Med. Vet. Vanessa Herrera Yunga E-mail: [email protected]


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Volumen 1 Revista Biotecnología